CN105567809A - 具有不同表达量的基因的鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于判定在等位基因之间表达量不同的基因的遗传多态性的检索方法，以及与表型相关的遗传多态性的检索方法。更具体地说，本发明涉及利用存在于核内RNA上的遗传多态性，有效地判定等位基因之间表达量不同的基因的方法。

Description

具有不同表达量的基因的鉴定方法
技术领域
本发明涉及用于判定在等位基因之间表达量不同的基因的遗传多态性检索方法以及与表型相关的遗传多态性的检索方法。
背景技术
即便是处于基因组相同位点的相同基因，当位于不同等位基因上时其基因表达量不同的现象是近年来报告的比较新的概念(非专利文献1：Knight JC. Allele-specificgene expression uncovered (等位基因-特异性基因表达无遮盖). Trends Genet. Mar;20(3): 113-6. PMID: 15049300、2004年)。
在等位基因之间显示不同表达量的基因大致分为印迹基因和非印迹基因两种。前者所谓的印迹是指在某种细胞或组织中，当从双亲各遗传一半等位基因时，任意一方受到生理性钝化(例如甲基化等)，基因的表达被抑制的现象。后者，即非印迹基因中，有时也会在等位基因之间可见不同表达量的情况。这是由于，基因内或与其邻近的等位基因之间的基因组的多态性作为调节附近基因的表达的顺式作用区域起作用，产生等位基因之间的基因表达量的差别。在后者中可见的、由于基因组DNA序列的不同所引起的每个等位基因的表达变化认为是超过世代遗传而来的性质，会影响个体间的基因表达量的差别、甚至个体的体质差别、病态及其危险率、或者对药物应答性的不同。
为了测定等位基因之间基因表达量的差别，在同一细胞内、即在相同环境条件下进行测定是最为精确的。而且在测定等位基因之间的基因表达量的差别时，重要的是能够鉴定某个RNA是来自于哪个等位基因。因此，能够区别等位基因的多态性(SNP等)必须也存在于作为基因转录产物的RNA序列上，通过对其进行测定从而能够鉴定。目前已经有数个使用该RNA上的多态性(SNP)测定等位基因之间的表达量差别的报告(非专利文献2~4：CowlesCR, Hirschhorn JN, Altshuler D, Lander ES. Detection of regulatory variationin mouse genes (在小鼠基因中调节变异的检测). Nat Genet. Nov; 32(3): 432-7.PMID: 12410233、2002年；Yan H, Yuan W, Velculescu VE, Vogelstein B, Kinzler KW.Related Allelic variation in human gene expression (在人类基因表达中相关的等位基因变异). Science. Aug 16; 297(5584): 1143. PMID: 12183620、2002年; BrayNJ, Buckland PR, Owen MJ, O’Donovan MC. Cis-acting variation in theexpression of a high proportion of genes in human brain (顺式作用变异在人脑基因的高比率表达). Hum Genet. 2003 Jul; 113(2): 149-53. Epub May 01. PMID:12728311、2003年)。
这些报告均是组合了RT-PCR法和直接测序反应或单核苷酸延伸反应的技术，即由mRNA合成cDNA，扩增后，将任意选择的多态性分别地分型，并非是能够同时测定多个基因的技术。
到目前为止，有一个使用SNP分型用微阵列广泛分析多个基因的报告(Lo HS,Wang Z, Hu Y, Yang HH, Gere S, Buetow KH, Lee MP. Allelic variation in geneexpression is common in the human genome (在人类基因组中等位基因变异在基因表达中是常见的). Genome Res. Aug; 13(8): 1855-62. PMID: 12902379、2003年)。这里，通过使用了polyT引物的普通RT法将带有PolyA的mRNA转变为cDNA，根据与通常的基因组DNA分型技术同样的实验规程，利用使用了多个特异引物的多重PCR法调制样品，使样品杂交于阵列，根据其信号比测定每个等位基因不同的cDNA (mRNA)的表达量比。但是，在带有polyA的成熟型mRNA中，仅为剪接后的外显子的序列，其长度很短、能够评价的多态性(SNP)也很少。因此，能够利用的多态性(SNP)有所局限，难以发现在每个等位基因上表达量均有差别的基因。
