CN104805206B - 检测tert基因启动子突变的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测TERT基因突变的试剂盒及其检测方法，试剂盒含有针对TERT基因突变位点的LNA锁核酸修饰的特异探针，该特异探针能够与野生型DNA结合，能检出含0.01％TERT基因突变DNA的样本、最低检出限为2‑5拷贝，本发明的检测方法对TERT基因突变检测具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性等优点，特别适合从血浆，尿液，唾液等含有突变含量低的体液中检测基因突变，适合对膀胱癌进行早期筛查和诊断，为个体化用药提供指导。

Description

检测TERT基因启动子突变的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及检测TERT基因启动子突变的试剂盒，还涉及利用该试剂盒在非疾病诊断中检测TERT基因启动子突变的方法。

背景技术

端粒酶是一种核糖核蛋白酶，在绝大多数真核生物中，对染色体末端的复制起到至关重要的作用。端粒酶由一种由催化蛋白和RNA模板组成，可合成染色体末端的DNA，从而使得端粒不会因细胞分裂而有所损耗，使得细胞分裂克隆的次数增加。端粒酶在正常体细胞中的无活性或低活性，而在生殖细胞，干细胞及癌细胞中活跃。端粒酶逆转录(TERT)是端粒酶的催化部分，位于5号染色体短臂，调控端粒酶活性。在人类肿瘤研究中发现TERT活跃，使得TERT成为与异常的细胞增值相关的疾病(例如癌症)的预防，治疗的靶点。

Huang et al.(2013)在70名黑素瘤患者中发现有50名患者(71％)有TERT启动子突变C228T与C250T。这两个点突变对ETS转录因子产生共有结合基序，提高了TERT启动子转录活性并高达2-4倍。研究发现，点突变C228T与C250T的突变频率在膀胱癌患者中也非常高，其在染色体的上的位置分别为Chr5:1,295,228(GRCh37)，Chr5:1,295,250(GRCh37)。研究发现，位于染色体Chr5:1,295,228(GRCh37)位点上的C228A与Chr5:1,295,242-1，295，243(GRCh37)位点上的CC242-243TT突变也在膀胱癌患者中检出。因此，检测尿液中TERT基因启动子的突变对于指导膀胱癌等癌症患者临床用药，具有重要的参考价值。

目前检测基因突变的方法主要有以下几种：

(1)DNA芯片技术(DNAchip)：DNA芯片技术是90年代后发展的一项DNA分析新技术，它集合了集成电路计算机、激光共聚焦扫描、荧光标记探针和DNA合成等先进技术。在基因突变检测方面，DNA芯片基本原理为将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1块集成电路板上，彼此之间重叠1个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧光标记的正常DNA和突变DNA发别与2块DNA芯片杂交，由于至少存在1个碱基的差异，正常和突变的DNA将会得到不同的杂交图谱，经过共聚集显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧光信号，即可确定是否存在突变，该方法快速简单、片动化程度高，具有很大的发展潜力，将在基因突变检测中心发挥非常重要的作用。

(2)PCR-SSCP法：PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。

(3)异源双链分析法(HA)HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。

(4)探针扩增阻滞突变法(amplification refractory mutation system，ARMS)。利用PCR探针的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计针对突变位点的特异性PCR扩增探针，在严格的条件下，只有在探针3’碱基与模板配对时PCR扩增反应才能正常进行，从而检测出突变。通过设计两个5’端探针，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯和性突变，分别加入两种探针及3’端探针进行两个平行的PCR，结合有与突变DNA完全互补的探针才可以延伸并得到PCR扩增产物。

(5)等位基因特异性寡核苷酸分析法(allele-specific oligonucleotide,ASO)ASO为一种以杂交为基础对已知突变的检测技术。以PCR和ASO相结合，设计一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变的部位，以此为探针，与固定在膜上的经PCR拉增的样品DNA杂交。可以用各种突变类型的寡核苷酸探针，同时以野生型探针为对照，如出现阳性杂交带，则表运河样品中存在与该ASO探针相应的点突变，ASO需严格控制杂交条件和设置标准对照避免假阳性和假阴性。

