CN109374904A - 一种蛋白质类脓毒症标志物及其在严重脓毒症早期预警的应用及其筛选方法 - Google Patents

一种蛋白质类脓毒症标志物及其在严重脓毒症早期预警的应用及其筛选方法 Download PDF

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CN109374904A CN201811267919.1A CN201811267919A CN109374904A CN 109374904 A CN109374904 A CN 109374904A CN 201811267919 A CN201811267919 A CN 201811267919A CN 109374904 A CN109374904 A CN 109374904A
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Abstract

本发明公开了一种蛋白质类脓毒症标志物及其在严重脓毒症早期预警的应用及其筛选方法，通过iTRAQ‑2DLC‑MS/MS方法对严重脓毒症不同阶段的血清样本进行检测和分析，再应用ELISA方法验证差异蛋白，最终筛选并鉴定出2种特征性差异蛋白，分别是：载脂蛋白CIII，β2微球蛋白；再通过这两种标志物建立检测严重脓毒症患者早期预警的联合检测模型，利用该检测模型能够提高严重脓毒症的早期预警的敏感性和特异性，为预测脓毒症病情的进展的早期事件，为临床早期干预提供了参考依据，最终实现降低脓毒症死亡率。

Description

一种蛋白质类脓毒症标志物及其在严重脓毒症早期预警的应 用及其筛选方法
技术领域
本发明涉及医药生物领域，特别是一种蛋白质类脓毒症标志物及其在严重脓毒症早期预警的应用及其筛选方法。
背景技术
脓毒症(sepsis)是由感染引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatoryresponse syndrome，SIRS)，是导致危重病患者死亡的主要原因。2012年全球脓毒症联盟公布的数据显示，因脓毒症而死亡的人数超过了前列腺癌、乳腺癌和艾滋病致死人数的总和，排美国死亡因素的前十位；并且在过去十年里，脓毒症发病率以每年8％至13％的速度剧增。更值得注意的是，一旦病情进展为严重脓毒症(severe sepsis)时，将导致器官功能障碍综合征和(或) 循环衰竭，严重影响患者预后。2007年，我国一项对十所大学附属医院的外科重症监护室的流行病学调查结果显示，严重脓毒症的发病率为8.68％(318/3665)，死亡率高达48.7％；患者每天的住院费用约为4016元，平均住院费用为91120元。因此，严重脓毒症不仅是患者死亡的高危因素，而且给个人和国家的带来了沉重的医疗负担。
近年来，虽已建立和统一了脓毒症临床诊断标准，并在病因、病理生理与治疗策略上都取得了一定的成果，但脓毒症的发病率和死亡率仍居高不下。我们分析其原因有以下几点：1) 脓毒症疾病本身的复杂性，虽然感染是脓毒症的重要诱因，但并不是所有的脓毒症患者能分离鉴定到病原菌，不能及时对脓毒症进行识别。2)严重脓毒症的诊断标准复杂，且多项指标需动态观察具有主观性，包括全身情况、血流动力学水平、组织灌注参数、实验室炎症指标及器官功能障碍参数等5大类20项标准。3)临床中缺乏早期干预的预警标志物。对于脓毒症病情进展规律尚未阐明，其变化并不依赖致病菌和毒素，而取决于机体的反应性，其反应机制一旦启动遵循自身规律发展，病情难以控制。近期研究结果显示，对脓毒症发展为更为严重的严重脓毒症、脓毒症休克进行早期识别，早期采取抗生素等措施，能显著降低脓毒症休克患者的死亡率。临床工作经验也提示，在严重脓毒症发病2小时内对疾病进行诊断，及时给与临床干预，患者生存率显著提高。因此，严重脓毒症的治疗重在及时，应用可靠的分子标志物进行筛查、简化流程、节省时间，从发热和具有全身炎症反应的患者中预警将会进展为严重脓毒症的患者，对其进行早期临床治疗，具有重要的临床价值。