另一方面，遗传多态性与特定表型及基因表达(例如疾病、药物有效性的不同)的关联性也备受关注。但是，在研究特定遗传多态性与表型及基因表达的关联性时，例如在基因组上为SNP时，对于每个性状必须对多个SNP (2004年10月报告的NCBI dbSNP build 123中约1000万)进行研究，对所有SNP进行研究是很困难的。
因此，如果能够迅速且高效地选择在等位基因之间表型及基因表达不同的基因、研究如此选择的遗传多态性与表型及基因表达的关联性，则可以探讨疾病的原因或有效的治疗方法等。
发明内容
因此，本发明鉴于上述事实，其目的在于提供迅速且高效地检索能够判定在等位基因之间表达量不同的基因的遗传多态性的方法。本发明的目的还在于，利用通过该方法检索的遗传多态性，检索与表型相关的遗传多态性的方法。
本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现通过利用存在于核内RNA上的遗传多态性，可以高效地发现在等位基因之间表达量不同的基因，在该方法中，当选择能够选择性地扩增核内RNA的DNA聚合酶时，成功地鉴定了实际上能够判定在等位基因之间表达量不同的基因的遗传多态性(SNP)，进而完成了本发明。
即，本发明包括以下内容。
(1) 用于判定在等位基因之间表达量不同的基因的遗传多态性的检索方法，包括以下步骤：
(a) 通过使用了随机引物的逆转录反应，由总RNA或核内RNA合成cDNA的步骤；
(b) 使用随机引物和在等温下反应的链置换DNA聚合酶，选择性地扩增来自于较长核内RNA (一次转录产物)的cDNA的步骤；
(c) 检测扩增的cDNA中存在的遗传多态性的步骤；
(d) 根据该遗传多态性，比较来自于位于基因组DNA的遗传多态性为杂合型的基因组上各等位基因的cDNA表达量的步骤；
(e) 当来自于各等位基因的cDNA表达量显著不同时，选择比较所使用的遗传多态性的步骤。
在上述检索方法中，作为DNA聚合酶例如可以使用φ29 DNA聚合酶。
在步骤(c)和(d)中优选包括以下步骤：标记扩增的cDNA，进行使用了遗传多态性特异性探针的杂交，根据该反应比较来自于各等位基因的表达量。
在上述检索方法中，可以使用单核苷酸多态性(SNP)作为遗传多态性。
(2) 与表型相关的遗传多态性的检索方法，其包括使用通过上述检索方法检索的遗传多态性，研究遗传多态性或基因表达量与表型的关系。
在上述检索方法中，作为表型，可以举出疾病的病态和严重程度、疾病的发病危险、对药物的应答性、对食品的应答性、对化学物质的应答性以及对环境因子的应答性等。
(3) 与遗传多态性相关的表型的检索方法，其包括使用通过上述检索方法检索的遗传多态性，研究遗传多态性或基因表达量与表型的关系。
在上述检索方法中，作为表型，可以举出疾病的病态和严重程度、疾病的发病危险、对药物的应答性、对食品的应答性、对化学物质的应答性以及对环境因子的应答性等。
通过本发明提供了用于检索能够判定在等位基因之间表达量不同的基因的遗传多态性的迅速且高效的方法。由于如此检索的遗传多态性能够识别等位基因之间的表达量，因此是用于分析该基因相关表型的有效方法。而且，认为如果能够发现如此检索的遗传多态性和表型(疾病危险率或药物应答性)的关系，则可以探讨疾病的原因或有效的治疗方法等。
附图简述
图1为通过使用了φ29 DNA聚合酶的扩增获得的cDNA的电泳照片；
图2为表示淋巴细胞BL1395的cDNA和基因组的信号比的频率分布与该遗传多态性(探针组合)存在的基因组上的基因的位置关系的图；
图3为表示淋巴细胞BL2122的cDNA和基因组的信号比的频率分布与该遗传多态性(探针组合)存在的基因组上的基因的位置关系的图；
图4为在表达分析用阵列U133plus2和100K阵列(XbaI 50K)中的cDNA/基因组的信号比的比较图；
图5为显示PPARγ基因上的SNP位点的图；
图6为显示使用直接测序法确认SNP的示意图；
