CN104894230B - 一种hla-dqb1基因分型的组特异性引物pcr-sbt方法及试剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于HLA‑DQB1基因分型的组特异性引物PCR‑SBT试剂，它由用于扩增的6对组特异性引物和用于测序分析的4条寡核苷酸测序引物组成；本发明还提供应用上述试剂的HLA‑DQB1基因分型的组特异性引物PCR‑SBT方法，本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，能成功解决HLA‑DQB1位点的准确分型鉴定问题，有利于提高造血干细胞移植供受者HLA配型的准确性，从而选择更合适的移植供者，降低移植过程中的排斥反应，这对于进一步提高器官移植的成功率和生存率具有重要的意义。

Description

一种HLA-DQB1基因分型的组特异性引物PCR-SBT方法及试剂

技术领域

本发明涉及基因分型检测方法，尤其涉及一种用于HLA-DQB1基因分型的分子生物学检测方法，本发明还涉及该方法所应用的试剂和有关实验参数。

背景技术

人类白细胞抗原（HLA）基因位于第6号染色体短臂21.3区域，是调控人体特异性免疫应答的主要基因系统，是目前所知的最富多态性的遗传系统。HLA抗原与同种器官移植的排斥反应密切相关，器官移植术后移植物能否存活很大程度上取决于供者与受者之间HLA型别是否相合。准确的HLA分型对选择合适的供者、降低移植物抗宿主病（GVHD）的发生率、提高移植物的存活率均有重要意义。

HLA-DQB1属于经典的HLA-II类基因，在免疫应答中起重要作用，现在HLA-DQB1的分型已被大多数免疫遗传实验室作为常规检测用于移植供受者配对选择。HLA-DQB1有6个外显子，目前常规检测主要为第2和第3外显子的多态性。HLA-DQB1具有高度遗传多态性，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)在内含子和外显子区域均有丰富的分布，如第1内含子中平均每7个核苷酸即存在1个SNP位点，在第2和第3外显子平均每6个核苷酸有1个SNP位点，并且不同组特异性等位基因SNP位点不同。熟悉HLA-DQB1基因这些特点，对于分析HLA-DQB1基因序列确定等位基因型有一定的帮助。

HLA测序分型为国际通用的组织配型高分辨检测技术, 基因测序分型技术的关键之一在于引物设计和PCR扩增。由于HLA-DQB1每一组等位基因在内含子和外显子均存在共享序列，为同时检测多组DQB1等位基因多态性，在试剂引物中可能含有多对扩增引物。在PCR同时扩增多对引物时由于存在竞争作用，某些等位基因会出现优势扩增现象。国外学者已报道DQB1基因在DQB1*02和DQB*03、DQBI*04等杂合情况下容易导致等位基因漏检。国内也有研究报道DQB1*06与DQB1*02杂合时，DQB*06等位基因优先扩增，DQB1*03与DQB1*02杂合时，DQB1*03等位基因优先扩增，从而导致DQB1*02等位基因漏检。我们在前期研究中也发现现有的商用试剂盒虽然可以同步检测HLA-DQB1的第2和3号外显子，但是也存在类似的等位基因漏检情况。因此，现有的方法存在一定缺陷，建立一种针对HLA-DQB1单一等位基因的PCR-SBT方法可以保证不同等位基因的有效扩增，对于提供准确的HLA-DQB1分型结果有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于HLA-DQB1基因分型的组特异性引物PCR-SBT试剂，以克服现有基因分型技术中的上述不足。

为此，本发明采用以下技术方案：

它由用于扩增的6对组特异性引物和用于测序分析的4条寡核苷酸测序引物组成；

所述用于扩增的引物为：

(1) 扩增HLA-DQB1*02 组的特异性引物

DQB1*02F：5'-CTCGTCATTCCCTTGAACTG-3'

DQB1*02R：5'-AACCACCGGACTTTGATCTG-3'，

(2) 扩增HLA-DQB1*03:01组的特异性引物

DQB1*0301F：5'-TCAAAAGCTTGTGCTCTTTCAG-3'

DQB1*0301R：5'-CAGTCCCTCCGAGCTATCAG-3'，

(3) 扩增HLA-DQB1*03组（除DQB1*03:01外）和DQB1*04组的特异性引物

DQB1*04F：5'-GATGAGGTGAGCACAGTCGG-3'

