KR20070087128A

KR20070087128A - 발현량 다양성을 갖는 유전자의 동정법

Info

Publication number: KR20070087128A
Application number: KR1020077016321A
Authority: KR
Inventors: 히로유키 아부라타니; 슘페이 이시카와
Original assignee: 도꾜 다이가꾸; 가부시키가이샤 하플로파마
Priority date: 2004-12-17
Filing date: 2005-12-15
Publication date: 2007-08-27
Also published as: US20080138807A1; AU2005314732A1; EP1829979B1; WO2006064964A1; CN105567809A; EP1829979A1; EP1829979A4; KR100916876B1; JP4111985B2; JPWO2006064964A1; US7794982B2; CN101124341A; AU2005314732B2; CA2591043A1; CA2591043C

Abstract

본 발명은 알렐간에 발현량이 다른 유전자를 판정하기 위한 유전자 다형의 검색 방법, 및 표현형에 관여하는 유전자 다형의 검색 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 핵내 RNA 상에 존재하는 유전자 다형을 이용하여, 알렐간에 발현량이 다른 유전자를 효율적으로 판정하는 방법에 관한 것이다.

알렐, 발현량, 유전자 다형, 표현형, 핵내 RNA

Description

발현량 다양성을 갖는 유전자의 동정법 {METHOD OF IDENTIFYING GENE WITH VARIABLE EXPRESSION}

본 발명은 알렐(allele)간에 발현량이 다른 유전자를 판정하기 위한 유전자 다형의 검색 방법, 및 표현형에 관여하는 유전자 다형의 검색 방법에 관한 것이다.

게놈의 동일한 위치에 있는 동일한 유전자이어도, 그것이 다른 알렐 상에 있는 경우에 그 유전자의 발현량에 차이가 보이는 현상은 최근에 보고된 비교적 새로운 개념이다(비특허 문헌 1: Knight JC. Allele-specific gene expression uncovered. Trends Genet.Mar; 20(3): 113-6. PMID: 15049300, 2004년).

알렐간에 다른 발현을 나타내는 유전자라는 것은 크게 나누어, 각인 유전자(imprinted gene)와 비각인 유전자(non-imprinted gene)의 2종이 있다. 전자는, 각인(imprinting)이라 하여, 어떤 세포 또는 조직에 있어서 양친으로부터 한쪽 알렐씩 이어받은 경우에 어느 쪽이든 한쪽이 생리적으로 메틸화 등의 불활화되어 발현이 억제된다고 하는 현상이다. 후자, 즉, 비각인 유전자(non-imprinted gene)에 있어서도 알렐간에 다른 발현차가 보이는 경우가 있다. 이것은, 유전자내 또는 그에 근접한 알렐간의 게놈 다형이, 근방 유전자의 발현을 조절하는 시스 작용 영역(cis-acting element)으로서 기능하여, 알렐간의 유전자 발현량의 차이를 발생시킨 다고 생각되었다. 후자에서 보이는, 게놈 DNA 서열의 차이에서 기인하는 알렐마다의 발현 변화는 세대를 초월하여 이어지는 성질이라고 생각되고, 개체간의 유전자 발현량의 차이, 나아가서는 개인의 체질차, 병태와 그의 리스크, 또한 약제의 응답성 차이에 영향을 주는 것으로 생각된다.

알렐간의 유전자 발현량의 차이를 측정하기 위해서는, 동일한 세포내에서, 즉, 동일한 환경 조건하에서 측정하는 것이 가장 정확하다. 또한, 알렐간의 유전자 발현량의 차이를 측정할 때에, 어떤 RNA가 어떤 알렐에서 유래한 것인지를 동정할 수 있는 것이 중요하다. 그를 위해서는, 알렐을 구별할 수 있는 다형(SNP 등)이, 유전자의 전사 산물인 RNA의 서열 상에도 존재하는 것이 필요하고, 그것을 측정함으로써 가능해진다. 이 RNA 상의 다형(SNP)을 이용하여 알렐간의 발현량 차이를 측정한다고 하는 보고가 지금까지 몇몇 있었다(비특허 문헌 2 내지 4: Cowles CR, Hirschhorn JN, Altshuler D, Lander ES. Detection of regulatory variation in mouse genes. Nat Genet. Nov; 32(3): 432-7. PMID: 12410233, 2002년; Yan H, Yuan W, Velculescu VE, Vogelstein B, Kinzler KW. Related Allelic variation in human gene expression. Science. Aug 16; 297(5584): 1143. PMID: 12183620, 2002년; Bray NJ, Buckland PR, Owen MJ, 0'Donovan MC. Cis-acting variation in the expression of a high proportion of genes in human brain. Hum Genet. 2003 Jul; 113(2): 149-53. Epub May 01. PMID: 12728311, 2003년).

이들 보고는 모두 RT-PCR법과 다이렉트ㆍ시퀀스 반응 또는 일염기 신장 반응을 조합한 것, 즉, mRNA로부터 cDNA를 합성하여 증폭시킨 후, 임의로 선택한 다형 을 개개로 타이핑하는 것이며, 많은 유전자를 동시에 측정할 수 있는 기술은 아니다.

SNP 타이핑용 마이크로어레이를 이용한 많은 유전자의 망라적 해석이 지금까지 보고되어 있다(문헌[Lo HS, Wang Z, Hu Y, Yang HH, Gere S, Buetow KH, Lee MP. Allelic variation in gene expression is common in the human genome. Genome Res. Aug; 13(8): 1855-62. PMID: 12902379, 2003년]). 여기서는 polyT 프라이머를 이용한 통상적인 RT법에 의해 polyA가 붙은 mRNA를 cDNA로 변환하여, 통상적인 게놈 DNA 타이핑과 동일한 프로토콜로 다수개의 특이적 프라이머를 이용한 멀티플렉스 PCR법에 의해 샘플을 제조하고, 어레이에 혼성화시켜 그의 시그널비로 알렐마다 다른 cDNA(mRNA)의 발현량비를 측정하였다. 그러나, polyA가 붙은 성숙형 mRNA에서는, 스플라이싱을 받은 후의 엑손만의 서열이고, 이것은 길이가 짧으며 평가할 수 있는 다형(SNP)도 적다. 그 때문에, 이용 가능한 다형(SNP)이 한정되어, 알렐마다 발현량에 차이가 있는 유전자를 발견하는 것은 곤란하였다.

