CN111057706A - 一组引物以及hla-dpb1基因测序分型的检测方法 - Google Patents

一组引物以及hla-dpb1基因测序分型的检测方法 Download PDF

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王天菊
李恒新
赵京文
尚利侠
武君华
陈乐�
王满妮
王小芳
房婕
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开了一组引物以及HLA‑DPB1基因测序分型的检测方法，包括2对特异性扩增引物和5条寡核苷酸测序引物。该方法包括PCR扩增、电泳检测PCR产物、PCR产物纯化、测序反应、测序产物醋酸钠‑乙醇沉淀法纯化、上机测序和数据分析步骤。本发明的方法能实现一次扩增HLA‑DPB1基因2外显子和3‑4外显子，并对3个外显子进行测序。本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立简便的、应用广泛的分型方法，能够低成本地对大样本量成功准确地进行HLA‑DPB1基因分型检测。

Description

一组引物以及HLA-DPB1基因测序分型的检测方法
技术领域
本发明涉及医疗领域，尤其涉及一种引物以及HLA-DPB1基因测序分型的检测方法。
背景技术
人类白细胞抗原(HLA)系统是迄今为止人类多态性最高的基因复合体之一，是影响造血干细胞移植物植入、造血重建时间延缓和存活最重要因素之一，供患者间不同HLA位点高分辨水平的相合程度对造血干细胞移植(HSCT)疗效的影响已有众多研究所证实，由此确立的HLA高分辨水平配型策略，使得近十年来的无血缘关系HSCT取得了巨大的成功。但当达到HLA-A,-B,-C,-DRB1,-DQB110/10全相合移植时，仍有可能因为HLA-DPB1位点不匹配而发生移植后严重病死事件，降低总体生存率。随着全世界越来越多的回顾性HSCT病例研究，此前在移植领域未引起足够关注的HLA-DPB1等位基因开始被逐渐认识，HLA-DPB1等位基因对移植结局的影响已经不容忽视。
HLA-DPB1属于经典HLA-II类等位基因，其表达的DP分子与其他HLA座位表达的抗原分子类似，具有同种免疫反应效应。随着分子生物学技术的进展，HLA-DP位点多态性被逐渐展示，截止2019年7月14日已发现HLA-DPA1等位基因132个，HLA-DPB1等位基因1449个(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.html)，可见其复杂性和多态性。HLA-DPB1具有6个外显子，目前常规检测检测主要为第2和第3外显子的多态性。
现阶段，HLA基因分型方法主要有多聚酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、多聚酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)、多聚酶链反应-序列特异性寡核苷酸反应(PCR-SSOP)、基因芯片和Sanger直接测序法(PCR-SBT)等。随着现代分子生物学和生物工程技术的长足发展，HLA基因分型技术已由一代测序向下一代、三代测序技术升级，但以聚合酶链反应为基础的PCR-SBT测序分型方法仍是目前最可靠准确的HLA-DPB1基因分型方法，是世界卫生组织(WHO)推荐的高分辨水平HLA基因分型的金标准。
HLA-DPB1的基因全长为18kb，片段相对较长，全长基因扩增难度较大，对DNA模板和酶的质量要求较高，成本较大。同时，我们在前期研究中也发现现有的一些商品试剂盒并不能同步检测HLA-DPB1 Exon 2～4，致使分型结果中存在一定模棱两可和漏检情况，且不能低成本地满足大规模样本HLA-DPB1高分辨基因分型的需求。
发明内容
发明的目的：为了提供一种效果更好的引物以及低成本HLA-DPB1基因测序分型的检测方法，具体目的见具体实施部分的多个实质技术效果。
为了达到如上目的，本发明采取如下技术方案：
用于HLA-DPB1基因高分辨分型的引物组，根据HLA-DPB1基因的外显子2设计的特异性引物组1，根据HLA-DPB1基因的外显子3～4设计的特异性引物为引物组2，用于测序反应的5条寡核苷酸测序引物组成。
所述用于扩增的引物组为：
(1)扩增HLA-DPB1外显子2的特异性引物
DPBE2U：tctctgcgtggtgagaaaacagg
DPBE2D：ctcgctcccctgacaagctc
(2)扩增HLA-DPB1外显子3-4的特异性引物
DPBE3U：acccttacccactagcctaatcac
DPBE4D：taatcagccattgaaaccacc
(3)用于测序的5条寡核苷酸测序引物序列如下
DPBE2F：tctctgcgtggtgagaaaacagg
DPBE2R：ctcgctcccctgacaagctc
DPBE3F：ggacaatctcaaattctat
DPBE3R：cctggcttcaaactatgct
DPBE4F：gaccttggcttaggggttcc