DQB1*04R：5'-CTCCGAGCTATCAGGACTGG-3'，

(4) 扩增HLA-DQB1*05 组的特异性引物

DQB1*05F：5'-ACAGCAGGATTTGTCATTTCA-3'

DQB1*05R：5'-GTCCTGTCTCCTCGCACTTC-3'，

(5)扩增HLA-DQB1*06:01 组的特异性引物

DQB1*0601F：5'-GGAAATACAAGGCAGCAATGA-3'

DQB1*0601R：5'-CCTGCTGAGGAGCTGAAGTC-3'，

(6) 扩增HLA-DQB1*06组(除DQB1*06:01外)的特异性引物

DQB1*0602F：5'-CAAGACTGCCTGGACTTAGG-3'

DQB1*0602R：5'-AGGACTGGGATTCAGAGCAA-3'；

所述用于测序的4条寡核苷酸测序引物序列如下：

DQB1-2F：5'-GGCCSGTGATTCCYCGCAG-3'

DQB1-2R：5'-GGKCRACSMCGCTCACCTC-3'

DQB1-3F：5'-CTTTYCCTGTCTGTTACTGC-3'

DQB1-3R：5'-GGCCCAYARTAACAGAAACTC-3'。

本发明还提供一种HLA-DQB1基因分型的组特异性引物PCR-SBT方法，它对HLA-DQB1基因进行分型，包括以下步骤：

（1）制备人基因组DNA；

（2）提供扩增引物，用聚合酶链反应分别扩增人基因组DNA中HLA-DQB1不同等位基因型序列；

（3）将步骤（2）得到的扩增产物进行双酶切纯化；

（4）提供测序引物，将步骤（3）得到的纯化产物进行测序PCR反应；

（5）将步骤（4）得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；

（6）将步骤（5）获得的序列通过软件分析，确定HLA-DQB1等位基因型。

所述步骤（2）中的扩增引物为上述6对组特异性引物，所述步骤（4）中的测序引物为上述4条寡核苷酸测序引物。

所述步骤（3）中纯化所需的两种酶为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。

本发明中引物设计是PCR扩增的关键，有关引物设计的方法和软件均可从英特网上免费获得。本发明所设计的寡核苷酸引物是根据IMGT/HLA数据库（ http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/）中HLA-DQB1位点基因序列中包括多态性位点在内的连续寡核苷酸序列而获得的。所有引物的设计均避开目前已知的突变位点或采用简并引物方法，以免因位点的漏检而导致分型错误。本发明中6对寡核苷酸扩增引物分别针对HLA-DQB1位点不同等位基因组的共有序列设计，每对扩增引物只特异性扩增一组等位基因第2和第3外显子，避免了其他组等位基因的干扰。测序引物选择HLA-DQB1基因的保守区域设计，4条共同的测序引物可对不同组等位基因的扩增片段进行双向测序，保证清晰准确检测第2和第3外显子的全部序列，从而将标本进行精确的分型。

本发明在明确HLA-DQB1位点组特异性的基础上，选择不同的组特异性引物扩增HLA-DQB1位点第2和第3外显子，进而应用共同的测序引物进行双向测序分析，精确地确定HLA-DQB1的等位基因型。利用这些组特异性引物可以对样本的单体型进行有效分离，在新等位基因的鉴定方面有重要作用。此外，本发明可有效判定等位基因型的漏检情况，弥补现有分型方法的不足，有助于准确指定HLA-DQB1等位基因型别。

本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，能成功解决HLA-DQB1位点的准确分型鉴定问题，有利于提高造血干细胞移植供受者HLA配型的准确性，从而选择更合适的移植供者，降低移植过程中的排斥反应，这对于进一步提高器官移植的成功率和生存率具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明中检测标本的HLA-DQB1基因PCR扩增电泳图谱。1孔为DQB1*02组扩增片段，2孔为DQB1*03:01组扩增片段，3孔为DQB1*03组（除DQB1*03:01外）和DQB1*04组扩增片段，4孔为DQB1*05组扩增片段，5孔为DQB1*06:01组扩增片段，6孔为的DQB1*06组(除DQB1*06:01外)扩增片段。M为DNA marker，分子量分别为2000,1000,750, 500，250,100bp。