한편, 유전자 다형과 특정 형질 발현(예를 들면 질환, 약제의 효능 차이)와의 관련성도 착안되었다. 그러나, 특정 유전자 다형과 형질 발현과의 관련성을 조사하기 위해서는, 예를 들면 게놈 상의 SNP의 경우에는 다수개의 SNP(2004년 10월에 보고된 NCBI dbSNP build123에서는 약 1000만)를 개개의 형질마다 조사할 필요가 있어, 전부에 대하여 검토하는 것은 곤란하였다.

따라서, 알렐간에 형질 발현이 다른 유전자를 신속하면서 효율적으로 선택하고, 그와 같이 선택된 유전자의 다형과 형질 발현과의 관련성을 조사할 수 있다면, 질환의 원인이나 효과적인 치료법 등을 검토할 수 있다고 생각되었다.

발명의 개시

따라서, 본 발명은 상술한 실상을 감안하여, 알렐간에 발현량이 다른 유전자를 판정할 수 있는 유전자 다형을 신속하면서 효율적으로 검색하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 검색된 유전자 다형을 이용하여, 표현형에 관여하는 유전자 다형을 검색하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 핵내 RNA 상에 존재하는 유전자 다형을 이용함으로써, 효율적으로 알렐간에 발현량이 다른 유전자를 발견할 수 있다고 생각하고, 그를 위한 수법에 있어서 핵내 RNA를 선택적으로 증폭시킬 수 있는 DNA 폴리머라제를 선택한 결과, 실제로 알렐간에 발현량이 다른 유전자를 판정할 수 있는 유전자 다형(SNP)을 동정하는 것에 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하를 포함한다.

(1) 이하의 단계를 포함하는, 알렐간에 발현량이 다른 유전자를 판정하기 위한 유전자 다형의 검색 방법.

(a) 총 RNA 또는 핵내 RNA로부터 랜덤 프라이머를 이용한 역전사 반응에 의해 cDNA를 합성하는 단계,

(b) 랜덤 프라이머, 및 등온에서 반응하는 쇄 치환형 DNA 폴리머라제를 사용하여 긴 핵내 RNA(일차 전사 산물) 유래의 cDNA를 선택적으로 증폭시키는 단계,

(c) 증폭시킨 cDNA에 존재하는 유전자 다형을 검출하는 단계,

(d) 게놈 DNA의 유전자 다형이 헤테로 접합형인 게놈 상에 위치하는 각 알렐로부터의 cDNA의 발현량을, 상기 유전자 다형에 기초하여 비교하는 단계, 및

(e) 각 알렐로부터의 cDNA의 발현량이 유의하게 다른 경우에, 비교에 사용한 유전자 다형을 선택하는 단계.

상기 검색 방법에 있어서 DNA 폴리머라제로서는, 예를 들면 φ29 DNA 폴리머라제를 사용할 수 있다.

또한, 단계(c) 및 (d)는, 증폭시킨 cDNA를 표지하고, 유전자 다형 특이적 프로우브를 이용한 혼성화를 행하며, 그 반응에 기초하여 각 알렐로부터의 발현량을 비교하는 것을 포함하는 것이 바람직하다.

상기 검색 방법에서 유전자 다형으로서는 일염기 다형(SNP)을 사용할 수 있다.

(2) 상기 검색 방법에 의해 검색된 유전자 다형을 이용하여, 유전자 다형 또는 유전자의 발현량과 표현형과의 관계를 조사하는 것을 포함하는, 표현형에 관여하는 유전자 다형의 검색 방법.

상기 검색 방법에서 표현형으로서는, 질환의 병태 및 중증도, 질환의 발증 리스크, 약제에 대한 응답성, 식품에 대한 응답성, 화학 물질에 대한 응답성 및 환경 인자에 대한 응답성 등을 들 수 있다.

(3) 상기 검색 방법에 의해 검색된 유전자 다형을 이용하여, 유전자 다형 또는 유전자의 발현량과 표현형과의 관계를 조사하는 것을 포함하는, 유전자 다형에 관여하는 표현형의 검색 방법.

본 발명에 의해, 알렐간에 발현량이 다른 유전자를 판정할 수 있는 유전자 다형을 검색하기 위한 신속하면서 효율적인 방법이 제공된다. 또한, 그와 같이 하여 검색된 유전자 다형은 알렐간의 발현량을 식별할 수 있기 때문에, 그 유전자가 관여하는 표현형에 대하여 해석하기 위한 효과적인 수단이 될 수 있다. 또한, 그와 같이 검색된 유전자 다형과 표현형(질환 리스크나 약제 응답성)과의 관계를 발견할 수 있다면, 질환의 원인이나 효과적인 치료법 등을 검토할 수 있다고 생각된다.

도 1은 φ29 DNA 폴리머라제를 이용한 증폭에 의해 얻어진 cDNA의 전기 영동 사진이다.

도 2는 림프구 BL1395에 있어서의 cDNA와 게놈과의 시그널비의 돗수 분포와, 그 유전자 다형(프로브 세트)의 존재하는 게놈 상의 유전자와의 위치 관계를 나타내는 도면이다.

도 3은 림프구 BL2122에 있어서의 cDNA와 게놈과의 시그널비의 돗수 분포와, 그 유전자 다형(프로우브세트)의 존재하는 게놈 상의 유전자와의 위치 관계를 나타내는 도면이다.

도 4는 발현 해석용 어레이 U133plus2와 100K 어레이(XbaI 50K)에서의 cDNA/게놈의 시그널비의 비교를 나타내는 도면이다.

도 5는 PPARγ 유전자 상의 SNP 위치를 나타내는 도면이다.

도 6은 다이렉트ㆍ시퀀스법을 이용한 SNP의 확인에 대한 개요를 나타내는 도면이다.

도 7은 일본인 30명의 말초혈 림프구의 PPARG 유전자의 발현량과 유전자 다형의 타이핑과의 상관을 나타내는 도면이다.

도 8A 및 B는 일본인 30명의 말초혈 림프구의 PPARG 유전자의 발현량과 유전자 다형의 타이핑의 돗수 분포(A), 및 하플로타입 M과 m의 알렐을 나타내는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본원은 2004년 12월 17일에 출원된 일본국 특허 출원 제2004-366671호의 우선권을 주장하는 것이고, 상기 특허 출원의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.

