CN115851973A - 实时荧光PCR快速检测人类InDel遗传多态性的方法、试剂盒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种实时荧光PCR快速检测人类InDel遗传多态性的方法、试剂盒和应用，涉及生物技术领域。本发明提供的探针组和引物组特异性强，灵敏度高，能够实现对人类30对常染色体InDel位点基因座和1对性别鉴定基因座的检测，针对每个InDel位点基因座设计两种荧光基因探针，可用两种荧光染料分别标记插入型(Ins型)和缺失型(Del型)探针，在单管PCR反应中同时检测两个InDel位点分型。本发明利用上述探针组和引物组建立了一种人类InDel遗传多态性的检测方法，可实现快速、准确、廉价的检测，能够用于人类个体识别、亲权鉴定以及降解检材识别，特别适合于现场和实验室快速检测。

Description

实时荧光PCR快速检测人类InDel遗传多态性的方法、试剂盒 和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种实时荧光PCR快速检测人类InDel遗传多态性的方法、试剂盒和应用。

背景技术

插入-缺失多态性(Insertion-Deletion，InDel)作为新型的遗传标记，其在法医遗传学领域得到了广泛关注。InDel的优点为：(1)低突变率，比第二代遗传标记短串联重复序列(short tandem repeat，STR)和第三代遗传标记单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)更稳定；(2) 扩增目标片段短，适合降解检材的检验分析；(3)基因频率存在地域差异性，因此该遗传标记不仅可以用于个体识别，还可以作为祖先相关信息位点以区分人群；(4)易于分型，可以用常规的毛细管电泳分型或者高通量的自动化分型方法，且无stutter产物。目前，InDel的分型检测方法主要是 PCR-毛细管电泳技术和新一代测序方法(next generation sequencing，NGS)。 PCR-毛细管电泳方法通常需要两个步骤来完成基因分型：第一步为PCR，第二步为产物的凝胶电泳及对扩增子进行数据分析。但该方法需要打开 PCR产物后放入仪器，存在很大的污染风险。NGS方法准确、灵敏度高，但其操作较复杂、数据分析难度大、检测成本较高、耗时长，不易实现快速检测。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供用于检测人类InDel遗传多态性的探针组。

本发明的第二目的在于提供用于检测人类InDel遗传多态性的引物组。

本发明的第三目的在于提供上述探针组或引物组在制备用于检测人类 InDel遗传多态性试剂盒中的应用，以解决上述问题中的至少一种。

本发明的第四目的在于提供一种用于检测人类InDel遗传多态性试剂盒。

本发明的第五目的在于提供上述试剂盒的应用。

本发明的第六目的在于提供一种非诊断目的的检测人类InDel遗传多态性的方法。

第一方面，本发明提供了用于检测人类InDel遗传多态性的探针组，所述探针组具有如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.62所示的序列。