目前，脓毒症及严重脓毒症的基础研究虽已深入到生物化学、细胞生理学及基因水平，但其诊断仍然主要依赖于临床症状和几个经典的实验室检测标志物。IL-6、IL-8及TNF-α参与严重脓毒症中病情发展，C反应蛋白是监测脓毒症的“经典”指标，但均缺乏特异性；越来越多的研究认为降钙素原(procalcitonin，PCT)是目前评价严重脓毒症严重程度及不良预后的最好指标，其敏感性和特异性均高于CRP、IL-6、IL-8及TNF-α。然而，临床应用中PCT 仍无法满足严重脓毒症的早期预警。最新的Meta分析结果也显示，与标准的抗生素治疗相比， PCT是进行短期持续的抗生素治疗的有效监测指标，但以PCT为指导的治疗最终对患者的死亡率没有改善。因此，PCT仍不是预测严重脓毒症病情的进展的早期事件，不能及时的预警严重脓毒症的发生，不能为临床早期干预提供参考依据，无法最终降低死亡率。临床中仍缺少有效的严重脓毒症早期预警的标志物。我们前期研究结果显示，肝素结合蛋白对急诊严重脓毒症/脓毒症休克患者的预警有一定的临床价值。然而，严重脓毒症患者作为复杂疾病，其标志物应为多个或一组蛋白质，而非单一蛋白质，临床研究中需要适当的方法进行机制研究。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于通过iTRAQ-2DLC-MS/MS方法对严重脓毒症确诊前后的血清样本进行检测和分析，筛选并鉴定出2种特征性差异蛋白建立严重脓毒症患者的联合检测模型，提高严重脓毒症的早期预警的敏感性和特异性，为预测脓毒症病情的进展，为临床早期干预提供了参考依据，最终实现降低脓毒症死亡率。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种蛋白质类脓毒症标志物，包括：载脂蛋白CIII，β2微球蛋白。
一种蛋白质类脓毒症标志物在严重脓毒症早期预警的应用，
通过标志物的水平获得评价严重脓毒症的预警价值，若载脂蛋白CIII水平显著降低 (P＝0.012)；β2微球蛋白水平显著升高(P＝0.000)；则具有严重脓毒症的预警作用；
标志物，包括：载脂蛋白CIII，β2微球蛋白。
前述的一种蛋白质类脓毒症标志物在严重脓毒症早期预警的应用，评价严重脓毒症的预警价值的数值具体通过如下过程得到：
采集外周血，待血块凝固收缩后，离心，收集血清，分别检测载脂蛋白CIII、β2微球蛋白；
载脂蛋白CIII水平通过ELISA方法检测；
稀释后血清样本加入已包被的ELISA酶标板，孵育；
用清洗缓冲液洗板，拍干酶标板，分别加入稀释的生物素标记抗体，孵育；
用清洗缓冲液洗涤，加入稀释的辣根过氧化物酶标记亲和素，孵育后用清洗缓冲液洗涤；
各反应孔中加入新配制的TMB底物溶液，避光孵育；
各反应孔中加入终止液终止反应，在ELISA检测仪上检测各孔OD值，计算各样本载脂蛋白CIII蛋白的浓度；
血清样本在全自动免疫分析仪上通过免疫比浊法检测β2微球蛋白水平；
将两种蛋白水平带入Logistic逐步模型的回归方程，经计算后评价严重脓毒症的预警价值。
前述的一种蛋白质类脓毒症标志物在严重脓毒症早期预警的应用，检测各样本蛋白浓度水平，带入Logistic逐步模型的回归方程，将载脂蛋白CIII和β2微球蛋白经计算后进入方程，用于评价是否为严重脓毒症；
Logistic逐步模型的回归方程为：
Logit(p)＝—0.08943—0.009521×(载脂蛋白CIII的蛋白浓度)+0.09736×(β2微球蛋白的浓度)
获得Logit(p)值，通过P＝exp[Logit(p)]/(1+exp[Logit(p)])换算得到p值，若p值大于等于 0.5，即判定为严重脓毒症。