1. 알렐간에 발현량이 다른 유전자를 판정할 수 있는 유전자 다형의 검색

본 발명은 알렐간에 발현량이 다른 유전자에 대하여 연구하기 위한 수법을 제공하는 것이다. 여기서, 「알렐간에 발현량이 다른 유전자」란, 한쪽 알렐로부터의 유전자 발현량과 다른 한쪽 알렐로부터의 유전자 발현량이 다른 유전자를 가리킨다. 각 알렐로부터의 유전자의 발현은 특정 유전자 다형을 지표로 하여 구별할 수 있지만, 모든 유전자 다형이 알렐간의 발현량 차이를 구별할 수 있는 것은 아니다. 따라서, 본 발명에 있어서는, 그와 같은 알렐간에의 발현량 차이를 판정할 수 있는 유전자 다형을 신속하면서 효율적으로 검색하는 수법을 제공한다.

(1) 핵내 RNA로부터의 cDNA의 합성과 증폭

본 방법에 있어서는 핵내 RNA로부터 cDNA를 합성한다. 여기서 「핵내 RNA」란, 게놈 DNA로부터 전사된 후, 스플라이싱을 받지 않고, 그 때문에 세포질로는 이행하지 않으며, 아직 핵내에 존재하고 있는 일차 전사 산물(primary transcript)을 말한다. 즉, 핵내 RNA는 게놈 상의 엑손 및 인트론을 모두 포함하고, 긴 쇄 길이를 갖는 것이 많다(예를 들면 2004년 4월에 보고된 Human Genome Build 34(http://genome. ucsc. edu/)의 서열 상에 있는 21804개의 참조 서열(reference sequence)로서는 평균 길이 85,284 bp, 중앙값 22,855 bp이고, 5000 bp보다 긴 것은 전체의 약 84 ％를 차지함).

알렐간의 발현량 차이를 측정하기 위해서는, 유전자의 전사 산물인 RNA 상에 유전자 다형이 존재하는 것이 필요하다. 본 발명자는, 핵내 RNA는 스플라이싱을 받지 않았기 때문에 쇄 길이가 길고, 알렐간의 발현량이 다른 유전자를 직별할 수 있는 유전자 다형도 많이 포함된다고 생각하였다. 예를 들면, 2004년 4월에 보고된 Human Genome Build34(http://genome.ucsc.edu/)의 서열 상에 있는 21804개의 참조 서열(reference sequence)에서는, mRNA의 평균 길이 2,757 bp, 중앙값 2,316 bp인 것에 대하여, 그의 인트론을 포함한 게놈 상의 길이는 평균 길이 85,284 bp, 중앙값 22,855 bp이고, 유전자 다형의 밀도를 생각하지 않더라도 약 40배 정도의 영역을 평가할 수 있게 된다.

핵내 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위해서는, 시료로부터 핵내 RNA만을 추출하여 그의 핵내 RNA로부터 cDNA를 합성하는 방법과, 시료로부터 총 RNA를 추출하여 총 RNA로부터 cDNA를 합성한 후, 긴 핵내 RNA에서 유래하는 cDNA만을 증폭시키는 방법의 2 가지 방법을 사용할 수 있다.

하나의 방법에 있어서는, 우선 시료로부터 핵 분획을 추출한다. 시료는 본 방법을 이용하여 알렐간에 발현량이 다른 유전자를 판정하기 위한 유전자 다형을 검색하고자 하는 것에서 유래하는 시료라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 동물, 식물, 미생물(진균, 세균 등) 유래의 시료, 시판용 세포주, 기탁된 세포주 등을 사용할 수 있다. 시료는 포유 동물, 특히 인간에서 유래하는 것이 바람직하다. 또한, 시료의 형태도 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 인간 유래 시료의 경우에는 혈액, 타액, 림프액, 기도 점액, 골수액, 뇨, 복강액 등의 체액, 세포, 조직 등의 형태의 시료를 사용할 수 있다.

핵 분획의 추출은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 행할 수 있다. 예를 들면, 세포를 균질기에 의해 파쇄하고, 분획 원심법 또는 밀도 구배 원심법에 의해 핵을 분리할 수 있다(예를 들면, 문헌[Molecular cloning Chapter 17. 8 Preparation of nuclear extracts from Tissue cultured mammalian cells. CSHL Press, ISBN O-87969-577-3] 참조).

다음에, 상기한 바와 같이 제조한 핵내 RNA로부터 랜덤 프라이머를 이용한 역전사 반응에 의해 cDNA를 합성한다. 랜덤 프라이머의 사용에 의해 시료 중에 존재하는 모든 서열의 RNA(핵내 RNA)로부터 cDNA를 합성할 수 있다.

계속해서, 역전사된 cDNA를 랜덤 프라이머를 이용하여 증폭시킨다. 핵내 RNA는 스플라이싱을 받지 않기 때문에 쇄 길이가 길고, 일반적으로 증폭에 사용되는 DNA 폴리머라제로는 증폭시킬 수 없다. 따라서, 본 방법에서는 등온도의 반응 조건(isothermal reaction)에서 쇄 치환(strand displacement)을 행하는 DNA 폴리머라제를 사용한다. 상기 성질을 갖는 DNA 폴리머라제로서는 한정되지 않지만, φ29 DNA 폴리머라제(Amersham Bioscience, 상품명 Genomiphi)를 들 수 있다. 이 φ29 DNA 폴리머라제는, 그의 증폭 반응이 매우 안정적이기 때문에, 역전사 반응에 의해 합성한 cDNA를 정제 과정을 행하지 않고 그대로 φ29 DNA 폴리머라제를 이용한 증폭 반응에 이용 가능하고, 또한 μg 오더의 수량이 얻어지기 때문에, 미량 샘플의 정제에 의한 손실을 우려하지 않으며 임상 검체 등의 매우 미량인 샘플로부터도 증폭시킬 수 있기 때문에, 본 방법의 실시에 특히 바람직하다. 그 밖에, 상기 성질을 갖는 것으로서는, Bst 폴리머라제도 알려져 있고, New England BioLab에서 발매되고 있다(문헌[Lage JM, Leamon JH, Pejovic T, Hamann S, Lacey M, Dillon D, Segraves R, Vossbrinck B, Gonzalez A, Pinkel D, Albertson DG, Costa J, Lizardi PM. Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome Res. 2003 Feb; 13(2): 294-307. PMID: 12566408]).

