CN108323184A - 验证生物标志物测量 - Google Patents

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Abstract

用于验证生物标志物的定量的方法，该生物标志物利用选定类型的定量技术定量，并且该方法包括：针对生物受试者的至少一种相应的生物标志物确定多种(a plurality of)生物标志物值，每种生物标志物值指示测量值或从测量值衍生的值，并且所述多种生物标志物值至少部分地指示取自受试者的样品中的生物标志物的浓度；通过确定生物标志物值的组合确定至少一个对照值；将每个对照值与各自的对照参考比较；以及利用比较的结果确定生物标志物值是否有效。

Description

验证生物标志物测量
发明背景
本发明涉及用于验证在生成指示物(indicator)中使用的生物标志物值的测量的方法和设备(apparatus)，并且在一个实例中，涉及用于验证在确定生物受试者具有至少一种医学状况的可能性中使用的指示物的方法和设备。
现有技术说明
在本说明书中对任何之前的出版物(或来源于其的信息)或对任何已知的物质的引用不是并且不应当被视为确认或承认或以任何形式暗示该之前的出版物(或来源于其的信息)或已知的物质形成本说明书涉及的领域中的公知常识的一部分。
取自活生物体的样品中的基因表达(如RNA或蛋白)的测量具有实际应用，包括但不限于，确定疾病状态，确定疾病程度或严重度、疾病预后和早期鉴定，鉴定组织类型(正常的和患病的(包括癌症)两者)，鉴定并列举细胞混合物中的细胞类型，以及了解正常新陈代谢过程及其对外部因素或损害(包括损伤、伤口、烧伤、压力、病毒或细菌或寄生虫或真菌感染、锻炼、饮食、治疗剂(therapeutics)、毒素、疗法、治疗(treatments)和实验程序)的响应。从低通量(单个基因和基因产物)到高通量(外显子组和阵列)，存在很多本领域熟知的可用于测量基因表达(如RNA或蛋白)的方法，包括RNA印迹法、聚合酶链式反应(qPCR)、微阵列、RNA测序(RNA-seq)、靶向RNA测序、ELISA、EIA、质谱法、HPLC、SNP分析、和表观遗传技术(ChIP-Seq、染色体构象签名(Chromatin Conformational Signatures,CCA)、DNA甲基化分析)。
这些技术中的每一种对每种测量的产物产生一个值或一组值。在医学探索及其应用的背景中，这些值被称为“生物标志物”。任何基因表达产物(如RNA或蛋白)的测量值被定义为测量的生物标志物，如通过处理器械或装置(device)测量的。测量的生物标志物的实例包括特定蛋白的蛋白浓度、在RNA测序的情况中单种转录子的转录子计数、在微阵列的情况中外显子或转录子的表达值、在质谱法的情况中的m/z值或在流式细胞术的情况中的荧光值。测量的生物标志物可以被理解为‘原始数据’，如通过装置测量的。多生物标志物测定将平行地测量很多生物标志物，报告测量的生物标志物的集合。
指示值(indicator value)是被设计为关联、分类或以其他方式指示一些状况、其阶段、诊断或预后或不存在的值。例如按度报告的温度是发热的指示值。可以建立任意复合的指示物用于任何目的，并且在多生物标志物医疗装置的情况中，指示物将是生物标志物的某一组合，所述生物标志物的某一组合通过方程式生成与患者的某一状态或状况(或此类状态或状况的不存在)关联的指示值。
指示值的开发和使用要求基因表达(如RNA或蛋白)测量值的准确且有效的测量，并可通过使用以下两个关键步骤实现：归一化和对照。对照提供潜在的值是有效的检查，并且归一化是通过移除样品之间变异的非生物来源从而使样品可比的任何方法。
对照被用于确保失败的相关潜在模式可以被检测出。如果在对照中检测出失败，则可以宣布测定或实验失败，并且指示值(如果有)将因此也是无效的。在医疗装置的上下文中，对照防止当指示物的潜在输入可能是无效的时报告测试(指示值)的结果，从而避免操作器得出错误结论的可能。可以使用的对照包括以下(使用的这些对照部分取决于测定的使用者、应用以及开发阶段)：
●无模板对照(与其他反应平行运行，以确定污染的程度—对于PCR)
●依靠核酸扩增的测定的无扩增对照(例如，不包含聚合酶—这依靠FRET原则检查例如标记的探针的完整性—对于PCR)
●阳性对照(在测定应用期间使用以证实测试能够产生可报告范围内的结果的样品)。这并不意味着该对照的报告值将高于给定的阈值(例如对于疾病呈阳性)，仅仅意味着对照明确地能够产生在测试的可报告范围内的值。阳性对照可以是生物起源的或合成的(或两种的杂合体，诸如重组产物)，并且阳性对照可以是内部的(来自被测试的样品内)或外部的(平行地运行并且独立于被测试的样品)。阳性对照可以包括阳性或者阴性生物或合成对照。
●不包含逆转录酶的对照(以确定污染性DNA的程度，特别是在引物不是跨外显子/内含子边界设计时—对于PCR)
●掺入(spike-in)对照包括添加至任一待测试样品(在任何阶段)的人工核酸，并用于确定PCR抑制的程度以及用于阵列和RNA-seq中的质量对照(对于定量、灵敏度、覆盖率和线性度)。
在这些测量的对照中，可能最常用的是包含已知浓度的给定分析物的外部阳性对照以及掺入物。此类对照的应用通过必须购买试剂和对照本身，通过使用可以以其他方式用于靶标的实验性“不动产”，以及因为另外的物力和具有除了产生指示值所需的靶标之外的这些对照靶标而固有的复杂性，导致运行实验或测定的成本和复杂性。因此，减少在确定指示值的过程中不测量的另外的测量对照是有利的。
归一化是重要的步骤，其确保可以进行样品之间以及参考和样品之间的比较。归一化步骤的目标是移除无法归因于生物变化性(variability)的差异，诸如批次影响和其他技术变化来源，包括由浓度、时间、温度、装置、操作者或测定参数引起的那些其他技术变化性来源(包括未知的或测定使用者的控制之外的那些其他技术变化性来源)，诸如在经典工作流诸如以下描述的经典工作流中引入的那些其他技术变化性来源。
取决于方法，利用例如微阵列或PCR或RNA-seq测量基因表达通常包括以下步骤中的一些或所有(在测量生物标志物的大多数实验中需要相似类型的对照)：
●实验设计，包括功效计算和待使用的重复数
●从感兴趣的样品分离RNA或mRNA
●确定RNA质量和数量
●片段化和尺寸选择(对于RNA-seq)
●将RNA转化成互补DNA(cDNA)
●将cDNA转化成cRNA(对于某些微阵列)
●片段化和标记(对于阵列，或对于PCR使用标记的探针)
●检测
●数据捕获
●数据质量的确定
●数据归一化
●用于错误发现的对照。
需要控制(归一化)的一些实验方法变量在以下表1中详述，并且在适当的步骤下改编自Roche Applied Science Technical Note No.LC15/2002。
表1
因此，可以比较数据集，并且公众可得的数据是高质量的，用于基因表达分析实验的最小信息指南(minimum information guidelines)对于PCR和微阵列两者已经在科学杂志中发表(Bustin SA、Benes V、Garson JA、Hellemans J、Huggett J等.(2009)The MIQEGuidelines:Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCRExperiments.Clinical Chemistry 55:611–622)(Brazma A、Hingamp P、Quackenbush J、Sherlock G、Spellman P等(2001)Minimum information about a microarrayexperiment(MIAME)-toward standards for microarray data.Nat Genet 29:365–371)并且对于RNA-seq是公众可得的(MINSEQE-www.mged.org/minseqe/)。
使用测量的生物标志物归一化数据以对这些影响做出解释是常见的。例如，可以与样品平行地运行已知浓度的外部阳性对照。然后可以参考测量的外部阳性对照推测(归一化)样品中测量的生物标志物值的值。这是用于归一化的标准校准曲线背后的概念。使用测量的生物标志物的另一种常见归一化方法使用内部阳性对照；例如，在RNA测序实验中，可以假定某些基因(或基因的组)具有恒定的生物表达水平(这些基因是归一化生物标志物(normalizer biomarkers))。然后假定这些归一化生物标志物的测量值在样品间的差异是非生物性的。然后上调或下调每个样品的测量值，以使得每个样品中的归一化生物标志物具有相同的值，并且然后数据被称为归一化的。然后可以在样品之间直接比较每种生物标志物的归一化值，例如用于诊断医学状况。该概念的扩展也是已知的，例如稳健的微阵列分析(Robust Microarray Analysis)(Irizarry,RA、Hobbs,B、Collin,F、Beazer-Barclay,YD、Antonellis,KJ、Scherf,U、Speed,TP(2003)."Exploration,normalisation,andsummaries of high density oligonucleotide array probe level data.".Biostatistics 4(2):249–64)，其中每个样品的测量值被调整以使得每个样品的归一化值拟合相同的分布。
在实践中，微阵列和RNA-seq以及其他平台往往被用于早期“发现”或实验的调查阶段以生成覆盖外显子组或基因组或其调控机制的测量的生物标志物组(sets ofmeasured biomarkers)。在此类发现实验中生成的测量的生物标志物组可以是多达6,000个基因或转录子，或在串联质谱发现数据集的情况中多达1,000,000个峰。在每个数据集中通常存在远多于患者样品的测量的生物标志物。这直接导致错误发现问题，如生物标志物发现领域的技术人员将领会到的。错误发现是，当与考虑的状况不具有真正的生物关联的测量的生物标志物偶然发生了与所述状况的关联时。这些错误发现与真实发现是不可区别的，直到更多的患者样品已经被测试。
某些生物标志物已经被“发现”或显示与期望的实验终点显著关联之后，往往极少的生物标志物组连同极少的适当对照组一起被迁移至适当的临床装置，诸如qPCR或医疗点RNA测序(Point-Of-Care RNA-sequencing)平台。
qPCR当前具有比微阵列和RNA-seq(包括靶向RNA-seq)显著且在商业上有吸引力的优势，特别是当用于临床环境时。此类优势包括快速周转时间、有限的技师设置测定的上机时间、有限的运行测定所需的技术技能水平、PCR仪器的可接近性(accessibility)和可得性(availability)、PCR仪器的小的占位面积(footprint)、容易的结果解释、对支持信息技术基础设施(软件、算法、硬件、网络)的有限需要、有限的许可费用、试剂的可得性和成本。此类因素导致减少的出售货物成本和测定的市场接受的较高可能性。
相关生物标志物向qPCR的成功迁移目前受包括以下的很多因素限制：
●有限的多重能力
●有限的报告子染料(具有非重叠的发射光谱或具有良好的光谱分辨率)
●需要阳性对照和掺入物
●需要运行被动参考染料(passive reference dye)
●掺入对照的成本
●对照、特别是外部对照的成本和额外的复杂性
●样品准备限制。
此类因素通常将多重qPCR限制至最多两种至四种靶标，因为多达三种染料被用作对照(被动参考、内部、掺入物)。
因此，为了成本和实践原因，对于基因表达分析中较好的对照策略，并且特别是专门用于医疗装置的较好的对照策略存在需求。
基因表达分析中的对照的设计和应用的现有实践受到限制，并且通常基于使用掺入物(人工序列和天然存在的序列)和内部测量对照的主题的变化。例如，Vandesompele等(2002)(Vandesompele J、De Preter K、Pattyn F、Poppe B、Van Roy N等(2002)Accuratenormalisation of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging ofmultiple internal control genes.Genome Biol 3:RESEARCH0034)描述了多个内部对照基因(测量的生物标志物的集合)而不仅仅是单个内部对照基因的使用，以及鉴定用于组织特异性内部对照基因使用的在不同组织中稳定表达的基因的方法。作者建议不同组织可以需要使用不同的内部对照基因，并且多于一种内部对照基因的使用提供了相对于归一化更一致的结果。在这一公开之前，通常公认的是，单个基因对于归一化是足够的，并且基因GAPDH、β-2微球蛋白或18S核糖体跨所有组织和所有状况稳定表达，这已经被证明是不正确的，特别是在对基因表达具有大的影响的状况中，诸如脓毒症中的外周血基因表达。
Fardin等,(2007)(Fardin P、Moretti S、Biasotti B、Ricciardi A、Bonassi S等.(2007)Normalisation of low-density microarray using external spike-incontrols:analysis of macrophage cell lines expression profile.BMC Genomics8:17.doi:10.1186/1471-2164-8-17)描述了使用人工掺入RNA作为提供低密度阵列qPCR数据的更一致的归一化的方法，特别地当上调和下调基因的分布不对称时。相似地，Jiang等,(2011)(Jiang L、Schlesinger F、Davis CA、Zhang Y、Li R等(2011)Synthetic spike-instandards for RNA-seq experiments.Genome Res 21:1543–1551.Doi:10.1101/gr.121095.111)描述了用于RNA-seq实验的合成的RNA掺入对照。
多个公布的专利描述了特别地用于血液的内部对照基因(测量的生物标志物)(EP2392668A2、US20100184608)或用于与任何组织类型一起使用的人工通用掺入(外部)对照(US20030148339)的使用。
在题为“Diagnostic and Prognostic Tests”的专利(US7622260)中，发明人描述了使用基因表达的比率诊断生物状态或状况，特别是癌症，以及将恶性胸膜间皮瘤从其他肺癌或从正常肺组织区分出，以及区分恶性胸膜间皮瘤的亚类的方法。
本发明的概述
以一种宽泛的方式，本发明力图提供一种用于验证生物标志物的定量的方法，所述生物标志物利用选定类型的定量技术定量，并且所述方法包括：
a)对生物受试者的至少一种相应的生物标志物确定多种(a plurality of)生物标志物值，每种生物标志物值指示测量值或从测量值衍生的值，并且所述多种生物标志物值至少部分地指示取自所述受试者的样品中的所述生物标志物的浓度；
b)通过确定生物标志物值的组合确定至少一个对照值；
c)将每个对照值与各自的对照参考比较；以及
d)使用所述比较的结果确定所述生物标志物值是否有效。
通常至少第一生物标志物值和第二生物标志物值被用于确定指示测试结果的指示物(indicator)，并且其中所述方法包括确定对照值，所述对照值包括：
a)所述第一生物标志物值和至少一种其他的生物标志物值的组合；和
b)所述第二生物标志物值和至少一种其他的生物标志物值的组合。
通常，方法包括：
a)确定至少四种生物标志物值，所述指示物是基于以下的组合：
i)第一指示值(indicator value)，所述第一指示值使用第一生物标志物值和第二生物标志物值计算；和
ii)第二指示值，所述第二指示值使用第三生物标志物值和第四生物标志物值计算；以及
b)确定对照值，所述对照值包括：
i)第一对照值，所述第一对照值使用第一生物标志物值和第三生物标志物值计算；
ii)第二对照值，所述第二对照值使用第一生物标志物值和第四生物标志物值计算；
iii)第三对照值，所述第三对照值使用第二生物标志物值和第三生物标志物值计算；
iv)第四对照值，所述第四对照值使用第二生物标志物值和第四生物标志物值计算。
通常，方法包括确定包括以下的对照值：
