CN111500727A - 用于检测kras基因和braf基因突变的引物组及其应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于检测KRAS基因和BRAF基因突变的引物组及其应用方法，该引物组，包括下述至少一个用于检测KRAS基因的引物对和用于检测BRAF基因的引物对：用于检测KRAS基因第2号外显子的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；用于检测KRAS基因第3号外显子的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；用于检测BRAF基因第15号外显子的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。使得基因检测通量提高。

Description

用于检测KRAS基因和BRAF基因突变的引物组及其应用方法
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及用于检测KRAS基因和BRAF基因突变的引物组及其应用方法。
背景技术
研究表明，西妥昔单抗(爱必妥)、帕尼单抗靶向作用于表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)的药物，吉非替尼(易瑞沙)和厄洛替尼(特罗凯)等表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIS)分子靶向药物，仅对未发生KRAS基因突变的患者有效率较高，而对已发生KRAS基因突变的患者则几乎没有反应。而《NCCN结直肠癌临床实践指南》指出，在决定是否用抗EGFR单克隆抗体(西妥昔单抗和帕尼单抗)治疗前，应先检测肿瘤组织基因突变，对KRAS野生型患者增加BRAF基因突变检测。由于BRAF是KRAS下游的信号传导分子，若BRAF突变则抗EGFR治疗对KRAS野生型患者无效，而对KRAS和BRAF均为野生型的患者效果最好。因此，在进行结直肠癌、肺癌的靶向治疗前进行BRAF基因突变的检测对于判别治疗药物的敏感性有一定的指导意义。
目前，可针对KRAS基因的第2号外显子(包含第12、13位密码子)、3号外显子(包含第61号密码子)和BRAF基因的15号外显子(包含第600位密码子)分别设计聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)检测试验，以进行基因突变情况的检测。
但是，由于每一个PCR反应只针对KRAS基因或者BRAF基因的一个外显子，故基因突变的检测通量低。
发明内容
本发明实施例提供了用于检测KRAS基因和BRAF基因突变的引物组及其应用方法，能够提高基因突变的检测通量。
为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
多重PCR是在常规PCR基础上发展的一种新型扩增技术，可在一个反应体系中加入两对及以上的引物，同时扩增多个核酸片段。多重PCR在微生物、遗传病、肿瘤药物基因组学有着重要的应用。基于此，针对KRAS基因的第2号外显子(包含第12、13位密码子)、3号外显子(包含第61号密码子)和BRAF基因的15号外显子(包含第600位密码子)来设计特异性扩增的上下游引物。
第一方面，本发明提供了用于检测KRAS基因和BRAF基因突变的引物组，包括：包括下述至少一个用于检测KRAS基因的引物对和用于检测BRAF基因的引物对：
用于检测KRAS基因第2号外显子的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
用于检测KRAS基因第3号外显子的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
用于检测BRAF基因第15号外显子的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
通过上述至少一个引物对组成的引物组，可以相对最大程度提高KRAS基因的第2、3号外显子和BRAF基因的第15号外显子突变的检测通量。
具体地，使用上述引物组进行多重PCR扩增反应时，KRAS基因的第2、3号外显子和BRAF基因的第15号外显子同时在一个扩增体系中进行扩增，即同时扩增包含常见4个突变密码子的基因产物。
具体地，当利用上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2来扩增KRAS基因的第2号外显子时，相应扩增产物的片段长度为297bp；当利用上游引物SEQ ID NO.3和下游引物SEQ ID NO.4来扩增KRAS基因的第3号外显子时，相应扩增产物的片段长度为490bp；当利用上游引物SEQ ID NO.5和下游引物SEQ ID NO.6来扩增BRAF基因的第15号外显子时，相应扩增产物的片段长度为336bp。
如此，利用上述引物组进行多重PCR扩增后，可产生不同长度的DNA片段，以便于后续可电泳分辨不同长度的片段。进而可对不同片段的DNA进行切胶回收，并进行序列的测定。
本发明还提供了试剂盒，该试剂盒包括SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6中所示的至少一个引物对。