또한, 이러한 DNA 폴리머라제는 DNA를 증폭시킬 때에 DNA 단편의 말단에서 반응을 정지시키기 때문에, 말단 부근은 증폭률이 현저히 저하되지만, 짧은 DNA 단편을 증폭시키는 경우에는, 양쪽 말단간의 거리가 가깝기 때문에 단편 전체의 증폭률이 저하되고, 결과로서 긴 DNA 단편, 즉, 스플라이싱을 받지 않은 핵내 RNA가 선택적으로 증폭된다(문헌[Lage JM, Leamon JH, Pejovic T, Hamann S, Lacey M, Dillon D, Segraves R, Vossbrinck B, Gonzalez A, Pinkel D, Albertson DG, Costa J, Lizardi PM. Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome Res. 2003 Feb; 13(2): 294-307. PMID: 12566408]; [General Amplification of Chromosomal DNA by phi29 DNA polymerase. Amersham Biosience]).

따라서, 핵내 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 다른 방법으로서, 시료로부터 총 RNA(핵내 RNA 및 mRNA를 포함함)를 제조하여, 다양한 RNA종으로부터 랜덤 프라이머를 이용한 역전사 반응에 의해 cDNA를 합성하고, 그 후 쇄 길이가 긴 cDNA(즉, 긴 핵내 RNA 유래의 cDNA)를 선택적으로 증폭시킬 수 있는 상기 DNA 폴리머라제(예를 들면 φ29 DNA 폴리머라제)를 이용하여 증폭시킴으로써, 핵내 RNA에서 유래하는 cDNA를 선택적으로 합성하여 증폭시킬 수 있다. 이 핵내 RNA로부터의 cDNA 증폭은 핵내 RNA만을 추출하는 절차를 생략할 수 있기 때문에, 본 방법의 실시에 있어서 바람직하다. 총 RNA의 추출은 당업자에게 공지된 방법에 의해 행할 수 있고, 예를 들면 구아니딘/세슘법, AGPC(산 구아니듐-페놀-클로로포름)법 등을 사용할 수 있다.

(2) 유전자 다형과 알렐 발현량

계속해서, 각 알렐에서 유래하는 유전자(증폭 cDNA)의 발현량을 비교한다. 여기서, 발현량의 비교는 헤테로 접합형의 알렐간에 행한다. 유전자 다형이 헤테로 접합형 알렐이란, 게놈 DNA에서의 2개 알렐에 있어서 각 알렐이 다른 유전자 다형을 갖는 것을 의미한다. 따라서, 헤테로 접합형 알렐을 갖는 경우에는, 각 알렐에서 유래하는 증폭 cDNA를 구별할 수 있다. 또한, 상기 발현량에 유의차가 있으면, 그 유전자 다형은 알렐간에 발현량이 다른 유전자를 판정하기 위한 지표로서 선택할 수 있다.

여기서, 「유전자 다형」 또는 「다형」이란, 개체간의 형질이나 형태의 다양성을 야기하는 유전자의 차이를 말하고, 일염기 다형(Single Nucleotide Polymorphism; SNP) 및 하플로타입 등이 포함된다. SNP란, 어떤 특정 유전자 또는 유전자군에 있어서의 일염기 핵산의 변이를 말한다. 이러한 SNP는, 개체간의 형질이나 형태의 다양성을 야기하는 경우가 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 하플로타입이란, 연속된 유전자 영역 또는 유전자군 중 복수개 부분의 변이 부위에 있어서의 알렐 종류와 수에 의해 표시되는 다형을 나타낸다. 하플로타입에 있어서의 재조합 빈도는 통상적인 재조합 빈도보다 낮고, 유전적으로 보존되는 경향이 있다. 따라서, 다형과 표현형과의 관련성을 조사하는 경우에는, 개개의 변이와의 관련성 뿐만 아니라 특정 하플로타입과의 관련성을 조사하는 것도 중요하다고 생각된다. 그 밖에, 유전자 다형에는 삽입/결실형 다형, 반복 서열의 반복 횟수의 차이에 의한 다형, 제한 단편 길이 다형 등이 포함된다. 본 방법에 있어서는 다수개의 SNP 검출 수법이 존재하는 것, 알렐간의 구별을 1 염기의 차이로 용이하게 행할 수 있는 것 등으로 인해, 일염기 다형(SNP)을 이용하는 것이 바람직하다.

이용 가능한 유전자 다형은 특별히 한정되지 않고, 유전자 다형 정보는 공공의 데이타베이스 등으로부터 용이하게 입수할 수 있다. 예를 들면, 인간, 마우스등의 SNP 및 하플로타입의 정보는 NCBI 데이타베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)로부터, 또한 인간 SNP의 정보는 JSNP 데이타베이스(http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/index_ja.html)로부터 입수할 수 있다. 그 밖의 유전자 다형 정보는 당업자라면 용이하게 입수할 수 있다.

유전자 다형의 검출 및 유전자 다형을 포함하는 알렐로부터의 발현량 측정은 당기술 분야에서 공지된 수법을 이용하여 행할 수 있다.

예를 들면, 유전자 다형의 검출 및 알렐로부터의 유전자 발현량의 측정은 하나의 유전자 다형에 특이적인 프로브와의 혼성화에 의해 행할 수 있다. 프로브는 필요에 따라서 형광 물질이나 방사성 물질 등의 적당한 수단에 의해 표지할 수 있다. 프로브는 유전자 다형 부위를 포함하고, 증폭시킨 cDNA와 특이적으로 혼성화되는 것인 한 어떠한 것일 수도 있으며, 구체적인 프로브의 설계는 당기술 분야에서 공지되어 있다. 또한, 혼성화의 조건도 유전자 다형을 구별하는 데 충분한 조건이면 되고, 예를 들면 하나의 유전자 다형의 경우에는 혼성화되지만, 다른 유전 자 다형의 경우에는 혼성화되지 않는 조건, 예를 들면 엄격한 조건이며, 이러한 조건은 당업자에게 공지되어 있다.

프로브는 한쪽 말단을 기판에 고정시켜 DNA 칩(마이크로어레이)으로서 이용할 수도 있다. 이 경우, DNA 칩에는, 하나의 유전자 다형에 대응하는 프로우브만이 고정될 수도, 양방(兩方)이 유전자 다형에 대응하는 프로브가 고정될 수도 있다. 이러한 DNA 칩을 이용한 유전자 다형의 검출은, 예를 들면 문헌[「DNA 마이크로어레이와 최신 PCR법」, 무라마쯔 마사아끼 및 나와 히로유끼, 슈준샤, 2000년, 제10장] 등에 기재되어 있다.