a)第五对照值，所述第五对照值使用第一生物标志物值和第二生物标志物值计算；
b)第六对照值，所述第六对照值使用第三生物标志物值和第四生物标志物值计算；以及
c)使用在确定指示值中未使用的测量的生物标志物的组合计算的对照值。
通常，方法包括通过将函数应用到各自的生物标志物值计算指示值和对照值中的至少一种。
通常，函数包括以下的至少一种：
a)对两种生物标志物值进行乘法运算；
b)对两种生物标志物值进行除法运算；
c)两种生物标志物值的比率；
d)对两种生物标志物值进行加法运算；
e)对两种生物标志物值进行减法运算；
f)至少两种生物标志物值的加权和；
g)至少两种生物标志物值的对数和；
h)至少两种生物标志物值的S形函数。
通常，方法包括确定以下：
a)使用第一生物标志物值和第三生物标志物值的比率确定第一对照值；
b)使用第一生物标志物值和第四生物标志物值的比率确定第二对照值；
c)使用第二生物标志物值和第三生物标志物值的比率确定第三对照值；以及
d)使用第二生物标志物值和第四生物标志物值的比率确定第四对照值。
通常，方法包括确定包括以下的对照值：
a)使用第一生物标志物值和第二生物标志物值的比率的第五对照值；
b)使用第三生物标志物值和第四生物标志物值的比率的第六对照值；以及
c)使用在确定指示值中未使用的测量的生物标志物的比率计算的对照值。
通常，方法包括：
a)基于所述比较的结果确定有效性概率；以及，
b)使用所述有效性概率确定所述生物标志物值是否有效。
通常，方法包括：
a)确定每个对照值与各自的对照参考的比较的对照值概率；以及
b)组合所述对照值概率以确定所述有效性概率。
通常，对照参考为以下的至少一种：
a)对照值阈值范围；
b)对照值阈值；以及，
c)对照值分布。
通常，对照参考是对照值阈值范围，并且其中方法包括：
a)将每个对照值与各自的对照值阈值范围比较；以及，
b)如果所述对照值中的任一种落在各自的对照值阈值范围之外，则确定所述生物标志物中的至少一种是无效的。
通常，对照参考是对照值分布，并且其中方法包括：
a)将每种对照值与各自的对照值分布比较；以及，
b)使用所述比较的结果确定所述有效性。
通常，每个各自的参考衍生自从样品群体中的很多个体收集的生物标志物值。
通常，针对所述样品群体的至少部分确定每个各自的参考。
通常，样品群体包括：
a)不同性别的多个个体；
b)不同种族的多个个体；
c)多个健康个体；
d)罹患至少一种诊断的医学状况的多个个体；
e)显示出至少一种医学状况的临床迹象的多个个体；以及
f)第一组个体和第二组个体，每组个体罹患各自的诊断的医学状况。
通常，指示物用于确定生物受试者具有至少一种医学状况的可能性，并且其中所述样品群体包括：
a)呈现出所述至少一种医学状况的临床迹象的个体；
b)被诊断具有所述至少一种医学状况的个体；和
c)健康个体。
通常，指示物通过使用组合函数组合所述第一衍生的指示值和所述第二衍生的指示值确定，所述组合函数为以下中的至少一种：
a)相加模型；
b)线性模型；
c)支持向量机；
d)神经网络模型；
e)随机森林模型；
f)回归模型；
g)遗传算法；
h)退火算法；
i)加权和；和
j)最近邻模型。
通常，方法包括：
a)确定指示值；
b)将所述指示值与至少一个指示值范围比较；以及
c)至少部分地使用所述比较的结果确定所述指示物。
通常，指示物指示受试者具有至少一种医学状况的可能性。
通常，方法包括生成指示物的展示(representation)。
通常，展示包括：
a)指示值的字母数字标示；
b)指示值与一种或更多种阈值的比较的图形标示；以及
c)受试者具有至少一种医学状况的可能性的字母数字标示。
通常，生物标志物值指示选自以下的一种或更多种的分子、细胞或生物体的水平或丰度：
a)蛋白；
b)核酸；
c)碳水化合物；
d)脂质；
e)蛋白聚糖；
f)细胞；
g)代谢物；
h)组织切片；
i)完整生物体；以及
j)分子复合体。
通常，方法至少部分地使用一种或更多种电子处理装置来进行。
通常，从数据库检索指示物参考。
通常，方法包括，在一种或更多种电子处理装置中：
a)接收所述生物标志物值；
b)使用所述生物标志物值中的至少两种确定所述至少一个对照值；
c)将所述至少一种对照值与所述各自的对照值阈值比较；以及
d)使用所述比较的结果确定所述测试是否是有效测试。
通常，方法包括，在一种或更多种电子处理装置中：
a)通过以下确定所述指示物：
i)使用第一生物标志物值和第二生物标志物值的比率计算第一指示值；
ii)使用第三生物标志物值和第四第二生物标志物值的比率计算第二指示值；以及，
iii)确定所述第一指示值和所述第二指示值的和；
b)通过以下步骤确定多个对照值：
i)使用所述第一生物标志物值和所述第三生物标志物值的比率计算第一对照值；
ii)使用所述第一生物标志物值和所述第四生物标志物值的比率计算第二对照值；
iii)使用所述第二生物标志物值和所述第三生物标志物值的比率计算第三对照值；
iv)使用所述第二生物标志物值和所述第四生物标志物值的比率计算第四对照值；
c)将每个对照值与各自的阈值范围比较；以及
d)响应于每个对照值的成功比较显示所述指示物。
通常，方法包括，在一种或更多种电子处理装置中：
a)使用所述第一生物标志物值和所述第二生物标志物值的比率计算第五对照值；
b)使用所述第三生物标志物值和所述第四生物标志物值的比率计算第六对照值；以及，
c)通过使用在确定指示值中未使用的生物标志物的组合计算另外的对照值或一组对照值。
通常，生物标志物是基因表达产物，并且其中方法包括：
a)从生物受试者获得样品，所述样品包含所述基因表达产物；
b)至少扩增所述样品中的所述基因表达产物；以及
c)对于每种基因表达产物，确定代表获得限定水平的各自的基因表达所需要的扩增程度的扩增量。
通常，扩增量为以下的至少一种：
a)循环时间；
b)循环数；
c)循环阈值；和
d)扩增时间。
通常，生物标志物是基因表达产物，并且其中所述方法包括通过对各自的基因表达产物的扩增量进行减法运算来确定生物标志物值的组合，以使得所述生物标志物值的组合代表所述各自的基因表达产物的相对浓度的比率。
通常，生物标志物值从呈现出至少一种医学状况的临床迹象的生物受试者获得。
通常，至少一种状况包括ipSIRS(感染阳性全身炎症反应综合征)并且其中生物标志物值相应于LAMP1、CEACAM4、PLAC8和PLA2G7的相对浓度。
通常，生物标志物值从呈现出第一状况和第二状况共同的临床迹象的生物受试者获得，并且其中所述指示物被用于区分第一状况和第二状况。
通常，第一状况和第二状况包括inSIRS(感染阴性全身炎症反应综合征)和ipSIRS。
通常，定量技术为以下的至少一种：
a)核酸扩增技术；
b)聚合酶链式反应(PCR)；
c)杂交技术；
d)微阵列分析；
e)低密度阵列；
f)与等位基因特异性探针杂交；
g)酶促突变检测；
h)连接链式反应(LCR)；
i)寡核苷酸连接测定(OLA)；
j)流式细胞异源双链体分析；
k)错配的化学裂解；
l)质谱法；
m)流式细胞术；
n)液相层析；
o)气相层析；
p)免疫组织化学；
q)核酸测序；
r)单链构象多态性(SSCP)；
s)变性梯度凝胶电泳(DGGE)；
t)温度梯度凝胶电泳(TGGE)；
u)限制性片段多态性；
v)基因表达系列分析(SAGE)；
w)亲和力测定；
x)放射性免疫测定(RIA)；
y)侧流免疫层析；
z)流式细胞术；
aa)电子显微术(EM)；和，
bb)酶-底物测定。
以一种宽泛的方式，本发明力图提供一种用于验证生成指示物中使用的生物标志物值的测量的设备，所述生物标志物利用选定类型的定量技术来定量，并且所述设备包括至少一个处理装置，所述至少一个处理装置：
a)对生物受试者的至少一种相应的生物标志物确定多种生物标志物值，每种生物标志物值指示测量值或从测量值衍生的值，并且所述多种生物标志物值至少部分地指示取自所述受试者的样品中的所述生物标志物的浓度；
b)通过确定生物标志物值的组合确定至少一个对照值；
c)将每个对照值与各自的对照参考比较；以及
d)使用所述比较的结果确定所述生物标志物值是否有效。
以一种宽泛的方式，本发明力图提供一种用于验证指示物的方法，所述指示物用于确定生物受试者具有至少一种医学状况的可能性，所述生物标志物利用选定类型的定量技术来定量，并且所述方法包括：
a)确定多种生物标志物值，每种生物标志物值指示所述生物受试者的至少一种相应的生物标志物的测量值或衍生值；
b)通过以下确定指示生物受试者具有至少一种医学状况的可能性的指示物：
i)使用第一生物标志物值和第二生物标志物值计算第一指示值；
ii)使用第三生物标志物值和第四第二生物标志物值计算第二指示值；以及，
iii)使用所述第一指示值和所述第二指示值确定所述指示物；
c)计算以下的至少一种：
i)第一对照值，所述第一对照值使用所述第一生物标志物值和所述第三生物标志物值计算；
ii)第二对照值，所述第二对照值使用所述第一生物标志物值和所述第四生物标志物值计算；
iii)第三对照值，所述第三对照值使用所述第二生物标志物值和所述第三生物标志物值计算；
iv)第四对照值，所述第四对照值使用所述第二生物标志物值和所述第四生物标志物值计算；
v)第五对照值，所述第五对照值使用所述第一值和所述第四第二值计算；
vi)第六对照值，所述第六对照值使用所述第三生物标志物值和所述第四生物标志物值计算；以及
vii)另外的对照值或对照值组，所述另外的对照值或对照值组通过使用在确定指示值中未使用的生物标志物的组合计算；
d)将所述至少一种对照值与各自的对照值阈值比较；以及
e)使用所述比较的结果选择性地验证所述指示物。
以一种宽泛的方式，本发明力图提供用于验证指示基因表达产物的测量值的指示物的设备，生物标志物利用选定类型的定量技术来定量，所述设备包括至少一个处理装置，所述至少一个处理装置：
a)确定多种生物标志物值，每种生物标志物值指示所述生物受试者的至少一种相应的生物标志物的测量值或衍生值；
b)通过以下确定所述指示物：
i)使用第一生物标志物值和第二生物标志物值计算第一指示值；
ii)使用第三生物标志物值和第四第二生物标志物值计算第二指示值；以及，
iii)使用所述第一指示值和所述第二指示值确定所述指示物；
c)计算以下的至少一种：
i)第一对照值，所述第一对照值使用所述第一生物标志物值和所述第三生物标志物值计算；
ii)第二对照值，所述第二对照值使用所述第一生物标志物值和所述第四生物标志物值计算；
iii)第三对照值，所述第三对照值使用所述第二生物标志物值和所述第三生物标志物值计算；
iv)第四对照值，所述第四对照值使用所述第二生物标志物值和所述第四生物标志物值计算；
v)第五对照值，所述第五对照值使用所述第一生物标志物值和所述第二生物标志物值计算；
vi)第六对照值，所述第六对照值使用所述第三生物标志物值和所述第四生物标志物值计算；以及
vii)另外的对照值或对照值组，所述另外的对照值或对照值组通过使用在确定指示值中未使用的生物标志物的组合计算。
d)将所述至少一种对照值与各自的对照值阈值比较；以及
e)使用所述比较的结果选择性地验证所述指示物。
以一种宽泛的方式，本发明力图提供一种用于验证指示物的方法，所述指示物用于确定生物受试者具有至少一种医学状况的可能性，所述生物标志物利用选定类型的定量技术来定量，并且所述方法包括：
a)从生物受试者获得样品，所述样品包含基因表达产物；
b)定量所述样品中的至少一些基因表达产物，以确定所述样品中所述基因表达产物的浓度；
c)通过组合以下确定指示生物受试者具有至少一种医学状况的可能性的指示物：
i)第一指示值，所述第一指示值指示第一基因表达产物和第二基因表达产物的浓度的比率；以及
ii)第二指示值，所述第二指示值指示第三基因表达产物和第四基因表达产物的浓度的比率；
d)通过确定以下的至少一种确定对照值：
i)第一对照值，所述第一对照值指示所述第一基因表达产物和所述第三基因表达产物的浓度的比率；
ii)第二对照值，所述第二对照值指示所述第一基因表达产物和所述第四基因表达产物的浓度的比率；
iii)第三对照值，所述第三对照值指示所述第二基因表达产物和所述第三基因表达产物的浓度的比率；
iv)第四对照值，所述第四对照值指示所述第二基因表达产物和所述第四基因表达产物的浓度的比率；
v)第五对照值，所述第五对照值指示所述第一基因表达产物和所述第二基因表达产物的浓度的比率；
vi)第六对照值，所述第六对照值指示所述第三基因表达产物和所述第四基因表达产物的浓度的比率；以及
vii)另外的对照值或对照值组，所述另外的对照值或对照值组通过使用在确定指示值中未使用的基因表达产物的组合确定；
e)将每个对照值与各自的对照值阈值范围比较；以及，
f)通过验证所述对照值中的每一个是否在所述各自的对照值范围内来验证所述指示物。
通常，方法包括通过以下定量基因表达产物的浓度：
a)扩增所述样品中的至少一些基因表达产物；以及
b)对于多种基因表达产物的每一种，确定代表获得限定水平的所述各自的基因表达产物所需要的扩增程度的扩增量。
通常，方法包括：
a)通过以下确定所述指示物：
i)确定第一指示值，所述第一指示值使用第一扩增时间和第二扩增时间来计算，所述第一扩增时间和所述第二扩增时间指示第一基因表达产物和第二基因表达产物的浓度；和
ii)第二指示值，所述第二指示值使用第三扩增时间和第四扩增时间来计算，所述第三扩增时间和所述第四扩增时间指示第三基因表达产物和第四基因表达产物的相对浓度；以及
b)通过确定以下的至少一种确定对照值：
i)第一对照值，所述第一对照值使用第一扩增时间和第三扩增时间来计算，所述第一扩增时间和所述第三扩增时间指示第一基因表达产物和第三基因表达产物的相对浓度；
ii)第二对照值，所述第二对照值使用第一扩增时间和第四扩增时间来计算，所述第一扩增时间和所述第四扩增时间指示第一基因表达产物和第四基因表达产物的相对浓度；
iii)第三对照值，所述第三对照值使用第二扩增时间和第三扩增时间来计算，所述第二扩增时间和所述第三扩增时间指示第二基因表达产物和第三基因表达产物的相对浓度；
iv)第四对照值，所述第四对照值使用第二扩增时间和第四扩增时间来计算，所述第二扩增时间和所述第四扩增时间指示第二基因表达产物和第四基因表达产物的相对浓度；
v)第五对照值，所述第五对照值使用第一扩增时间和第二扩增时间来计算，所述第一扩增时间和所述第二扩增时间指示第一基因表达产物和第二基因表达产物的相对浓度；
vi)第六对照值，所述第六对照值使用第三扩增时间和第四扩增时间来计算，所述第三扩增时间和所述第四扩增时间指示第三基因表达产物和第四基因表达产物的相对浓度；以及
vii)另外的对照值或对照值组，所述另外的对照值或对照值组通过使用在确定指示值中未使用的扩增时间的组合确定。
以一种宽泛的方式，本发明力图提供用于验证指示物的设备，所述指示物用于确定生物受试者具有至少一种医学状况的可能性，所述设备包括：
a)取样装置，所述取样装置从生物受试者获得样品，所述样品包含基因表达产物；
b)定量装置，所述定量装置定量所述样品中的至少一些基因表达产物，以确定所述样品中所述基因表达产物的浓度；以及
c)至少一种处理装置，所述至少一种处理装置：
i)通过组合以下确定指示生物受试者具有至少一种医学状况的可能性的指示物：
(1)第一指示值，所述第一指示值指示第一基因表达产物和第二基因表达产物的浓度的比率；以及
(2)第二指示值，所述第二指示值指示第三基因表达产物和第四基因表达产物的浓度的比率；
ii)通过确定以下的至少一种确定对照值：
(1)第一对照值，所述第一对照值指示所述第一基因表达产物和所述第三基因表达产物的浓度的比率；
(2)第二对照值，所述第二对照值指示所述第一基因表达产物和所述第四基因表达产物的浓度的比率；
(3)第三对照值，所述第三对照值指示所述第二基因表达产物和所述第三基因表达产物的浓度的比率；
(4)第四对照值，所述第四对照值指示所述第二基因表达产物和所述第四基因表达产物的浓度的比率；
(5)第五对照值，所述第五对照值指示所述第一基因表达产物和所述第二基因表达产物的浓度的比率；
(6)第六对照值，所述第六对照值指示所述第三基因表达产物和所述第四基因表达产物的浓度的比率；以及
(7)另外的对照值或对照值组，所述另外的对照值或对照值组指示在确定指示值中未使用的生物标志物的浓度的比率；
iii)将每个对照值与各自的对照值阈值范围比较；以及，
iv)通过验证所述对照值中的每一个是否在所述各自的对照值范围内来验证所述指示物。