图2-7为本发明检测的HLA-DQB1基因部分测序电泳图谱，图中A、G、C、T分别为测序的四种碱基，A为腺嘌呤，G为鸟嘌呤，C为胞嘧啶，T为胸腺嘧啶。

图2为HLA-DQB1基因第2外显子部分多态性序列图谱，样本分型结果为DQB1*02:01。

图3为HLA-DQB1基因第2外显子部分多态性序列图谱，样本分型结果为DQB1*03:01。

图4为HLA-DQB1基因第2外显子部分多态性序列图谱，样本分型结果为DQB1*03:03。

图5为HLA-DQB1基因第2外显子部分多态性序列图谱，样本分型结果为DQB1*05:03。

图6为HLA-DQB1基因第2外显子部分多态性序列图谱，样本分型结果为DQB1*06:01。

图7为HLA-DQB1基因第2外显子部分多态性序列图谱，样本分型结果为DQB1*06:09。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明内容作进一步详细说明。

本实施具体以1个标本进行HLA-DQB1基因分型为例对本发明内容做详细说明，本发明所采用的一种HLA-DQB1基因分型的组特异性引物PCR-SBT方法具体包括以下步骤：

1、制备人基因组DNA，作为后续步骤的PCR扩增模板。

取待检全血200µl，按照QuickGene DNA whole blood kit S试剂盒说明书提取基因组DNA，利用分光光度计测定基因组浓度和纯度。

2、合成6对扩增引物和4条测序引物，具体序列见前述发明内容中的序列，不再赘述，将扩增引物用纯水稀释至50μmol/L；

准备LA -Taq酶（TaKaRa）、10×缓冲液（TaKaRa）、dNTP（TaKaRa）、Mg²⁺（TaKaRa）、纯水，与步骤1所制备的PCR扩增模板按表1所述体系配制PCR扩增体系：

表1：步骤2中HLA-DQB1 基因PCR扩增体系

上表中，引物1和引物2根据HLA-DQB1的组特异性来确定，引物1指DQB1*02F、DQB1*0301F、DQB1*04F、DQB1*05F、DQB1*0601F和DQB1*0602F中的一条，引物2指DQB1*02R、DQB1*0301R、DQB1*04R、DQB1*05R、DQB1*0601R和DQB1*0602R中的一条，应成对选择。

用PCR仪（ABI9700）按以下程序扩增：

扩增条件：94°C 预变性1min；98°C 变性10s，68°C退火和延伸5min，30个循环；72°C，10min, 扩增片段充分延伸；

3、扩增产物的双酶切纯化。检测样本所扩增片段，各取2 µl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定扩增片段的特异性。在剩余的PCR产物中分别加入虾碱性磷酸酶（SAP，1 U/µl，Lot：M820A，Promega）和核酸外切酶Ⅰ（Exo- ，10 U/µl，Lot：CK11011B，TaKaRa），利用虾碱性磷酸酶（SAP）的核苷酸5′ 端去磷酸化功能以及核酸外切酶Ⅰ（Exo-）的单链特异性3′→5′ 核酸外切酶功能，进行扩增产物纯化。在25µl扩增产物体系中加入SAP 2 µl和Exo-1 µl，37℃酶切30 min，80℃作用15 min酶失活。

4、对PCR产物进行测序PCR。将步骤3中纯化之后的PCR产物中加入20µl纯水稀释，混匀。将发明内容中所述的四条测序引物用纯水稀释至浓度为3.2μmol/L，以BigDyeterminator v3.1 sequencing kit（美国ABI公司）试剂按照表2配制反应体系：

表2：步骤4中PCR产物的PCR测序体系

其中测序引物1为 DQB1-2F、 DQB1-2R、 DQB1-3F、 DQB1-3R中任意一条。

所测样本以扩增纯化的片段1:1稀释后作为模板，分别进行4个反应，用PCR仪（ABI9700）按以下程序扩增：预变性96℃1min，DNA双链充分解开；96℃ 变性10s，50℃ 退火5s，测序引物结合到DNA模板上，60℃延伸4min，延长扩增片段，25个循环。

