JP4666237B2 - 遺伝子検定方法、遺伝子検定プログラム及び遺伝子検定装置 - Google Patents

Description

本発明は、バイオアッセイ用の基盤などを用いて得られた遺伝子発現量に係る技術分野に属するものである。

従来、設計された複数のＤＮＡプローブと、サンプル細胞から抽出されたｍＲＮＡを逆転写酵素で変換したｃＤＮＡとの相補鎖の形成量を蛍光強度により測定し、当該測定結果からサンプル細胞に発現している遺伝子発現量を検出する技術がある。

この遺伝子発現量は、異なった条件下や異なった細胞間で相互比較して、その差異を抽出、解析することで有用性を発揮する。この相互比較では、そもそも比較可能であるかという点と、比較した際に相互間にどの程度の差異があれば有意な差異と認められるかという点が重要な要素となる。

前者の点に関して、既存の解析手法では一応の注意が払われており、マイクロアレイチップ間の規格化手法が数多く提案されている。しかしながら、後者の点に関しては、一般には、増加した遺伝子発現量だけに着目し、しかも比較対象の基準であるコントロールに対して２ 倍という経験的な値を基準とし、その値よりも大きければ増加という変化があったものとされる（例えば非特許文献１参照)。
Ido Amit, Ami Citri,Tal Shay,他、A module of negativefeedback regulators defines growth factor signaling、NATURE GENETICS、VOLUME39,NUMBER4,APRIL,2007、p.503-512

一方、減少変化した遺伝子発現量は、増加変化した遺伝子発現量と同様に、生物学的な意義を精査する上では重要な要素である。しかしながら、減少変化する遺伝子発現量については、当該分野では着目されずに破棄されているか、または解析の対象外とされる状況にある。

本発明は以上の点を考慮してなされたもので、従来よりも詳細に遺伝子を解析させ得る遺伝子検定方法、遺伝子検定プログラム及び遺伝子検定装置を提案しようとするものである。

かかる課題を解決するため本発明は、遺伝子検定方法であって、同一遺伝子における複数の測定時刻の発現量を示す時系列データを、複数の標的遺伝子についてそれぞれ取得する取得ステップと、時系列データに示される発現量を、基準とすべき測定時刻の発現量との比率に変換する変換ステップと、複数の標的遺伝子における時系列データごとに、最小となる比率と、最大となる比率とを抽出する抽出ステップと、最小となる比率の個数を測定時刻の時系列として表す分布でピークをとる第１の比率と、最大となる比率の逆数の個数を測定時刻の時系列として表す分布でピークをとる第２の比率との少なくとも一方を分類ボーダーとして、複数の標的遺伝子を分類する分類ステップとを有する。

また本発明は、遺伝子検定プログラムであって、取得部に対して、同一遺伝子における複数の測定時刻の発現量を示す時系列データを、複数の標的遺伝子についてそれぞれ取得することを実行させ、演算部に対して、時系列データに示される発現量を、基準とすべき測定時刻の発現量との比率に変換すること、複数の標的遺伝子における時系列データごとに、最小となる比率と、最大となる比率とを抽出すること、最小となる比率の個数を測定時刻の時系列として表す分布でピークをとる第１の比率と、最大となる比率の逆数の個数を測定時刻の時系列として表す分布でピークをとる第２の比率との少なくとも一方を分類ボーダーとして、複数の標的遺伝子を分類すること実行させる。

また本発明は、遺伝子検定装置であって、同一遺伝子における複数の測定時刻の発現量を示す時系列データを、複数の標的遺伝子についてそれぞれ取得する取得部と、時系列データに示される発現量を、基準とすべき測定時刻の発現量との比率に変換する変換部と、複数の標的遺伝子における時系列データごとに、最小となる比率と、最大となる比率とを抽出する抽出部と、最小となる比率の個数を測定時刻の時系列として表す分布でピークをとる第１の比率と、最大となる比率の逆数の個数を測定時刻の時系列として表す分布でピークをとる第２の比率との少なくとも一方を分類ボーダーとして、複数の標的遺伝子を分類する分類部とを有する。

細胞内では各種物質が一定量に保つこと（ホメオスタシス）が一般に知られていることから、遺伝子発現量も一定量に保つ機能が存在するものと考えられる。一方、本発明により抽出される最小値の個数分布でピークは、対象とされる複数の遺伝子に対する発現量が細胞内でそれぞれ最小となるときのピークを示すものである。したがって、このピークは、標的細胞では恒常性によりもとに復帰し得る下位臨界点をもつ遺伝子が密集する部分という生物学的な意味を有すると考えることができ、このことからも、標的細胞において有意に減少したか否かのボーダーとして生物学的に意義のあるものとなる。

本発明は、このピークをとる値をボーダーとした場合、そのボーダーよりも低い最小値をとる遺伝子を、有意に減少した遺伝子とすることが可能となる。有意に減少した遺伝子を分類可能ということは、標的細胞において減少傾向にある遺伝子を着目せずに全て破棄していた従来に比べると、該標的細胞について網羅解析する上で極めて有用となる。

一方、本発明により抽出される最大値の逆数の個数分布でピークは、対象とされる複数の遺伝子に対する発現量が細胞内でそれぞれ最大となるときのピークを示すものである。したがって、このピークは、標的細胞では恒常性によりもとに復帰し得る上位臨界点をもつ遺伝子が密集する部分という生物学的な意味を有しているものと考えることができ、標的細胞において有意に増加したか否かのボーダーとして生物学的に意義のあるものとなる。