以一种宽泛的方式，本发明力图提供一种用于验证生物标志物的定量的方法，并且所述方法包括：
a)对生物受试者的至少一种相应的生物标志物确定多种生物标志物值，每种生物标志物值指示测量值或从测量值衍生的值，并且所述多种生物标志物值至少部分地指示取自所述受试者的样品中的所述生物标志物的浓度；
b)通过确定生物标志物值的组合确定至少一个对照值；
c)将每个对照值与各自的对照参考比较；以及
d)使用所述比较的结果确定所述生物标志物值是否有效，其中所述生物标志物值指示选自以下的一种或更多种的分子、细胞或生物体的水平或丰度：
i)蛋白；
ii)核酸；
iii)碳水化合物；
iv)脂质；
v)蛋白聚糖；
vi)细胞；以及
vii)病原性生物体。
以一种宽泛的方式，本发明力图提供一种用于验证生物标志物的定量的方法，所述方法包括：
a)对生物受试者的至少一种相应的生物标志物确定多种生物标志物值，每种生物标志物值指示测量值或从测量值衍生的值，并且所述多种生物标志物值至少部分地指示取自所述受试者的样品中所述生物标志物的浓度；
b)通过确定生物标志物值的组合确定至少一个对照值；
c)将每个对照值与各自的对照参考比较；以及
d)使用所述比较的结果确定所述生物标志物值是否有效，其中所述生物标志物值指示选自以下的一种或更多种的分子、细胞或生物体的水平或丰度：
i)蛋白；
ii)核酸；
iii)碳水化合物；
iv)脂质；
v)蛋白聚糖；
vi)细胞；
vii)代谢物；
viii)组织切片；
ix)完整生物体；以及
x)分子复合体。
以一种宽泛的方式，本发明力图提供一种用于验证生物标志物的定量的方法，所述方法包括：
a)对生物受试者的至少一种相应的生物标志物确定多种生物标志物值，每种生物标志物值指示测量值或从测量值衍生的值，并且所述多种生物标志物值至少部分地指示取自所述受试者的样品中的所述生物标志物的浓度；
b)通过确定生物标志物值的组合确定至少一个对照值；
c)将每个对照值与各自的对照参考比较；以及
d)使用所述比较的结果确定所述生物标志物值是否有效，其中所述生物标志物利用以下的至少一种来定量：
i)核酸扩增技术；
ii)聚合酶链式反应(PCR)；
iii)杂交技术；
iv)微阵列分析；
v)低密度阵列；
vi)与等位基因特异性探针杂交；
vii)酶促突变检测；
viii)连接链式反应(LCR)；
ix)寡核苷酸连接测定(OLA)；
x)流式细胞异源双链体分析；
xi)错配的化学裂解；
xii)质谱法；
xiii)流式细胞术；
xiv)液相层析；
xv)气相层析；
xvi)免疫组织化学；
xvii)核酸测序；
xviii)单链构象多态性(SSCP)；
xix)变性梯度凝胶电泳(DGGE)；
xx)温度梯度凝胶电泳(TGGE)；
xxi)限制性片段多态性；
xxii)基因表达系列分析(SAGE)；
xxiii)亲和力测定；
xxiv)放射性免疫测定(RIA)；
xxv)侧流免疫层析；
xxvi)流式细胞术；
xxvii)电子显微术(EM)；和，
xxviii)酶-底物测定。
将领会到的是，本发明的宽泛形式以及其各自的特征可以结合、互换和/或独立地使用，并且提及不同的宽泛的形式并不意图是限制性的。
附图简述
现在将参考附图来描述本发明的实例，在附图中：-
图1A是用于验证生物标志物值测量的方法的实例的流程图；
图1B和1C是比较独立对照方法和相对对照方法的实例的流程图；
图2是分布式计算机体系结构的实例的示意图；
图3是基站处理系统的实例的示意图；
图4是图2的客户端装置的实例的示意图；
图5是用于验证衍生自生物标志物测量和相应的参考分布的指示物的方法的实例的流程图；
图6是用于验证衍生自生物标志物测量的指示物的方法的实例的流程图；
图7A是图5的方法中的生物标志物值的关系的标示的示意图；
图7B是在标准对照布置中生物标志物值与对照的关系的标示的示意图；
图8A和8B是用于验证衍生自生物标志物测量的指示物的方法的实例的流程图；
图9A和9B是指示值的展示的实例的示意图；
图10A是在多生物标志物医疗装置中，标准对照使用的实例的流程图；
图10B是在多生物标志物医疗装置中，使用相对对照取代标准对照的实例的流程图；
图10C是在多生物标志物医疗装置中，使用标准对照和相对对照的混合的实例的流程图；
图11A是针对测量的生物标志物获得的循环时间对一系列浓度的图；
图11B是衍生自图11A的循环次数的生物标志物值的指示值的图；
图12A是样品群体的测量的生物标志物值的密度图；
图12B(a)-(f)是相对于测量的生物标志物的参考群体显示的无效样品的每个测量的生物标志物值的图；
图12C(a)-(f)是相对于参考衍生的对照值显示的无效样品的衍生的对照值的图。
图12D是显示针对参考衍生的对照生物标志物之一的无效样品的散点图。
图13A(a)-(d)是显示针对测量的生物标志物的参考群体的无效样品的图。
图13B(a)-(f)是显示针对衍生的对照生物标志物的参考群体的相同无效样品的图。
优选实施方案的详细说明
现在将参考图1描述用于验证生物标志物的测量的方法的实例，所述生物标志物的测量用于确定指示物，诸如指示生物受试者具有至少一种主要医学状况的可能性的指示物。
为了解释的目的，将使用很多种不同的术语。
例如，术语“生物标志物”指可以被用作生物状态的指示物的任何可定量的值或参数的组合或衍生物。在本申请的上下中，生物标志物包括蛋白；核酸，诸如DNA、RNA等；碳水化合物；脂质；蛋白聚糖；细胞；代谢物；组织切片；完整生物体(例如病原性和非病原性微生物)和分子复合体(例如蛋白/核酸复合体)等。
术语“生物标志物值”指通过定量受试者或个体内的相应生物标志物的量、丰度、水平、浓度、数量、或活性确定的值。生物标志物值可以基于测量的生物标志物值或从其衍生的值，并且以下将更详细地描述实例。
术语“参考生物标志物”被用于指对于具有一种或更多种状况、一种或更多种状况的阶段、一种或更多种状况的亚型或不同预后的一个或更多个个体的样品群体，其值是已知的生物标志物。术语“参考数据”指对样品群体中的一个或更多个个体测量的数据，并且可以包括：对每个个体测量的生物标志物的水平或活性的定量；关于个体的任何状况的信息；和任选的感兴趣的任何其他信息，包括已经衍生自测量的标志物的衍生的生物标志物。参考生物标志物因其提供新的或未知的样品可以与其比较的参考的主要目的而得名。
术语“指示值”被用于指在衍生指示物中使用的生物标志物值的组合，所述指示物可以指示受试者罹患生物状况的可能性。指示物可以为绝对数或相对数或其他值的形式，并且可以基于值与一个或更多个阈值的比较。
术语“测试”用于指被用于定量多种生物标志物以确定各自的生物标志物值的机制，然后所述各自的生物标志物值可以随后被用于确定指示值。“测试”可以包括一个或更多个测量过程或步骤，所述一个或更多个测量过程或步骤可以共同地或独立地进行，但是其使用选定类型的定量平台或技术进行。“测试”可以形成更宽泛的“医疗评价”的一部分，所述更宽泛的“医疗评价”可以包括被进行以允许诊断与医学状况有关的存在、不存在、等级或预后的很多不同测试。
术语“选定类型的定量平台”和“选定类型的定量技术”在本文可互换地使用来指可以确定感兴趣的一种或更多种生物标志物的量、丰度、水平、浓度、数量或活性的装置和/或方法或者装置和/或方法的组合，其中质量对照测量值被用作总体程序的部分，或者利用对照的应用。此类技术的代表性实例包括核酸扩增技术，包括聚合酶链式反应(PCR)(例如，基于PCR的方法，诸如实时聚合酶链式反应(RT-PCR)、定量实时聚合酶链式反应(Q-PCR/qPCR)、使用PCR来分析染色体构象(CCA)等)；杂交技术，包括微阵列分析；低密度阵列；与等位基因特异性探针杂交；酶促突变检测；连接链式反应(LCR)；寡核苷酸连接测定(OLA)；流式细胞异源双链体分析；错配的化学裂解；质谱法；流式细胞术；液相层析；气相层析；免疫组织化学；核酸测序(包括下一代测序、ChIP-seq、DNA甲基化分析)；单链构象多态性(SSCP)；变性梯度凝胶电泳(DGGE)；温度梯度凝胶电泳(TGGE)；限制性片段多态性；基因表达系列分析(SAGE)；亲和力测定，包括免疫测定，诸如免疫印迹；免疫沉淀；酶联免疫吸附测定(ELISA；EIA)；侧流免疫层析；放射免疫测定(RIA)；电子显微术(EM)；酶-底物测定；或其组合。
术语“对照”被用于指为了确定测试的有效性的通过或失败状态并且由此确定输出的有效性而使用的机制。
对照可以包括“独立对照”，其被添加至测试并且独立于被定量的生物标志物。因此，独立对照独立于测量的生物标志物，并且可以被认为是用于整个测试的有效性的独立测试。一个实例是基因表达测试中的已知浓度的体外合成产生的转录子。在该情况中，被测试的样品(即血液)与独立对照根本不相互作用。对照仅仅用来确保跨整个测试使用的试剂能够使对该独立对照的值重现为预期值。
术语“对照值”被用于指用于评价生物标志物值，诸如用于衍生指示值的生物标志物值和得到的指示值是否有效的生物标志物值或指示物的组合。就这一点而言，如果生物标志物值或指示值已经被不正确地测量、计算或定量并且因此无法真实地指示目标状况，或者如果生物标志物值或指示值的值在相应的参考数据中足够罕见地呈现，使得可以合理地假定该值不可能衍生自成功的测试为真实的并且因此测定应被宣布无效(在失败的对照的情况中)，则生物标志物值或指示值是无效的。可以考虑的假定为真实的p值的实例的范围为：
●从0.50到0.20
●从0.20到0.10
●从0.10到0.05
●从0.05到0.01
●从0.01到0.001
●从0.001到0。
对照值是定义不独立于被定量的生物标志物的测试的通过或失败状态的“相对对照”。例如，如果在测试中存在两种测量的标志物，标志物A和标志物B，则其中这些标志物可以与彼此有关系(relative to each other)的一种方式是标志物A与标志物B的比率。如果其值被用于使测试的有效性通过或失败，则该关系是对照。在该实例中，如果标志物A与标志物B的比率是可接受的范围之外的值，则测试将被宣布无效。
“阳性对照”被用于显示测试能够产生阳性结果。通常，阳性对照被设计为使得当被暴露至与被测量的其他标志物相同的处理时，其将导致在某种水平的检测。假定是，如果对于阳性对照，处理可接受地起作用，则其对于测试中的其他测定也起作用。其中这将是有用的实例是在如下情况中：其中在运输期间，测试已经被暴露至不可接受的温度，其已经破坏了测试中的一些关键组分。由于被破坏的关键组分，阳性对照将不如预期的起作用，并且测试将被宣布无效。
“阴性对照”被用于显示测试能够产生阴性结果。通常，阴性对照被设计为使得当被暴露至与被测量的其他标志物相同的处理时，其将导致低于某种水平的检测(通常低于测试的可检测极限)。假定是，如果对于阴性对照，处理未导致阳性检测结果，则测试中的其他测定也能够得到阴性检测结果。
术语“生物受试者”、“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用来指动物受试者，特别是脊椎动物受试者，并且甚至更特别是哺乳动物受试者。落在本发明的范围内的合适的脊椎动物包括但不限于脊索动物亚门的任何成员，包括灵长目动物、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)、兔形目动物(例如，家兔、野兔)、牛科动物(例如，牛)、绵羊类动物(例如，绵羊)、山羊类动物(例如，山羊)、猪类动物(例如，猪)、马科动物(例如，马)、犬科动物(例如，狗)、猫科动物(例如，猫)、鸟类动物(例如，鸡；吐绶鸡；鸭；鹅；陪伴鸟类，诸如金丝雀、虎皮鹦鹉等)、海洋哺乳动物(例如海豚、鲸鱼)、爬行动物(蛇、青蛙、蜥蜴等)和鱼。优选的受试者是灵长目动物(例如人、猿、猴、黑猩猩)。
如本文使用的，术语SIRS(“全身炎症反应综合征”)指由非特异性损害引起的具有以下可测量的临床特征中的两种或更多种的临床响应：高于38℃或低于36℃的体温、大于90次/分钟的心率、大于20/分钟的呼吸率、大于12,000/mm3或小于4,000/mm3的白血细胞计数(总白细胞)、或大于10％的带状中性白细胞百分比。从免疫学角度，可以将其看作代表对损害(例如大外科手术)或全身性炎症的全身性响应。如本文使用的，“inSIRS”(其在其范围内包括“外科手术后”(PS)炎症)包括以上提到的，但是在全身性感染过程的不存在下的临床响应(感染阴性全身炎症反应综合征)。相反，“ipSIRS”(感染阳性全身炎症反应综合征)包括以上提到的，但是在假定的或证实的感染的存在下的临床响应。假定的感染可以基于临床医师的判断，而感染的证实可以利用微生物培养、感染原的分离或检测或通过使用提供感染证据的其他参数来确定。从免疫学角度，可以将ipSIRS看作对微生物的全身性响应，无论是局部感染、外周感染或全身性感染。
如本文使用的，术语状况的“可能性”指与受试者是否可能罹患状况相关的确信水平。应注意的是，这并不必然与状况的等级、严重度(seriousness)、严重程度(severity)、阶段或状态相关联。
将领会到的是，以上描述的术语和相关定义仅仅被用于解释的目的并且并不意图是限制性的。
在该实例中，方法包括在步骤100确定多种生物标志物值，每种生物标志物值指示生物受试者的至少一种生物标志物的测量值或衍生值。
生物标志物值可以为任何适当的形式，并且特别是可以与可以定量其值的受试者的任何属性相关。该技术特别适于高通量技术，诸如质谱、测序平台、阵列和杂交平台、免疫测定、流式细胞术，并且在一种优选的实例中，生物标志物值与表达产物和其他可测量的分子的活性水平或丰度水平有关。
生物标志物值可以是测量的生物标志物值，其是对受试者测量的生物标志物的值，或者可选地可以是衍生的生物标志物值，所述衍生的生物标志物值是已经从一种或更多种测量的生物标志物值衍生的值，例如通过对一种或更多种测量的生物标志物值应用函数。如本文使用的，已经对其应用函数的生物标志物被称为“衍生的生物标志物”。
生物标志物值可以以很多方式的任一种来确定。在一种实例中，确定生物标志物值的方法可以包括测量生物标志物值，例如通过从生物受试者获得样品以及然后定量样品内的生物标志物。然而更通常地，确定生物标志物值的步骤包括使电子处理装置接收或以其他方式获得预先已经测量或衍生的生物标志物值。这可以包括例如，从数据存储诸如本地或远程器械或数据库检索生物标志物值，利用输入装置获得已经人工输入的生物标志物值，等。
在步骤110，指示物可以任选地用至少部分地基于生物标志物值的指示物来确定。指示物通常指示测试结果，并且可以以很多种方式中的任一种来确定，并且可以至少部分地基于生物标志物值的比率，如以下将更详细地描述的。但是，这并不是必要的，可选地生物标志物值可以被用于验证定量已经被正确地进行，并且生物标志物值的指示物或其他解释在随后的下游过程被进行。
在步骤120，确定一种或更多种对照值。对照值基于生物标志物值的组合来确定。可以以很多种方式中的任一种来组合生物标志物值，并且这可以包括例如对生物标志物值进行加法、乘法、减法或除法运算来确定对照值。进行该步骤以使得可以将多个生物标志物组合成单个对照值，并且通常组合成自我归一化的值，如以下将更详细地描述的。
在步骤130，将每个对照值与各自的对照参考比较。通常基于对包括健康个体和罹患或表现出一种或更多种状况的临床迹象的个体的混合的样品群体确定的参考对照值确立各自的对照参考。对照参考可以是单个阈值或者由各自的上限值和下限值限定的范围，但更通常地为对照值的分布的形式。
在步骤140，生物标志物值的测量可以使用比较的结果来验证。因此，如果任何对照值超出/低于阈值、在限定的阈值范围之外、或超出阈值内的特定点、或超出分布的特定点，这用于指示测量的探知的生物标志物值不适于用于生成足够可靠以用于确定状况的可能性的指示物。
相应地，以上技术使用生物标志物值的不同组合来鉴定生物标志物值是否有效。
在一个实例中，对照值是基于生物标志物值的组合，所述组合不同于用于确立指示测定结果的指示物的生物标志物组合。例如，如果对受试者的三种生物标志物定量值，即A、B和C，并且生物标志物值A和B被用于确立指示物，则A和C以及B和C的组合可以被用于确定对照值。
在该实例中，如果生物标志物A的测量为假，例如由于来自受试者的样品的询问、存储或处理的失败等，这可导致基于生物标志物A和B的组合的指示值，该指示值指示受试者具有或不具有状况。然而，事实上，因为生物标志物A的测量是不正确的，所以该结果没有意义，并且因此如果依赖其可导致不准确的诊断。