图7为显示30名日本人的外周血淋巴细胞的PPARG基因表达量与遗传多态性分型的关联性的图；
图8A和B为显示30名日本人的外周血淋巴细胞的PPARG基因表达量与遗传多态性分型的频率分布(A)以及单倍型M和m的等位基因的图。
实施发明的最佳方式
以下，详细地说明本发明。本申请主张了2004年12月17日申请的日本国专利申请第2004-366671号的优先权，包括上述专利申请的说明书和/或附图所记载的内容。
1. 检索能够判定等位基因之间表达量不同的基因的遗传多态性
本发明提供用于研究等位基因之间表达量不同的基因的方法。这里，所谓的“等位基因之间表达量不同的基因”是指来自于一个等位基因的基因表达量与来自于另一个等位基因的基因表达量不同的基因。来自于各等位基因的基因的表达可以作为区别特定遗传多态性的指标，但并非所有的遗传多态性可以区别等位基因之间的表达量差别。因此，本发明提供了迅速且高效地检索能够判定这种等位基因之间的表达量不同的遗传多态性。
(1) 来自于核内RNA的cDNA的合成和扩增
本方法中，由核内RNA合成cDNA。这里所谓的“核内RNA”是指由基因组DNA转录后，不经过剪接，因此不会移动至细胞质，还存在于核内的一次转录产物(初级转录本)。即，许多核内RNA含有基因组上的外显子和内含子两者，具有较长的链长(例如位于在2004年4月报告的Human Genome Build 34 (http://genome.ucsc.edu/)序列上的21804个参考序列中，平均长为85,284 bp、中位值为22,855 bp，长度超过5000 bp的占全部的约84%)。
在测定等位基因之间的表达量差别时，必须在作为基因转录产物的RNA上存在遗传多态性。由于核内RNA未受到剪接具有较长的链长，因此本发明人预期核内RNA可能含有许多能够识别等位基因之间表达量不同的基因的遗传多态性。例如在位于2004年4月报告的Human Genome Build 34 (http://genome.ucsc.edu/)序列上的21804个参考序列中，mRNA的平均长为2,757 bp、中位值为2,316 bp，而含有其内含子的基因组上的长度为平均长85,284 bp、中位值为22,855 bp，即便不考虑遗传多态性的密度，也有约40倍左右的区域能够评价。
为了由核内RNA合成cDNA，可以使用以下两种方法：从试样中仅提取出核内RNA，由该核内RNA合成cDNA的方法和从试样中提取总RNA，由总RNA合成cDNA后，仅将来自于较长核内RNA的cDNA扩增的方法。
在一个方法中，首先从试样中提取核组分。试样只要是来自于预使用本方法检索用于判定等位基因之间表达量不同的基因的遗传多态性的试样则没有特别限定，例如，可以使用来自于动物、植物、微生物(真菌、细菌等)的试样，市售的细胞株、冻存的细胞株等。试样优选来自于哺乳动物、特别是人的试样。对试样的形态也没有特别限定，例如为来自于人的试样时，可以使用血液、唾液、淋巴液、气管粘液、骨髓液、尿液、腹腔液等体液，细胞、组织等形态的试样。
核组分的提取可以使用本领域技术人员公知的方法进行。例如，可以通过匀浆器破碎细胞，利用差速离心或密度梯度离心分离核(例如参照Molecular cloning Chapter17.8 Preparation of nuclear extracts from Tissue/cultured mammalian cells (分子克隆章17.8由组织/培养哺乳动物细胞制备核的提取). CSHL Press, ISBN 0-87969-577-3)。
接着，通过使用了随机引物的逆转录反应由如上调制的核内RNA合成cDNA。通过使用随机引物，可以由试样中存在的所有序列的RNA(核内RNA)合成cDNA。
接着，使用随机引物扩增逆转录的cDNA。由于核内RNA未经过剪接，因此链长较长，利用通常在扩增中使用的DNA聚合酶不能扩增。因此，本方法中使用在等温度反应条件(等温反应)下进行链置换的DNA聚合酶。作为具有上述性质的DNA聚合酶没有局限，可以举出φ29 DNA聚合酶(Amersham Bioscience、商品名 Genomiphi)。该φ29 DNA聚合酶由于其扩增反应非常稳定，因此可以将通过逆转录反应合成的cDNA不经纯化过程直接用在使用了φ29DNA聚合酶的扩增反应中，另外，由于可以获得µg级的收量，因此不用介意由于微量样品的纯化所导致的损失，由临床检体等极微量的样品也可以扩增，因此在本方法的实施中特别优选。