本発明は、このピークをとる値をボーダーとした場合、そのボーダーよりも高い最大値をとる遺伝子を、有意に増加した遺伝子とすることが可能となる。有意に増加した遺伝子を分類可能ということは、標的細胞での各遺伝子の発現動向を無視して、おおざっぱに発現量がコントロールの２倍となる遺伝子に着目していた従来に比べると、該標的細胞について網羅解析する上で極めて有用となる。

以下図面について本発明の一実施の形態を詳述する。

（１）遺伝子解析システムの全体構成
図１において、本実施の形態による遺伝子解析システム１の全体構成を示す。この遺伝子解析システム１には、蛍光強度読取装置３と、遺伝子検定装置４とが含まれた構成とされる。

蛍光強度読取装置３は、測定ステージを有し、該測定ステージには核酸チップＣＰがセットされる。核酸チップＣＰは、標的細胞における全遺伝子に対応する核酸プローブが配される基盤である。

この核酸チップＣＰでは、例えば図２に示すように、核酸プローブに（長波線で示す部分）対して、標的生物の細胞から抽出され、標識物質（黒丸で示す部分）を付加された標的核酸（短波線で示す部分）が与えられ、相補鎖の形成反応（以下、これをハイブリダイゼーションとも呼ぶ）が行われる。

核酸プローブは、一般には、特定の遺伝子における全塩基配列に対となるヌクレオチドではなく、当該遺伝子において特異的とされる複数の塩基配列部分にそれぞれ対となるヌクレオチド断片（以下、これをプローブセットとも呼ぶ）としてデザインされる。また、各プローブセットに対するコントロールもデザインされる。プローブセットとコントロールとは、対ごとに、核酸チップＣＰに割り当てられた所定の領域に配列される。ちなみに、プローブ断片は、具体的には、１８〜６０[mer]程度のＤＮＡ(deoxyribonucleic acid) 断片、ｃＤＮＡ(complementary DNA) 断片又はＰＮＡ(peptide nucleic acid)などが適用される。

一方、標的核酸は、核酸プローブとのハイブリダイゼーション対象とされる１本鎖のヌクレオチドである。一般に、標的核酸は、ｍＲＮＡ（pre-ｍＲＮＡを含む）又はその断片そのものが用いられるのではなく、該ｍＲＮＡ又はその断片を逆転写酵素により変換したものが用いられる。

他方、標識物質は、一般に、ビオチンまたはＦＩＴＣ(fluorescein isothiocyanate)等の蛍光色素とされるが、これに限定されるものではなく、例えば放射性同位元素等としてもよい。

蛍光強度読取装置３（図１）は、測定指令が与えられた場合、測定ステージにセットされる核酸チップＣＰに対して、標的核酸に付加される標識物質の励起光を照射する。核酸チップＣＰに配される各遺伝子に対応する核酸プローブが標的核酸と相補鎖を形成している場合、該標的核酸に付加された標識物質が励起光により発光する。この発光量は、標的核酸と核酸プローブとの相補鎖の形成量と相関があり、該核酸プローブと相補鎖が形成される標的核酸の量が多いほど発光量が強くなる。

また蛍光強度読取装置３は、励起光を照射した後に核酸プローブ及びコントロールでの発光量を読み取り、読み取った発光量のデータ（以下、これを蛍光強度データと呼ぶ）を出力するようになされている。

遺伝子検定装置４は、例えば図３に示すように、継代した標的細胞から所定期間ごとに抽出される標的核酸と、同一の製品番号でなる別の核酸チップＣＰの核酸プローブとのハイブリダイゼーション結果から、読取時間ｔ_ｍ（ｍは自然数）ごとに標的生物における細胞での遺伝子Ｇ_ｎ（ｎは自然数）の発現量ＧＥ_ｎを取得する。

そして遺伝子検定装置４は、遺伝子発現量ＧＥ_ｎから、遺伝子の分類に関するボーダー値（以下、これを分類ボーダー値とも呼ぶ）を決定し、該決定した分類ボーダー値と遺伝子発現量ＧＥ_ｎとを用いて遺伝子Ｇ_ｎを分類するようになされている。

（２）遺伝子検定装置の回路構成
次に、遺伝子検定装置４の構成について説明する。この遺伝子検定装置４は、図４に示すように、該遺伝子検定装置４全体の制御を司るＣＰＵ(Central Processing Unit)１０に対して各種ハードウェアを接続することにより構成される。

具体的には、例えば、ＲＯＭ(Read Only Memory)１１、ＣＰＵ１０のワークメモリとなるＲＡＭ(Random Access Memory)１２、操作部１３、記憶部１４、インターフェース１５及び表示部１６がバス１７を介して接続される。

ＲＯＭ１１には、遺伝子発現量を検定するためのプログラム（以下、これを遺伝子検定プログラムとも呼ぶ）が格納され、またインターフェイス１５は、蛍光強度読取装置３に対して有線又は無線を通じてアクセス可能とされる。

ＣＰＵ１０は、ＲＯＭ１１に格納された遺伝子検定プログラムをＲＡＭ１２に展開した場合、該遺伝子検定プログラムに基づいて記憶部１４、インターフェース１５及び表示部１６を適宜制御し、遺伝子検定処理を実行するようになされている。

（３）遺伝子検定プログラムに基づくＣＰＵの処理内容
遺伝子検定プログラムをＲＡＭに展開したＣＰＵ１０は、機能的には、図４に示したように、蛍光強度取得部２１、発現量演算部２２、基準決定部２３及び分類部２４の各部に分けることができる。