(6)连接酶链反应(ligase chain reaction,LCR)：与其他核酸扩增技术比较，其最大特点为可准确区分基因序列中单个基因突变。LCR是以DNA连接酶将某一DNA链的5`-磷酸与另一相邻链3`-羟基连接为基础，应用两对互补的引物，双链DNA经加热变性后，两对引物分别与模板复性，若完全互补，则在连接酶的作用下，使相邻两引物的5`-磷酸与3`-羟基形成磷酸二酯二酯键而连接，前一次的连接产物又作为下一次循环反应的模板，如果配对的碱基存在突变则不能连接和扩增。LCR产物检测最初是通过这32p标记上游引物3`未端，经变性凝胶电泳分离后放射自显影加以鉴定，其检测敏感性达到200个靶分子。也可设计1个横跨两引物的检测探针，用它与LCR产物进行杂交检测。由于LCR的快速、特蛋和敏感的特性，以及能检测单个碱基突变的能力，因此被应用于肿瘤基因突变的分子诊断，并与PCR结合用以提高其敏感性。

因此，急需一种提高检测TERT基因的灵敏度的方法和相应的检测试剂盒，为膀胱癌患者的诊断和治疗提供指导。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供检测TERE基因启动子突变的试剂盒，该试剂盒特异性强且灵敏度高；本发明的目的之二在于提供检测TERT基因启动子突变，该方法检测周期短。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、检测TERT基因启动子突变的试剂盒，所述试剂盒含有针对TERT基因启动子突变位点的LNA锁核酸修饰的特异探针。

优选的，所述锁核酸修饰的特异探针的核苷酸序列为CCT+CCCG+GGT+C+CCCG或CC+CC+CTC+CG+GGCCC，其中“+”后的C或G表示锁核酸修饰碱基。

优选的，所述试剂盒中还包含检测TERT基因突变的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.5所示。

更优选的，所述试剂盒中还包括PCR缓冲液、dNTPs、Eva Green和二氯化镁。

更优选的，所述试剂盒中各组分的终浓度如下：1×PCR buffer、2.5mM MgCl₂、dNTP 250μM、引物250nM、探针500nM、1×EVE GREEN、DNA聚合酶1U和DNA模板2-20ng。

2、所述检测TERT基因启动子突变的试剂盒在非疾病诊断中检测TERT基因启动子突变的方法，包括如下步骤：

a.设计检测TERT基因启动子突变的引物和针对TERT基因启动子突变位点的LNA锁核酸修饰的特异探针；

b.从待测样品中提取模板DNA，然后利用步骤a得到的引物和特异探针进行荧光定量PCR扩增反应；

c.根据熔解曲线法根据溶解曲线判读Ct值，然后根据Ct值判断待测样品中TERT基因突变情况，若溶解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内，并且Ct<45，表明扩增区段发生突变。

本发明的检测原理如图1所示。

优选的，所述LNA锁核酸修饰的特异探针的核苷酸序列为CCT+CCCG+GGT+C+CCCG或CC+CC+CTC+CG+GGCCC，其中“+”后的C或G表示锁核酸修饰碱基。

优选的，所述检测TERT基因突变的引物如SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.2与SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.5所示。

更优选的，所述荧光定量PCR扩增反应的条件如下：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸25s，50个循环；95℃变性1min，40℃退火1min，65-95℃解链，每秒钟升温0.02℃，每摄氏度收集25次荧光信号，最后40℃保存。

本发明的有益效果在于：(1)特异性强：加入能与野生型特异性结合的LNA锁核酸修饰的特异探针；(2)灵敏度高，检测灵敏度达到0.01％；(3)检测过程为闭管反应，减少污染的可能性；(4)操作简单快速，整个PCR反应过程只有90分钟；而直接测序法则需要2天的时间，且为开管操作，大大增加污染的可能性；(5)结果判读明确客观，只需根据扩增数据和熔解曲线即可完成对样本基因类型的判读；(6)安全性好，整个体系不包含有毒有害物质，无需PCR产物的开管，对试验人员以及环境都无危害。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1本发明的检测原理图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本项目由“江苏省科技成果转化专项资金资助”和“国家高技术研究发展计划(863计划)资助”，项目编号2014AA020803。

本发明中所使用的仪器如下：Lightcycler 480、nanodrop 1000、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、烘箱、灭菌锅。

本发明中所使用的试剂：DNA聚合酶(罗氏公司)、10×PCR Buffer(罗氏公司)、MgCl₂(罗氏公司)、dNTP(TaKaRa)、纯化水。

本发明中所使用探针：所有探针纯度应达到电泳级(PAGE)或HPLC级，不含杂带。提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱，证明使用PAGE或者HPLC纯化后应有明显单峰PAGE或者HPLC纯化图谱，浓度为10ng/μl备用。