另外，作为具有上述性质的聚合酶，还已知Bst聚合酶，由New England BioLab供应(Lage JM, Leamon JH, Pejovic T, Hamann S, Lacey M, Dillon D, Segraves R,Vossbrinck B, Gonzalez A, Pinkel D, Albertson DG, Costa J, Lizardi PM. Wholegenome analysis of genetic alterations in small DNA sample usinghyperbranched strand displacement amplification and array-CGH (使用高支链置换扩增和阵列-CGH用少量DNA 样品进行遗传变异的全基因组分析). Genome Res. 2003Feb; 13(2): 294-307. PMID:12566408)。
这种DNA聚合酶由于在扩增DNA时会在DNA片段的末端停止反应，因此末端附近的扩增率显著降低，但当为较短DNA片段的扩增时，由于两末端间的距离很近，因此整个片段的扩增率降低，结果较长的DNA片段、即未经过剪接的核内RNA被选择性地扩增(Lage JM,Leamon JH, Pejovic T, Hamann S, Lacey M, Dillon D, Segraves R, Vossbrinck B,Gonzalez A, Pinkel D, Albertson DG, Costa J, Lizardi PM. Whole genomeanalysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranchedstrand displacement amplification and array-CGH (使用高支链置换扩增和阵列-CGH用少量DNA样品进行遗传变异的全基因组分析). Genome Res. 2003 Feb; 13(2): 294-307. PMID: 12566408; General Amplification of Chromosomal DNA by phi29 DNApolymerase (通过phi29 DNA聚合酶常规扩增染色体的DNA). Amersham Biosience)。
因此，作为用于由核内RNA合成cDNA的其他方法，可以由试样调制总RNA(含有核内RNA和mRNA)，通过使用了随机引物的逆转录反应，由多样的RNA种合成cDNA，之后使用能够选择性扩增链长较长的cDNA(即，来自于较长核内RNA的cDNA)的上述DNA聚合酶(例如φ29DNA聚合酶)进行扩增，从而选择性地合成、扩增来自于核内RNA的cDNA。来自于该核内RNA的cDNA的扩增由于可以省略仅提取核内RNA的操作，因此在本方法的实施中优选。总RNA的提取可以通过本领域技术人员公知的方法进行，例如可以使用胍/铯法、AGPC (酸-异硫氰酸胍-苯酚-氯仿)法等。
(2) 遗传多态性和等位基因表达量
接着，比较来自于各等位基因的基因(扩增cDNA)的表达量。这里，表达量的比较在杂合性等位基因之间进行。遗传多态性为杂合性的等位基因是指在基因组DNA的2个等位基因中具有各等位基因不同的遗传多态性。因此，具有杂合性等位基因时，可以区分来自于各等位基因的扩增cDNA。而且，如果在上述表达量中具有显著差异，则可以选择其遗传多态性作为用于判定等位基因之间表达量不同的基因的指标。
这里，“遗传多态性”或“多态性”是指引起个体间的性状或形态多样性的基因的差异，包括单核苷酸多态性(SNP)和单倍型等。SNP是指某个特定基因或基因群的单核苷酸的核酸发生突变。已知上述SNP会引起个体间的性状或形态的多样性。另外，所谓的单倍型是指由处于连续基因区域或基因群中多个位点突变部位的等位基因的种类和数量表示的多态性。单倍型的重组频率小于通常的重组频率，有在遗传上保存的倾向。因此，在研究多态性和表型的关联性时，不仅研究与各个突变的关联性很重要，而且研究与特定单倍型的关联性也很重要。另外，在遗传多态性中包含插入/缺失多态性、重复序列的重复次数不同所导致的多态性、限制片段长度多态性等。在本方法中，由于存在多个SNP检测方法、通过1个核苷酸的不同即可容易地区别等位基因等，因此优选利用单核苷酸多态性(SNP)。