蛍光強度取得部２１は、操作部１３から、核酸チップＣＰに対する蛍光強度の読取要求を待ち受け、該読取要求を受けた場合、インターフェース１５を用いて、該インターフェース１５に接続される蛍光強度読取装置３に対して読取要求する。

また蛍光強度取得部２１は、読取要求の応答として、蛍光強度読取装置３から蛍光強度を取得した場合、例えば取得日付及び取得番号を、当該核酸チップＣＰに関する識別子のデータ（以下、これをチップ識別データと呼ぶ）として生成するようになされている。

発現量演算部２２は、蛍光強度取得部２１が蛍光強度データを取得した場合、該蛍光強度データに基づいて、プローブセットごとに遺伝子発現量を算出し、該算出した各プローブセットでの遺伝子発現量を示すデータ（以下、これを発現量データと呼ぶ）をチップ識別データと関連付けて、記憶部１４に保存するようになされている。

遺伝子発現量は、標的細胞内において発現している遺伝子を示す推定量であり、標的核酸と核酸プローブとの相補鎖の形成量に相関する発光量から、該発光量の割合として算出される。

この実施の形態の場合、遺伝子発現量は、Affymetrix社のＭＡＳ(Micro Array Suite)と呼ばれるデータ解析ソフトウェアのバージョン５を用いて算出される。

ここで、このＭＡＳ５を、１つのプローブセットに着目して簡単に説明する。ＭＡＳ５では、（１）プローブセットにおける各プローブ断片での発光量から、局所的な物理的影響（バックグランド）が排除される。（２）各プローブ断片（パーフェクトマッチプローブと呼ばれる）の発光量が、当該プローブ断片と対応する断片コントロール（ミスマッチプローブと呼ばれる）との差に応じて適宜補正される。（３）各プローブ断片（パーフェクトマッチプローブと呼ばれる）の発光量が対数変換により遺伝子発現量として算出される。

詳細には、Ｉ．Ｓ．Ｋｏｈａｎｅ／Ａ．Ｔ．Ｋｈｏ／Ａ．Ｊ．Ｂｕｔｔｅ 星田有人著、統合ゲノミクスのためのマイクロアレイデータアナリシス、シュプリンガー・ジャパン出版、ｐ．５８−７４を参照されたい。

基準決定部２３は、操作部１３から、分類ボーダー値の決定開始要求を待ち受け、該決定開始要求を受けた場合、２以上のチップ識別データ（または当該チップ識別データに関連付けられる発現量データ）が記憶部１４に保存されている否かを認識する。

ここで、２以上のチップ識別データ（または発現量データ）が記憶部１４に存在しない場合、このことは、標的細胞に対する遺伝子発現量の時間変化の情報が取得されていないことを意味する。この場合、基準決定部２３は、その旨を、例えば表示部１６を介して通知する。

これに対して、２以上のチップ識別データ（または発現量データ）が記憶部１４に存在する場合、基準決定部２３は、該記憶部１４に保存される全てのチップ識別データと、該チップ識別データに関連付けられた発現量データとを用いて分類ボーダー値を決定する。

すなわち、基準決定部２３は、例えば図５に示すように、各読取時間ｔ_ｍのうち基準とすべき例えば読取時間ｔ_１を決定し（図５（Ａ））、各読取時間ｔ_ｍの遺伝子発現量ＧＥ_ｎを、基準として決定した読取時間ｔ_１の遺伝子発現量との比率に変換する（図５（Ｂ））。この結果、初期の遺伝子発現量を基準としたときの、当該遺伝子Ｇ_ｎでの変化の割合が得られることとなる。ちなみに、図５における各遺伝子発現量ＧＥ_ｎの値は便宜的に示したものであり、実際の数値ではない。

また基準決定部２３は、例えば図６に示すように、遺伝子Ｇ_ｎごとに、最大となる比率（以下、これを最大発現量比率とも呼ぶ）ＧＥ_ｎＭＡＸと、最小となる比率（以下、これを最小発現量比率とも呼ぶ）ＧＥ_ｎＭＩＮとを抽出する。

そして基準決定部２３は、各遺伝子Ｇ_ｎにおける最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸの逆数の個数分布でピークをとる比率（以下、これを最大逆比率分布ピーク値とも呼ぶ）と、各遺伝子Ｇ_ｎにおける最小発現量比率ＧＥ_ｎＭＩＮの個数分布でピークをとる比率（以下、これを最小比率分布ピーク値とも呼ぶ）とを分類ボーダー値として決定する。なお、最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸの「逆数」の分布としたのは、最小発現量比率の分布幅と同一とするためである。

ここで、実験結果を図７〜図１０に示す。図７はＥ−ＧＥＯＤ−１０３６をサンプルとし、Ｋ５６２細胞に対してｈｅｍｉｎを刺激として与えたときの所定測定時間ごとの最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸの逆数の個数分布（図７（Ａ））と、最小発現量比率ＧＥ_ｎＭＩＮの個数分布（図７（Ｂ））を示したものである。この実験での測定時間は、０，６，１２，２４，４８，７２〔ｈｏｕｒ〕経過時点であり、遺伝子数は６９３６〔個〕である。