在该情况中，还通过使用A和C以及B和C的组合来确定对照值的值，对于具有或不具有感兴趣的状况的个体，将鉴定出相应于A和C的对照值在预期的范围之外，意味着A和/或B的生物标志物值不是有效的，并且因此不可以被用于确立准确指示物。
因此，以上描述的过程识别出生物标志物值通常在个体的限定范围内，不管他们是否罹患状况。因此，通过测量不同生物标志物值的多种组合，并将这些组合与对具有一系列不同状况的个体，包括健康个体的参考群体确定的范围比较，这可以被用于确立生物标志物值是否在预期的范围内。
还将领会到的是，尽管在理论上与组合相对，这可以使用单独的生物标志物进行，但是这将要求测量绝对值，诸如样品内的生物标志物的绝对浓度的能力，其通常无法实现。这通常通过使用独立对照来解决，以使得生物标志物相对于已知浓度的对照的浓度被测量。然而，此类独立对照的使用通常是昂贵的，因为对照生物标志物自身难以产生，引入了复杂性，并且还限制了可以通过测量程序的能力测量的生物标志物的数目，因此随着引入更多的对照，这减少了可以对受试者测量的生物标志物的数目。然而，通过使用生物标志物值的组合，诸如比率等，这允许测量的生物标志物值指示相对浓度，并从而自我归一化。特别地，如果最终的输出是基于例如基因比率，则使用相似的基因比率测量有效性更直观、稳健和适当。因此，通过将生物标志物值的不同组合与阈值比较，这允许在本地测量空间进行检查测量的值的有效性(即比率)，基本上导致自我验证的测试，而不需要独立对照的测量。
此类方法提供了更好的对照策略。使用作为对照测量的生物标志物特别地解决了与归一化结果有关的问题，改善了失败测定的检测的统计功效，减少了使用的对照的总数目，减少了测定的复杂性，并减少了总的测定成本和风险。
首先并且例如，通过使用描述的对照策略，可以使用很多生物标志物来限定多个衍生的生物标志物，相对于每个衍生的生物标志物的相应的参考范围，所述多个衍生的生物标志物被用作多个对照范围。这些生物标志物不需要是用于针对感兴趣的状况对患者分类的指示物生物标志物中包括的那些生物标志物。为了该目的使用很多相关的内部生物标志物对归一化具有顺利化和稳定化的作用，从而减低总变异。
第二，通过依赖外部对照或掺入对照，如果存在这些对照的失败，则测定将被称为无效的，即便来自测量的基因的结果是准确的，并因此指示值的结果是准确的。第三，通过通过考察大量可用的相对生物标志物测量测量的生物标志物之间的多重相互作用，对于被测量的每个生物标志物存在更相关的对照检查，导致更高的统计功效、置信度和灵敏度。第四，通过避免使用外部对照、或使用外来管家对照，降低了测定的复杂度，其转化为降低的成本和风险。
特别是，通过使用衍生自感兴趣的测量的生物标志物的对照值来自我验证测试，该技术可以避免对独立对照的需要。该方法通过将独立对照方法和相对对照方法比较被例示，显示于图1B和1C。
如该实例中显示的，在每种情况中，生物标志物值在步骤151、161被测量，并在步骤152、162被用于生成指示值。在依赖性对照方法中，不同的对照在步骤153被测量并在步骤154被评价以确定这些对照是否在预期的范围内。相比之下，在相对对照方法中，在步骤163，测量的生物标志物值被用于衍生对照值，然后在步骤164所述对照值被评价以确定它们是否在预期的范围内。在每种情况中，如果对照在范围内，在步骤155、165报告测试结果，否则在步骤156、166测试失败。
因此，可以看出，从衍生自测量的生物标志物值的对照值形成的相对对照可以以与独立对照相似的方式使用，但是不需要独立对照的存在。这避免了对另外的对照标志物的需要，意味着测试可以更便宜。这还避免了对独立地失败的额外的独立对照的需要，所述添加的独立对照可以不必要地使有效测试无效。另外，测量的标志物之间的关系将更严格且更多的限制施加至预期的值，从而在无效测试的检测中提高了统计功效并因此提高了置信度，如以下将更详细地描述的。
现在将描述很多另外的特征。
在一个实例中，使用了至少三种生物标志物值，第一生物标志物值和第二生物标志物值被用于确定指示物，并且使用第一生物标志物值和至少一种其他的生物标志物值以及第二生物标志物值和至少一种其他的生物标志物的组合来确定对照值。然而，在另一个优选的实例中，方法包括确定至少四种生物标志物值。在该情况中，指示物可以基于使用第一生物标志物值和第二生物标志物值计算的第一指示值以及使用第三生物标志物值和第四生物标志物值计算的第二指示值的组合。然后可以组合这两种指示值来形成指示物，所述指示物组合了前两种指示值的每一种的辨别能力。这允许独立的两对生物标志物值被组合并用于确立指示物，这可以显著增强指示物辨别具有状况的受试者的可能性的能力。
此外，当使用四种生物标志物值时，这允许确定至少四个对照值，包括使用第一生物标志物值和第三生物标志物值计算的第一对照值，使用第一生物标志物和第四生物标志物值计算的第二对照值，使用第二生物标志物值和第三生物标志物值计算的第三对照值，以及使用第二生物标志物值和第四生物标志物值计算的第四对照值。因此，再次，这允许使用另外的对照值，进一步增加无效测量可以被准确辨别的可能性。将领会到的是，构成指示值的生物标志物的组合还可以是对照值：在该实例中，第一生物标志物和第二生物标志物以及第三生物标志物和第四生物标志物构成指示值，并且如果超出相应的参考的范围，它们也可以指示测定的失败。
还将领会到的是，在以上实例中，用于确立指示物的生物标志物值的每一个还用于验证检查。这使生物标志物的使用最大化，以使得实际上每个测量的生物标志物值被用于生成指示物和验证两者。对于仅可以处理有限数目的生物标志物值的平台和方法，通过允许所有的测量的生物标志物值被用于确定指示物，这因此可以使指示物的辨别能力最大化，同时仍然确保指示物有效性。然而，这并不是必需的，并且另外地和/或可选地，可以进行与对受试者测量的，但并未用于生成指示物的生物标志物值的比较。
还应注意的是，指示值还可以被用作对照值。在该实例中，通常指示值的可接受范围将被指定用于评价受试者具有状况的可能性，该范围代表了在目标群体中观察到或预期的最大指示值和最小指示值。该范围之外的值可以暗示构成指示值的潜在值中的至少一个有问题，并且测试将被宣布无效。相应地，在该实例中，方法包括确定对照值，所述对照值包括以下的一个或更多个：使用第一生物标志物值和第二生物标志物值的比率的第五对照值，使用第三生物标志物值和第四生物标志物值的比率的第六对照值，以及使用未用于确定指示值的测量的生物标志物的比率计算的单个或一组对照值。
方法通常包括通过将函数应用到各自的生物标志物值计算指示值和对照值中的至少一种。使用的函数因此将取决于优选的实施方式而变化。在一个实例中，函数包括以下的至少一种：对两种生物标志物值进行乘法运算，对两种生物标志物值进行除法运算；对两种生物标志物值进行加法运算，对两种生物标志物值进行减法运算，至少两种生物标志物值的加权和，至少两种生物标志物值的对数和，以及至少两种生物标志物值的S形函数。
更通常地，函数是两种生物标志物值的除法运算或对数减法运算(logsubtraction)(其等效于绝对值的除法运算)，以使得衍生的生物标志物值相应于两种测量的生物标志物值的比率。为什么比率可以是优选的，存在很多原因。例如，比率的用途是自我归一化的，意味着测量技术的变异将自动地被适应。例如，如果样品的输入浓度加倍，生物标志物的相对比例将保持相同。结果，函数的类型因此在一系列输入浓度内具有稳定的轮廓(profile)，这是重要的，因为输入浓度是表示数据的已知变量。另外，很多生物标志物是生物化学途径上的节点，所以生物标志物的比率给出了关于一种生物途径与另一种生物途径的相对活性的信息，这是系统内的生物学改变的自然表示。最后，比率通常易于解释。
在一个实例中，对照值是比率，每个对照值与各自的对照值阈值范围比较，并且如果对照值中的任一个落在各自的对照值阈值范围之外，则确定生物标志物值中的至少一种是无效的。在该实例中，每个各自的阈值范围通常衍生自从样品群体中的很多个体收集的生物标志物值。这可以例如使用统计方法或对样品群体的生物标志物值训练的计算机实施的分类器算法进行。样品群体通常包括：多个健康个体；罹患至少一种诊断的医学状况的多个个体；显示出至少一种医学状况的临床迹象的多个个体；或第一组和第二组个体，每组个体罹患各自的诊断的医学状况。这可以被用于提供群体的合适的代表性实例，并确保对照值阈值范围不受状况的存在或不存在的影响。
特别是，当指示物用于确定生物受试者具有特定的医学状况的可能性时，样品群体包括呈现出特定医学状况的临床迹象的个体、被诊断或证实具有或已经具有(包括回顾地)特定的医学状况的个体和/或健康个体。这确保指示物有效性的评价适用，不管个体是否具有特定的状况。
还将领会的是，样品群体还可以包括不同性别、种族、年龄等的多个个体，允许对照值的范围为跨群体共同的。然而，这并不是必需的，并且可选地，对照值阈值可以被确立为对于群体的特定亚群特异的。在该情况中，确保使用的对照值阈值范围适合于所考虑的受试者将是必需的。
通常，通过使用组合函数组合第一衍生的指示值和第二衍生的指示值来确定指示物，所述组合函数为相加模型、线性模型、支持向量机、神经网络模型、随机森林模型、回归模型、遗传算法、退火算法、加权和和最近邻模型中的至少一种。
在一个实例中，方法还包括确定指示值，将指示值与至少一个指示值范围比较，以及至少部分地使用比较的结果确定指示物。因此，已经确立生物标志物值适合用于确定指示物之后，指示物可以被计算并与指示值范围比较以评价受试者具有至少一种医学状况的可能性。
此后，方法还可以包括生成指示物的展示。在这点上，展示允许指示物例如被医疗实践者查看，允许医疗实践者进行诊断并评价进行何种干预(如果有)。展示可以为任何适当的形式，并且可以包括以下的一种或更多种：指示值的字母数字标示、指示值与一种或更多种阈值的比较的图形标示、以及受试者具有至少一种医学状况的可能性的字母数字标示。以下将更详细地描述具体的实例展示。
方法通常至少部分地使用例如形成一种或更多种处理系统的部分的一种或更多种电子处理装置来进行，诸如计算机或服务器，所述一种或更多种电子处理装置可以继而经由网络体系结构被连接至一种或更多种其他计算装置，诸如移动电话、便携式计算机等，如以下将更详细地描述的。
在一个实例中，一种或更多种电子处理装置接收生物标志物值，使用生物标志物值确定指示物，使用生物标志物值中的至少两种确定至少一个对照值，将至少一个对照值与各自的对照值阈值比较，以及使用比较的结果确定测试是否是有效测试。
在这点上，生物标志物值可以从值预先已经被存储于其中的数据库等接收，或者可以从被用于确定生物标志物值的测量装置，诸如PCR仪器等直接接收。然后处理装置可以自动地评价测量的有效性，并且然后如果计算出指示物是有效的，则如所需要的生成并显示其展示。因此，将领会到的是，从样品被装载到测量装置中的点，这可以提供基本上自动化的程序。
在一个实例中，一种或更多种电子处理装置通过以下确定指示物：使用第一生物标志物值和第二生物标志物值的比率计算第一指示值，使用第三生物标志物值和第四生物标志物值的比率计算第二指示值，以及确定第一指示值和第二指示值的和。一种或更多种电子处理装置通过以下类似地确定多个内部相对对照值：使用第一生物标志物值和第三生物标志物值的比率计算第一对照值，使用第一生物标志物值和第四生物标志物值的比率计算第二对照值，使用第二生物标志物值和第三生物标志物值的比率计算第三对照值，以及使用第二生物标志物值和第四生物标志物值的比率计算第四对照值，然后将每个对照值与各自的阈值范围比较，并响应于对每个对照值的成功比较显示指示物。
当生物标志物是基因表达产物时，靶标生物标志物的相对丰度可以如此确定：从生物受试者获得样品，以使得样品包括靶标基因表达产物，然后扩增样品中的至少一种靶标基因表达产物，然后对每种基因表达产物确定获得限定水平的各自的基因表达产物需要的扩增量，所述扩增量取决于样品中的基因表达产物的浓度，所述浓度是基于循环时间、扩增循环数、循环阈值、扩增时间等。在该情况中，相对生物标志物可以使用扩增时间的组合通过对各自的基因表达产物的扩增时间进行减法运算来生成，以使得这些相对生物标志物值代表各自的基因表达产物的相对浓度的比率。
将领会到的是，以上描述的过程通常对呈现出至少一种医学状况的临床迹象的生物受试者进行。在该情况中，医疗实践者通常将进行临床迹象的初步评价并确立待进行的特定测试。例如，如果实践者鉴定出受试者可能具有ipSIRS，以上描述的过程通常用相应于LAMP1、CEACAM4、PLAC8和PLA2G7的相对浓度的相对生物标志物值进行。
更通常地，临床迹象可以是第一状况和第二状况共有的，在该情况中指示物用于在第一状况和第二状况之间加以区分。因此，例如，inSIRS和ipSIRS通常具有相似的临床迹象，因此实践者可以使用指示物来在状况之间加以区分。
因此，以上可以用于验证指示物，所述指示物用于确定生物受试者具有至少一种医学状况的可能性，所述生物标志物利用选定类型的定量技术来定量，并且方法包括：
a)确定多种生物标志物值，每种生物标志物值指示来自生物受试者的至少一种相应的测量的生物标志物的测量值或衍生值；
b)通过以下确定指示生物受试者具有至少一种医学状况的可能性的指示物：
i)使用第一生物标志物值和第二生物标志物值计算第一指示值；
ii)使用第三生物标志物值和第四第二生物标志物值计算第二指示值；
iii)使用第一指示值和第二指示值确定指示物；以及
c)计算以下的至少一种：
i)第一对照值，所述第一对照值使用第一生物标志物值和第三生物标志物值计算；
ii)第二对照值，所述第二对照值使用第一生物标志物值和第四生物标志物值计算；
iii)第三对照值，所述第三对照值使用第二生物标志物值和第三生物标志物值计算；
iv)第四对照值，所述第四对照值使用第二生物标志物值和第四生物标志物值计算；
d)将至少一种对照值与各自的对照值阈值比较；以及
e)使用所述比较的结果选择性地验证所述指示物。
因此，以上还可以用于验证指示物，所述指示物用于确定生物受试者具有至少一种医学状况的可能性，生物标志物利用选定类型的定量技术来定量，并且方法包括：
a)从生物受试者获得样品，样品包含基因表达产物；
b)定量样品中的至少一些基因表达产物，以确定样品中的基因表达产物的浓度；
c)通过组合以下确定指示生物受试者具有至少一种医学状况的可能性的指示物：
i)第一指示值，所述第一指示值指示第一基因表达产物和第二基因表达产物的浓度的比率；以及
ii)第二指示值，所述第二指示值指示第三基因表达产物和第四基因表达产物的浓度的比率；以及
d)通过确定以下确定对照值：
i)第一对照值，所述第一对照值指示第一基因表达产物和第三基因表达产物的浓度的比率；
ii)第二对照值，所述第二对照值指示第一基因表达产物和第四基因表达产物的浓度的比率；
iii)第三对照值，所述第三对照值指示第二基因表达产物和第三基因表达产物的浓度的比率；以及
iv)第四对照值，所述第四对照值指示第二基因表达产物和第四基因表达产物的浓度的比率；
e)将每个对照值与各自的对照值阈值比较；以及，
f)使用比较的结果选择性地验证指示物。
在一个实例中，方法由作为分布式体系结构的部分运行的一种或更多种处理系统来进行，现在将参考图2描述所述分布式体系机构的实例。
在该实例中，很多基站201经由通讯网络诸如因特网202，和/或很多局域网(LAN)204偶联至很多客户端装置203和一种或更多种测量装置205，诸如PCR、测序仪器等。将领会到的是，网络202、204的配置仅仅是为了举例的目的，并且在实践中基站201、客户端装置203和测量装置205，可经由任何适当的机制通讯，诸如经由有线和无线连接，包括但不限于移动网络、专用网络诸如802.11网络、因特网、LAN、WAN等，以及经由直接连接或点对点连接诸如蓝牙等。
在一个实例中，每个基站201包括一种或更多种处理系统210，其每一种可以被偶联至一个或更多个数据库211。基站201被改造为用于计算并验证指示物并对这些生成展示以经由客户端装置显示。客户端装置203通常被改造为与基站201通讯，允许指示物展示被显示出。
尽管基站201被显示为单个实体，但是将领会到，例如通过使用作为基于云的环境的部分提供的处理系统210和/或数据库211，基站201可以遍布很多个在地理上分隔的位置分布。然而，以上描述的布置并不是必需的，并且可以使用其他合适的配置。