对可以利用的遗传多态性没有特别限定，遗传多态性的信息可以由公共的数据库等容易地获得。例如，人、小鼠等的SNP和单倍型的信息可以通过NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)获得，另外人SNP信息也可以从JSNP数据库(http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/index_ja.html)获得。其他的遗传多态性信息只要是本领域内技术人员即可容易地获得。
遗传多态性的检测和测定由含有遗传多态性的等位基因的表达量可以使用本技术领域中公知的方法进行。
例如，遗传多态性的检测和测定由等位基因的基因表达量可以通过与一个遗传多态性的特异性探针的杂交来进行遗传多态性。探针可以根据需要通过荧光物质或放射性物质等的适当手段进行标记。探针只要是含有遗传多态性部位、与扩增的cDNA特异性杂交，则没有限定，具体的探针设计在本技术领域中是公知的。另外，杂交的条件只要是用于区别遗传多态性的充分条件即可，例如在一个遗传多态性的情况下杂交、而在其他遗传多态性的情况下不杂交的条件，例如为本领域技术人员所公知的严格条件。
探针还可以一端固定在基板上作为DNA芯片(微阵列)使用。此时，DNA芯片中可以仅固定对应于一个遗传多态性的探针，还可以固定对应于两个遗传多态性的探针。使用了这种DNA芯片的遗传多态性的检测例如记载在“DNA微阵列和最新PCR法”、村松正明和那波宏之监修、秀润社、2000年、第10章等中。
作为使用了DNA芯片的遗传多态性的检测的具体例子，对使用Affymetrix公司生产的GeneChip (注册商标) Human Mapping 100K array 的方法进行说明。GeneChip (注册商标) Human Mapping 100K array是含有2张阵列，能够检测基因组上存在的超过100,000个的SNP。使用方法如下：利用限制性酶(XbaI或HindIII)剪切试样(基因组、cDNA等)，连接接头，使用与该接头特异的1种引物(对于XbaI、HindIII分别为1种)通过PCR反应扩增，进行标记。2张阵列按照与每个SNP的等位基因互补进行设计，杂交后，根据信号判定试样的SNP，根据信号强度或信号比可以比较各等位基因的表达量。对于该DNA芯片的详细情况，可以参照在http://www.affymetrix.co.jp/ products/arrays/specific/100k.和htmlhttp://www.affymetrix.co.jp/pdf/ Mapping_100K.pdf中公开的产品信息和数据表格。
另外，遗传多态性除了上述方法之外，还可以通过本领域技术人员公知的所有方法检测。作为这种方法，可以使用下述方法：利用与遗传多态性特异的引物的方法、利用限制片段长度多态性(RFLP)的方法、直接测序法、变性梯度凝胶电泳法(DGGE)、化学裂解错配法(CCM)、引物延伸法(PEX)、侵入法、实时定量PCR(TaqMan法)等。
本方法中，优选使用简单且迅速、能够尽量多地检测遗传多态性存在的DNA芯片(微阵列)。
如上所述，当根据遗传多态性的不同研究每个等位基因的基因表达量(信号强度)，来自于各等位基因的基因表达量有显著性差异时，选择其遗传多态性。具体地说，求出表达量高的等位基因相对于表达量低的等位基因的表达量比率，选择其比率至少为1.3、优选至少为1.5的遗传多态性。这里，所谓的比率为1是指来自于两等位基因的基因表达量基本相等。
如上所述，利用遗传多态性比较各等位基因的表达量，结果，可以选择表达量有差异的遗传多态性作为用于判定等位基因之间表达量不同的基因的遗传多态性。如此选择的遗传多态性在以后只要仅检测其遗传多态性，即可判断某个检体是否具有表达量多的等位基因。另外，如后所述，由于在等位基因之间表达量不同的基因可能与特定的表型有关，因此利用如此选择的遗传多态性，可以明确遗传多态性和表型的关系。
2. 与表型相关的遗传多态性的检索方法
遗传多态性由于是引起个体间的性状或形态多样性的基因差别，因此遗传多态性和表型可能具有某种关系。但是，遗传多态性即便仅是存在于基因组上的SNP至少就有约1000万个(2004年10月报告的NCBI dbSNP build 123)，由如此庞大数量的SNP中选择与特定表型相关的信息是非常困难的。另一方面，在等位基因之间表达量不同的基因有可能与特性表型有关。因此，通过上述方法检索的、能够判定等位基因之间表达量不同的基因的遗传多态性与其他遗传多态性相比，与表型关联的可能性更高。