DNA 칩을 이용한 유전자 다형의 검출의 구체적인 예로서, Affymetrix사 제조의 GeneChip(등록 상표) Human Mapping 100K array를 이용하는 방법에 대하여 설명한다. GeneChip(등록 상표) Human Mapping 10O Karray는 2매의 어레이를 포함하여, 게놈 상에 존재하는 100,000개를 초과하는 SNP의 검출을 행할 수 있는 어레이이다. 사용 방법은, 시료(게놈, cDNA 등)을 제한 효소(XbaI 또는 HindIII)로 절단하여 어댑터(adapter)를 연결시키고, 그 어댑터에 특이적인 1 종류의 프라이머(XbaI, HindIII에 대하여 각각 1 종류씩)를 이용하여 PCR 반응에 의해 증폭시켜 라벨링을 행한다. 2매의 어레이는 각 SNP의 알렐마다 상보적으로 되도록 설계되어 있고, 혼성화 후, 시그널에 기초하여 시료의 SNP를 판정하고, 또한 각 알렐의 발현량을 시그널 강도 또는 시그널비에 기초하여 비교할 수 있다. 이 DNA 칩의 상세한 것에 대해서는 http://www.affymetrix.co.jp/products/arrays/specific/100k. 및 htmlhttp://www.affymetrix.co.jp/pdf/Mapping-100K.pdf에서 공개되어 있는 제품 정보 및 데이터 시트를 참조하면 된다.

또한, 유전자 다형은 상술한 것 외에도 당업자에게 공지된 모든 방법에 의해 검출할 수 있다. 그와 같은 방법으로서는, 유전자 다형에 특이적인 프라이머를 이용하는 방법, 제한 단편 길이 다형(RFLP)을 이용하는 방법, 직접 서열 결정법, 변성 구배 겔 전기 영동법(DGGE), 미스매치 부위의 화학적 절단을 이용한 방법(CCM), 프라이머 신장법(PEX), 인베이더(Invader)법, 정량적 리얼 타임 PCR 검출법(TaqMan법) 등을 사용할 수 있다.

본 방법에서는 간편하면서 신속하게 가능한 한 많은 유전자 다형의 존재에 대하여 검출할 수 있는 DNA 칩(마이크로어레이)를 사용하는 것이 바람직하다.

상술한 바와 같이, 유전자 다형의 차이에 기초하여 알렐마다 유전자 발현량(시그날 강도)를 조사하여, 각 알렐로부터의 유전자의 발현량이 유의하게 다른 경우에, 그 유전자 다형을 선택한다. 구체적으로는, 발현량이 낮은 알렐에 대한 발현량이 높은 알렐 발현량의 비율을 구하고, 그 비율이 적어도 1.3, 바람직하게는 적어도 1.5인 유전자 다형을 선택한다. 여기서, 비율이 1이란, 두 알렐로부터의 유전자의 발현량이 거의 같은 것을 의미한다.

상술한 바와 같이 하여, 유전자 다형을 이용하여 각 알렐의 발현량을 비교하고, 그 결과, 발현량에 차이가 있는 유전자 다형은, 알렐간에 발현량이 다른 유전자를 판정하기 위한 유전자 다형으로서 선택할 수 있다. 이와 같이 하여 선택한 유전자 다형은, 이 후에 그 유전자 다형을 검출하는 것만으로, 어떤 검체가 발현량 이 많은 알렐을 갖는가 아닌가 등을 조사하는 것이 가능해진다. 또한, 후술하는 바와 같이, 알렐간에 발현량이 다른 유전자는 특정 표현형과 관련될 가능성이 있기 때문에, 이와 같이 하여 선택된 유전자 다형을 이용하여, 유전자의 다형과 표현형과의 관계를 분명히 할 수 있다.

2. 표현형에 관여하는 유전자 다형의 검색 방법

유전자 다형은 개체간의 형질이나 형태의 다양성을 야기하는 유전자의 차이이기 때문에, 유전자 다형과 표현형은 어떠한 관계가 있을 가능성이 있다. 그러나, 유전자 다형은 게놈 상에 존재하는 SNP만에서도 적어도 약 1000만(2004년 10월에 보고된 NCBIdbSNPbui1d123)이나 있고, 이러한 방대한 수의 SNP 중으로부터 특정 표현형에 관여하는 것을 선택하는 것은 곤란하다. 한편, 알렐간에 발현량이 다른 유전자는 특정 표현형과 관련될 가능성이 있다. 따라서, 상기 방법에 의해 검색된, 알렐간에 발현량이 다른 유전자를 판정할 수 있는 유전자 다형은, 다른 유전자 다형보다 표현형과 관련되어 있을 가능성이 높다고 생각된다.

따라서, 본 발명에 따른 표현형에 관여하는 유전자 다형의 검색 방법에 있어서는, 상기 방법에 의해 검색된 유전자 다형을 이용하여, 유전자 다형 또는 유전자의 발현량과 표현형과의 관계를 조사하는 것을 특징으로 한다. 여기서, 표현형으로서는, 질환의 존재(병태 및 중증도), 질환의 발증 리스크, 약제에 대한 응답성, 식품에 대한 응답성, 화학 물질에 대한 응답성, 환경 인자(예를 들면 자외선, 온도 등) 등을 들 수 있다.

구체적으로는, 본 방법은 당기술 분야에서 주지된 어소시에이션(관련)법, 나 환(羅患) 동포대법(affected sib pair method) 등에 기초하여 행할 수 있다. 예를 들면, 어소시에이션법에 있어서는, 특정 표현형을 나타내는 피검체와 나타내지 않는 피검체를 이용하여, 상기 검색 방법에서 검색한 유전자 다형의 출현 빈도, 또는 유전자 발현량과의 관계를 조사한다. 예를 들면, 특정 유전자 다형을 가지고 있는 빈도가, 특정 표현형을 나타내는 피검체에서 유의하게 높은 경우에는, 그 유전자 다형의 차이가 표현형에 관여하는 유전자 발현량의 양적 조절에 영향을 주거나, 또는 유전자 다형의 유전 암호 변화에 의해 아미노산에 변화가 일어나서 단백질의 성질이 변하였기 때문에, 그것이 표현형의 발현에 영향을 주는 등으로 판단할 수 있다. 또한, 나환 동포대법에 있어서는, 동일한 표현형(예를 들면 질환)을 갖는 가계(형제 자매)를 비교하여, 표현형 관련 유전자의 존재하는 염색체 영역을 특정하는 방법이다. 이들 방법은, 예를 들면 문헌[「선단의 게놈 의학을 안다」, 나까무라 유스께 저서, 요도샤, 2000년, 제1장] 등에 기재되어 있다.