本发明还提供一种HLA-DPB1基因分型的PCR-SBT方法，包括以下步骤：
(1)以上述扩增引物，用聚合酶链反应分别扩增人基因组DNA中的HLA-DPB1位点的外显子2和外显子3-4序列；扩增反应条件为95℃，4min；95℃，20s，62℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃，10min；4℃保持。
(2)将步骤(1)得到的扩增产物进行ExoSAP-IT@双酶切法纯化；
(3)以提供的测序引物，将步骤(2)得到的纯化产物进行测序PCR反应；
(4)将步骤(3)得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化。
(5)将步骤(4)得到的测序纯化产物变性后进行毛细管电泳测序；
(6)将步骤(5)获得的原始序列通过软件分析，确定HLA-DPB1等位基因型。
所述步骤(1)中的扩增引物为上述扩增引物组(2对)，所述步骤(3)中的测序引物为上述5条寡核苷酸测序引物。
所述步骤(2)中的ExoSAP-IT@双酶切法为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。
本发明中引物设计是PCR-SBT方法的关键之一，通过NCBI、Ensembl和UCSC数据库获取HLA-DPB1基因序列，下载CDS序列，同时显示序列中的SNP信息，有关引物设计的方法和软件均可从互联网免费获得。所有引物设计均避开目前已知的突变位点，避免因位点漏检而导致分型错误。测序引物选择HLA-DPB1基因保守区设计，对HLA-DPB1的第2、3外显子分别进行双向测序，第4外显子正向测序，确保清晰准确地测定这3个外显子的全部序列，保证样本精确分型。
本发明通过引物Tm理论值，结合梯度法设置Tm值范围，确定PCR最适反应条件，HLA-DPB1扩增体系合适，扩增条件稳定，扩增产物特异性强，条带清晰，位置大小正确。
本发明前期设计不同的测序引物显示出序列质量的差异，某些样本能够顺利测出，另一些样本则在CDS某一位置出现套峰，导致测序失败；此后经多方综合分析，多软件评分系统评估引物对的质量和各种性质，最终解决了某些HLA-DPB1分型的特殊性，最大限度减少错误引发效率，同时纠正测序引物“打滑”、套峰和丢峰现象，由此获得最优双向测序引物对。
本发明通过多次预实验结果分析，进行测序优化反应体系和反应程序，包括模板与引物最适比例；改变测序反应条件如退火温度、优化序列等。
本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的分型方法，能够低成本地对大样本量成功准确地进行HLA-DPB1基因分型检测，目前市场上的商品化HLA-DPB1测序分型试剂盒售价昂贵，千人份检测费用高达几十万，本发明提供的试剂和方法可将检测成本大幅降低90％，一方面使大宗样本HLA-DPB1人群基因多态性分布研究具备可行性；另一方面针对移植供患者进行准确分型有利于避免因HLA-DPB1不允许错配而引发的移植后严重病死事件，指导移植医生优化最适供者选择，并根据不同匹配格局和可能产生的风险有针对性和预防性的制定移植治疗方案，进一步提高我国造血干细胞移植的总体疗效。
附图说明
图1：HLA-DPB1基因PCR扩增引物及测序引物位置示意图，其中，DPBE2U、DPBE2D、DPBE3U和DPBE4D为扩增引物；DPBE2F、DPBE2R、DPBE3F、DPBE3R和DPBE4F为测序引物。
图2：HLA-DPB1基因24例样本PCR扩增产物电泳图。
图3：HLA-DPB1基因第2外显子部分测序峰图示例。
图4：HLA-DPB1基因第3外显子部分测序峰图示例。
图5：HLA-DPB1基因第4外显子部分测序峰图示例。
具体实施方案
以下结合实施例对本发明内容作进一步详细说明。但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
1、制备PCR扩增模板，即抽提人基因组DNA。
取待检全血200ul，按照核酸自动提取纯化试剂血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，紫外分光光度仪测定基因组浓度和纯度。
2、合成2对扩增引物和5条测序引物，具体序列见前述发明内容，不再赘述，将扩增引物用超纯水稀释至10uM。
室温平衡GoTaq Reaction Buffer(Promega)、dNTP Mix(TaKaRa)、GoTaq DNAPolymerase(Promega)、双蒸水，分别振荡离心5-10s，备用；与步骤1所制备的PCR扩增模板按照表1所述体系配制PCR扩增体系；当配制多个样本反应时，N个样本需按N+1的量计算配制预混液；DNA或特异性引物不加入预混液，直接加入PCR管中；将配制好的预混液充分混匀，离心5-10s，向PCR管中按照加样顺序依次分装预混液，并核对八联管或96孔板上的标记。
表1：HLA-DPB1等位基因PCR扩增体系
5X Green or Colorless GoTaq Reaction Buffer 5ul