在图3中显示了合适的处理系统210的实例。在该实例中，处理系统210包括如显示的经由总线304相互连接的至少一个微处理器300，存储器301，任选的输入/输出装置302诸如键盘和/或显示器，以及外部接口303。在该实例中，可以使用外部接口303将处理系统210连接至外围装置，诸如通讯网络202、204，数据库211，其他存储装置等。尽管显示了单个外部接口303，这仅仅是为了举例的目的，并且在实践中可以提供使用多种方法(例如，以太网、串口、USB、无线等)的多种接口。
在使用中，微处理器300执行储存于存储器301中的应用软件形式的指令，以允许进行需要的过程。应用软件可以包括一个或更多个软件模块，并且可以在合适的执行环境诸如操作系统环境等中执行。
因此，将领会到，可以从任何合适的处理系统，诸如合适地编程的客户端装置、PC、网络服务器(web server)、网络服务器(network server)等形成处理系统210。在一个特定的实例中，处理系统210是标准处理系统，其执行存储于非易失性(例如，硬盘)存储器上的软件应用，尽管这并不是必需的。然而，还将理解的是，处理系统可以是任何电子处理装置，诸如微处理器，微芯片处理器，逻辑门配置，任选地与执行逻辑关联的固件诸如FPGA(现场可编程门阵列)或任何其他电子装置、系统或布置。
如图4中显示的，在一个实例中，客户端装置203包括如显示的经由总线404相互连接的至少一个微处理器400，存储器401，输入/输出装置402诸如键盘和/或显示器，以及外部接口403。在该实例中，可以使用外部接口403将客户端装置203连接至外围装置，诸如通讯网络202、204，数据库，其他存储装置等。尽管显示了单个外部接口403，这仅仅是为了举例的目的，并且在实践中可以提供使用多种方法(例如，以太网、串口、USB、无线等)的多种接口。
在使用中，微处理器400执行存储于存储器401中的应用软件形式的指令，以允许与基站201的通讯，例如以允许参数值的选择和展示的查看等。
因此，将领会到，可以从任何合适的处理系统，诸如合适地编程的PC、因特网终端、膝上型电脑或手持型PC形成客户端装置203，并且在优选的实例中为平板或智能手机等。因此，在一个实例中，处理系统210是标准处理系统，其执行存储于非易失性(例如，硬盘)存储器上的软件应用，尽管这并不是必需的。然而，还将理解的是，客户端装置203可以是任何电子处理装置，诸如微处理器，微芯片处理器，逻辑门配置，任选地与执行逻辑关联的固件诸如FPGA(现场可编程门阵列)或任何其他电子装置、系统或布置。
现在将更详细地描述用于确定并验证指示物的测量的过程的实例。为了这些实例的目的，假定一种或更多种处理系统210采取行动从测量装置接收测量的生物标志物值，计算指示值和对照值，并使用这些值计算和验证指示物，所述指示物然后可以经由位于客户端装置203的托管网页或App被显示为展示的部分。因此处理系统210通常为服务器，所述服务器取决于可用的特定网络基础设施，经由通讯网络等与客户端装置203和测量装置205通讯。
为了实现其，基站201的处理系统210通常执行应用软件来进行需要的过程，由处理系统210进行的行动由处理器300根据在存储器301中被存储为应用软件的指令和/或经由I/O装置302从使用者接收的输入指令，或从客户端装置203接收的指令进行。
还将假定，使用者经由GUI(图形化使用者界面)或客户端装置203上呈现的类似物，并且在一个特定的实例中，经由显示由基站201托管的网页的浏览器应用程序，或显示由处理系统210提供的数据的App与处理系统210互动。由客户端装置203进行的行动由处理器400根据在存储器401中被存储为应用软件的指令和/或经由I/O装置402从使用者接收的输入指令进行。
然而，将领会到，以上描述的为了以下实例的目的假定的配置并不是必需的，并且可以使用很多其他配置。还将领会到，客户端装置203和基站201之间的功能划分可以取决于特定的实施方式而变化。
现在将参考图5更详细地描述用于确立对照和指示物参考的示例过程。
在该实例中，在步骤500，处理系统210确定对参考群体获得的生物标志物值的形式的参考数据。
参考群体为对其收集信息的感兴趣的任何群体，可以相对于其进行参考。例如可以将群体表征为具有或不具有状况，或者具有不同程度的严重度、预后、阶段，或通过状况分层法具有相似的疾病的那些群体。
可以以任何适当的方式获得参考数据，但是通常这包括从多个个体获得基因表达产物数据，所述多个个体被选择以包括被诊断为患有感兴趣的一种或更多种状况的个体以及健康个体。术语“表达”或“基因表达”指仅仅RNA的产生，或RNA的产生和RNA翻译为蛋白或多肽。在特定的实施方案中，术语“表达”或“基因表达”指信使RNA(mRNA)，核糖体RNA(rRNA)，微小RNA(miRNA)，或其他RNA类别诸如线粒体RNA(mtRNA)、非编码RNA(ncRNA、lncRNA(长))、小干涉RNA(siRNA)、转运RNA(tRNA)，或蛋白的产生。
如本文使用的，术语“微小RNA”或“miRNA”指长度为约18-30个核苷酸(合适地长度为18-24个核苷酸，通常21-23个核苷酸)的短核糖核酸(RNA)，所述短核糖核酸通过与靶标mRNA上的互补序列结合转录后地调控靶标信使RNA(mRNA)转录子，并导致靶标mRNA的降解。该术语还包括来自miRNA基因的前体(未加工的)RNA或成熟(加工的)RNA转录子。前体miRNA到成熟miRNA的转化受助于RNA酶诸如Dicer、Argonaut或RNA酶III。
在参考数据中捕获的状况通常是医疗、兽医或其他健康状态状况，并且可以包括任何疾患、疾病、疾病的阶段、疾病亚型、疾病的严重度、不同预后的疾病等。
示例性参考生物标志物可以包括表达产物，诸如核酸或蛋白质分子，以及进行临床评价相关的其他分子。
参考群体中的个体通常还经历临床评价，允许任何状况在临床上被鉴定作为参考群体的表征过程的部分，并且具有任何评价或状况的标示，形成参考数据的部分。尽管任何状况可以被评价，在一个实例中，该过程被特别地用于鉴定状况诸如SIRS(全身炎症反应综合征)(M S Rangel-Frausto,D Pittet,M Costigan,T Hwang,C S Davis,and R PWenzel,“The Natural History of the Systemic Inflammatory Response Syndrome(SIRS).a Prospective Study.,”JAMA:the Journal of the American MedicalAssociation273,no.2(January 11,1995):117–123.)。SIRS是压倒性全身反应，其可以具有感染性或非感染性病因，而脓毒症是在感染期间发生的SIRS。两者均由很多非特异性宿主反应参数限定，所述非特异性宿主反应参数包括心率和呼吸率的改变、体温和白细胞计数(Mitchell M Levy et al.,“2001SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International SepsisDefinitions Conference,”Critical Care Medicine 31,no.4(April 2003):1250–1256.；K Reinhart,M Bauer,N C Riedemann,and C S Hartog,“New Approaches toSepsis:Molecular Diagnostics and Biomarkers,”Clinical Microbiology Reviews25,no.4(October 3,2012):609–634)。为了区分这些状况，它们在本文中被称为SIRS(两种状况)、感染阴性SIRS(无感染的SIRS，后文被称为“inSIRS”)和感染阳性SIRS(脓毒症，具有已知或疑似感染的SIRS，后文被称为“ipSIRS”)。SIRS的起因是多样且变化的，并且可以包括但不限于创伤、烧伤、胰腺炎、内毒素血症、外科手术、不利的药物反应和感染(局部的和全身的)。然而，将从以下领会到的是，这可以适用于一系列不同的状况，并且提及inSIRS或ipSIRS并不意图是限制性的。
另外的参考数据还可以对参考群体收集，并且可以包括另外的生物标志物，诸如个体和/或其亲属的已经通过装置测量或临床评价生成或捕获的一种或更多种表型或临床参数。表型参数可以包括信息诸如性别、种族、年龄、毛发颜色、眼睛颜色、高度、重量、腰围和臀围等。另外，在应用至除了人之外的个体的技术的情况中，其还可以包括信息诸如物种、品种等的名称。临床特性可以包括遗传信息、白血细胞计数、心脏舒张血压和心脏收缩血压、骨密度、体重指数、糖尿病的存在或不存在、静息心率、HOMA(稳态模型评价)、HOMA-IR(稳态模型评价胰岛素耐受)、IVGT(静脉内葡萄糖耐受测试)、静息心率、β细胞功能、大血管功能、微脉管功能、致动脉粥样化指数、低密度脂蛋白/高密度脂蛋白比率、内膜中层厚度、体温、序贯器官衰竭评分(Sequential Organ Failure Score，SOFA)等。
参考群体具有两种功能，第一种是关于感兴趣的状况表征患者，在该实例中将患者分类成inSIRS和ipSIRS。第二种是捕获需要的值以生成用于测定的值。因此，对于参考群体以及对于特定的指示物，将指示物应用至参考数据将产生相应于已知分类或等级诸如inSIRS和ipSIRS的值的参考指示物分布，从新样品确定的指示值可以与所述参考指示物分布比较。
相似地，内部相对对照可以使用参考群体数据来生成并与对每个新样品相似地生成的内部相对对照比较。
通常将参考群体内的每个个体分配成组。组可以以任何适当的方式，诸如以下标示中的任一种或更多种来限定：状况的存在、不存在、等级、阶段、严重度、预后或进程；其他测试或测定；或与个体相关的测量的生物标志物。
例如，首选的组可以被用于鉴定罹患SIRS的一组或更多组个体，罹患ipSIRS的一组或更多组个体，和罹患inSIRS的一组或更多组个体。还可以对罹患其他状况的个体限定另外的组。组可以包括重叠的组，所以例如可以期望限定健康个体的组和具有SIRS的个体的组，并进一步限定以将inSIRS患者与ipSIRS患者区分开，以及区分不同程度的inSIRS或ipSIRS，这些组共同地具有SIRS，但每组患者在临床医生是否已经确定感染的存在与否方面不同。另外，可以基于表型特性进行进一步细分，所以可以基于性别、种族等来限定组，以使得罹患状况的多于一组个体被限定，每组与不同的表型特性相关。
然而，还将领会到的是，不同组的鉴定可以以其他方式进行，例如基于参考个体的生物样品内的生物标志物的特定活性或特性，并且因此，提及状况并不意图是限制性的并且根据需要可以使用其他信息。
将参考群体中的患者进行分类成组的方式可以取决于优选的实施方式而变化。在一个实例中，这可以由处理系统201，例如使用非监督方法诸如主成分分析(PCA)或有监督方法诸如K-平均值或自组织映射(SOM)自动地进行。可选地，这可以通过允许操作者查看图形化使用者界面(GUI)上呈现的参考数据并使用适当的输入指令限定各自的组由操作者人工地进行。
因此，在一个实例中，参考数据可以包括每个参考个体的关于至少一种并且期望地关于多个参考生物标志物的信息，以及状况的存在、不存在、等级或进程。
参考数据可以从医疗中心的表现出具有与感兴趣的任何相关状况有关的临床迹象的个体收集，并且可以包括随访会诊以证实临床评价，以及鉴定生物标志物和/或临床迹象和/或临床迹象的严重度经一段时间段的改变。在该后一情况中，参考数据可以包括指示状况的进程和/或参考生物标志物的活性的时间序列数据，以使得个体的参考数据可以被用于确定个体的状况是否改善、恶化或静止。还将领会到的是，对于样品群体内的个体，参考生物标志物优选地基本相似，以使得可以进行个体间的测量活性的比较。
该参考数据还可以随时间流逝，例如随着个体内的状况发展，从单个个体收集，尽管更通常地其可以从多个个体获得，所述多个个体的每一个具有感兴趣的一种或更多种状况的不同阶段。
将领会的是，收集后，参考数据可以被储存在数据库211中，允许该参考数据随后被处理系统210检索用于后续分析，或者可以被直接提供至处理系统210用于分析。
在一个实例中，测量结果作为原始数据被接收，所述原始数据然后经历初步处理。此类原始数据相应于已经来自来源处而无修改的信息，诸如来自装置诸如PCR仪、阵列(例如微阵列)扫描仪、测序仪的输出；临床记录或任何其他生物化学数据、生物数据、观察数据；等。该步骤可以被用于将原始数据转化成更好地适于分析的格式。在一个实例中，进行该步骤以归一化原始数据，并从而有助于确保生物标志物值显示为一致，即使当使用不同的技术、不同的器材等测量时。因此，归一化的目标是去除无法直接归因于考虑的特定分析的样品内的变异。例如，去除由在不同位置处理的样品的差异导致的变异。本领域所熟知的归一化的实例包括通用数据的z-评分转化，或通用的特定领域(domain specific)归一化，诸如用于微阵列的RMA归一化。
然而，还将领会到，在一些应用中，诸如在单个数据获取仪器上运行的单样品实验中，该步骤可以不是严格必需的，在该情况中，函数可以是产生与输入相同的输出的Null函数。
在一个实例中，用于生成参考数据的优选方法是针对对数归一化的数据的配对函数方法。对数归一化是对基因和蛋白表达数据的标准数据转化，因为测量的生物标志物遵循对数正态分布，如由装置直接测量的。应用对数转化将数据转化成过程友好的正态分布的数据。测量的生物标志物值将取决于被评价的主要状况，所以例如在确定受试者具有与inSIRS相对的ipSIRS的可能性的情况中，使用的RNA生物标志物Bm1、Bm2、Bm3、Bm4可以是LAMP1、CEACAM4、PLAC8和PLA2G7。第二种可能的实例，在确定受试者具有肝病的可能性的情况中，使用的蛋白生物标志物Bm1、Bm2、Bm3、Bm4可以是碱性磷酸酶(AP)、氨基转移酶(AT)、天冬氨酸转氨酶(AspAT)和γ-谷酰基转肽酶(GGT)。
作为以上过程的一部分，在步骤510，使用传统现有技术验证测量结果，以确保测量已被成功进行并且因此是有效的。
在步骤520，对参考群体确定至少四个内部相对对照值Ctrl1、Ctrl2、Ctrl3、Ctrl4，和两个另外的对照值Ctrl5、Ctrl6，任选地如下确定：
Ctrl1＝(Bm1/Bm3)
Ctrl2＝(Bm1/Bm4)
Ctrl3＝(Bm2/Bm3)
Ctrl4＝(Bm2/Bm4)
Ctrl5＝(Bm1/Bm2)
Ctrl6＝(Bm3/Bm4)
在步骤530，对照值用于升级或产生各自的对照参考数据。在这点上，在当前的实例中，每个对照参考为参考群体的对照值的分布的形式，所述参考群体包括健康个体和罹患感兴趣的状况的个体。分布自身可以被用作对照参考，或可选地可以从其衍生一个或更多个值，诸如以限定阈值范围。例如，可以将其设置为包括99％的分布。
另外，可以限定对照参考以使得其对于个体的特征诸如受试者的性别、种族、年龄、重量、高度或其他生理特征是特异的，从而允许对具有相似特征的不同组个体限定不同对照参考。
生成后，对照参考并且特别是对照分布被存储于数据库211中用于后续使用。
在步骤540，确定第一指示值和第二指示值。第一指示值和第二指示值In1、In2分别基于第一生物标志物值和第二生物标志物值的比率以及第三生物标志物值和第四生物标志物值的比率来确定：
In1＝(Bm1/Bm2)
In2＝(Bm3/Bm4)
指示值在步骤550被用于升级或生成指示物参考组，所述指示物参考组被用于分析受试者的测量的指示值来确立受试者具有状况的可能性。特别地，在统计上分析每个参考组的指示值以确立指示每个组的指示值的范围或分布，从而允许指示值被用于辨别不同的组，并因此确定受试者罹患特定的状况的可能性，如以下将更详细地描述的。
现在将参考图6更详细地描述用于验证在生成指示物中使用的生物标志物值的测量的过程的示例过程。
在该实例中，在步骤600，通过测量装置205测量四种生物标志物Bm1、Bm2、Bm3、Bm4的值。选择的四种生物标志物值将取决于被评价的主要状况。例如，在确定患者具有与inSIRS相对的ipSIRS的可能性的情况中，使用的生物标志物Bm1、Bm2、Bm3、Bm4将是LAMP1、CEACAM4、PLAC8和PLA2G7。
在步骤610，处理系统210直接从测量装置205，或通过在存储于数据库211或其他数据存储中后检索值，来确定第一指示值和第二指示值。第一指示值和第二指示值In1、In2分别基于第一生物标志物值和第二生物标志物值的比率以及第三生物标志物值和第四生物标志物值的比率来确定：