また図８はＥ−ＧＥＯＤ−６０１３をサンプルとし、Ａ５４９細胞に対してアスベストを刺激として与えたときの所定測定時間ごとの最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸの逆数の個数分布（図８（Ａ））と、最小発現量比率ＧＥ_ｎＭＩＮの個数分布（図８（Ｂ））、および、Ａ５４９細胞に対して刺激を与えずに所定測定時間ごとの最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸの逆数の個数分布（図８（Ｃ））と、最小発現量比率ＧＥ_ｎＭＩＮの個数分布（図８（Ｄ））を示したものである。この実験での測定時間は、０，１，６，２４，４８〔ｈｏｕｒ〕，７〔ｄａｙｓ〕経過時点である。またこの実験での遺伝子数は、図８（Ａ）及び図８（Ｂ）では１６８９６〔個〕であり、図８（Ｃ）及び図８（Ｄ）では１６４５３〔個〕である。

また図９はＥ−ＧＥＯＤ−６０１３をサンプルとし、Ｂｅａｓ２Ｂ細胞に対してアスベストを刺激として与えたときの所定測定時間ごとの最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸの逆数の個数分布（図９（Ａ））と、最小発現量比率ＧＥ_ｎＭＩＮの個数分布（図９（Ｂ））、および、Ｂｅａｓ２Ｂ細胞に対して刺激を与えずに所定測定時間ごとの最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸの逆数の個数分布（図９（Ｃ））と、最小発現量比率ＧＥ_ｎＭＩＮの個数分布（図９（Ｄ））を示したものである。この実験での測定時間は、０，１，６，２４，４８〔ｈｏｕｒ〕経過時点である。またこの実験での遺伝子数は、図９（Ａ）及び図９（Ｂ）では１６８９６〔個〕であり、図９（Ｃ）及び図９（Ｄ）では１８１５９〔個〕である。

また図１０はＥ−ＧＥＯＤ−５２６４をサンプルとし、３人のヒト気管支上皮細胞における所定測定時間ごとの最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸの逆数の個数分布（図１０（Ａ）、図１０（Ｃ）、図１０（Ｅ））と、最小発現量比率ＧＥ_ｎＭＩＮの個数分布（図１０（Ｂ）、図１０（Ｄ）、図１０（Ｆ））を示したものである。この実験での測定時間は、図１０（Ａ）及び図１０（Ｂ）では０，１，４，８，１０，１４，２１，２８〔ｄａｙｓ〕であり、図１０（Ｃ）及び図１０（Ｄ）では０，４，８，１０，１２，１４，１７，２１，２８〔ｄａｙｓ〕であり、図１０（Ｅ）及び図１０（Ｆ）では０，１，２，４，８，１０，１２，１４，１７，２１，２８〔ｄａｙｓ〕である。またこの実験での遺伝子数は、図１０（Ａ）及び図１０（Ｂ）では１６２３８〔個〕であり、図１０（Ｃ）及び図１０（Ｄ）では１６０４７〔個〕であり、図１０（Ｅ）及び図１０（Ｆ）では１５８５４〔個〕である。

なお、図７〜図９及び図１０（Ａ）、図１０（Ｃ）、図１０（Ｅ）における比率は０〜１を１０分割したもの、つまり「１」は０以上０．１未満、「２」は０．１以上０．２未満、……、「１０」は０．９以上１未満である。一方、図１０（Ｂ）、図１０（Ｄ）、図１０（Ｆ）における比率は０〜１を２０分割したもの、つまり「１」は０以上０．０５未満、「２」は０．０５以上０．１未満、……、「２０」は０．９５以上１未満である。

これら図７〜図１０からも明らかなように、最小発現量比率の分布と、最大発現量比率の逆数の分布とは一定ではなくピークを有していることが分かる。ただし、最大発現量比率の逆数の分布では、基準「１」を最大値として扱う関係上、０．９（又は０．９５）以上１未満における比率部分以外のピークが対象とされる。

最小発現量比率の分布と、最大発現量比率の逆数の分布の形状は細胞種によって異なるが、当該分布には細胞種にかかわらずピークが出現するということが本出願人により確認されている。

また、これらピークをとる比率は、細胞種にかかわらず、最小発現量比率の分布及び最大発現量比率の逆数の分布ともに、「０．７」を中心とする一定の範囲内に収まることも本出願人により確認されている。

細胞内では各種物質が一定量に保たれていることが一般に知られ（ホメオスタシス）、また細胞内におけるＡＴＰ(アデノシン３リン酸)量と同調して、ｍＲＮＡの構成材料となるＣＴＰ，ＧＴＰ，ＵＴＰも一定となることが示唆されている（例えば、Faziol I. Ataullakhanov & Victor M. Vitvitsky, What determines the intracellular ATP oncentration, Bioscience Reports vol.22, Nos5&6,October & December 2002, p.501-p.511）。

このことから、細胞内では遺伝子発現量も一定量に保つ機能が存在するものと考えられる。一方、最小比率分布ピーク値は、対象とされる複数の遺伝子に対する発現量が細胞内でそれぞれ最小となるときのピークを示すものである。そうすると、このピークは、標的細胞では恒常性によりもとに復帰し得る下位臨界点をもつ遺伝子が密集する部分という生物学的な意味を有すると考えられる。このことからも、このピークは、標的細胞において有意に減少したか否かの減少ボーダーとして生物学的に意義のあるものということができる。

他方、最大逆比率分布ピーク値は、対象とされる複数の遺伝子に対する発現量が細胞内でそれぞれ最大となるときのピークを示すものである。このピークは、標的細胞では恒常性によりもとに復帰し得る上位臨界点をもつ遺伝子が密集する部分という生物学的な意味を有すると考えられる。このことからも、このピークは、標的細胞において有意に増加したか否かの増加ボーダーとして生物学的に意義のあるものということができる。