예를 들면, 상기 방법에 의해 검색된 유전자 다형을 포함하는 유전자는, 동일한 개체내의 알렐간에 발현량에 차아가 있기 때문에, 그 알렐 타입(즉, 유전자 다형의 종류)에 의해 개체간의 발현량이 다른 것으로 추측된다. 따라서, 다수개의 개체에 있어서의 유전자 다형과 발현량을 측정하여, 개체간의 발현량이 유전자 다형 정보와 상관되는 것을 확인할 수 있다.

본 방법에 의해 표현형에 관여하는 유전자 다형을 검색할 수 있다. 이와 같이 검색된 유전자 다형은 질환의 발증이나 발증 리스크에 대하여 진단하거나, 약제의 응답성을 미리 판정하기 위해 유용하다.

또한, 본 발명에 있어서는 상기 방법에 의해 검색된 유전자 다형을 이용하여, 유전자 다형 또는 유전자의 발현량과 표현형과의 관계를 조사함으로써 유전자 다형에 관여하는 표현형을 검색할 수도 있다.

예를 들면, 임의의 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 갖는 「고유한 성질」(예를 들면, PPARγ이 지질 대사 등에 관여하는 것 등)에 의해, 그 유전자 상의 유전자 다형의 차이에 의해 표현형에 차이가 있는 것으로 추측된다(예를 들면, PPARγ에 대하여, 당뇨병 등의 지질 대사에 관한 표현형에 관여하는 것으로 추측됨). 따라서, 실제로 유전자 다형과 표현형을 평가(validation)함으로써(예를 들면, 다양한 개체에 있어서의 당뇨병 약 악토스(ACTOS)의 반응성을 PPARγ의 유전자 다형의 타이핑 결과와 비교해봄), 실제로 그의 관여를 확인할 수 있다.

본 발명자는 상술한 방법을 실시한 결과, 실제로 인간의 퍼옥시솜 증식 인자 활성화 수용체 γ(PPARγ 또는 PPARG) 유전자가 알렐간에 발현량이 다른 것을 발견하고, 또한 각 알렐로부터의 발현량 차이를 판정할 수 있는 유전자 다형을 찾아낼 수 있었다.

이하, 실시예를 이용하여 본 방법을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

본 실시예에서는 핵내 RNA로부터의 cDNA 합성 및 증폭을 행하였다.

EB 바이러스에 의해 주화된 림프구 BL1395(ATCC CRL-5957) 및 BL2122(ATCC CRL-5967)의 총 RNA 각각 1 μg을 DNAase 처리를 한 후에 역전사 효소(Invitrogen사 Superscript III RT enzyme)를 이용하여 첨부 프로토콜에 따라서 역전사하여 1본쇄 cDNA를 제조하였다. 얻어진 반응액 20 μl로부터 1 μl를 정제없이, Amersham Bioscience로부터 발매되고 있는 상품명 Genomiphi의 프로토콜에 따라서 랜덤 프라이머 및 phi29 효소 함유 반응 용액에 첨가하고, 30 ℃에서 16 시간의 반응을 행하여 각각 2.34 μg 및 2.27 μg 수량의 cDNA를 얻었다.

이와 같이 하여 증폭시킨 cDNA의 전기 영동을 행한 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1의 레인 1 및 2는 상술한 바와 같이 phi29DNA 폴리머라제를 이용하여 제조한 cDNA를 나타낸다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 10 Kb 이상의 부분으로부터 약 8 Kb의 근처를 중심으로 약 3 Kb까지 스미어링(smearing)되는 형상이 얻어졌다(도 1의 레인 1 내지 2). 이것은, 통상적인 mRNA로부터 합성한 경우의 cDNA 길이의 중앙값이 2,316 bp인 것을 생각하면, 긴 cDNA만이 선택적으로 증폭된 것이 시사되었다. 즉, phi29 효소를 이용함으로써, 쇄 길이가 긴 핵내 RNA로부터의 cDNA를 선택적으로 증폭시킬 수 있음이 시사되었다.

[실시예 2]

본 실시예에서는, 실시예 1에 있어서 제조한 핵내 RNA로부터의 cDNA를 이용하여 SNP의 타이핑과 유전자 발현량에 대하여 실험하였다.

(1) phi29 효소를 이용한 핵내 RNA로부터의 cDNA 증폭의 확인

먼저, 실시예 1에서 증폭시킨 cDNA를 이용하여, 100K 어레이의 프로토콜 (Affimetrix)에 따라서 250 ng으로 반응을 개시하였다. 구체적으로는, 실시예 1에 기재된 바와 같이 phi29로 증폭시킨 cDNA와, 동일하게 phi29로 증폭시킨 게놈 DNA를 통상적인 100K의 프로토콜에 따라서 증폭시킨 후, 그 시그날 강도의 비(cDNA의 시그날 강도/게놈 DNA의 시그널 강도)를 취하고, 그의 돗수 분포를 조사하였다. 이와 같이 하여 시그날 강도비를 구함으로써, 서열의 차이가 발생하는 이차 구조차이에 의해 phi29에 의해 증가하기 쉬운 서열과 증가하기 어려운 서열이 있지만(증폭 바이어스), cDNA의 시그널값을 phi29로 증폭시킨 게놈의 시그널값으로 나눔으로써, 이러한 증폭 바이어스를 제거할 수 있다.