In1＝(Bm1/Bm2)
In2＝(Bm3/Bm4)
在步骤620，处理装置210组合指示值来确定指示物In，其可以使用第一指示值和第二指示值的和或其他相似量度来获得。所以例如：
In＝In1+In2＝(Bm1/Bm2)+(Bm3/Bm4)
在步骤630，处理装置210如下确定四个对照值Ctrl1、Ctrl2、Ctrl3、Ctrl4和任选地另外的对照值Ctrl5、Ctrl6：
Ctrl1＝(Bm1/Bm3)
Ctrl2＝(Bm1/Bm4)
Ctrl3＝(Bm2/Bm3)
Ctrl4＝(Bm2/Bm4)
Ctrl5＝(Bm1/Bm2)
Ctrl6＝(Bm3/Bm4)
因此，如图6中显示的，计算四种生物标志物Bm1、Bm2、Bm3、Bm4的值的每种可能的比率，比率中的两种被用于形成指示值，并且因此指示物以及所有的比率被用于对照值。
然后在步骤640，将对照值中的每一个与各自的对照参考并且特别地对照分布比较。在这点上，将领会的是，处理系统210将检索特定生物标志物的各自的对照分布，所述特定的生物标志物被用于确定各自的对照值Ctrl1、Ctrl2、Ctrl3、Ctrl4，任选地另外的对照值Ctrl5、Ctrl6，这些对照分布预先被确定并被存储于数据库211，如以上描述的。在步骤650，处理系统210基于比较的结果确定每个对照值是否是可接受的。在该点上，如果任一对照值在限定的对照值阈值范围之外，则这指示测试失败，所述测试失败在步骤660被传达至使用者，例如通过在请求测试的医疗实践者的客户端装置203上提供标示。否则，在步骤670，在客户端装置203上显示指示物的展示，如以下将更详细地描述的。
在以上描述的过程中，四种生物标志物Bm1、Bm2、Bm3、Bm4的值被用于确定四个(或任选地六个)对照值。因为每种生物标志物(Bm1、Bm2、Bm3、Bm4)被包括在与作为对照的其他生物标志物(Ctrl1、Ctrl2、Ctrl3、Ctrl4)的多重比较中，所以比起如果仅相对于单个期望的范围或相对于单个对照生物标志物测量每个生物标志物，存在更多的机会检测到以生物标志物为基础的无效。每种生物标志物的这种多重测试导致比与独立对照的单独比较实现的大的多的灵敏度，如图7B的布置中显示的。
例如，在表示基于测量的生物标志物的标准对照策略的图7B的情况中，使用对照，相对于对照或等效地相对于绝对值确定Bm1，以衍生值。在期望的范围之外的测量值仅在每千个样品中才观察到一次，所以如果测量值落在该范围之外，则该样品测量属于分布(即，其是有效的)的概率为1/1000并且失败检测的p值为：0.001。
与之相对，在图7A的当前系统的情况中，将生物标志物Bm1的测量值与生物标志物Bm2、Bm3、Bm4的每一个比较。每一次代表对Bm1的测量值的独立检查，所以对于每次比较，范围之外的值每1000个样品只有一次。该样品不处于有效样品的分布中(失败)的概率为1/1000x 1/1000x1/1000，以使得失败检测的p值为：1e-9，意味着图7A中显示的该相对对照组合比图7B中显示的标准测量对照灵敏百万倍。
现在将参考图8A和8B描述另外的实例。
在该实例中，在步骤800，从受试者获得样品。取决于被确定的生物标志物值的性质，样品可以是任何合适的样品，诸如外周血样品等。在步骤805，样品经历这样的制备，所述制备允许该样品被提供至测量装置205并用于步骤810的定量过程。为了该实例的目的，定量过程包括PCR扩增，测量装置为PCR仪，尽管其他合适的生物标志物测量装置和技术可以被使用。在该实例中，在步骤815，对四种生物标志物Bm1、Bm2、Bm3、Bm4中的每一种确定扩增时间At1、At2、At3、At4，扩增时间从测量装置205转移至处理系统210，允许处理系统210进行相应的生物标志物值的分析。
因此，在步骤820，处理系统210使用扩增时间计算比率。在这点上，由于扩增时间代表对数值，所以通过对扩增时间进行减法运算来确定比率，如本领域技术人员将领会到的。
因此，在该实例中，将如下确定指示值和对照值：
Ctrl1＝(Log Bm1-Log Bm3)＝(At1-At3)
Ctrl2＝(Log Bm1-Log Bm4)＝(At1-At4)
Ctrl3＝(Log Bm2-Log Bm3)＝(At2-At3)
Ctrl4＝(Log Bm2-Log Bm4)＝(At2-At4)
如之前提及的，指示值还可以被用作对照值，导致两个另外的对照值：
Ctrl5＝(Log Bm1-Log Bm2)＝(At1-At2)
Ctrl6＝(Log Bm3-Log Bm4)＝(At3-At4)
在步骤825，处理系统将代表对照值的比率与从数据库211检索的各自的对照值阈值范围比较。再次，这可以基于受试者的特征，且对照值源自对具有相似特征的个体的样品群体测量的对照值。
在步骤830，处理系统210确定对照比率是否相应于可接受的对照值，换言之它们是否落在限定的阈值范围内。如果情况并非如此，则在步骤835，例如通过使处理系统210生成失败通知并将其提供至客户端装置205来指示测试失败。通知可以为任何合适的形式，并且可以包括电子邮件、在测试管理软件应用的控制板中的通知等。作为其的一部分，落在对照值范围之外的任何异常比率可被鉴定到，允许操作者鉴定是否由于任何原因，有任何生物标志物值失败或者被不准确地测量。
如果对照值的每一个都是可接受的，则在步骤840，处理系统210如下通过组合指示值的比率来确定指示值：
In＝(Log Bm1-Log Bm2)+(Log Bm3-Log Bm4)＝(At1-At2)+(At3-At4)
然后在步骤845，处理系统210将指示值与一个或更多个各自的指示物阈值比较。
如之前描述的，指示物参考是对样品群体衍生的，并且被用于指示受试者罹患ipSIRS或另一种状况的可能性。为了实现其，指示物参考通常衍生自与受试者具有相似特征的样品群体。样品群体通常基于临床评价被分组成具有/不具有状况或状况的严重度、风险或进程阶段的量度的组，然后这被用于评价可以在组间加以区分的阈值指示值或提供严重度、风险或进程阶段的量度。在步骤850，该比较的结果被处理系统210使用来计算受试者具有ipSIRS的可能性，这被用于在步骤855生成结果的展示，所述展示被传输至客户端装置203用于在步骤860显示，例如作为电子邮件、控制板标示等的一部分。
在图9A和9B中显示了展示的实例。
在该实例中，展示900包括指针910，指针910相对于线性刻度930移动。线性刻度被分成指示受试者具有SIRS或脓毒症的可能性的区域921、922、923、924。相应的指示物数值在步骤930显示，并带有在步骤940显示的相应的值是否代表inSIRS或ipSIRS的可能性的标示。评分的字母数据标示在步骤951显示，连同生物受试者具有ipSIRS的相关概率在步骤952显示。
如该实例中显示的，指针所处于的线性刻度区域被突显，最不可能的诊断被淡化(greyed out)以使受试者位于刻度上的位置绝对地清晰。这导致一种展示，所述展示当在步骤860显示时，容易地理解并进行快速诊断对于医师来说是容易的。
现在将参考图10A、10B和10C描述使用衍生的内部对照相对于现有技术的益处的特征。
使用以上具有被用于生成指示值的四种测量的生物标志物的实例，图10A显示了标准对照方法。测定的工作流程被分成物理部分1010和算法部分1020，其中物理部分1010是固有的硬件、试剂和非软件部分，并且算法部分1020在适当的计算装置210上进行。测量的生物标志物1015的值和外部测量对照1030的值使用物理装置1010生成。外部阳性对照1030被用于通过相对于参考范围1040测量，来验证测试能够产生在可报告的范围内的结果，并且如果不在可报告的范围内，则使测试1050失败，或者如果在可报告的范围内，则在报告1070中输出指示值1060。
为了比较，在图10B中显示了使用内部相对对照的相同装置。再次，工作流程被分成物理部分1010和算法部分1020，并在物理装置1010上生成测量的生物标志物1015。注意，在图10A中显示的外部阳性对照1030并不存在，并且存在源自测量的生物标志物1015的内部相对对照1035的另外生成。在其他方面，两种方法相似，具有相对于参考阈值1040的对照的测试，并且如果在这些阈值之外，则报告测定的失败1050，否则指示值1060将以报告1070的形式输出。
将领会的是，通过移除装置的外部对照1030形式的物理部分，并用内部相对对照1035的使用替换它们的功能，测试的对照组分已经以固定的成本/单元从物理部分移至算法部分，所述算法部分作为软件在实质上更可扩展。因此，如图10B中显示的内部相对对照的使用具有超过如图10A中显示的现有技术测量对照的使用的优势，包括更低的工业制造成本、复杂性和风险，或处理风险。
该方法的延伸是图10C中的实例，如果测量的生物标志物1015无法产生相对对照1035或产生相对对照1035不切实际，所述相对对照1035完全地覆盖了其中失败样品必须被检测出1040的所有例子，则该实例可被使用。在其中即使没有包含指示物的对照的组合可能在范围之外，指示值可以是无效的情况中，此类另外的内部相对对照的使用是有用的。实例可以是，测试被设计用于由于感染而具有炎性反应的人，并且指示值可以是患者在随后24小时将改善或恶化的可能性的量度。可以是，指示物在该群体中是高度预后的，并且与该指示物不相关的内部相对生物标志物可以可靠地区分具有或不具有感染的那些人。在该实例中，内部相对生物标志物可以被用作另外的对照以确保患者确实被感染，并且因此是意图的使用群体的一部分，并且因此对该患者使用指示值是有效的。在该情况中，与用于指示值1060的测量的生物标志物1015平行地，可以在物理装置1010上运行另外的测量的生物标志物1031。另外的测量的生物标志物1031不需要被用于指示值(测试结果)，并且被特别选择以确保当针对可接受的范围1040测试时，任何无效样品将适当地使测试失败1050。将领会的是，可以要求多个另外的内部对照1031以覆盖无效样品的所有可能情况，并且可以将多种函数应用至彼此组合的另外的测量的内部对照以及包含指示值的测量的生物标志物以满足该目的。还将领会的是，通常在医疗装置中测量另外的内部对照1031比使用外部对照1030更简单且更便宜，并且因此即便添加很多内部对照，通常仍将提供超过使用少量外部对照的成本和复杂性优势。
现在将参考图12A至12C(a)-(f)描述实例，图12A至12C(a)-(f)显示了该群体的核密度图。每种基因的循环阈值(Ct)的分布以实线显示，并且作为对照的已知浓度的体外合成的转录子的Ct值显示为虚线。
将使用相同的实例，参考图11A和11B描述使用相对对照方法超过标准测量对照的另一种优势。在图11A中，显示了在输入PCR反应的从20ng至2000ng的范围的浓度的范围内，测量的生物标志物(Bm1、Bm2、Bm3、Bm4)的每一种的Ct值。在该实例中，指示值被测量为这些测量的生物标志物的比值的和：
In＝In1+In2＝(Bm1/Bm2)+(Bm3/Bm4)
在图11B中显示了每种浓度的这些生物标志物的指示值，图11B显示出平坦的曲线，尽管在输入范围内浓度的很大的改变。这些结果表明在输入浓度的范围内指示物是稳定的，因为它测量了生物标志物之间的相对浓度。如果在稳定的指示物范围(20ng至2000ng输入)内，将参考阈值(以Ct单位)应用至图11A中的测量的生物标志物的每一个，则参考范围将很宽。在该实例中，PLAC8的有效范围的范围将为从17Ct单位至23Ct单位。此类宽的对照参考范围通常并不适当，因此通常测定指定窄的输入范围，以使得可以使测量的生物标志物的参考范围足够窄。从样品生成输入浓度中的该步骤是处理中的额外步骤，如果指示值使用源自测量的生物标志物的相对信息，以及如果对照还使用源自测量的生物标志物的相对信息，则可去除该额外步骤。通过去除要求稀释至指定的输入浓度的处理步骤，这节省了时间、成本并降低了复杂性，此类实例显示出超过在该情况中使用测量的生物标志物的对照的改善的有用性。
在该实例中，图12A中显示的数据以2种或更多种ipSIRS标准取自被分成具有或不具有感染的患者的106个连续的样品，针对签名基因LAMP1、CEACAM4、PLAC8和PLA2G7的形式的生物标志物。
接下来，将描述四种签名基因之一的测量的失败。使用样品号13，并人工地将LAMP1反应的反应效率降低至89％(失败的测定)，我们将记录的Ct值从25.71降低至22.88。如在图12B(a)-(f)中对LAMP1显示的，基于该基因的参考Ct观察，测定已经失败的概率是32.5％，不足以宣布为失败的测定。图12B(a)-(f)显示了对失败样品以及还对高阳性对照和低阳性对照，对其他生物标志物(PLA2G7、PLAC8和CEACAM4)中的每一个记录的Ct值，值在期望的范围内。
表2显示了对于测量的生物标志物和两种对照的每一个，值在参考范围内，并且不存在充足的证据(p<0.05)鉴定为失败样品。
表2
现在观察图12C(a)-(f)中的测量的生物标志物之间的比率，比率PLAC8-LAMP1清楚地检测到失败p<0.001，这足以正确地宣布测定失败。
表3显示，失败的测定通过PLAC8与LAMP1的相对值的低p值(<0.01)检测到。
表3
图12D将失败样品绘制为PLAC8和LAMP1的散点图。可以看出，尽管该样品在PLAC8和LAMP1两者的最大和最小范围内，当考虑相对于这些生物标志物的每一个的相对位置时，它是清楚的异常值。这反映在该相对对照的低p值，因为它在参考范围之外，并因此被正确地鉴定为失败样品。
因此，使用该方法，单独地可能不足以宣布失败测定的多个相对对照可以利用贝叶斯规则或其他概率方法组合，以给出联合失败概率。
因此，以上方法描述了在基因表达实验和分析中，包括测量的生物标志物值，诸如靶基因的表达的比率的对照的使用，而不是非靶标内部或外部对照或掺入物的使用。此类方法的优势除了高灵敏度以及如果指示值也包括比率，在处理期间跳过输入归一化步骤的能力之外，还包括：在用于指示值的那些测量之外无另外的测量，在单个实验中分析更多靶标的能力，以及减少的进行基因表达分析的整体成本。
现在将参考图13A(a)-(d)描述实例，图13A(a)-(d)显示了来自BUPAMedicalResearch Ltd的针对由于酗酒引起的肝损伤的检测的男性患者的研究的数据。在该研究中，有144名登记的志愿者被分类为酗酒者，以及200名登记的志愿者被分类为非酗酒者。对每个志愿者获取来自外周血的肝相关蛋白的测量，并且这些蛋白(指示物)的诊断性组合对于酒精相关肝损伤获得94％的分类准确性(Comak,Emre,等"A new medical decisionmaking system:Least square support vector machine(LSSVM)with Fuzzy WeightingPre-processing."Expert Systems with Applications 32.2(2007):409-414.)。该测试的有用性是，可以用来自外周血的多标志物蛋白组进行由于酗酒引起的肝损伤的准确诊断，胜于侵入性和更昂贵的肝活组织检查。从外周血测量四种蛋白：碱性磷酸酶(AP)、氨基转移酶(AT)、天冬氨酸转氨酶(AspAT)和γ-谷酰基转肽酶(GGT)。参考群体是研究中的一组患者，并且参考数据是每种蛋白浓度的测量值加被定义为每种蛋白的丰度的所有配对比率的相对对照。在该实例中，考虑具有未知肝状态的患者的假定的新样品具有以下测量结果：AP＝56、AT＝49、AspAT＝28和GGT＝6。可以从这些测量结果生成肝病的指示值，但是尚不知晓这些值是否有效(在测量中是否存在一些失败)。所有这些测量结果在这些蛋白的每一种的值的观察范围内，所以该样品在惯例上将被认为已经满足对照(在观察到的参考分布内)。图13A(a)-(f)显示了相对于每种测量的生物标志物(AP、AT、AspAT和GGT)的参考分布，新样品的测量值。可以看出，样品落在每种测量的生物标志物的参考范围内，并且因此在惯例上将被认为是有效的。表4显示了相对于参考分布，每种测量的生物标志物的值，以及对于每种参考分布的失败概率。
表4
AP AT AspAT GGT
样品值 56 49 28 6
在范围内 是 是 是 是
P值 0.451 0.340 0.739 0.411
图13B(a)-(f)显示了相对于衍生的对照分布的相同样品。在AT-GGT和Asp-GGT的情况中，存在小于0.05的p值，表明该样品不可能来自该测试针对其设计的样品群体，或者存在一些其他失败，并因此该测试的指示值(结果)是无效的。