第二方面，基于上述内容，本发明提供了一种第一方面所述的用于检测KRAS基因和BRAF基因突变的引物组的应用方法，包括：
设计权利要求1所述的引物组；
从待测样本中提取DNA作为扩增模板；
配制包含所述引物组和所述扩增模板的多重聚合酶链式反应PCR反应体系；
对所述多重PCR反应体系进行多重PCR扩增反应，得到PCR产物；
根据所述PCR产物，确定所述待测样本的KRAS基因的第2、3号外显子和BRAF基因的第15号外显子的基因突变情况。
在本发明一个实施例中，所述根据所述PCR产物，确定所述待测样本的KRAS基因的第2、3号外显子和BRAF基因的第15号外显子的基因突变情况，包括：
电泳检测所述PCR产物，获得所述PCR产物的扩增片段大小；
当所述PCR产物的扩增片段大小正确时，对所述PCR产物进行序列测定，获得所述待测样本的KRAS基因的第2、3号外显子和BRAF基因的第15号外显子的基因突变情况。
具体地，由于利用上述引物组进行多重PCR扩增后，可产生不同长度的DNA片段，因此，基于PCR产物的扩增片段大小，即PCR产物的片段长度，确定是否扩增出的PCR产物是否为所需的DNA片段，当扩增出的PCR产物的长度正确时，则可对PCR产物进行测序。
具体地，可用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳分辨不同长度的DNA片段。
需要说明的是，上述应用方法为非诊断目的的方法。
在本发明一个实施例中，所述多重PCR反应体系还包括：DNA聚合酶、所述DNA聚合酶对应的PCR缓冲液、4种脱氧核糖核苷三磷酸dNTP的混合物和超纯水。
具体地，DNA聚合酶的用量为0.5-5U，以在保证脱氧核苷酸能够加到扩增模板上的同时，避免DNA聚合酶过量造成浪费。
具体地，每种dNTP的终浓度为50-500μM，所述引物组中每条引物的终浓度为20-300nM。
针对DNA聚合酶的用量来说，0.5-5U是指在0.5U到5U范围内的任一用量值，比如，0.5U、1U、1.5U、2U、2.5U、3U、3.5U、4U、4.5U以及5U。
针对每种dNTP的终浓度来说，50-500μM是指50μM到500μM范围内的任一浓度，比如，50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM以及500μM。
针对每条引物的终浓度来说，20-300nM是指20nM到300nM范围内的任一浓度，比如，20nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM以及300nM。
具体地，所述DNA聚合酶，包括：Taq聚合酶、KOD FX、Phusion或Platinum聚合酶。PCR缓冲液即为与所选的DNA聚合酶相对应的浓缩缓冲液。其中，PCR缓冲液的浓缩程度可选用2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×或10×。
在本发明一实施例中，所述PCR反应体系的反应条件如表1：
表1
Figure BDA0002477177770000051
表1中还示出了PCR产物保存在2～8℃条件下。
针对PCR反应条件中预变性的温度来说，92-95℃是指92℃到95℃范围内的任一温度，比如，92℃、93℃、94℃以及95℃。
针对PCR反应条件中预变性的时间来说，1～8min是指1min到8min内的任一时间，比如，1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min以及8min。
针对PCR反应条件中变性反应的温度来说，92-98℃是指92℃到98℃范围内的任一温度，比如，92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97以及98℃。
针对PCR反应条件中变性的时间来说，5～20s是指5s到20s范围内的任一时间，比如，5s、8s、10s、14s、17s以及20s。
针对PCR反应条件中退火反应的温度来说，52～68℃是指52℃到68℃范围内的任一温度，比如，52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃以及68℃。
针对PCR反应条件中退火反应的时间来说，10～60s是指10s到60s范围内的任一时间，比如，10s、15s、20s、25s、30s、32s、38s、40s、45s、50s、53s、56s以及60s。
针对PCR反应条件中延伸反应的温度来说，68～72℃是指68℃到72℃范围内的任一温度，比如，68℃、69℃、70℃、71℃以及72℃。
针对PCR反应条件中延伸反应的时间来说，0.2～5min是指0.2min到5min内的任一时间，比如，0.2min、0.5min、1min、1.5min、2min、2.5min、3min、3.5min、4min、4.5min以及5min。
针对PCR反应条件中终延伸反应的温度来说，65～74℃指65℃到74℃范围内的任一温度，比如，65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃以及74℃。
针对PCR反应条件中终延伸反应的时间来说，0～30min是指0min到30min范围内的任一时间，比如，0min、5min、10min、15min、20min、25min以及30min。