因此，本发明的与表型相关的遗传多态性的检索方法的特征在于，使用通过上述方法检索的遗传多态性，研究遗传多态性或基因表达量与表型的关系。这里，作为表型可以举出疾病的存在(病态和严重程度)、疾病的发病危险、对药物的应答性、对食品的应答性、对化学物质的应答性、对环境因子(例如紫外线、温度等)的应答性等。
具体地说，本方法可以根据本技术领域中公知的关联法、同胞配对法等进行。例如，在关联法中，使用显示特定表型的被检体和不显示特定表型的被检体，研究与通过上述检索方法检索的遗传多态性的出现频率或基因表达量的关系。例如，具有特定遗传多态性的频率在显示特定表型的被检体中显著高时，可以判断其遗传多态性的差别对于调节与表型相关的基因表达量的量具有影响，或者由于遗传多态性的遗传密码变化在氨基酸中产生变化、蛋白质的性质发生改变，因而其影响表型的表达等。同胞配对法是比较具有相同表型(例如疾病)的家属(兄弟姐妹)，特定表型相关基因存在的染色体区域的方法。这些方法例如记载于“了解前沿的基因组医学”、中村辅著、羊土社、2000年、第1章等中。
例如，含有通过上述方法检索的遗传多态性的基因由于在同一个体内的等位基因之间的表达量不同，因此通过其等位基因的类型(即遗传多态性的种类)可以推测个体间的表达量不同。因而，测定多个个体的遗传多态性和表达量，可以确认个体间的表达量与遗传多态性信息相关。
通过本方法，可以检索与表型相关的遗传多态性。如此检索的遗传多态性对诊断疾病的发病或发病危险、评估药物的应答性有用。
本发明中，使用通过上述方法检索的遗传多态性研究遗传多态性或基因的表达量与表型的关系，从而还可以检索与遗传多态性相关的表型。
例如，通过由某个基因编码的蛋白质所具有的“固有性质”(例如PPARγ与脂质代谢等有关等)，推测由于其基因上的遗传多态性不同，表型有所不同(例如，推测PPARγ与糖尿病等脂质代谢有关的表型相关)。因此，实际上通过评价遗传多态性和表型(例如将各种个体的糖尿病药ACTOS的反应性与PPARγ遗传多态性的分型结果相比较)，实际上可以确认其关联。
本发明人在实施上述方法时发现，实际上人的过氧化物酶体增殖因子激活受体γ(PPARγ或PPARG)基因在等位基因之间的表达量不同，另外，还找到了能够判定由各等位基因的表达量不同的遗传多态性。
实施例
以下使用实施例更加详细地说明本发明的方法，但本发明的技术范围并不局限于这些实施例。
[实施例1]
在本实施例中，由核内RNA进行cDNA的合成和扩增。
对于由EB病毒株化的淋巴细胞BL1395 (ATCC CRL-5957)和BL2122 (ATCC CRL-5967)的总RNA各1µg，进行DNAase处理，之后使用逆转录酶(Invitrogen公司SuperscriptIII RT enzyme)，按照包含在内的实验规程进行逆转录，制作单链cDNA。从20µl所得的反应液中取出1µl，不经过纯化直接加入到按照Amersham Bioscience出售的商品名为Genomiphi的实验规程加入有随机引物和phi29酶的反应溶液中，在30℃下反应16小时，分别获得2.34µg和2.27µg的cDNA。
对上述扩增的cDNA进行电泳，结果示于图1中。图1的条带1和2表示如上那样使用phi29 DNA聚合酶调制的cDNA。
如图1所示，在10Kb以上至约3KB的以约8Kb为中心的范围获得成片的条带(图1的条带1~2)。考虑到由通常的mRNA合成时的cDNA长度的中间值为2,316 bp，这说明仅选择性地扩增了较长的cDNA。即，通过使用phi29酶，可以选择性地扩增来自于链长较长的核内RNA的cDNA。
[实施例2]
在本实施例中，使用来自于实施例1调制的核内RNA的cDNA，对SNP的分型和基因表达量进行实验。
(1) 确认来自于使用phi29酶的核内RNA的cDNA扩增
最初，使用在实施例1中扩增的cDNA，根据100K阵列的实验规程(Affimetrix)从250ng开始反应。具体地说，根据通常的100K的实验规程将如实施例1所记载的利用phi29扩增的cDNA和同样利用phi29扩增的基因组DNA扩增后，获取其信号强度比(cDNA的信号强度/基因组DNA的信号强度)，研究其频率分布。通过如此求出的信号强度比，由于序列差别所产生的二级结构的差别而存在易被phi29扩增的序列和难以被扩增的序列(扩增的偏倚)，但通过用cDNA的信号值除以利用phi29扩增的基因组的信号值，可以除去该扩增的偏倚。