一种蛋白质类脓毒症标志物的筛选方法，包括如下过程：
筛选及验证血清蛋白的患者病例入组，
差异蛋白筛选阶段包括：四组混合血清样本：非严重脓毒症组、严重脓毒症组，严重脓毒症患者确诊前样本、严重脓毒症患者确诊后样本；
差异蛋白验证阶段：非严重脓毒症组，严重脓毒症组；
应用iTRAQ-2DLC-MS/MS技术筛选血清中差异蛋白质；
将保存的血清样本经高速离心、去除杂质、去除高丰度蛋白预处理后，经酶解的蛋白质片段用于iTRAQ标记，通过2DLC-MS/MS分析筛选出差异峰，得出各组蛋白表达水平；
比较四组混合血清样本，共搜索到293个蛋白质；根据iTRAQ报告离子强度比值计算蛋白表达的倍数变化，筛选出37个差异蛋白，其中19个蛋白上调(≥1.20倍)，18个蛋白下调(≤0.83倍)；
对iTRAQ-2DLC-MS/MS技术筛选的显著差异蛋白进行验证；
根据iTRAQ筛选出蛋白表达的倍数差异、GO分析、是否有商品化的蛋白鉴定试剂盒等因素，共对11个筛选出的差异蛋白进行鉴定。
经鉴定8种蛋白在非严重脓毒症组与严重脓毒症组间未见显著性差异，分别是：谷胱甘肽过氧化物酶3(P＝0.701)、α1抗胰蛋白酶(P＝0.837)、APOE(P＝0.451)、IgA(P＝0.211)、IgG (P＝0.565)、IgM(P＝0.117)、KAP(P＝0.464)、LAM(P＝0.876)；
经鉴定3种蛋白在非严重脓毒症组与严重脓毒症组间具有显著性差异，分别是：与非严重脓毒症组相比，严重脓毒症组载脂蛋白CIII水平显著降低(P＝0.012)，β2微球蛋白(P＝0.000)、血管细胞黏附分子1(P＝0.006)显著升高。仅有载脂蛋白CIII和β2微球蛋白进入Logistic回归方程，Logit(p)＝—0.08943—0.009521×(载脂蛋白CIII的蛋白浓度)+0.09736×(β2微球蛋白的浓度)，获得Logit(p)值，通过p＝exp[Logit(p)]/(1+exp[Logit(p)])换算得到p值，若p值大于等于0.5，即判定为严重脓毒症。
前述的一种蛋白质类脓毒症标志物的筛选方法，应用iTRAQ-2DLC-MS/MS技术筛选血清中差异蛋白质时，每组混合样本分别进行两种标记检测作为技术重复，结果取平均值。
前述的一种蛋白质类脓毒症标志物的筛选方法，应用iTRAQ-2DLC-MS/MS技术筛选血清中差异蛋白质的具体过程包括：
每组样品由多个不同患者的等量血清制成混合样本；
分别取各组混合样本经Agilent H-14多重亲和去除柱去除高丰度蛋白质；低丰度蛋白质组分浓缩后，Bradford法测定蛋白质浓度；取蛋白样品进行SDS-PAGE预实验，样本保存备用；
对预处理后的样品进行酶切，得到酶解样本；
取酶解样本，用iTRAQ标记；
将标记后的所有肽段进行混合，进行用强阳离子交换色谱柱(SCX)分级；
将每份SCX分级后的样品合并，采用纳升流速HPLC液相系统进行分离；
每份样品经毛细管高效液相色谱分离后用质谱仪进行质谱分析；
将质谱分析的原始数据进行查库鉴定、定量和数据分析。
前述的一种蛋白质类脓毒症标志物的筛选方法，
对预处理后的样品进行酶切，得到酶解样本的具体过程包括：
处理样本，去除SDS；
加入IAA，对样本进行烷基化处理；
洗涤除去过量未反应的IAA；
提供碱性酶切环境后进行酶切，OD280肽段定量，得到酶解样本。
前述的一种蛋白质类脓毒症标志物的筛选方法，
将标记后的所有肽段进行混合，进行SCX分级的具体过程包括：
将标记后的所有肽段进行混合，进行SCX预分级；
色谱柱：4.6x100mm肽阳离子交换色谱柱，缓冲液：缓冲液A为10mM KH2PO4 pH3.0， 25％CAN；缓冲液B为10mM KH2PO4 pH 3.0，500mM KCl，25％CAN；