dNTP Mix(2.5mmol/L) 2ul
Primer 1 0.5ul
Primer 2 0.5ul
GoTaq DNA Polymerase(5U/ul) 0.125ul
DNA 1ul
超纯水 16ul
总体系 25ul
上表中，Primer 1为发明内容中所述的DPBE2U或DPBE3U，Primer 2为发明内容中所述的DPBE2D或DPBE4D。
2、扩增反应条件：用PCR仪(德国SENSO)按以下程序扩增
Figure BDA0002226037020000051
4、电泳检测PCR产物
取扩增产物3-5ul，在2％琼脂糖凝胶中以100V电压下电泳15min；在紫外凝胶成像仪中观察特异性条带，拍照；合格的扩增产物条带应清晰明亮无扩散，预期扩增产物片段大小分别为600bp和1000bp，否则为扩增失败，不再进入后续实验。
5、PCR扩增产物纯化：ExoSAP-IT@双酶切法
在剩余的PCR扩增产物中加入3ul ExoSAP-IT@，振荡离心后，放置于PCR仪上，利用虾碱性磷酸酶(SAP)的核苷酸5’端去磷酸化功能和核酸外切酶I(Exo-I)的单链特异性3’→5’核酸外切酶的功能，进行扩增产物纯化；纯化反应条件为37℃，30min；80℃，15min；4℃保持。
6、测序反应
将纯化后的扩增产物加入20ul～30ul超纯水稀释，混匀并离心；以BigDye terminatorv3.1 sequencing kit(美国ABI公司)试剂按照表2配制测序反应体系：
表2：测序反应体系
Template 2ul
Forward/Reverse primer(10uM) 2ul
BigDye v3.1 0.5ul
5X BigDye Buffer 1.75ul
超纯水 3.75ul
总体系 10ul
其中Forward primer为发明内容中所述的DPBE2F或DPBE3F或DPBE4F，Reverse primer为发明内容中所述的DPBE2R或DPBE3R。
将上述测序反应体系用PCR仪(德国SENSO)按以下程序扩增：
Figure BDA0002226037020000061
8、测序反应产物纯化：采用醋酸钠/乙醇纯化法
在测序反应产物中加入EDTA(125mM)和醋酸钠(3M)等比例混合液2ul，离心后轻微振荡，加入40ul无水乙醇，充分振荡1min，2000g离心30min；倒扣500g离心1min去除上清，加入100ul 80％乙醇，2000g离心5min，倒扣500g离心1min去除上清；避光静置10min，待乙醇挥发后加入10ul甲酰胺溶解，95℃变性2min，迅速在冰上冷却。
9、上机测序
将步骤6制备好的产物在ABI 3730xl测序仪上进行96道毛细管高通量电泳测序，编辑上机测序模板文件，所生成的序列原文件利用uType v7.2软件进行序列比对分析，确定HLA-DPB1基因型，结果显示了检测样本HLA-DPB1的部分序列。图3～图5为本发明检测样本HLA-DPB1基因的部分测序电泳图谱。
本专利的名称还可以是：一种人类白细胞抗原HLA-DPB1基因测序分型的方法。
2对共4条特异性扩增引物：
第1对特异性扩增引物，扩增HLA-DPB1的第2外显子：DPBE2U、DPBE2D；
第2对特异性扩增引物，扩增HLA-DPB1的第3-4外显子：DPBE3U、DPBE4D。
5条寡核苷酸测序引物的核苷酸：DPBE2F、DPBE2R、DPBE3F、DPBE3R、DPBE4F，其中第2外显子的测序引物DPBE2F和DPBE2R分别与第1对特异性扩增引物DPBE2U和DPBE2D序列相同。
解释：在前期发明研究中，发明人针对第2外显子设计了多条测序引物，均不同于其扩增引物的序列，但在实验过程中经过多次已知样本的比对，发现当测序引物的序列与扩增引物序列相同时，测序效果优于设计的其他测序引物；且由于扩增片段远大于第2外显子全长，当测序引物序列与扩增引物序列相同时，完全能够对第2外显子全长进行高质量地测序。故最终确定第2外显子的测序引物DPBE2F和DPBE2R分别与第2外显子的扩增引物DPBE2U和DPBE2D序列相同。
以下附上相关中英文翻译的表单：
Figure BDA0002226037020000071
Figure BDA0002226037020000081
Figure BDA0002226037020000091
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本领域的技术人员应该了解本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。
Figure BDA0002226037020000101
Figure BDA0002226037020000111
Figure BDA0002226037020000121
Figure BDA0002226037020000131
Figure BDA0002226037020000141
序列表
<110> 西安市中心血站（陕西省血液中心）