结果，如图2和3所示，在信号比低的地方出现认为是噪音的接近于正态分布曲线的形状，此处有很多来自于存在于无基因区域(图2和3的棒状图的浅灰色区域)的遗传多态性的信号(探针组合)。另一方面，在图2和3的右侧可见超出上述正态分布曲的信号比很强的部分(图2和3中箭头所示的部分)，此处有很多来自于存在于有基因区域(基本来自于内含子)的遗传多态性的信号(探针组合)。由该频率分布的形状和探针组合与基因组上的基因的位置关系，通过该测定法可以分离来自于基因(cDNA)的信号和噪音，通过测定cDNA与基因组的信号比，可以将信号比高的部分看作表达基因(主要是来自于核内RNA的cDNA)所产生的信号。
另外，使用通常的表达分析用阵列(Affymetrix U133plus2.0 array；http://www.affymetrix.co.jp/pdf/HG_DS.pdf)确认了利用通常的微阵列测定的基因表达量与如上分析的cDNA和基因组DNA的信号比有关。
具体地说，调制BL2122的总RNA，使用Affymetrix U133plus2.0 array按照通常的实验规程进行分析。使约54000个探针组合的平均信号值作为100，将全体平均化后，对信号强认为表达量高的基因群(得分100以上)和信号弱认为表达量低的基因群(10以下)的2组，在位于含有其基因内含子的基因组区域内的100K阵列(这里为XbaI 50K阵列)的SNP探针中，研究根据上述信息获得的cDNA/基因组的信号比，观察其频率分布。
结果，如图4所示，表达低(U133plus2.0中得分为10以下)者基本进入了上述被认为是噪音的接近于正态分布形状的部分中，相反，表达高(U133plus2.0中得分为100以上)者大部分进入了上述右侧认为是捕获来自于cDNA的信号的部分中。由上认为，通过本实施例测定的cDNA/基因组比的值与实际的基因表达量有关，通过phi29可以更加具有选择性地扩增核内剪接前的含有内含子的较长核内RNA。
(2) 等位基因之间的表达量差异的检测
如上述(1)所述，从BL1395和BL2122(来自女性)的各2种等位基因(A、B)中获取cDNA和基因组的信号比，测定来自于等位基因A和等位基因B的RNA(cDNA)量，进而，利用两者的比(等位基因A的cDNA/基因组比与等位基因B的cDNA/基因组比之比)确定等位基因A和等位基因B之间的表达量差异有多少。这里，当比值为1时，可以说两个等位基因的表达量相等。结果，如表1所示，与其他常染色体(1.69和2.01)相比，在由于生理印迹导致一个等位基因钝化的X染色体中可见统计学上有意义的等位基因之间的表达差别(4.24和5.06)。
表1
常染色体 X染色体 t检验p值
BL1395 1.69 4.24 1.12×10ˆ(-6)
BL2122 2.01 5.06 1.70×10ˆ(-8)
由以上可知，在通过phi29聚合酶扩增的cDNA中，通过试行100K阵列(50K XbaI阵列)根据SNP研究等位基因的表达量，可以确认能够测定各等位基因的表达量。
[实施例3]
本实施例中，研究PPARG基因的等位基因之间的表达差别。
在通过实施例2确认在等位基因之间具有表达差别的基因中，可以选择PPARG(过氧化物酶体增殖激活受体γ)。
在100K阵列中含有的50K XbaI阵列上，设计位于PPARG基因区域共计7个SNP位点上的探针组合。在通过实施例2进行的淋巴细胞BL1395的分析中，邻近上游、接近300 bp以内的rs10510410、rs10510411和rs10510412 (NCBI dbSNP数据库ID)的3个SNP通过基因组的分型为多态性(即能够区别2个等位基因)。这3个SNP在PPARG基因上的位置示于图5中。图5中，开星形为可以判断PPARG基因的等位基因之间表达量差异的SNP (信息SNP)。
对于任何位点的SNP，两等位基因之间的表达比(等位基因A和等位基因B的cDNA/基因组比之比)如表2所示，均为4倍以上。
表2
SNP id 等位基因之间的表达比
rs10510410 4.55
rs10510411 4.85
rs10510412 6.75