그 결과, 도 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 시그널비가 낮은 부분에는 노이즈라고 생각되는 정규 분포 곡선에 가까운 모양이 나타나고, 여기에서는 유전자가 없는 영역(도 2 및 3에 있어서의 막대 그래프의 엷은 회색)에 존재하는 유전자 다형에 기초하는 시그널(프로브 세트)가 많았다. 한편, 도 2 및 3의 우측에 상술한 정규 분포 곡선으로부터 튀어나오는 것과 같이, 시그날비가 강한 부분이 보였고(도면 2 및 3 중, 화살표로 나타내는 부분), 여기에서는 유전자의 어느 (대부분은 인트론 유래의) 영역에 존재하는 유전자 다형에 기초하는 시그날(프로브 세트)이 많았다. 이 돗수 분포의 모양 및 프로브 세트와 게놈 상의 유전자와의 위치 관계로부터, 이 분석에 의해 유전자(cDNA) 유래의 시그널과 노이즈가 분리될 수 있고, cDNA와 게놈과의 시그널비의 측정에 의해, 시그널비가 높은 부분을 발현 유전자(주로 핵내 RNA 유래의 cDNA)에 의한 시그널이라고 생각할 수 있는 것을 알았다.

또한 통상적인 발현 해석용 어레이(Affymetrix U133plus2.0 array; http:/www.affymetrix.co.jp/pdf/HG_DS.pdf)를 이용하여 통상적인 마이크로어레이로 측정되는 유전자 발현량과, 상기한 바와 같이 해석한 cDNA와 게놈 DNA의 시그널비에 상관이 있는지를 확인하였다.

구체적으로는, BL2122의 총 RNA를 제조하고, Affymetrix U133plus2.0 array를 이용하여 통상적인 프로토콜에 따라서 해석하였다. 약 54000개의 프로브 세트의 평균 시그날값을 100이 되도록 전체를 평균화한 후, 시그널이 높으며 발현량이 높다고 생각되는 유전자군(스코어 100 이상)과 시그날이 낮으며 발현량이 낮다고 생각되는 유전자군(10 이하)의 2군에 대하여, 그 유전자의 인트론을 포함한 게놈 상의 영역내에 있는 100K 어레이(여기서는 XbaI 50K 어레이)의 SNP 프로브에 있어서, 상술한 정보에 의해 얻어진 cDNA/게놈 시그널비를 조사하고, 그의 빈도 분포를 보았다.

그 결과, 도 4와 같이 발현이 낮은 (U133plus2.0로 스코어 10 이하) 것은 상기 노이즈라고 생각되는 정규 분포에 가까운 모양의 부분에 대부분이 들어가고, 반대로 발현이 높은 (U133plus2.0로 스코어 100 이상) 것은 대부분이 상기 우측의 cDNA 유래의 시그널을 포착한다고 생각되는 부분에 들어가 있었다. 이상으로부터, 본 실시예에서 측정한 cDNA/게놈비의 값과 실제 유전자 발현량과는 상관이 있고, phi29에 의해 핵내 스플라이싱 전의 인트론을 포함하는 긴 핵내 RNA보다 선택적으로 증폭시킬 수 있다고 생각되었다.

(2) 알렐간에의 발현량 차이의 검출

또한, BL1395 및 BL2122(여성 유래)에 있어서 각 2종의 알렐(A, B)마다, 상 기 (1)과 같이 cDNA와 게놈의 시그널비를 취하여 알렐 A 및 알렐 B 유래의 RNA(cDNA)량을 측정하고, 또한 알렐 A와 알렐 B 사이에 발현량 차이가 얼마만큼인가를 2개의 비(알렐 A의 cDNA/게놈비와 알렐 B의 cDNA/게놈비의 비)로 얻었다. 여기서, 비가 1인 경우에는, 두 알렐의 발현량이 같다고 할 수 있다. 그 결과, 생리적으로 각인에 의한 한쪽 알렐의 불활화가 잘 알려져 있는 X 염색체에 있어서는, 표 1에 나타낸 바와 같이 다른 상염색체(1.69 및 2.01)에 비교하여 통계적으로 유의하게 알렐간의 발현차(4.24 및 5.06)가 보였다.

이상으로부터, phi29 폴리머라제에 의해 증폭된 cDNA에 있어서, 100K 어레이(50 K XbaI 어레이)를 시행하여 SNP에 기초하여 알렐의 발현량을 조사함으로써, 알렐 개개의 발현차를 측정할 수 있는 것이 확인되었다.

[실시예 3]

본 실시예에서는 PPARG 유전자의 알렐간의 발현차를 조사하였다.

실시예 2에 의해 알렐간에 발현차가 있는 것이 확인된 유전자 중, PPARG(퍼옥시솜 증식 활성화 수용체 γ)를 선택할 수 있었다.

100K 어레이에 포함되는 50 K XbaI 어레이에는 게놈 상의 PPARG 유전자 영역에 합계 7 부분의 SNP 위치에 프로브 세트가 설계되어 있다. 실시예 2에서 행한 림프구 BL1395의 해석에서는, 상류에 가까운 300 bp 이내에 근접한 rs10510411, rs10510411 및 rs10510412(NCBI dbSNP 데이타베이스 ID) 중 3개의 SNP가 게놈 타이핑에서 다형이었다(즉, 2개의 알렐이 구별 가능함). 이 3개 SNP의 PPARG 유전자 상의 위치를 도 5에 나타낸다. 도 5 중, 흰 별표가 PPARG 유전자의 알렐간의 발현량 차이를 판정할 수 있는 SNP(informative SNP)이다.

어느 위치의 SNP에 대해서도 두 알렐간의 발현비(알렐 A와 알렐 B의 cDNA/게놈비의 비)는 표 2에 나타내는 대로 4배 이상이었다.

이 3개의 SNP를 포함하는 영역을 다이렉트ㆍ시퀀스법에 의해 알렐의 존재비를 확인하였다. 그의 개요는 도 6에 나타내지만, 예를 들면 BL1395 샘플에서의 rs10510410의 경우에는, 도면과 같이 게놈 DNA(c)에 있어서는 A/C의 헤테로이고, 그것은 phi29로 증폭된 게놈 DNA에서도 변화는 없었다. 한편, phi29로 증폭된 cDNA(a 및 b)에 있어서는 알렐 A로부터의 시그널이 저하되어 거의 알렐 C만의 파형이 되었다. 즉, 게놈 상에서 rs10510410은 A/C의 헤테로이지만, 실제로 발현되는 유전자에서는 C의 알렐로부터의 발현량이 많은 것을 알았다. 이 결과는 50 K XbaI 어레이의 결과와 일치하였다. BL2122의 림프구에서는 PPARG 유전자의 발현은 확인되지 않았다.