表5显示了该样品的相对对照值以及能够检测该失败的特异性对照(specificcontrols)。
表5
因此，以上描述的系统在多生物标志物医疗装置的情况中引入了相对内部对照的使用，以使得可以减少或消除对不是内部相对对照的对照的需要。
在一个实例中，相对内部对照是样品内部的相对生物标志物，其被用于确保确立指示物中使用的值是有效的。相对生物标志物可以衍生自测量的生物标志物值，这些相对生物标志物值通过限定每种相对生物标志物的相应的可接受的参考阈值而被使用。这些相对生物标志物可以或可以不包括确定指示物中使用的相对生物标志物，并且可以包括以不同或相同组合使用的相同生物标志物值。在一个实例中，这提供了一组相关对照而不需要任何另外的测量的生物标志物被添加至测定。
该系统还可以被用于提供这些对照在使用用于确立指示值的相对生物标志物的医疗装置中的适当应用。
该系统还可以提供一种方法，通过该方法，另外的内部相对生物标志物可以被添加至相对对照组以满足任何任意地严格的对照要求，以使得需要最小的一组另外的测量的生物标志物，从而以最少的成本提供最佳性能。
尽管允许避免另外的标志物，在其中现有技术的方法无法检测的情况中，该系统可以成功地检测测试失败，在其中基于无效测试结果起作用的医疗装置可以具有潜在的生命威胁后果的情况中，这是至关重要的进步。
还显示，例如在现有技术的方法多余地使样品失败的情况中，该系统适当地使结果通过。对于如果测试多余地失败(并且因此结果是不可用的)，医疗装置具有潜在的对生命至关重要的结果，这也是重要的进步。
现在将使用内部数据描述另外的实例，所述内部数据源自对取自患有疑似脓毒症的患者的546个血液样品使用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)。测定结果基于使用四种靶基因(PLA2G7、PLAC8、LAMP1和CEACAM4)的每一种的PCR Ct(循环时间)值的式，提供患者具有脓毒症(或SIRS)的概率。
简而言之，方法如下。将患者血液直接收集至PAXgene管，并提取总RNA。RT-PCR测定被以试剂盒的形式提供至位于Netherlands的医院实验室。测定基于qRT-PCR装置(例如，Applied Biosystems 7500Fast Dx Real-Time PCR Instrument,Applied Biosystems,Foster City,CA,目录号440685；K082562)上的荧光检测，使用样品中四种机体免疫细胞RNA转录子中的每一种的量的定量、实时确定。使用在FAM通道中可视的探针，在每种靶标基因的不同反应孔中，各自逆转录、扩增、检测和定量转录子。四种靶标基因的每一种具有已知的Ct范围，并且当获得的测定结果在这些范围之外时，测试失败。对于每个样品，在不同的反应容器中还运行以下内部对照—高、低、阴性和无模板(NTC)。高、低和阴性内部对照包含已知量的人工DNA模板—这些不同反应的每一个还必须落在特定Ct范围内以使测定通过，并且NTC必须不扩增出PCR产物。
以下在表6中显示了使用两种对照方法(“常规”和“相对”)对这546个样品运行测定得到的结果的汇总表。完整结果显示于表7、8、9和10。
表6
以下是这些结果的简述、解释和讨论。
使用两种对照方法，505个样品(92.5％)通过。
使用两种对照策略，两(2)个样品失败。使用常规对照方法，两个样品均失败，因为靶基因PLA2G7的Ct值在预期Ct范围之外。使用相对对照方法，相同的这两个样品强烈地失败，因为得到低于0.001的多个相对对照p值。
26个样品使用常规对照方法失败，但使用相对对照方法通过。在这26个样品中，23个失败是因为低对照在范围之外。对于这23个样品，所有的个体基因靶标测量结果(PLA2G7、PLAC8、LAMP1和CEACAM4)在预期的Ct范围之内，并且所有的相对对照通过。在进一步检查个体基因和其他的常规对照的Ct值之后，由于一个在范围外的常规对照(低)而失败的23个样品不应失败。相对对照策略未使这些样品失败。在实践中，这将意味着相对对照策略的使用将‘挽救’23个有效诊断测试，对于使用常规对照方法的患者，该23个有效诊断测试将被拒绝。
其他三(3)个样品使用常规方法失败，因为PLA2G7的Ct值在该基因的预期范围之外。在这三个样品中：
1)样品IXP_128：报告的对于相对对照调整的p值在0.045以上。这样的p值表明该样品不应失败。在进一步检查Ct值之后，所有的个体基因测量结果相比之下是高的(其他三种基因的预期值在高的范围，但并不在范围之外)。此类结果表明，测定以低输入RNA浓度或低质量RNA运行。尽管如此，仍能够计算脓毒症的有效概率。另外，患者的回顾性临床诊断匹配来自测定的脓毒性概率，暗示测定结果是有效的并且不应失败。
2)样品6869：报告的相对对照p值低到0.0016。在每千个常规测试中的16个中可以预期到像这样的结果。
3)样品1357：报告的相对对照p值低到0.002。在每五百个常规测试中的1个中可以预期到像这样的结果。
相对对照p值的使用允许异常水平(p值)相关的临床解释，而不是绝对判断(call)，允许治疗医师(或代表医师的程序)确定判断测试为失败状态的最佳p值。
存在13个这样的例子，其中常规方法使样品通过，而相对方法不通过。在这些例子中，所有测量的基因标志物在预期的Ct范围内，并且所有常规对照也在范围内。然而，使用相对方法，这些样品导致低的p值。事实上，对于这些样品中的任一个，相对对照测量将偶然发生的概率低于千分之一。这些相对对照结果表明了这13个样品的高异常水平，并且暗示了这些样品与观察的其他样品不相似，与用于诊断的开发和解释的患者群体也不相似。基于使用相对对照方法的高异常水平，这13个样品应是失败的，尽管测量的标志物和常规对照落在预期的Ct范围内。在该例子中，相对对照方法是特别有用的，因为它已经鉴定到使用常规对照方法的诊断结果的解释是无效的患者。另外，相对对照方法提供了结果的无效的置信度。这后两点在以下更详细地讨论。
考虑样品3787：基因的所有Ct值在预期的范围内，并且常规内部对照全部在范围内。因此，使用常规对照方法，该结果将被认为有效。然而，相对对照CEACAM4/LAMP1具有0.0007642的p值，并且相对对照LAMP1/PLAC8具有3.96E-07的p值，表明此类结果以小于百万分之一发生(基于预期结果的分布曲线)。此类结果可以以两种方式解释：
1).测试值是正确的，并且这的确是百万分之一的患者。
2).测试值不正确，并且测定存在一些问题。
生成与所有其他患者样品如此彻底不同(1:1,000,000的机会)的测试结果的任何患者样品不应参考拟合常规分布的其他患者样品结果诊断-应至少对此类结果进一步调查(例如重复测定和/或调查患者临床记录)。
因此，当相对对照方法显示出高度不可能的结果(基于p值)时，测试应是失败的。在这13个病例中，通过样品的适当失败，相对对照方法可以1)‘保护’患者免于不可能实际上有效的诊断预测，和2)更灵敏地检测不反映患者的真实状态的测试结果。
在表7、8、9和10中显示了546个测定的全部结果。
表7显示了使用常规对照方法和相对对照方法两者均通过的505个样品(546个中的)的原始数据结果。
表7
表7
表8显示了使用常规对照方法和相对对照方法两者均失败的2个样品(546个中的)的原始数据结果。
表8
表9显示了使用常规对照方法失败但使用相对对照方法通过的26个样品(546个中的)的原始数据结果。
表9
表10显示了使用常规对照方法通过但使用相对对照方法失败的13个样品(546个中的)的原始数据结果。
表10
遍及本说明书和后面的权利要求，除非上下文另有要求，词语“包含(comprise)”和变形诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为暗示包括陈述的整数或者整数的组或步骤，但不排除任何其他整数或整数的组。
本领域技术人员将领会到，很多变化和改变将变得明显。对于本领域技术人员变得明显的所有此类变化和改变应被认为落在前文宽泛地呈现的描述的本发明的精神和范围内。

Claims (47)

1.一种用于验证生物标志物的定量的方法，所述生物标志物利用选定类型的定量技术定量，并且所述方法包括：
a)对生物受试者的至少一种相应的生物标志物确定多种生物标志物值，每种生物标志物值指示测量值或从测量值衍生的值，并且所述多种生物标志物值至少部分地指示取自所述受试者的样品中所述生物标志物的浓度；
b)通过确定生物标志物值的组合确定至少一个对照值；
c)将每个对照值与各自的对照参考比较；以及
d)使用所述比较的结果确定所述生物标志物值是否有效。
2.根据权利要求1所述的方法，其中至少第一生物标志物值和第二生物标志物值被用于确定指示测试结果的指示物，并且其中所述方法包括确定对照值，所述对照值包括：
a)所述第一生物标志物值和至少一种其他的生物标志物值的组合；和
b)所述第二生物标志物值和至少一种其他的生物标志物值的组合。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法包括：
a)确定至少四种生物标志物值，所述指示物是基于以下的组合：
i)第一指示值，所述第一指示值使用第一生物标志物值和第二生物标志物值计算；和
ii)第二指示值，所述第二指示值使用第三生物标志物值和第四生物标志物值计算；以及
b)确定对照值，所述对照值包括：
i)第一对照值，所述第一对照值使用第一生物标志物值和第三生物标志物值计算；
ii)第二对照值，所述第二对照值使用第一生物标志物值和第四生物标志物值计算；
iii)第三对照值，所述第三对照值使用第二生物标志物值和第三生物标志物值计算；以及
iv)第四对照值，所述第四对照值使用第二生物标志物值和第四生物标志物值计算。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法包括确定对照值，所述对照值包括：
a)第五对照值，所述第五对照值使用第一生物标志物值和第二生物标志物值计算；
b)第六对照值，所述第六对照值使用第三生物标志物值和第四生物标志物值计算；以及
c)使用在确定指示值中未使用的测量的生物标志物的组合计算的对照值。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中所述方法包括通过将函数应用到各自的生物标志物值计算指示值和对照值中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述函数包括以下中的至少一种：
a)对两种生物标志物值进行乘法运算；
b)对两种生物标志物值进行除法运算；
c)两种生物标志物值的比率；
d)对两种生物标志物值进行加法运算；
e)对两种生物标志物值进行减法运算；
f)至少两种生物标志物值的加权和；
g)至少两种生物标志物值的对数和；
h)至少两种生物标志物值的S形函数。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
a)使用第一生物标志物值和第三生物标志物值的比率确定第一对照值；
b)使用第一生物标志物值和第四生物标志物值的比率确定第二对照值；
c)使用第二生物标志物值和第三生物标志物值的比率确定第三对照值；以及
d)使用第二生物标志物值和第四生物标志物值的比率确定第四对照值。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述方法包括确定对照值，包括：
a)使用第一生物标志物值和第二生物标志物值的比率的第五对照值；
b)使用第三生物标志物值和第四生物标志物值的比率的第六对照值；以及
c)使用在确定指示值中未使用的测量的生物标志物的比率计算的对照值。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
a)基于所述比较的结果确定有效性概率；以及，
b)使用所述有效性概率确定所述生物标志物值是否有效。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
a)确定每个对照值与各自的对照参考的比较的对照值概率；以及
b)组合所述对照值概率以确定所述有效性概率。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述对照参考是以下中的至少一种：
a)对照值阈值范围；
b)对照值阈值；以及，
c)对照值分布。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述对照参考是对照值阈值范围，并且其中所述方法包括：
a)将每个对照值与各自的对照值阈值范围比较；以及，
b)如果所述对照值中的任一种落在各自的对照值阈值范围之外，则确定所述生物标志物中的至少一种是无效的。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述对照参考是对照值分布，并且其中所述方法包括：
a)将每种对照值与各自的对照值分布比较；以及，
b)使用所述比较的结果确定所述有效性。
14.根据权利要求11所述的方法，其中每个各自的参考衍生自从样品群体中的很多个体收集的生物标志物值。
15.根据权利要求14所述的方法，其中针对所述样品群体的至少部分确定每个各自的参考。
16.根据权利要求14或权利要求15所述的方法，其中所述样品群体包括：
a)不同性别的多个个体；
b)不同种族的多个个体；
c)多个健康个体；
d)罹患至少一种诊断的医学状况的多个个体；
e)显示出至少一种医学状况的临床迹象的多个个体；以及
f)第一组个体和第二组个体，每组个体罹患各自的诊断的医学状况。
17.根据权利要求1至16中的一项所述的方法，当从属于至少权利要求2时，其中所述指示物用于确定生物受试者具有至少一种医学状况的可能性，并且其中所述样品群体包括：
a)呈现出所述至少一种医学状况的临床迹象的个体；
b)被诊断具有所述至少一种医学状况的个体；和
c)健康个体。
18.根据权利要求1至17中的一项所述的方法，当从属于至少权利要求2时，其中所述指示物通过使用组合函数组合所述第一衍生的指示值和所述第二衍生的指示值确定，所述组合函数为以下中的至少一种：
a)相加模型；
b)线性模型；
c)支持向量机；
d)神经网络模型；
e)随机森林模型；
f)回归模型；
g)遗传算法；
h)退火算法；
i)加权和；和
j)最近邻模型。
19.根据权利要求1至18中的一项所述的方法，当从属于至少权利要求2时，其中所述方法包括：
a)确定指示值；
b)将所述指示值与至少一个指示值范围比较；以及
c)至少部分地使用所述比较的结果确定所述指示物。
20.根据权利要求1至19中的一项所述的方法，当从属于至少权利要求2时，其中所述指示物指示所述受试者具有至少一种医学状况的可能性。
21.根据权利要求1至20中的一项所述的方法，当从属于至少权利要求2时，其中所述方法包括生成所述指示物的展示。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述展示包括：
a)所述指示值的字母数字标示；
b)所述指示值与一种或更多种阈值的比较的图形标示；以及
c)所述受试者具有至少一种医学状况的可能性的字母数字标示。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述生物标志物值指示选自以下的一种或更多种的分子、细胞或生物体的水平或丰度：
a)蛋白；
b)核酸；
c)碳水化合物；
d)脂质；
e)蛋白聚糖；
f)细胞；
g)代谢物；
h)组织切片；
i)完整生物体；以及
j)分子复合体。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述方法至少部分地使用一种或更多种电子处理装置进行。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中指示物参考从数据库检索。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述方法包括在所述一种或更多种电子处理装置中：
a)接收所述生物标志物值；
b)使用所述生物标志物值中的至少两种确定所述至少一种对照值；
c)将所述至少一种对照值与所述各自的对照值阈值比较；以及