分類部２４は、基準決定部２３によって分類ボーダー値として決定された最小比率分布ピーク値及び最大逆比率分布ピーク値を用いて、遺伝子を各種グループに分類する。

具体的には、最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸ＞最大逆比率分布ピーク値、かつ、最小発現量比率ＧＥ_ｎＭＩＮ＞最小比率分布ピーク値となる比率をもつ遺伝子は、有意に増加した遺伝子グループとして割り当てる。この遺伝子グループに属する遺伝子は、概略的には例えば図１１に示すような発現動向となる。

一方、最小発現量比率ＧＥ_ｎＭＩＮ＜最小比率分布ピーク値、かつ、最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸ＜最大逆比率分布ピーク値となる比率をもつ遺伝子は、有意に減少した遺伝子グループとして割り当てる。この遺伝子グループに属する遺伝子の発現量は、概略的には例えば図１２に示すような発現動向となる。

他方、最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸ＜最大逆比率分布ピーク値、かつ、最小発現量比率ＧＥ_ｎＭＩＮ＞最小比率分布ピーク値となる比率をもつ遺伝子は、増減の乏しい遺伝子グループとして割り当てる。この遺伝子グループに属する遺伝子は、概略的には例えば図１３に示すような発現動向となる。

また、最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸ＞最大逆比率分布ピーク値、かつ、最小発現量比率ＧＥ_ｎＭＩＮ＜最小比率分布ピーク値となる比率をもつ遺伝子は、有意に増減する乃至実験不良の遺伝子グループとして割り当てる。有意に増減する遺伝子は、概略的には例えば図１４に示すような発現動向となる。

また分類部２４は、遺伝子を各種グループに分類した場合、当該分類結果を例えばグラフとして適宜表示部１６に表示するようになされている。

（４）遺伝子検定処理手順
次に、遺伝子検定プログラムに基づくＣＰＵ１０の処理手順について、図１５及び図１６に示すフローチャートを用いて説明する。

すなわちＣＰＵ１０は、例えば電源投入操作をトリガーとしてこの遺伝子検定処理手順を開始し、ステップＳＰ１において核酸チップＣＰでの蛍光強度の読取要求を待ち受け、ステップＳＰ２において分類ボーダー値の決定開始要求を待ち受ける。

ＣＰＵ１０は、蛍光強度の読取要求を受けた場合、ステップＳＰ３に進んで、蛍光強度読取装置３に対して測定を開始させ、当該測定結果として蛍光強度読取装置３から与えられる蛍光強度データを取得する。そしてＣＰＵ１０は、蛍光強度データから遺伝子発現量を示す発現量データを生成し、これを記憶部１４に保存した後にステップＳＰ１に戻る。

一方、ＣＰＵ１０は、分類ボーダー値の決定開始要求を受けた場合、ステップＳＰ４に進んで、記憶部１４に保存されているデータに基づいて、分類ボーダー値の決定に要する条件を満たすか否かを判定する。

ＣＰＵ１０は、記憶部１４に２以上の発現量データが存在していない場合には、ステップＳＰ５に進んで、分類ボーダー値の決定ができない旨及びその原因を通知し、ステップＳＰ１に戻る。

これに対してＣＰＵ１０は、記憶部１４に２以上の発現量データが存在する場合には、ステップＳＰ６に進んで、各遺伝子発現量ＧＥ_ｎを、読取期間ｔ_ｍのいずれかを基準として、比率に変換し（図５）、次のステップＳＰ７において、遺伝子ごとに、最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸ及び最小発現量比率ＧＥ_ｎＭＩＮを抽出する（図６）。

またＣＰＵ１０は、続くステップＳＰ８に進んで、最小比率分布ピーク値を減少ボーダーとして、最大逆比率分布ピーク値を増加ボーダーとしてそれぞれ決定した後（図７、図８）、続くステップＳＰ９〜ステップＳＰ１５において遺伝子を分類する。

すなわちＣＰＵ１０は、ステップＳＰ９に進んで、対象とすべき遺伝子Ｇ_ｎを決定し、該決定した遺伝子Ｇ_ｎの最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸと、ステップＳＰ８で決定した増加ボーダー（最大逆比率分布ピーク値）とを比較する。

またＣＰＵ１０は、対象とした遺伝子の最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸが増加ボーダーよりも大きいものとなる場合にはステップＳＰ１０に進み、該最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸが増加ボーダーよりも小さいものとなる場合にはステップＳＰ１１に進む。そしてＣＰＵ１０は、このステップＳＰ１０又はステップＳＰ１１において、対象とした遺伝子Ｇ_ｎの最小発現量比率ＧＥ_ｎＭＩＮと、ステップＳＰ８で決定した減少ボーダー（最小比率分布ピーク値）とを比較する。

ここで、ステップＳＰ９での比較結果として、最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸが増加ボーダーよりも大きいものとなり、ステップＳＰ１０での比較結果として、最小発現量比率ＧＥ_ｎＭＩＮが減少ボーダーよりも小さいものとなる場合、ＣＰＵ１０は、ステップＳＰ１２に進んで、このとき対象とした遺伝子Ｇ_ｎを、有意に増減する乃至実験不良の遺伝子グループとして割り当てる（図１４）。

一方、ステップＳＰ９での比較結果として、最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸが増加ボーダーよりも大きいものとなり、ステップＳＰ１０での比較結果として、最小発現量比率ＧＥ_ｎＭＩＮが減少ボーダーよりも大きいものとなる場合、ＣＰＵ１０は、ステップＳＰ１３に進んで、このとき対象とした遺伝子Ｇ_ｎを、有意に増加した遺伝子グループとして割り当てる（図１１）。