具体地，从待测样本中提取DNA的方式，包括：手工提取或试剂盒提取，再对提取DNA进行提取处理，得到DNA。
具体地，待测样本为含有人类DNA的血液、细胞、组织或口腔拭子的样本。
具体地，上述引物组或任一引物对，可在制备用于检测KRAS基因的第2、3号外显子上12、13、61位密码子和BRAF基因的第15号外显子上的第600位密码子基因突变的试剂或试剂盒中的应用。
同现有技术相比，本发明至少可以具有以下有益效果：
(1)提高检测通量：普通PCR每个反应只针对一个外显子，而多重PCR可以同时检测2个基因的3个外显子，通过一次反应可以对KRAS基因的第2、3号外显子上12、13、61位密码子和BRAF基因的第15号外显子上的第600位密码子及其它基因突变进行检测。如此，可以同时检测90多例样本，不仅提高了检测效率，也很大程度的节约了成本费用。
(2)降低成本：本发明可以将PCR反应体系由3个体系/程序缩减至1个体系/程序，故减少了DNA聚合酶、dNTP等试剂和耗材的使用量，可大幅度降低检测成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一实施例提供的琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图2是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对KRAS基因第2号外显子上的12、13号密码子处及其上下游的核苷酸碱基序列；
图3是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对KRAS基因第3号外显子上的61号密码子处及其上下游的核苷酸碱基序列；
图4是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对BRAF基因第15号外显子上的第600位密码子及其上下游的核苷酸碱基序列。
具体实施方式
非特殊说明，本发明实施所采用的试剂均为市售商品，本发明实施所采用的数据库均为公开的在线数据库。以下实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
设计并合成引物组
步骤1.1：基于KRAS基因的第2、3号外显子和BRAF基因的第15号外显子，设计特异性扩增的上下游引物。
对于设计引物，采用Primer Quest和Primer Premier 5.0对引物进行设计及二聚体、茎环错配分析，在包含突变位点的两端设计引物，4对引物的退火温度基本保持一致。
本实施例所提供的引物组覆盖了KRAS基因的第2、3号外显子上12、13、61位密码子和BRAF基因的第15号外显子上的第600位密码子及外显子内其它基因突变区域。由于小的序列变化会导致引物扩增效率显著降低、特异性变差，故分别针对不同位点/外显子分别设计多重PCR引物组，并在经过预实验筛选后，综合产物片段长度和位点/外显子包含情况，选取了如下述表2所示的扩增效果最佳的引物组。
表2
Figure BDA0002477177770000081
步骤1.2：合成步骤1.1中设计好的引物组。
实施例2
从待测样本中提取DNA作为扩增模板
步骤2.1：待测样本为：肿瘤患者的新鲜外周血分离的血清、血浆样本或肿瘤组织样本、用口腔拭子从人体收集口腔脱落细胞或从人体采集的新鲜外周血。
步骤2.2：具体地，采用凯杰QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(55114)，或，采用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)，从待测样本中提取肿瘤游离DNA(ctDNA)，或，肿瘤DNA，并采用NP80-touch(德国IMPLEN)测定DNA的浓度及纯度，保存DNA。
实施例3
配制PCR反应体系
步骤3.1：以步骤2.2中所得的DNA为扩增模板，并采用步骤1.2中合成的引物组，配制多重PCR反应体系。
本实施例采用东洋纺(TOYOBO)公司KOD FX酶系(货号：KFX-101)中DNA聚合酶及缓冲液为基本原料，在酶系说明书中扩增体系的基础上，通过调整引物浓度、dNTP浓度、缓冲液浓度、酶用量，来配制多重PCR扩增体系，这一反应体系的具体组成如下述表3所示。
可以理解的是，反应体系等比例放大/缩小均在本发明实施例的保护范围内；更换其他DNA聚合酶系，经过适当比例调整也可以达到扩增目的。
表3
试剂成分 体积
2×PCR buffer for KODFX 30μl
2mM dNTP 6μl
Primer Mix(每种引物1.67μM) 5μl
KOD FX聚合酶(1U/μl) 3.5μl
扩增模板 1μl
超纯水 4.5μl
步骤3.2：按照下述表4所示的多重PCR反应条件，设置PCR仪器的程序，并对步骤3.1中配制的多重PCR反应体系，进行多重PCR扩增反应，得到PCR产物。
表4
Figure BDA0002477177770000091
可以理解的是，本实施例得到的PCR产物在4℃条件下保存待用。
实施例4
电泳检测
步骤4.1：琼脂糖凝胶电泳检测步骤3.2中得到的PCR产物，获得PCR产物片段的大小。