d)使用所述比较的结果确定所述测试是否是有效测试。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述方法包括在所述一种或更多种电子处理装置中：
a)通过以下确定指示物：
i)使用第一生物标志物值和第二生物标志物值的比率计算第一指示值；
ii)使用第三生物标志物值和第四第二生物标志物值的比率计算第二指示值；以及，
iii)确定所述第一指示值和所述第二指示值的和；
b)通过以下确定多个对照值：
i)使用所述第一生物标志物值和所述第三生物标志物值的比率计算第一对照值；
ii)使用所述第一生物标志物值和所述第四生物标志物值的比率计算第二对照值；
iii)使用所述第二生物标志物值和所述第三生物标志物值的比率计算第三对照值；以及
iv)使用所述第二生物标志物值和所述第四生物标志物值的比率计算第四对照值；
c)将每个对照值与各自的阈值范围比较；以及
d)响应于每个对照值的成功比较显示所述指示物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述方法包括在所述一种或更多种电子处理装置中：
a)使用所述第一生物标志物值和所述第二生物标志物值的比率计算第五对照值；
b)使用所述第三生物标志物值和所述第四生物标志物值的比率计算第六对照值；以及，
c)通过使用在确定指示值中未使用的生物标志物的组合计算另外的对照值或一组对照值。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述生物标志物是基因表达产物并且其中所述方法包括：
a)从生物受试者获得样品，所述样品包含所述基因表达产物；
b)扩增所述样品中的至少所述基因表达产物；以及
c)对于每种基因表达产物，确定代表获得限定水平的各自的基因表达所需要的扩增程度的扩增量。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述扩增量是以下中的至少一种：
a)循环时间；
b)循环数；
c)循环阈值；和
d)扩增时间。
31.根据权利要求29或权利要求30所述的方法，其中所述生物标志物是基因表达产物，并且其中所述方法包括通过对各自的基因表达产物的扩增量进行减法运算来确定生物标志物值的组合，以使得所述生物标志物值的组合代表所述各自的基因表达产物的相对浓度的比率。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述生物标志物值从呈现出至少一种医学状况的临床迹象的生物受试者获得。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述至少一种状况包括ipSIRS，并且其中所述生物标志物值对应于LAMP1、CEACAM4、PLAC8和PLA2G7的相对浓度。
34.根据权利要求32或权利要求33所述的方法，其中所述生物标志物值从呈现出第一状况和第二状况共同的临床迹象的生物受试者获得，并且其中所述指示物被用于区分所述第一状况和所述第二状况。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述第一状况和所述第二状况包括inSIRS和ipSIRS。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述定量技术为以下的至少一种：
a)核酸扩增技术；
b)聚合酶链式反应(PCR)；
c)杂交技术；
d)微阵列分析；
e)低密度阵列；
f)与等位基因特异性探针杂交；
g)酶促突变检测；
h)连接链式反应(LCR)；
i)寡核苷酸连接测定(OLA)；
j)流式细胞异源双链体分析；
k)错配的化学裂解；
l)质谱法；
m)流式细胞术；
n)液相层析；
o)气相层析；
p)免疫组织化学；
q)核酸测序；
r)单链构象多态性(SSCP)；
s)变性梯度凝胶电泳(DGGE)；
t)温度梯度凝胶电泳(TGGE)；
u)限制性片段多态性；
v)基因表达系列分析(SAGE)；
w)亲和力测定；
x)放射性免疫测定(RIA)；
y)侧流免疫层析；
z)流式细胞术；
aa)电子显微术(EM)；和，
bb)酶-底物测定。
37.一种用于验证生成指示物中使用的生物标志物值的测量的设备，所述生物标志物利用选定类型的定量技术来定量，并且所述设备包括至少一个处理装置，所述至少一个处理装置：
a)对生物受试者的至少一种相应的生物标志物确定多种生物标志物值，每种生物标志物值指示测量值或从测量值衍生的值，并且所述多种生物标志物值至少部分地指示取自所述受试者的样品中的所述生物标志物的浓度；
b)通过确定生物标志物值的组合确定至少一个对照值；
c)将每个对照值与各自的对照参考比较；以及
d)使用所述比较的结果确定所述生物标志物值是否有效。
38.根据权利要求37所述的设备，其中所述设备用于进行如权利要求1至36中任一项所述的方法。
39.一种用于验证指示物的方法，所述指示物用于确定生物受试者具有至少一种医学状况的可能性，所述生物标志物利用选定类型的定量技术来定量，并且所述方法包括：
a)确定多种生物标志物值，每种生物标志物值指示所述生物受试者的至少一种相应的生物标志物的测量值或衍生值；
b)通过以下确定指示生物受试者具有至少一种医学状况的可能性的指示物：
i)使用第一生物标志物值和第二生物标志物值计算第一指示值；
ii)使用第三生物标志物值和第四第二生物标志物值计算第二指示值；以及，
iii)使用所述第一指示值和所述第二指示值确定所述指示物；
c)计算以下的至少一种：
i)第一对照值，所述第一对照值使用所述第一生物标志物值和所述第三生物标志物值计算；
ii)第二对照值，所述第二对照值使用所述第一生物标志物值和所述第四生物标志物值计算；
iii)第三对照值，所述第三对照值使用所述第二生物标志物值和所述第三生物标志物值计算；
iv)第四对照值，所述第四对照值使用所述第二生物标志物值和所述第四生物标志物值计算；
v)第五对照值，所述第五对照值使用所述第一值和所述第四第二值计算；
vi)第六对照值，所述第六对照值使用所述第三生物标志物值和所述第四生物标志物值计算；以及
vii)另外的对照值或对照值组，所述另外的对照值或对照值组通过使用在确定指示值中未使用的生物标志物的组合计算；
d)将所述至少一种对照值与各自的对照值阈值比较；以及
e)使用所述比较的结果选择性地验证所述指示物。
40.一种用于验证指示基因表达产物的测量值的指示物的设备，所述生物标志物利用选定类型的定量技术来定量，所述设备包括至少一个处理装置，所述至少一个处理装置：
a)确定多种生物标志物值，每种生物标志物值指示所述生物受试者的至少一种相应的生物标志物的测量值或衍生值；
b)通过以下确定所述指示物：
i)使用第一生物标志物值和第二生物标志物值计算第一指示值；
ii)使用第三生物标志物值和第四第二生物标志物值计算第二指示值；以及，
iii)使用所述第一指示值和所述第二指示值确定所述指示物；
c)计算以下的至少一种：
i)第一对照值，所述第一对照值使用所述第一生物标志物值和所述第三生物标志物值计算；
ii)第二对照值，所述第二对照值使用所述第一生物标志物值和所述第四生物标志物值计算；
iii)第三对照值，所述第三对照值使用所述第二生物标志物值和所述第三生物标志物值计算；
iv)第四对照值，所述第四对照值使用所述第二生物标志物值和所述第四生物标志物值计算；
v)第五对照值，所述第五对照值使用所述第一生物标志物值和所述第二生物标志物值计算；
vi)第六对照值，所述第六对照值使用所述第三生物标志物值和所述第四生物标志物值计算；以及
vii)另外的对照值或对照值组，所述另外的对照值或对照值组通过使用在确定指示值中未使用的生物标志物的组合计算；
d)将所述至少一种对照值与各自的对照值阈值比较；以及
e)使用所述比较的结果选择性地验证所述指示物。
41.一种用于验证指示物的方法，所述指示物用于确定生物受试者具有至少一种医学状况的可能性，所述生物标志物利用选定类型的定量技术来定量，并且所述方法包括：
a)从生物受试者获得样品，所述样品包含基因表达产物；
b)定量所述样品中的至少一些基因表达产物，以确定所述样品中所述基因表达产物的浓度；
c)通过组合以下确定指示生物受试者具有至少一种医学状况的可能性的指示物：
i)第一指示值，所述第一指示值指示第一基因表达产物和第二基因表达产物的浓度的比率；以及
ii)第二指示值，所述第二指示值指示第三基因表达产物和第四基因表达产物的浓度的比率；
d)通过确定以下的至少一种确定对照值：
i)第一对照值，所述第一对照值指示所述第一基因表达产物和所述第三基因表达产物的浓度的比率；
ii)第二对照值，所述第二对照值指示所述第一基因表达产物和所述第四基因表达产物的浓度的比率；
iii)第三对照值，所述第三对照值指示所述第二基因表达产物和所述第三基因表达产物的浓度的比率；
iv)第四对照值，所述第四对照值指示所述第二基因表达产物和所述第四基因表达产物的浓度的比率；
v)第五对照值，所述第五对照值指示所述第一基因表达产物和所述第二基因表达产物的浓度的比率；
vi)第六对照值，所述第六对照值指示所述第三基因表达产物和所述第四基因表达产物的浓度的比率；以及
vii)另外的对照值或对照值组，所述另外的对照值或对照值组通过使用在确定指示值中未使用的基因表达产物的组合确定；
e)将每个对照值与各自的对照值阈值范围比较；以及，
f)通过验证所述对照值中的每一个是否在所述各自的对照值范围内来验证所述指示物。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述方法包括通过以下定量所述基因表达产物的浓度：
a)扩增所述样品中的至少一些基因表达产物；以及
b)对于多种基因表达产物的每一种，确定代表获得限定水平的所述各自的基因表达产物所需要的扩增程度的扩增量。
43.根据权利要求41或权利要求42所述的方法，其中所述方法包括：
a)通过以下确定所述指示物：
i)确定第一指示值，所述第一指示值使用第一扩增时间和第二扩增时间来计算，所述第一扩增时间和所述第二扩增时间指示第一基因表达产物和第二基因表达产物的浓度；和
ii)第二指示值，所述第二指示值使用第三扩增时间和第四扩增时间来计算，所述第三扩增时间和所述第四扩增时间指示第三基因表达产物和第四基因表达产物的相对浓度；以及
b)通过确定以下的至少一种确定对照值：
i)第一对照值，所述第一对照值使用第一扩增时间和第三扩增时间来计算，所述第一扩增时间和所述第三扩增时间指示第一基因表达产物和第三基因表达产物的相对浓度；
ii)第二对照值，所述第二对照值使用第一扩增时间和第四扩增时间来计算，所述第一扩增时间和所述第四扩增时间指示第一基因表达产物和第四基因表达产物的相对浓度；
iii)第三对照值，所述第三对照值使用第二扩增时间和第三扩增时间来计算，所述第二扩增时间和所述第三扩增时间指示第二基因表达产物和第三基因表达产物的相对浓度；
iv)第四对照值，所述第四对照值使用第二扩增时间和第四扩增时间来计算，所述第二扩增时间和所述第四扩增时间指示第二基因表达产物和第四基因表达产物的相对浓度；
v)第五对照值，所述第五对照值使用第一扩增时间和第二扩增时间来计算，所述第一扩增时间和所述第二扩增时间指示第一基因表达产物和第二基因表达产物的相对浓度；
vi)第六对照值，所述第六对照值使用第三扩增时间和第四扩增时间来计算，所述第三扩增时间和所述第四扩增时间指示第三基因表达产物和第四基因表达产物的相对浓度；以及
vii)另外的对照值或对照值组，所述另外的对照值或对照值组通过使用在确定指示值中未使用的扩增时间的组合确定。
44.一种用于验证指示物的设备，所述指示物用于确定生物受试者具有至少一种医学状况的可能性，所述设备包括：
a)取样装置，所述取样装置从生物受试者获得样品，所述样品包含基因表达产物；
b)定量装置，所述定量装置定量所述样品中的至少一些基因表达产物，以确定所述样品中所述基因表达产物的浓度；以及
c)至少一种处理装置，所述至少一种处理装置：
i)通过组合以下确定指示生物受试者具有至少一种医学状况的可能性的指示物：
(1)第一指示值，所述第一指示值指示第一基因表达产物和第二基因表达产物的浓度的比率；以及
(2)第二指示值，所述第二指示值指示第三基因表达产物和第四基因表达产物的浓度的比率；
ii)通过确定以下的至少一种确定对照值：
(1)第一对照值，所述第一对照值指示所述第一基因表达产物和所述第三基因表达产物的浓度的比率；
(2)第二对照值，所述第二对照值指示所述第一基因表达产物和所述第四基因表达产物的浓度的比率；
(3)第三对照值，所述第三对照值指示所述第二基因表达产物和所述第三基因表达产物的浓度的比率；
(4)第四对照值，所述第四对照值指示所述第二基因表达产物和所述第四基因表达产物的浓度的比率；
(5)第五对照值，所述第五对照值指示所述第一基因表达产物和所述第二基因表达产物的浓度的比率；
(6)第六对照值，所述第六对照值指示所述第三基因表达产物和所述第四基因表达产物的浓度的比率；以及
(7)另外的对照值或对照值组，所述另外的对照值或对照值组指示在确定指示值中未使用的生物标志物的浓度的比率；
iii)将每个对照值与各自的对照值阈值范围比较；以及，
iv)通过验证所述对照值中的每一个是否在所述各自的对照值范围内来验证所述指示物。
45.一种用于验证生物标志物的定量的方法，所述方法包括：
a)对生物受试者的至少一种相应的生物标志物确定多种生物标志物值，每种生物标志物值指示测量值或从测量值衍生的值，并且所述多种生物标志物值至少部分地指示取自所述受试者的样品中所述生物标志物的浓度；
b)通过确定生物标志物值的组合确定至少一个对照值；
c)将每个对照值与各自的对照参考比较；以及
d)使用所述比较的结果确定所述生物标志物值是否有效，其中所述生物标志物值指示选自以下的一种或更多种的分子、细胞或生物体的水平或丰度：
i)蛋白；
ii)核酸；
iii)碳水化合物；
iv)脂质；
v)蛋白聚糖；
vi)细胞；以及
vii)病原性生物体。
46.一种用于验证生物标志物的定量的方法，所述方法包括：
a)对生物受试者的至少一种相应的生物标志物确定多种生物标志物值，每种生物标志物值指示测量值或从测量值衍生的值，并且所述多种生物标志物值至少部分地指示取自所述受试者的样品中所述生物标志物的浓度；
b)通过确定生物标志物值的组合确定至少一个对照值；
c)将每个对照值与各自的对照参考比较；以及
d)使用所述比较的结果确定所述生物标志物值是否有效，其中所述生物标志物值指示选自以下的一种或更多种的分子、细胞或生物体的水平或丰度：
i)蛋白；
ii)核酸；
iii)碳水化合物；
iv)脂质；
v)蛋白聚糖；
vi)细胞；
vii)代谢物；
viii)组织切片；
ix)完整生物体；以及
x)分子复合体。
47.一种用于验证生物标志物的定量的方法，所述方法包括：
a)对生物受试者的至少一种相应的生物标志物确定多种生物标志物值，每种生物标志物值指示测量值或从测量值衍生的值，并且所述多种生物标志物值至少部分地指示取自所述受试者的样品中所述生物标志物的浓度；
b)通过确定生物标志物值的组合确定至少一个对照值；
c)将每个对照值与各自的对照参考比较；以及
d)使用所述比较的结果确定所述生物标志物值是否有效，其中所述生物标志物利用以下的至少一种来定量：
i)核酸扩增技术；
ii)聚合酶链式反应(PCR)；
iii)杂交技术；
iv)微阵列分析；
v)低密度阵列；
vi)与等位基因特异性探针杂交；
vii)酶促突变检测；
viii)连接链式反应(LCR)；
ix)寡核苷酸连接测定(OLA)；
x)流式细胞异源双链体分析；
xi)错配的化学裂解；
xii)质谱法；
xiii)流式细胞术；
xiv)液相层析；
xv)气相层析；
xvi)免疫组织化学；
xvii)核酸测序；
xviii)单链构象多态性(SSCP)；
xix)变性梯度凝胶电泳(DGGE)；
xx)温度梯度凝胶电泳(TGGE)；
xxi)限制性片段多态性；
xxii)基因表达系列分析(SAGE)；
xxiii)亲和力测定；
xxiv)放射性免疫测定(RIA)；
xxv)侧流免疫层析；
xxvi)流式细胞术；
xxvii)电子显微术(EM)；和，
xxviii)酶-底物测定。
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