他方、ステップＳＰ９での比較結果として、最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸが増加ボーダーよりも小さいものとなり、ステップＳＰ１１での比較結果として、最小発現量比率ＧＥ_ｎＭＩＮが減少ボーダーよりも小さいものとなる場合、ＣＰＵ１０は、ステップＳＰ１４に進んで、このとき対象とした遺伝子Ｇ_ｎを、有意に減少した遺伝子グループとして割り当てる（図１２）。

また、ステップＳＰ９での比較結果として、最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸが増加ボーダーよりも小さいものとなり、ステップＳＰ１１での比較結果として、最小発現量比率ＧＥ_ｎＭＩＮが減少ボーダーよりも大きいものとなる場合、ＣＰＵ１０は、ステップＳＰ１５に進んで、このとき対象とした遺伝子Ｇ_ｎを、増減の乏しい遺伝子グループとして割り当てる（図１３）。

このようにしてＣＰＵ１０は、ステップＳＰ１６において全ての遺伝子Ｇ_ｎを分類したと判定するまで、上述のステップＳＰ９乃至ステップＳＰ１５の分類ループを繰り返す。一方、ＣＰＵ１０は、ステップＳＰ１６において全ての遺伝子Ｇ_ｎを分類したと判定した場合、この遺伝子検定処理手順を終了するようになされている。

（５）動作及び効果
以上の構成において、この遺伝子検定装置４は、標的となる複数の遺伝子Ｇ_ｎに対する各読取時間ｔ_ｍでの発現量ＧＥ_ｎを示すデータを取得し（図３）、該各遺伝子Ｇ_ｎの遺伝子発現量ＧＥ_ｎを、読取時間ｔ_１の遺伝子発現量との比率に変換する（図５（Ｂ））。

そして遺伝子検定装置４は、遺伝子Ｇ_ｎごとに、最小となる比率（最小発現量比率ＧＥ_ｎＭＩＮ）と、最大をなる比率（最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸ）とを抽出する（図６）。

この後、遺伝子検定装置４は、最大となる比率の個数分布（図７（Ａ））でピークをとる比率（最大逆比率分布ピーク値）と、最小となる比率の逆数の個数分布（図７（Ｂ））でピークをとる比率（最小比率分布ピーク値）を用いて、各遺伝子Ｇ_ｎを分類する。

最小比率分布ピーク値は、上述したように、標的細胞では恒常性によりもとに復帰し得る下位臨界点をもつ遺伝子が密集する部分という生物学的な意味を有すると考えることができる。つまりこの遺伝子検定装置４では、各遺伝子Ｇ_ｎにおける発現動向全体のなかで、下位臨界点をもつであろう遺伝子群が多い発現部分が減少ボーダーとされる。

したがって、標的細胞での各遺伝子Ｇ_ｎの発現動向を無視して、減少傾向にある遺伝子を着目せずに全て破棄していた従来に比べると、この遺伝子検定装置４は、標的細胞において、網羅解析すべき発現動向が減少する遺伝子として有意となるものを提示することが可能となる。このことは、遺伝子を網羅解析する（生物学的な意義を精査する）上では極めて有用となる。

一方、最大逆比率分布ピーク値は、上述したように、標的細胞では恒常性によりもとに復帰し得る上位臨界点をもつ遺伝子が密集する部分という生物学的な意味を有すると考えることができる。つまりこの遺伝子検定装置４では、各遺伝子Ｇ_ｎにおける発現動向全体のなかで、上位臨界点をもつであろう遺伝子群が多い発現部分が増加ボーダーとされる。従来では増加傾向にある遺伝子とされる基準はおおよそコントロールの２倍、当該比率に換算すれば「０．５」で固定とされていた。

したがって、標的細胞での各遺伝子Ｇ_ｎの発現動向を無視して、おおざっぱに発現量がコントロールの２倍となる遺伝子に着目していた従来に比べると、この遺伝子検定装置４は、標的細胞において、網羅解析すべき発現動向の大きい遺伝子として有意となるものを提示することが可能となる。このことも、遺伝子を網羅解析する（生物学的な意義を精査する）上では極めて有用となる。

これに加えて、各遺伝子Ｇ_ｎの発現量ＧＥ_ｎから、分類基準としての最小比率分布ピーク値と、最大逆比率分布ピーク値とが求められるため、当該基準を得るためのコントロールがなくても、発現量データ間におけるボーダーを決定することが可能となる。このことは、操作性や精度等の観点からみると極めて有用となる。

また、この遺伝子検定装置４では、これら最小比率分布ピーク値及び最大逆比率分布ピーク値の双方を用いているので、最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸ＜最大逆比率分布ピーク値、かつ、最小発現量比率ＧＥ_ｎＭＩＮ＞最小比率分布ピーク値となる比率をもつ遺伝子を、増減の乏しい遺伝子グループとして割り当てることもできる。加えて、最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸ＞最大逆比率分布ピーク値、かつ、最小発現量比率ＧＥ_ｎＭＩＮ＜最小比率分布ピーク値となる比率をもつ遺伝子を、有意に増減する乃至実験不良の遺伝子グループとして割り当てることもできる。なお、有意に増減する乃至実験不良である可能性を示唆できるということは、遺伝子を網羅解析する（生物学的な意義を精査する）上では極めて有用となる。

また、この遺伝子検定装置４は、発現量データとして、複数の核酸プローブごとに、標的核酸との相補鎖形成量がセンサ（蛍光強度読取装置３）によって読み取られ、該読み取られた物理量（発光量）が、当該核酸プローブに対するコントロールでの物理量（発光量）の差に応じて補正された後に割合として変換されたものを対象とする。