通过直接测序法确认了含有上述3个SNP区域的等位基因的存在比。大致结果示于图6，当为BL1395样品的rs10510410时，如图所示，基因组DNA (c)为A/C的杂合子，这在通过phi29扩增的基因组DNA中也没有变化。另一方面，在通过phi29扩增的cDNA (a和b)中，来自于等位基因A的信号降低，基本成为仅是等位基因C的波形。即，虽然基因组上rs10510410为A/C的杂合子，但实际上被表达的基因中来自于C的等位基因的表达量更多。结果与50KXbaI阵列的结果一致。在BL2122的淋巴细胞中未见PPARG基因的表达。
另外，对于上述3个SNP，通过直接测序法对30名日本人进行了分型，研究与外周血淋巴细胞的PPARG基因的表达的相关性。即，对于上述3个SNP类型与PPARG基因的表达量的关系进行了分析。PPARG基因的表达分析按照常规的实验规程使用Amersham Bioscience公司表达分析用阵列CodeLink，按照中间值为1对各阵列的总探针信号进行平均化。
结果，如图7和图8A (表和频率分布)所示，根据30名日本人的存在频率，检体可以分类为在rs10510410、rs10510411和rs10510412中分别为C型、A型和A型的存在频率低的等位基因(m)的纯合子型；在rs10510410、rs10510411和rs10510412中分别为A型、G型和G型的存在频率高的等位基因(M)的纯合子型；以及它们的杂合子型。在存在频率低的等位基因的纯合子型(mm型。图7和图8A中以网格表示)中，与其他类型(mM和MM型)相比，表达值高(mm的平均值为1.58，其余的为0.80)，特别是表达特别高的3个检体中，有2个检体是mm型。
由以上结果可知，这些SNP (单倍型)的存在与PPARG基因的表达量有关，这些SNP分型对于研究个体的PPARG活性、诊断和筛查与PPARG相关的疾病、以及研究以PPARG为靶标的药物的应答性有效。
另外，在这30人的检体中，由于3个位点的SNP (rs10510410、rs10510411和rs10510412)中主要等位基因M和次要等位基因m的组合完全一致(图7)，因此3个SNP处于完全连锁不平衡状态，形成单倍型，如图8B所示，认为存在2个单倍型M和m，单倍型m的PPARG表达量更高(图7)。通过研究该单倍型内和与其处于连锁不平衡的周围的SNP，也可以达成上述目的。
以上，通过本方法检索了能够判定等位基因之间表达量不同的基因的遗传多态性，如此检索的遗传多态性与基因的表达量有关，因此有可能还影响表型。
本说明书中引用的所有刊物、专利和专利申请均是直接作为参考编入在本说明书中的。
产业实用性
本发明提供用于检索能够判定等位基因之间表达量不同的基因的遗传多态性的迅速且高效的方法。另外，如此检索的遗传多态性可以识别等位基因之间的表达量，因此可以成为分析该基因相关的表型的有效方法。而且，如果可以发现如此检索的遗传多态性与表型(疾病危险率或药物应答性)的关系，则可以研究疾病的原因或有效的治疗方法等。
序列表自由正文
序列号1~3：人过氧化物酶体增殖因子激活受体γ的部分序列(序列号3的n表示g或t)。

Claims (5)

1.用于判定在等位基因之间表达量不同的基因的遗传多态性的检索方法，其包括以下步骤：
(a) 通过使用了随机引物的逆转录反应，由总RNA或核内RNA合成cDNA的步骤；
(b) 使用随机引物和φ29 DNA聚合酶，选择性地扩增来自于较长约3kb以上的核内RNA作为一次转录产物的cDNA的步骤；
(c) 检测扩增的cDNA中存在的遗传多态性的步骤；
(d) 根据该遗传多态性，比较来自于位于基因组DNA的遗传多态性为杂合型的基因组上各等位基因的cDNA表达量的步骤；
(e) 当来自于各等位基因的cDNA表达量显著不同时，选择比较所使用的遗传多态性的步骤。
2.权利要求1的方法，其中步骤(c)和(d)包括将扩增的cDNA标记，进行使用了遗传多态性特异性探针的杂交，根据该反应比较来自于各等位基因的表达量。
3.权利要求1或2的方法，其中遗传多态性为单核苷酸多态性SNP。
4.与表型相关的遗传多态性的检索方法，其特征在于：包括使用通过权利要求1~3中任一项的方法检索的遗传多态性，研究遗传多态性或基因表达量与表型的关系，条件是不包括疾病的诊断。
5.权利要求4的方法，其中表型选自疾病的病态和严重程度、疾病的发病危险、对药物的应答性、对食品的应答性、对化学物质的应答性以及对环境因子的应答性。
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