또한, 이 3개의 SNP에 대하여, 일본인 30명을 다이렉트ㆍ시퀀스법에 의해 타이핑하여, 말초혈 림프구의 PPARG 유전자의 발현과의 상관을 조사하였다. 즉, 상기 3개 SNP의 타입과 PPARG 유전자의 발현량과의 관계에 대하여 분석하였다. PPARG 유전자의 발현 해석에는 Amersham Bioscience사 발현 해석용 어레이 CodeLink를 통상적인 프로토콜대로 사용하여, 각 어레이의 총 프로브의 시그널을 중앙값이 1이 되도록 평균화하였다.

그 결과, 도 7과 도 8A(표와 돗수 분포)에 나타낸 바와 같이, 검체는 일본인 30명에 있어서의 존재 빈도에 따라서 rs10510411, rs10510411 및 rs105l0412에서 각각 C형, A형 및 A형인 존재 빈도가 낮은 알렐 (m)의 호모형, rs10510411, rs10510411 및 rs10510412에서 각각 A형, G형 및 G형인 존재 빈도가 높은 알렐 (M)의 호모형, 및 이들의 헤테로형으로 분류할 수 있었다. 존재 빈도가 낮은 알렐의 호모형(mm형이라 함. 도 7과 도 8A에서 음영으로 표시)에서는 그 이외(mM 및 MM 형이라 함)의 것에 비해 발현값이 높고(mm의 평균값 1.58에 대하여 그 외는 0.80),특히 발현이 특히 높은 상위 3 검체 중 2검체에서 mm이었다.

이상의 결과로부터, 이들 SNP(하플로타입)의 존재가 PPARG 유전자의 발현량과 상관되고, 개인의 PPARG 활성, PPARG와의 관련이 시사되는 병의 진단, 스크리닝 및 PPARG를 표적으로 하는 약제의 응답성을 조사하기 위해서 이러한 SNP 타이핑이 효과적인 것이 시사되었다.

또한, 이들 30명의 검체에서 3 부분의 SNP(rs10510411, rs10510411 및 rs10510412)에 있어서 메이저 알렐 M과 마이너 알렐 m의 조합이 전부 일치하는 것(도 7)으로부터, 3개의 SNP는 완전히 연쇄 불균형 상태에 있으며 하플로타입을 형성하고, 도 8B에 나타낸 바와 같이 2개의 하플로타입 M 및 m이 존재하여 하플로타입 m이 PPARG의 발현량이 높은 편이라고 생각되었다(도 7). 이 하플로타입내 및 그와 연쇄 불균형에 있는 주변 SNP를 조사함으로써도 상기 목적을 달성할 수 있다고 생각되었다.

이상으로부터, 본 방법에 의해 알렐간에 발현량이 다른 유전자를 판정할 수 있는 유전자 다형을 검색하고, 그와 같이 하여 검색된 유전자 다형은 유전자의 발현량과 관련되며, 그 때문에 표현형에도 영향을 줄 가능성이 있는 것이 시사되었다.

본 명세서내에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서내에 포함하는 것으로 한다.

본 발명에 의해 알렐간에 발현량이 다른 유전자를 판정할 수 있는 유전자 다형을 검색하기 위한 신속하면서 효율적인 방법이 제공된다. 또한, 그와 같이 하여 검색된 유전자 다형은 알렐간의 발현량을 식별할 수 있기 때문에, 그 유전자가 관여하는 표현형에 대하여 해석하기 위한 효과적인 수단이 될 수 있다. 또한, 그와 같이 검색된 유전자 다형과 표현형(질환 리스크나 약제 응답성)과의 관계를 발견할 수 있다면, 질환의 원인이나 효과적인 치료법 등을 검토할 수 있다고 생각된다.

서열표 프리텍스트

서열 1 내지 3: 인간 퍼옥시솜 증식 인자 활성화 수용체 γ의 부분 서열(서열3에 있어서의 n은 g 또는 t를 나타냄)

SEQUENCE LISTING <110> The University of Tokyo HaploPharma Inc. <120> Method for identifying a gene with allelic variation in gene expression <130> PH-2667-PCT <150> JP 2004-366671 <151> 2004-12-17 <160> 3 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> partial sequence of human peroxisome proliferator-activated receptor gamma <400> 1 ttccagatta cactc <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> partial sequence of human peroxisome proliferator-activated receptor gamma <400> 2 ttccatatta cactc <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> partial sequence of human peroxisome proliferator-activated receptor gamma <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> N = G or T <400> 3 ttccanatta cactc

Claims

1. 이하의 단계:

(c) 증폭시킨 cDNA에 존재하는 유전자 다형을 검출하는 단계,

(d) 게놈 DNA의 유전자 다형이 헤테로 접합형인 게놈 상에 위치하는 각 알렐(allele)로부터의 cDNA의 발현량을, 상기 유전자 다형에 기초하여 비교하는 단계,

(e) 각 알렐로부터의 cDNA의 발현량이 유의하게 다른 경우에, 비교에 사용한 유전자 다형을 선택하는 단계

를 포함하는, 알렐간에 발현량이 다른 유전자를 판정하기 위한 유전자 다형의 검색 방법.

제1항에 있어서, DNA 폴리머라제가 φ29 DNA 폴리머라제인 방법.

제1항 또는 제2항에 있어서, 단계(c) 및 (d)가, 증폭시킨 cDNA를 표지하고, 유전자 다형 특이적 프로브를 이용한 혼성화를 행하며, 그 반응에 기초하여 각 알렐로부터의 발현량을 비교하는 것을 포함하는 방법.

제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 다형이 일염기 다형(SNP)인 방법.

제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 검색된 유전자 다형을 이용하여, 유전자 다형 또는 유전자의 발현량과 표현형과의 관계를 조사하는 것을 포함하는, 표현형에 관여하는 유전자 다형의 검색 방법.

제5항에 있어서, 표현형이 질환의 병태 및 중증도, 질환의 발증 리스크, 약제에 대한 응답성, 식품에 대한 응답성, 화학 물질에 대한 응답성 및 환경 인자에 대한 응답성으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 방법.

제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 검색된 유전자 다형을 이용하여, 유전자 다형 또는 유전자의 발현량과 표현형과의 관계를 조사하는 것을 포함하는, 유전자 다형에 관여하는 표현형의 검색 방법.

제7항에 있어서, 표현형이 질환의 병태 및 중증도, 질환의 발증 리스크, 약제에 대한 응답성, 식품에 대한 응답성, 화학 물질에 대한 응답성 및 환경 인자에 대한 응답성으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 방법.