检测结果如图1所示，图1中所示出的K1711、K1712、B1711、B1712、759、760、PSF和“空”字样的标识，是用于区分不同的样本的PCR产物的电泳结果的标识，图1的最左侧列展示了用于表征长度的标尺条，图1的最右侧列(即，“空”字样标识)展示了空白对照组的PCR产物的电泳结果，中间各列展示了不同待测样本的PCR产物的电泳结果。
根据图1中各个PCR产物亮带所在位置与左侧标尺条的对比，可以识别出各个PCR产物亮带分别对应的是哪一外显子的扩增产物。比如，自下向上的3条亮带，通常是分别对应于KRAS基因2号外显子、BRAF基因15号外显子、KRAS基因3号外显子的PCR扩增产物。
请参考图1，根据空白组的电泳结果可知，环境因素对待测样本的电泳检测结果无不良影响。根据各个样本的PCR产物的电泳结果可知，存在的3个亮带分别对应于KRAS基因2号外显子、BRAF基因15号外显子、KRAS基因3号外显子的PCR扩增产物，亮带数量与理论保持一致；3个亮带清晰且间隔明显，不同亮带间无重叠、无拖影等，亮带效果良好。如此，可以说明利用步骤1.1中设计的PCR扩增引物组进行PCR扩增时，仅生成了预期的目标产物，而未生成其他无关产物，引物组设计合理。
实施例5
序列测定
步骤5.1：在确定步骤4.1获得的PCR产物片段的大小正确后，将步骤3.3中得到的PCR产物送至测序公司进行序列测定，得到.ab1格式的测序结果。
步骤5.2：通过Chromas序列分析软件分析步骤5.1中得到的测序结果，获得KRAS基因的第2、3号外显子和BRAF基因的第15号外显子的基因突变情况。
部分测序结果如图2至图4所示。
请参考图2，图2示出了KRAS基因第2号外显子上的12、13号密码子处及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图2中的框线部分，可知该样本在第12、13号密码子处未发生基因突变。
请参考图3，图3示出了KRAS基因第3号外显子上的61号密码子处及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图3中的框线部分，可知该样本在第61号密码子处未发生基因突变。
请参考图4，图4示出了BRAF基因第15号外显子上的第600位密码子及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考4图中的框线部分，可知该样本在第1799位的T碱基突变成A。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京和合医学诊断技术股份有限公司
<120> 用于检测KRAS基因和BRAF基因的引物组及其应用方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
ccggtactgg tggagtattt gatagtgtat taacc 35
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
ccgtactcat gaaaatggtc agagaaacct t 31
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
ggtcccccaa gaacttcatt tataaaacag ggat 34
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
gtccgtcatc tttggagcag gaacaatgtc t 31
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
cggagacata cttattgact ctaagaggaa agatgaag 38
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
gcagcatctc agggccaaaa atttaatcag tgga 34

Claims (6)

1.用于检测KRAS基因和BRAF基因突变的引物组，其特征在于，包括下述至少一个用于检测KRAS基因的引物对和用于检测BRAF基因的引物对：
用于检测KRAS基因第2号外显子的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
用于检测KRAS基因第3号外显子的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
用于检测BRAF基因第15号外显子的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.一种权利要求1所述的用于检测KRAS基因和BRAF基因突变的引物组的应用方法，其特征在于，包括：
设计权利要求1所述的引物组；
从待测样本中提取DNA作为扩增模板；
配制包含所述引物组和所述扩增模板的多重聚合酶链式反应PCR反应体系；
对所述多重PCR反应体系进行多重PCR扩增反应，得到PCR产物；
根据所述PCR产物，确定所述待测样本的KRAS基因的第2、3号外显子和BRAF基因的第15号外显子的基因突变情况。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述根据所述PCR产物，确定所述待测样本的KRAS基因的第2、3号外显子和BRAF基因的第15号外显子的基因突变情况，包括：
电泳检测所述PCR产物，获得所述PCR产物的扩增片段大小；