作为进一步技术方案，所述探针组的3’末端修饰有淬灭荧光基团；

优选地，所述淬灭荧光基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、DABCYL 或TAMRA。

作为进一步技术方案，所述探针组的5’端修饰有荧光基团；

优选地，所述荧光基团包括FAM、HEX、CY5、ROX、Texas Red-X、 CY3、JOE或TET。

作为进一步技术方案，探针的类型包括TaqMan探针、复合探针、双链部分互补探针、双杂交探针、分子信标探针或蝎型探针。

第二方面，本发明提供了用于检测人类InDel遗传多态性的引物组，所述引物组的序列如SEQ ID NO.63～SEQ ID NO.124所示。

第三方面，本发明提供了上述探针组或者引物组在制备用于检测人类 InDel遗传多态性试剂盒中的应用。

第四方面，本发明提供了一种用于检测人类InDel遗传多态性的试剂盒，包括所述的探针组和引物组。

作为进一步技术方案，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs 和无菌水；

优选地，所述引物组的上游引物和下游引物的摩尔比为1：1～1：5，优选为1：1。

第五方面，本发明提供了上述试剂盒在如下a)-c)中的任一项中的应用：

a)个体识别；

b)亲权鉴定；

c)降解检材识别。

第六方面，本发明提供了一种非诊断目的的检测人类InDel遗传多态性的方法，包括：以所述的探针组和引物组，采用实时荧光PCR的方法对待测样品进行检测；

优选地，所述待测样品包括人类血液、口腔脱落细胞、组织或骨骼。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的探针组和引物组特异性强，灵敏度高，能够实现对人类 30对常染色体InDel位点基因座(rs142281120、rs6143946、rs139530962、 rs59027185、rs10555133、rs10535391、rs3061475、rs56059565、rs10544053、rs151142037、rs36119043、rs34822234、rs34529638、rs10562732、rs10656522、 rs10541877、rs10667259、rs35776500、rs33928328、rs142380122、rs6481、 rs2307561、rs35464887、rs67365630、rs34564973、rs56053760、rs35332265、 rs3837647、rs2307963、rs34843628)和1对性别鉴定基因座的检测，针对每个InDel位点基因座设计两种荧光基因探针，可用两种荧光染料分别标记插入型(Ins型)和缺失型(Del型)探针，在单管PCR反应中同时检测两个InDel位点分型。

本发明利用上述探针组和引物组建立了一种实时荧光PCR快速检测人类InDel遗传多态性的方法，可实现快速、准确、廉价的检测，能够用于人类个体识别、亲权鉴定以及降解检材识别，特别适合于现场和实验室快速检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的实时荧光PCR检测经测序确认的InDel 三种基因型；

图2为本发明实施例2提供的实时荧光PCR检测样本InDel灵敏度的结果；

图3为本发明实施例3提供的实时荧光PCR检测InDel特异性的结果；

图4为本发明实施例4提供的实时荧光PCR检测InDel的干扰实验的结果；

图5为本发明实施例5提供的实时荧光PCR检测30个InDel位点在中国中部汉族群体遗传学研究的结果。

具体实施方式

下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

第一方面，本发明提供了用于检测人类InDel遗传多态性的探针组，所述探针组具有如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.62所示的序列，如表1。

表1

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该探针组包括识别人类InDel插入型(Ins型)基因的第一探针组和识别人类InDel缺失型(Del型)基因的第二探针组。第一核探针组的核苷酸序列与InDel的Ins型基因片段完全匹配，与Del型基因片段在变异位置处发生错配，所述第二核探针组的核苷酸序列与Del型靶基因片段完全匹配，与Ins型靶基因片段在变异位置处发生错配。

在一些优选的实施方式中，所述探针组的3’末端修饰有淬灭荧光基团，增加探针的Tm值、阻断探针在扩增过程中延伸。

优选地，所述淬灭荧光基团包括但不限于BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、 DABCYL或TAMRA，或者采用本领域技术人员所熟知的其他淬灭荧光基团。

在一些优选的实施方式中，所述探针组的5’端修饰有荧光基团；

优选地，所述荧光基团包括但不限于FAM、HEX、CY5、ROX、Texas Red-X、CY3、JOE或TET，或者采用本领域技术人员所熟知的其他荧光基团。

本发明中对于探针的类型不作具体限制，例如可以为TaqMan探针、复合探针、双链部分互补探针、双杂交探针、分子信标探针或蝎型探针。

第二方面，本发明提供了用于检测人类InDel遗传多态性的引物组，所述引物组的序列如SEQ ID NO.63～SEQ ID NO.124所示，如表1。

本发明提供的探针组和引物组特异性强，灵敏度高，能够实现对人类 30对常染色体InDel位点基因座(rs142281120、rs6143946、rs139530962、 rs59027185、rs10555133、rs10535391、rs3061475、rs56059565、rs10544053、 rs151142037、rs36119043、rs34822234、rs34529638、rs10562732、rs10656522、 rs10541877、rs10667259、rs35776500、rs33928328、rs142380122、rs6481、 rs2307561、rs35464887、rs67365630、rs34564973、rs56053760、rs35332265、 rs3837647、rs2307963、rs34843628)和1对性别鉴定基因座的检测，针对每个InDel位点基因座设计两种荧光基因探针，可用两种荧光染料分别标记插入型(Ins型)和缺失型(Del型)探针，在单管PCR反应中同时检测两个InDel位点分型。

第三方面，本发明提供了上述探针组或者引物组在制备用于检测人类 InDel遗传多态性试剂盒中的应用。

第四方面，本发明提供了一种用于检测人类InDel遗传多态性试剂盒，包括所述的探针组和引物组。

该试剂盒由于包括上述探针组和引物组，因此具有该探针组和引物组的全部有益效果。

在一些优选的实施方式中，所述试剂盒可以采用实时荧光PCR的方法实现对人类InDel遗传多态性的检测。

在一些优选的实施方式中，所述试剂盒还包括扩增试剂和/或扩增耗材。

引物、探针与其他扩增试剂以单独包装的形式提供，或者以混合的单一试剂的形式提供；

在一些优选的实施方式中，扩增试剂包括DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、无菌水。当扩增试剂为多种时，以单独包装的方式提供，或者扩增试剂中的至少两种以混合的单一试剂的形式提供，例如引物Mix、探针Mix、缓冲液和PCR酶。