5、测序扩增PCR产物直接用醋酸钠/乙醇纯化法进行纯化。将步骤4中测序扩增PCR产物直接用醋酸钠/乙醇纯化法进行纯化。直接在PCR产物中加入1µl EDTA（1.25μM）和25µl醋酸钠（3M）/无水乙醇（1：40）混合液，混匀，3000g离心30min；去除上清，加入50µl 75%乙醇，3000g离心10min，去除上清，酒精挥发后加入10µl甲酰胺溶解，95℃变性3min，迅速在冰上冷却。

6、将制备好的产物在ABI 3730测序仪上进行48孔毛细管高通量电泳测序，所测序结果利用Assign3.6+软件进行序列比对，确定HLA-DQB1基因型，结果显示了检测样本HLA-DQB1的部分序列。图2-7为本发明检测样本HLA-DQB1基因的部分测序电泳图谱。图中A、G、C、T分别为测序的四种碱基，A为腺嘌呤，G为鸟嘌呤，C为胞嘧啶，T为胸腺嘧啶。

所以，本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，能成功解决HLA-DQB1位点的准确分型鉴定问题，有利于提高造血干细胞移植供受者HLA配型的准确性，从而选择更合适的移植供者，降低移植过程中的排斥反应，这对于进一步提高器官移植的成功率和生存率具有重要的意义。

<110> 浙江省血液中心

<120> 一种HLA-DQB1基因分型的组特异性引物PCR-SBT方法及试剂

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ctcgtcattc ccttgaactg 20

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

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aaccaccgga ctttgatctg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tcaaaagctt gtgctctttc ag 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cagtccctcc gagctatcag 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gatgaggtga gcacagtcgg 20

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<213> 人工序列

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ctccgagcta tcaggactgg 20

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acagcaggat ttgtcatttc a 21

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gtcctgtctc ctcgcacttc 20

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<212> DNA

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ggaaatacaa ggcagcaatg a 21

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cctgctgagg agctgaagtc 20

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caagactgcc tggacttagg 20

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aggactggga ttcagagcaa 20

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ggccsgtgat tccycgcag 19

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ctttycctgt ctgttactgc 20

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ggcccayart aacagaaact c 21

Claims (1)

1.一种HLA‐DQB1基因分型的组特异性引物PCR‐SBT试剂，其特征在于：所述试剂由用于扩增HLA‐DQB1不同等位基因的6对组特异性引物和用于测序分析的4条寡核苷酸测序引物组成；

所述用于扩增的6对组特异性引物为：

(1)扩增HLA‐DQB1*02组的特异性引物

DQB1*02F：5'‐CTCGTCATTCCCTTGAACTG‐3'

DQB1*02R：5'‐AACCACCGGACTTTGATCTG‐3'，

(2)扩增HLA‐DQB1*03:01组的特异性引物

DQB1*0301F：5'‐TCAAAAGCTTGTGCTCTTTCAG‐3'

DQB1*0301R：5'‐CAGTCCCTCCGAGCTATCAG‐3'，

(3)扩增除HLA‐DQB1*03:01外的HLA‐DQB1*03组和HLA‐DQB1*04组的特异性引物

DQB1*04F：5'‐GATGAGGTGAGCACAGTCGG‐3'

DQB1*04R：5'‐CTCCGAGCTATCAGGACTGG‐3'，

(4)扩增HLA‐DQB1*05组的特异性引物

DQB1*05F：5'‐ACAGCAGGATTTGTCATTTCA‐3'

DQB1*05R：5'‐GTCCTGTCTCCTCGCACTTC‐3'，

(5)扩增HLA‐DQB1*06:01组的特异性引物

DQB1*0601F：5'‐GGAAATACAAGGCAGCAATGA‐3'

DQB1*0601R：5'‐CCTGCTGAGGAGCTGAAGTC‐3'，

(6)扩增除HLA‐DQB1*06:01外的HLA‐DQB1*06组的特异性引物

DQB1*0602F：5'‐CAAGACTGCCTGGACTTAGG‐3'

DQB1*0602R：5'‐AGGACTGGGATTCAGAGCAA‐3'；

所述4条寡核苷酸测序引物序列如下：

DQB1‐2F：5'‐GGCCSGTGATTCCYCGCAG‐3'，

DQB1‐2R：5'‐GGKCRACSMCGCTCACCTC‐3'，

DQB1‐3F：5'‐CTTTYCCTGTCTGTTACTGC‐3'，

DQB1‐3R：5'‐GGCCCAYARTAACAGAAACTC‐3'。