实施例1

本发明中涉及的质控品由TERT基因启动子C228T、C228A、CC242-243TT、C250T对应的阳性质粒及阴性基因组DNA组成，阴性基因组DNA为未突变的人血基因组DNA，其浓度为10³拷贝数；阳性质粒为含突变位点的突变序列，由苏州金唯智生物技术公司合成并连到pUC57-Amp载体中，经过DNA提取、纯化后稀释成浓度为10³拷贝数，得阳性质粒。上述突变位点信息来源于NCBI-OMIM数据库，具体的突变序列如下：

C228T：

gcgggcacagacgcccaggaccgcgcttcccacgtggcggagggactggggacccgggcacccgtcctgccccttcaccttccagctccgcctcctccgcgcggaccccgccccgtcccgacccctcccgggtccccggcccagcccctccgggccctcccagcccctccccttcctttccgcggccccgccctctcctcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcgtcctgctgcgcacgtgggaagccctggccccggccacccccgcgatgccgcgcgctccccgctgccgagccgtgcgctccctgctgcgcagccactaccgcgaggtgctgccgctggccacgt；

C228A：

gcgggcacagacgcccaggaccgcgcttcccacgtggcggagggactggggacccgggcacccgtcctgccccttcaccttccagctccgcctcctccgcgcggaccccgccccgtcccgacccctcccgggtccccggcccagcccctccgggccctcccagcccctccccttcctttccgcggccccgccctctcctcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcgtcctgctgcgcacgtgggaagccctggccccggccacccccgcgatgccgcgcgctccccgctgccgagccgtgcgctccctgctgcgcagccactaccgcgaggtgctgccgctggccacgt；

C250T：

gcgggcacagacgcccaggaccgcgcttcccacgtggcggagggactggggacccgggcacccgtcctgccccttcaccttccagctccgcctcctccgcgcggaccccgccccgtcccgacccctccgggtccccggcccagccccctccgggccctcccagcccctccccttcctttccgcggccccgccctctcctcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcgtcctgctgcgcacgtgggaagccctggccccggccacccccgcgatgccgcgcgctccccgctgccgagccgtgcgctccctgctgcgcagccactaccgcgaggtgctgccgctggccacgt；

CC242-243TT：

gcgggcacagacgcccaggaccgcgcttcccacgtggcggagggactggggacccgggcacccgtcctgccccttcaccttccagctccgcctcctccgcgcggaccccgccccgtcccgacccctcccgggtttccggcccagccccctccgggccctcccagcccctccccttcctttccgcggccccgccctctcctcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcgtcctgctgcgcacgtgggaagccctggccccggccacccccgcgatgccgcgcgctccccgctgccgagccgtgcgctccctgctgcgcagccactaccgcgaggtgctgccgctggccacgt。

然后根据含突变位点的序列设计检测TERT基因启动子4个突变位点的引物，具体引物如下：

表1、检测TERT基因启动子突变的引物

名称	序列	长度
			C228T-F	5’-cccggcccagcccct-3’(SEQ ID NO.1)	15
C228A-F	5’-cccggcccagcccca-3’(SEQ ID NO.2)	15
			CC242-243TT-F	5’-gacccctcccgggttt-3’(SEQ ID NO.3)	16
C250T-F	5’-cccgtcccgacccctt-3’(SEQ ID NO.4)	16
			TERT-R	5’-gcgaggagagggcggg-3’(SEQ ID NO.5)	16

Block是指一种寡核苷酸，其3’端做过以下修饰：磷酸化或者间臂，Spacer 3、Spacer 6和Spacer 18处理中的一种或多种处理，在PCR反应过程中，没有探针延伸扩增的功能。Block以锁核酸(LNA)修饰以硫化修饰后的野生型DNA为模板，进行设计序列和合成。Block和模板的特异结合的部位覆盖了探针的结合部位，当非突变DNA存在时，Block与之结合，提高了探针和突变DNA结合的特异性。设计的Block具体为：

CC242-243TT,C250T检测位点Block1:CCT+CCCG+GGT+C+CCCG；核酸序列中+后碱基C或G经锁核酸修饰；

C228A检测位点Block2:CC+CC+CTC+CG+GGCCC；核酸序列中+后碱基C或G经锁核酸修饰。

根据设计的引物和Block，对各组分在如下条件下进行优化：1～10×PCR缓冲液、0.1～1mM dNTPs、0.1～1μM TERT正向探针、0.1～1μM TERT基因启动子反向探针、0.1～2μMblock、0.05～2ng/μl模版DNA、Eva Green染料0.5～2μl、1～5mM二氯化镁，反应程序为92～97℃预变性5～15分钟；92～97℃变性10～20s，50～65℃退火10～30s，70～75℃延伸10～35s，进行35～55个循环；然后92～97℃预变性0.2～5分钟，20～55℃退火0.2～5分钟，60～97℃采集荧光(每秒钟升温0.02℃，每摄氏度收集25次荧光信号)，每秒采集荧光10～30次，最后40℃保存。考虑到实验过程中可能存在加样或人为因素导致的差异，故选择重复测定3次，并设置浓度梯度的样本和空白对照。