センサ（蛍光強度読取装置３）から読み取られた物理量（発光量）そのものを対象とする場合に比して、バックグラウンド（局所的な物理的影響）等が排除されるので、発現量データは要求される相補鎖形成量に近似した信頼性の高いものとなる。

したがって、この遺伝子検定装置４は、センサ（蛍光強度読取装置３）から読み取られた物理量（発光量）そのものを対象とする場合に比して、分類基準としての最小比率分布ピーク値と、最大逆比率分布ピーク値とを極めて信頼性が高いものとして得ることができる。このことは、本出願人による実験結果からも確認されている。

なお、核酸プローブは、標的細胞での遺伝子の発現動向を加味した上で、分類基準としての最小比率分布ピーク値及び最大逆比率分布ピーク値を得るものであるから、その細胞における遺伝子に対応するプローブ数が多いほど、当該最小比率分布ピーク値及び最大逆比率分布ピーク値の信頼性はあがる。したがって、核酸プローブ数は、標的細胞において発現され得る総遺伝子に対応する数とすれば、最小比率分布ピーク値及び最大逆比率分布ピーク値の信頼性については最も高いものとなる。

以上の構成によれば、各遺伝子Ｇ_ｎにおける最小発現量比率ＧＥ_ｎＭＩＮの個数分布（図７（Ｂ））でピークをとる比率（最小比率分布ピーク値）と、各遺伝子Ｇ_ｎにおける最大発現量比率ＧＥ_ｎＭＡＸの逆数の個数分布（図７（Ａ））でピークをとる比率（最大逆比率分布ピーク値）を用いて、各遺伝子Ｇ_ｎを分類するようにしたことにより、従来よりも詳細に遺伝子を解析させ得る遺伝子検定装置４を実現できる。

（６）他の実施の形態
複数の標的遺伝子における発現量を示す、比較対象とすべき２以上のデータを取得する取得形態として、上述の実施の形態では、標的細胞における複数の遺伝子Ｇ_ｎにおける読取時間ｔ_ｍあたりの発現量ＧＥ_ｎを示す発現量データが取得された（図３）。しかしながら、取得形態はこの実施の形態に限定されるものではない。

例えば、ある刺激を標的細胞に与えた場合における発現量ＧＥ_ｎを示すデータと、該刺激とは異なる刺激を標的細胞に与えた場合における発現量ＧＥ_ｎを示すデータとを取得するといった形態も適用可能である。もっとも、ある刺激を標的細胞に与えた場合における読取時間ｔ_ｍあたりの発現量ＧＥ_ｎを示す発現量データと、該刺激とは異なる刺激を標的細胞に与えた場合における読取時間ｔ_ｍあたりの発現量ＧＥ_ｎを示すデータとを取得することも可能である。

また例えば、ある標的細胞に刺激を与えた場合における発現量ＧＥ_ｎを示すデータと、該標的細胞とは異なる細胞に該刺激と同じ刺激を与えた場合における発現量ＧＥ_ｎを示すデータとを取得するといった形態も適用可能である。なお、標的細胞は、異生物の同一組織であっても、同生物の異組織であってもよい。

また、発現量データは、上述の実施の形態では、蛍光強度読取装置３から読み取られた蛍光強度から遺伝子発現量を算出することにより得られた。しかしながら、この形態に限定されるものではない。

例えば、標的細胞で発現される各ｍＲＮＡを抽出し、これらをリアルタイムＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)を用いて、一定量に増殖することにより直接的に取得するといった形態も適用可能である。

また例えば、データ格納媒体から蛍光強度を示すデータを読み取り、該読み取った蛍光強度から遺伝子発現量を算出することにより得るといった形態も適用可能である。また例えば、データ格納媒体から遺伝子発現量を示すデータを読み取ることにより取得するといった形態も適用可能である。この形態を適用した場合、例えば遠方となる様々な実験場所で得られたデータを用いて、より多くの遺伝子発現量から分類基準を求めることが可能となり、この結果、より一段と網羅的な解析を行うことができる。

なお、データ格納媒体としては、例えばフレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ（Compact Disk-Read Only Memory）、ＤＶＤ（Digital Versatile Disc）等のパッケージメディアや、データが一時的若しくは永続的に格納される半導体メモリや磁気ディスク等がある。またこれらデータ格納媒体からデータを取得する方法としては、ローカルエリアネットワークやインターネット、ディジタル衛星放送等の有線又は無線の通信媒体を利用することができる。

また、読取量として、上述の実施の形態では光学的に発光量を読み取るようにした。しかしながら、読取量はこの実施の形態に限定されるものではない。例えば、電磁学的に電気量又はインピーダンス量等を適用することもできる。要は、所定の物理量を読み取るセンサによって読み取られた読取量を適用することができる。なお、核酸チップＣＰとしては、例えば、Affymetrix社製、スタンフォード型等を適用することができ、これら以外のものを適用することもできる。

また、読取場所として、上述の実施の形態では核酸チップＣＰが対象とされた。しかしながら、読取場所はこれに限定されるものではない。例えば、組織切片を適用することができ、これ以外の場所も適用することができる。

また、遺伝子発現量の演算手法として、上述の実施の形態ではＭＡＳが適用された。しかしながら、演算手法はこれに限定されるものではない。例えば、ＲＭＡ等の既知のデータ解析ソフトウェア、その他の新規の演算手法を適用することができる。このことは既に本出願人により確認されている。要は、センサから読み取られた、相補鎖の形成量を示すデータを統計学的手法を用いて補正するものであればよい。