<120> 一组引物以及HLA-DPB1基因测序分型的检测方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctctgcgtg gtgagaaaac agg 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcgctcccc tgacaagctc 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acccttaccc actagcctaa tcac 24
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taatcagcca ttgaaaccac c 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tctctgcgtg gtgagaaaac agg 23
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctcgctcccc tgacaagctc 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggacaatctc aaattctat 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cctggcttca aactatgct 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaccttggct taggggttcc 20

Claims (5)

1.一组引物，其特征在于，引物为2对共4条特异性扩增引物和5条寡核苷酸测序引物的核苷酸；
2对共4条特异性扩增引物核苷酸序列如下：
DPBE2U： tctctgcgtggtgagaaaacagg
DPBE2D： ctcgctcccctgacaagctc
DPBE3U： acccttacccactagcctaatcac
DPBE4D： taatcagccattgaaaccacc
5条寡核苷酸测序引物的核苷酸序列如下：
DPBE2F： tctctgcgtggtgagaaaacagg
DPBE2R： ctcgctcccctgacaagctc
DPBE3F： ggacaatctcaaattctat
DPBE3R： cctggcttcaaactatgct
DPBE4F： gaccttggcttaggggttcc。
2.权利要求1所述的引物在检测HLA-DPB1基因分型中的用途。
3.HLA-DPB1基因测序分型的检测方法，其特征在于：利用权利要求1所述的引物，包括以下步骤：
（1）抽提待检样本基因组DNA；
（2）利用DPBE2U、DPBE2D、DPBE3U和DPBE4D扩增引物，用PCR反应分别扩增人基因组DNA中的HLA-DPB1位点的外显子2和外显子3-4序列；
（3）利用ExoSAP-IT@对扩增产物进行双酶切法纯化，所需的两种酶为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I；
（4）利用DPBE2F、DPBE2R、DPBE3F、DPBE3R 和DPBE4F测序引物，将得到的纯化产物进行测序PCR反应；
（5）测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化；
（6）测序纯化产物变性后进行毛细管电泳测序；
（7）获得的原始序列通过软件分析，确定HLA-DPB1等位基因型。
4.如权利要求3所述的HLA-DPB1基因测序分型的检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中，PCR扩增按照下述配制反应体系预混液，共25ul：5X Green or Colorless GoTaqReaction Buffer 5ul, dNTP Mix (2.5mmol/L) 2ul,特异性引物各0.5ul，GoTaq DNAPolymerase （5U/ul）0.125ul，超纯水16ul，待测DNA 1ul；其中，特异性引物为DPBE2U和DPBE2D以及DPBE3U和DPBE4D；
扩增反应条件：95℃，4min；95℃，20s，62℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃，10min；4℃ 保持。
5.如权利要求3所述的HLA-DPB1基因测序分型的检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中，测序反应按照下述体系配制预混液，共10ul：模板 2ul，测序引物2ul，BigDye v3.10.5ul，5X BigDye Buffer 1.75ul，超纯水3.75ul；其中测序引物为DPBE2F、DPBE2R、DPBE3F、DPBE3R或DPBE4F；
测序反应条件：96℃，1min；96℃，10s，50℃，15s，60℃，3min，25个循环；4℃ 保持。
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