表2、不同位点突变的Tm值范围

突变名称	突变的Tm值范围
		C228T	76-78℃
C228A	76-78℃
		CC242-243TT	76-78℃
C250T	76-78℃

荧光定量结束后根据CT值和熔解曲线进行结果判定，具体方法如下：

1、运行Abs Quant/2nd Derivative Max程序来判断扩增曲线有无，如有扩增曲线，计算Ct值(Cp值)。

2、运行Tm Calling程序来查看熔解曲线并计算Tm值，如果熔解曲线有2个或者2个以上的峰，以最高峰对应的Tm为准。

3、运行阳性质控品(STD)，阳性质控有扩增曲线且Ct值<40，每个位点熔解曲线峰的Tm值在其参考范围内。

4、运行Control，如果有扩增曲线，组织样本Ct值<32或血浆样本Ct值<39，且熔解峰型(Tm值)在参考范围内，则样本合格可继续分析；如无扩增曲线，或组织样本Ct值≥32或血浆样本Ct值≥39，或熔解峰型(Tm值)不在参考范围内说明样品DNA降解严重，不适合试验需要。

5、运行无模板对照(NTC)，应无扩增曲线；或有扩增曲线，但是Ct≥45；或是每个位点熔解峰Tm值不在参考范围内。

6、符合上述条件，运行待检样本，首先判读扩增曲线有无，如无扩增曲线，可直接判读为阴性。如有扩增曲线，但是每个位点的Ct值大于或等于45，判断为阴性；如果有扩增曲线且Ct值小于45，且熔解峰型Tm值在参考范围内，判断为TERT基因启动子突变；如果熔解峰型Tm值不在参考范围内判断为阴性。

不符合上述第3，5项要求，重做本次实验；不符合第4项要求，重新从样本中提取DNA，再次检测。

对反应体系的优化结果显示，如表3所示的反应体系效果最佳。

表3、最优反应体系

原材料	体系(反应最终体系浓度)
		10×PCR buffer	1×
	2.5mM
		dNTP	250μM
引物(上下游)	250nM
		Block	500nM
EVE-GREEN	1×
		DNA聚合酶	1U
DNA模板	2-20ng
		总体系	20μL

最佳反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸25s，50个循环；95℃变性1min，40℃退火1min，65-95℃解链，(每秒钟升温0.02℃，每摄氏度收集25次荧光信号)，最后40℃保存。

实施例2

利用优化的检测体系和反应程序分析TERT基因启动子4个突变位点的最低检测限度。

最低检测限度研究主要包括以下两方面：1)突变比例最低检测限的研究：在DNA浓度一定的条件下能检出的最低突变DNA的比例。2)DNA浓度的最低检测限的研究：在突变比例一定的情况下能检出的最低DNA浓度。

1)突变比例最低检测限的研究

首先对TERT启动子突变阳性质控品以及Control质控品进行准确稀释，统一稀释到10³拷贝数，稀释液为10ng/μl的野生型DNA。在将阳性质控品与10ng/ul的阴性基因组按照体积比为0:100、0.01:99.99、0.5:99.5、1:99和5:95进行混合，得突变率分别为0％、0.01％、0.5％、1％和5％，然后按照实施例1的最优体系和反应程序分析最低检测限度，结果如表4所示。考虑到实验过程中可能存在加样或个人因素导致的差异，故选择重复测定3次，每次将混合样本与0％的进行对比分析，检测其灵敏度，根据结果中的平局值分析对应的灵敏度区间。根据最低检测限度实验结果，所有位点空白样本都没有发生扩增，实验可信。

表4、突变比例最低检测限研究结果

由表4可知，TERT基因启动子4个突变位点突变率最低检测限度为0.01％。

2)DNA浓度最低检测限研究

首先对突变阳性质控品以及Control质控品进行准确稀释，统一稀释到10³拷贝数，然后根据10:90(前为突变DNA，后为野生DNA)进行稀释，然后对背景DNA浓度进行调节，寻找一定突变比例(10％)DNA浓度的最低检测限，结果如表5所示。考虑到实验过程中可能存在加样或个人因素导致的差异，故选择重复测定3次，每次将其他梯度样本与0％的进行对比分析，检测其灵敏度，根据最终得的平局值分析对应的灵敏度区间。据最低检测限度实验结果，所有位点空白样本都没有发生扩增，实验可信。本实验检测样本时，最低检测限度必须是每个位点都必须达到，所以在选择设置最低检测限度时应该以4个位点中全部适用的结果。