在一些优选的实施方式中，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、缓冲液、 dNTPs和无菌水；

优选地，所述引物组的上游引物和下游引物的摩尔比为1：1～1：5，优选为1：1。

第五方面，本发明提供了上述试剂盒在如下a)-c)中的任一项中的应用：

a)个体识别；

b)亲权鉴定；

c)降解检材识别。

本发明提供的试剂盒能够在人类个体识别、亲权鉴定以及降解检材识别的快速、现场应用。

第五方面，本发明提供了一种非诊断目的的检测人类InDel遗传多态性的方法，包括：以所述的探针组和引物组，采用实时荧光PCR的方法对待测样品进行检测。

其中，待测样品例如可以为，但不限于人类血液、口腔脱落细胞、组织或骨骼。优选地，待测样本浓度大于每微升50皮克，降解系数小于20。

本发明利用上述探针组和引物组建立了一种人类InDel遗传多态性的检测方法，针对每个位点设计两种荧光基因探针，用两种荧光染料分别标记Ins型和Del型探针，在单管PCR反应中同时检测两个位点的基因型。经样品测试，发现探针均可准确区分出Ins型和Del型。

本发明建立的检测体系与猪，牛，马，羊，猫，狗，老鼠和兔子无交叉，特异性强；最低检测限为每微升50皮克，灵敏度高；从样品提取到出结果，整个实验过程只需约2小时，操作简单，更易推广本方法的使用。

因此，本发明提供的方法可实现快速、准确、廉价的检测，能够用于人类个体识别、亲权鉴定以及降解检材识别，特别适合于现场和实验室快速检测。

下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

以下实施例使用的主要样本、仪器和试剂如下：

1.样本收集与DNA提取

在知情同意基础上，采集100名汉族无关个体的血液。所有样本均使用天根公司血液基因组提取试剂盒提取DNA。

2.试剂与仪器

5×AK Taq buffer(with Mg²⁺)和AK Taq Master PCR Mix(25×)购自广东菲鹏生物有限公司，引物和探针由通用生物(安微)股份有限公司合成纯化，使用ABI7500荧光定量PCR仪(ThermoFisher公司)进行分型分析。

以下实施例中，检测方法为以表1中的引物和探针，采用实时荧光PCR 的方法对待测样品进行检测，具体步骤包括：

在15个独立反应中扩增30个InDel(每个反应检测2个位点)，在另一个反应中扩增性别鉴定基因座。PCR总体积为25μL，其中DNA模板1μl， 25×AK Master PCR Mix 1μL，5×AK Buffer(含MgCl2)5μL(菲鹏生物技术有限公司)，最佳引物和探针浓度混合液3μL。在ABI7500仪器上进行以下条件下的热循环:50℃2min,95℃2min 30s；95℃30s,55℃30s，共40次循环。在PCR循环退火阶段自动读取各反应中FAM、VIC、CY5和ROX 荧光强度。

实施例1

实时荧光PCR检测经测序确认的InDel三种基因型：

为建立实时荧光PCR鉴定InDel的基因型体系，首先需要有这30个 InDel位点的已知三种基因型质控品，为此，本发明先通过测序方法筛选出这30个InDel位点的三种基因型的样本。经测序筛选，本发明筛选出来了这30个InDel位点的三种基因型样本，作为每个位点的质控品用于后期实验。例如，rs59027185三种基因型测序及实时荧光PCR检测结果见图1(图中，左侧为测序结果，右侧为相应的实时荧光PCR检测结果)。

实施例2

检测样本灵敏度：男性样本标准品9948，用定量PCR方法进行定量后，分别以500、200、100、50、25、12.5pg的模板DNA进行扩增检测，平行重复3次。结果如图2所示。

实施例3

特异性检测样本：猪，牛，马，羊，猫，狗，老鼠和兔子全血样品，根据天根公司血液基因组提取试剂盒提取DNA，将DNA稀释到1.0ng/μL，进行扩增检测，平行重复3次。结果如图3所示。