本発明は、遺伝子実験、医薬の創製又は患者の経過観察などのバイオ産業上において利用可能である。

遺伝子解析システムの全体構成を示す概略図である。 核酸チップでのハイブリダイゼーションの説明に供する略線図である。 標的細胞における各読取時間での遺伝子発現量の取得の説明に供する略線図である。 遺伝子検定装置の構成を示すブロック図である。 各遺伝子における発現量に対する基準との比率への変換の説明に供する略線図である。 各遺伝子における最大及び最小をとる発現量比率の抽出の説明に供する略線図である。 実験結果（１）を示すグラフである。 実験結果（２）を示すグラフである。 実験結果（３）を示すグラフである。 実験結果（４）を示すグラフである。 発現量が有意に増加する遺伝子の発現動向を示す概略図である。 発現量が有意に減少する遺伝子の発現動向を示す概略図である。 発現量の増減が乏しい遺伝子の発現動向を示す概略図である。 発現量が有意に増減する遺伝子の発現動向を示す概略図である。 遺伝子検定処理手順（１）を示すフローチャートである。 遺伝子検定処理手順（２）を示すフローチャートである。

符号の説明

１……遺伝子解析システム、３……蛍光強度読取装置、４……遺伝子検定装置、１０……ＣＰＵ、１１……ＲＯＭ、１２……ＲＡＭ、１３……操作部、１４……記憶部、１５……インターフェイス、１６……表示部、２１……蛍光強度取得部、２２……発現量演算部、２３……基準決定部、２４……分類部、ＣＰ……核酸チップ、Ｇ_１〜Ｇ_ｎ……遺伝子、ＧＥ_１〜ＧＥ_ｎ……遺伝子発現量。

Claims (9)

1. 同一遺伝子における複数の測定時刻の発現量を示す時系列データを、複数の標的遺伝子についてそれぞれ取得する取得ステップと、
   上記時系列データに示される発現量を、基準とすべき測定時刻の発現量との比率に変換する変換ステップと、
   複数の標的遺伝子における時系列データごとに、最小となる比率と、最大となる比率とを抽出する抽出ステップと、
   上記最小となる比率の個数を測定時刻の時系列として表す分布でピークをとる第１の比率と、上記最大となる比率の逆数の個数を測定時刻の時系列として表す分布でピークをとる第２の比率との少なくとも一方を分類ボーダーとして、上記複数の標的遺伝子を分類する分類ステップと
   を有する遺伝子検定方法。
2. 上記分類ステップでは、
   上記最小となる比率の個数を測定時刻の時系列として表す分布で、規定値を中心とする一定の範囲内となったピークをとる第１の比率と、上記最大となる比率の逆数の個数を測定時刻の時系列として表す分布で、上記規定値を中心とする一定の範囲内となったピークをとる第２の比率との少なくとも一方を分類ボーダーとする
   請求項１に記載の遺伝子検定方法。
3. 上記変換ステップでは、
   上記時系列データに示される発現量を、初期の測定時刻の発現量との比率に変換する
   請求項１又は請求項２に記載の遺伝子検定方法。
4. 上記最大となる比率が上記第１の比率よりも小さく、かつ、上記最小となる比率が上記第２の比率よりも大きい条件を満たす標的遺伝子以外の標的遺伝子を、有意に変化した遺伝子グループとして割り当てる
   請求項１に記載の遺伝子検定方法。
5. 上記最大となる比率が上記第１の比率よりも小さく、かつ、上記最小となる比率が上記第２の比率よりも小さい条件を満たす標的遺伝子を、減少した遺伝子グループとして割り当てる
   請求項２に記載の遺伝子検定方法。
6. 上記最大となる比率が上記第１の比率よりも大きい条件を満たす標的遺伝子を、増加した遺伝子グループとして割り当てる
   請求項２に記載の遺伝子検定方法。
7. 上記最大となる比率が上記第１の比率よりも大きく、かつ、上記最小となる比率が上記第２の比率よりも小さい条件を満たす標的遺伝子を、増減した遺伝子グループとして割り当てる
   請求項２に記載の遺伝子検定方法。
8. 取得部に対して、同一遺伝子における複数の測定時刻の発現量を示す時系列データを、複数の標的遺伝子についてそれぞれ取得すること
   を実行させ、
   演算部に対して、上記時系列データに示される発現量を、基準とすべき測定時刻の発現量との比率に変換すること、
   複数の標的遺伝子における時系列データごとに、最小となる比率と、最大となる比率とを抽出すること、
   上記最小となる比率の個数を測定時刻の時系列として表す分布でピークをとる第１の比率と、上記最大となる比率の逆数の個数を測定時刻の時系列として表す分布でピークをとる第２の比率との少なくとも一方を分類ボーダーとして、上記複数の標的遺伝子を分類すること
   を実行させる遺伝子検定プログラム。
9. 同一遺伝子における複数の測定時刻の発現量を示す時系列データを、複数の標的遺伝子についてそれぞれ取得する取得部と、
   上記時系列データに示される発現量を、基準とすべき測定時刻の発現量との比率に変換する変換部と、
   複数の標的遺伝子における時系列データごとに、最小となる比率と、最大となる比率とを抽出する抽出部と、
   上記最小となる比率の個数を測定時刻の時系列として表す分布でピークをとる第１の比率と、上記最大となる比率の逆数の個数を測定時刻の時系列として表す分布でピークをとる第２の比率との少なくとも一方を分類ボーダーとして、上記複数の標的遺伝子を分類する分類部と
   を有する遺伝子検定装置。

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