表5、最低检测限度结果

由表5可知，TERT基因启动子4个突变位点的最低DNA背景浓度为0.1ng/μl。

3)最低拷贝数研究

首先对突变阳性质控品进行准确稀释，稀释液为10ng/μl的野生型DNA。将阳性质控品梯度稀释至10拷贝～1拷贝，寻找体系的最低检测拷贝数，结果如表6所示。

表6、最低检测拷贝数研究结果

最低检测拷贝数研究结果表明其最低检测限度可达到2-5拷贝数。

体液最低检测限度，检测结果与组织参考品检测结果一致，具体数据未展示。

实施例3

采集10份结膀胱癌患者组织样本及所配对的尿液样本，样本采集后，立即放入-80度冰箱中保存。组织样本中的DNA与尿液中游离的DNA(cf-DNA)，均采用Qiagen试剂盒进行抽提，并进行琼脂糖凝胶电泳和浓度测定。

然后使用实施例1的方法分别检测10例用组织样本和尿液样本中的突变位点，同时对组织样本进行测序，其结果如表7所示。

表7、采用本发明的方法检测结直肠癌患者结果

注：“-”代表该样本在该位点检测结果未有扩增曲线或测序结果为阴性

结果显示，使用本发明的方法检测尿液样本与测序方法检测尿液样本的突变符合率在90％。用本发明的方法检测组织样本与测序方法检测组织样本的符合率为80％。

以上实施例对于体液的研究仅选用尿液样本进行研究。基于检测膀胱癌样本检测的可行性对于唾液，血液等体液未进行研究。但对于应用本发明技术方案检测唾液，血液等突变含量低的体液的TERT基因启动子突变检测研究亦属于本发明范畴。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.检测TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有针对TERT基因启动子突变位点的LNA锁核酸修饰的特异探针和检测TERT基因突变的引物；

所述锁核酸修饰的特异探针的核苷酸序列为CCT+CCCG+GGT+C+CCCG或CC+CC+CTC+CG+GGCCC，其中“+”后的C或G表示锁核酸修饰碱基；

所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1与SEQ ID NO.5、SEQ ID NO. 2与SEQ IDNO.5、SEQ ID NO. 3与SEQ ID NO.5和SEQ ID NO. 4与SEQ ID NO.5所示。

2.根据权利要求1所述检测TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括PCR缓冲液、dNTPs、Eva Green和二氯化镁。

3.根据权利要求2所述检测TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中各组分的终浓度如下：1×PCR buffer、2.5mM MgCl₂、dNTP 250μM、引物250nM、探针500nM、1×EVE GREEN、DNA 聚合酶1U和DNA模板2-20ng。

4.权利要求1~3任一项所述检测TERT基因启动子突变的试剂盒在非疾病诊断中检测TERT基因启动子突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a.设计检测TERT基因启动子突变的引物和针对TERT基因启动子突变位点的LNA锁核酸修饰的特异探针；所述LNA锁核酸修饰的特异探针的核苷酸序列为CCT+CCCG+GGT+C+CCCG或CC+CC+CTC+CG+GGCCC，其中“+”后的C或G表示锁核酸修饰碱基；所述检测TERT基因突变的引物如SEQ ID NO. 1与SEQ ID NO.5、SEQ ID NO. 2与SEQ ID NO.5、SEQ ID NO. 3与SEQ IDNO.5和SEQ ID NO. 4与SEQ ID NO.5所示；

b.从待测样品中提取模板DNA，然后利用步骤a得到的引物和特异探针进行荧光定量PCR扩增反应；

c.根据熔解曲线法根据溶解曲线判读Ct值，然后根据Ct值判断待测样品中TERT基因突变情况，若溶解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内，并且Ct<45，表明扩增区段发生突变。

5.根据权利要求4所述检测TERT基因启动子突变的方法，其特征在于：所述荧光定量PCR扩增反应的条件如下：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸25s，50个循环；95℃变性1min，40℃退火1min，65-95℃解链，每秒钟升温0.02℃，每摄氏度收集25次荧光信号，解链中每秒采集荧光20次，最后40℃保存。