实施例4

干扰实验：扩增抑制剂常存在于不同的生物标本中。腐植酸、鞣酸和尿素是PCR的抑制剂，这可能导致InDel位点的等位基因丢失，甚至是完全假阴性结果。DNA模板中加入不同浓度的这3种抑制剂，验证该体系的稳定性。总的来说，随着抑制剂浓度的增加，位点检出百分比和扩增效率均降低。结果显示，10μg/μL尿素几乎完全抑制荧光PCR检测结果(无扩增曲线)。此外，在鞣酸小于1μM、腐殖酸小于100ng/μL和尿素小于2.5 μg/μL浓度情况下，均可获得30个InDel位点和性别鉴别基因座的全部扩增曲线(图4)，表明该体系对这些PCR抑制剂具有较强的抗干扰性能。

实施例5

30个InDel位点在中国中部汉族群体遗传学研究：我们使用该系统对 241名中国中部汉族无关健康个体进行了等位基因频率和法医学参数调查，如图5和表2所示。结果显示，除rs59027185(0.33)、rs36119043(0.324)、 rs35776500(0.33)、rs3837647(0.332)和rs34529638(0.320)外，InDel 的次要等位基因频率(MAF)均大于0.35。在中国汉族人群中，等位基因频率(AF)分布相对均衡(图5)，观测杂合度(Ho)范围为0.4070(rs56059565) ～0.568(rs3061475)，平均值为0.4937，多态性信息含量(PIC)均在0.3 以上，个体识别率(PD)为0.5730(rs3061475)～0.642(rs2307561)，非父排除率(PE)为0.1180(rs56059565)～0.2550(rs3061475)。此外，除 rs56059565(p＝0.0039)、rs3061475(p＝0.0146)和rs34564973(p＝0.0218) 外，所有标记的分布均符合哈迪-温伯格平衡定律(HWE)(p>0.05)，经 Bonferroni校正后，所有位点均处于平衡状态。因此，这30个InDel不存在连锁关系，适用于个人身份鉴定和亲缘关系检测。综合鉴别能力(CPD) 为0.9999999999921，这意味着30个InDel系统可以作为华中地区汉族人群法医学个体识别的有力工具。

表2

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实施例6

降解检材识别：为了验证该方法在降解样本中的优势，采用该体系对降解后的DNA进行分析。用Covaris超声系统将9948标准品DNA剪切成 150～250bp的片段。用降解指数(DI)描述DNA降解程度，用小常染色体(SA)和大常染色体(LA)DNA浓度的比值([SA]/[LA]比值)评估 DNA降解程度。DI>2表示样本DNA有轻度至中度降解，DI>10表示样本 DNA有高度降解，检测的所有样本的DI平均值为11(n＝11)，范围为 5.58～20.51，分别对应最低和最高的DI值。结果显示DI值与该方法获得的InDel基因分型的完整性无明显相关性，表明该方法是分析降解DNA InDel基因多态性的良好工具。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.用于检测人类InDel遗传多态性的探针组，其特征在于，所述探针组具有如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.62所示的序列。

2.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述探针组的3’末端修饰有淬灭荧光基团；

优选地，所述淬灭荧光基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、DABCYL或TAMRA。

3.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述探针组的5’端修饰有荧光基团；

优选地，所述荧光基团包括FAM、HEX、CY5、ROX、Texas Red-X、CY3、JOE或TET。

4.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，探针的类型包括TaqMan探针、复合探针、双链部分互补探针、双杂交探针、分子信标探针或蝎型探针。

5.用于检测人类InDel遗传多态性的引物组，其特征在于，所述引物组的序列如SEQ IDNO.63～SEQ ID NO.124所示。

6.权利要求1-4任一项所述的探针组或者权利要求5所述的引物组在制备用于检测人类InDel遗传多态性试剂盒中的应用。

7.一种用于检测人类InDel遗传多态性的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的探针组和权利要求5所述的引物组。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于；所述试剂盒还包括DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs和无菌水；

优选地，所述引物组的上游引物和下游引物的摩尔比为1：1～1：5，优选为1：1。

9.权利要求7或8所述的试剂盒在如下a)-c)中的任一项中的应用：

a)个体识别；

b)亲权鉴定；

c)降解检材识别。

10.一种非诊断目的的检测人类InDel遗传多态性的方法，其特征在于，包括：以权利要求1-4任一项所述的探针组和权利要求5所述的引物组，采用实时荧光PCR的方法对待测样品进行检测；

优选地，所述待测样品包括人类血液、口腔脱落细胞、组织或骨骼。

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