当所述PCR产物的扩增片段大小正确时，对所述PCR产物进行序列测定，获得所述待测样本的KRAS基因的第2、3号外显子和BRAF基因的第15号外显子的基因突变情况。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述多重PCR反应体系还包括：DNA聚合酶、所述DNA聚合酶对应的PCR缓冲液、4种脱氧核糖核苷三磷酸dNTP的混合物和超纯水；
其中，DNA聚合酶的用量为0.5-5U，每种dNTP的终浓度为50-500μM，所述引物组中每条引物的终浓度为20-300nM。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述DNA聚合酶，包括：Taq聚合酶、KOD FX、Phusion或Platinum聚合酶。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述PCR反应体系的反应条件包括：92-95℃，预变性1～8min；92-98℃，变性5～20s；52～68℃，退火10～60s；68～72℃，延伸0.2～5min将变性、退火、延伸循环25～40次，65～74℃，终延伸0～30min。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101838683A (zh) * 2008-12-12 2010-09-22 深圳华大基因科技有限公司 一种kras基因和/或braf基因的核苷酸突变位点的检测方法
WO2011130265A2 (en) * 2010-04-12 2011-10-20 Response Genetics, Inc. Kras primers and probes
CN105331611A (zh) * 2015-11-04 2016-02-17 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 一种基于下一代测序技术检测egfr/kras/braf基因突变位点的多重pcr引物和方法及应用
CN105567854A (zh) * 2016-03-01 2016-05-11 济南银丰医学检验有限公司 一种检测人egfr、kras、braf基因突变的引物组合及其试剂盒
WO2018011351A2 (en) * 2016-07-14 2018-01-18 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Kras inhibitor for use in treating cancer
CN108220444A (zh) * 2018-02-28 2018-06-29 无锡禾盛医疗器械有限公司 一种kras基因突变检测的引物探针组合及其应用
CN110938693A (zh) * 2019-12-04 2020-03-31 阅尔基因技术（苏州）有限公司 用于检测braf基因突变的引物组、试剂盒及方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101838683A (zh) * 2008-12-12 2010-09-22 深圳华大基因科技有限公司 一种kras基因和/或braf基因的核苷酸突变位点的检测方法
WO2011130265A2 (en) * 2010-04-12 2011-10-20 Response Genetics, Inc. Kras primers and probes
CN105331611A (zh) * 2015-11-04 2016-02-17 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 一种基于下一代测序技术检测egfr/kras/braf基因突变位点的多重pcr引物和方法及应用
CN106801104A (zh) * 2015-11-04 2017-06-06 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 多重pcr引物、试剂盒及用途
CN106868139A (zh) * 2015-11-04 2017-06-20 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 Pcr引物、试剂盒及用途
CN105567854A (zh) * 2016-03-01 2016-05-11 济南银丰医学检验有限公司 一种检测人egfr、kras、braf基因突变的引物组合及其试剂盒
WO2018011351A2 (en) * 2016-07-14 2018-01-18 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Kras inhibitor for use in treating cancer
CN108220444A (zh) * 2018-02-28 2018-06-29 无锡禾盛医疗器械有限公司 一种kras基因突变检测的引物探针组合及其应用
CN110938693A (zh) * 2019-12-04 2020-03-31 阅尔基因技术（苏州）有限公司 用于检测braf基因突变的引物组、试剂盒及方法

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