待SCX预分级完成后，收集穿流及洗脱分馏成分，再根据SCX色谱图合并重组，冻干备用；
上机前，用三氟乙酸溶解，上样至平衡好的C18填料的固相萃取小柱后，用三氟乙酸洗涤三次，除去盐分，最后用ACN和三氟乙酸混合溶液洗脱，冻干，再用FA复溶上机测试。
前述的一种蛋白质类脓毒症标志物的筛选方法，将质谱分析的原始数据进行查库鉴定、定量和数据分析的具体过程为：
质谱分析原始数据为RAW文件，用软件Maxquant1.4.1.2和perseus1.4.1.3进行查库鉴定、定量和数据分析；本次使用数据库：Uniprot_human_141033_20141219，应用Maxquant软件进行LC-MS/MS质谱测序数据的蛋白数据库搜索及分析，软件抽提肽段报告离子峰强度值信息进行定量分析，肽段定量结果为参考样品所在标签的信号强度值与内标信号强度值的比值，蛋白质定量结果为鉴定肽段定量结果的中位数；根据iTRAQ报告离子强度比值计算蛋白表达的倍数变化，若是≥1.20倍或≤0.83倍的蛋白将进行下一步进行研究；并用生物信息学方法对差异蛋白质进行GO分析，对蛋白质进行功能注释和分类。
本发明的有益之处在于：
本发明通过iTRAQ 2D LC-MS/MS方法对严重脓毒症不同阶段的血清样本进行检测和分析，筛选并鉴定出2种特征性差异蛋白，
通过筛选出的2种特征性差异蛋白，建立2种特征性差异蛋白在严重脓毒症患者预警的联合检测模型，提高严重脓毒症的早期预警的敏感性和特异性，预测脓毒症的病情进展，为临床早期干预提供了参考依据，最终实现降低脓毒症的死亡率；
两个指标组合鉴别严重脓毒症与非严重脓毒症的灵敏度、特异性和曲线下面积为66.2％、 70.2％和0.725，具有优秀的诊断价值；
iTRAQ-2DLC-MS/MS技术将同位素标记与二维液相色谱串联质谱技术相联用，蛋白质覆盖度广，不会造成蛋白质的漏检；并可对蛋白质进行直接鉴定和相对定量分析，能获得的不易获得的低丰度差异蛋白质；且其具有良好的可重复性。因此，其优势非常适合用于脓毒症诊断标志物的检测。
附图说明
图1是本发明的严重脓毒症早期预警检测方法的流程图；
图2是本发明的血清载脂蛋白CIII(APOC3)在非严重脓毒症组及严重脓毒症组中的表达示意图；
图3是本发明的血清β2微球蛋白(β2-MG)蛋白在非严重脓毒症组及严重脓毒症组中的表达示意图；
图4是本发明的两种血清标志分别或联合检测对非严重脓毒症与严重脓毒症诊断的受试者工作特征曲线示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种蛋白质类脓毒症标志物的筛选方法具体过程如下：
一、筛选及验证血清蛋白的患者病例入组
患者入组入选标准：高度怀疑感染的成年ICU患者，并且有一个或多个下列指标(①体温<36℃或>38℃，②呼吸率>20次/分钟，③心率>90次/分钟，④主诉发热/发冷，⑤外周血白细胞计数>12.0×109/L或<4×109/L或未成熟粒细胞>10％)。排除标准：拒绝签署知情同意书者，或年龄<18岁，或恶性肿瘤终末期。在入组时、24h、48h及72h对患者进行诊断，并记录每一访视时患者为非脓毒症、脓毒症或严重脓毒症。相关临床检查和实验室检测指标资料。其中包括：年龄、性别、基础疾病等基本信息，SOFA评分、APACHE评分等，及血脂指标、肝功能指标、白细胞数、血小板数、凝血指标、血气指标等实验室检查指标。
差异蛋白筛选阶段：18位患者的24个样本用于iTRAQ标记的预警差异蛋白筛选。根据访视的诊断，样本一共分为4组：非严重脓毒症组(6个样本的访1)，严重脓毒症组(6个样本的访1)，同患者严重脓毒症确诊前、确诊后(6个样本的对应访视)。离心后收集血清， -80度保存。
差异蛋白验证阶段：132位患者的血清样本用于差异蛋白的验证，其中非严重脓毒症56 例，严重脓毒症76例，这些病例在入组时、24h、48h及72h对患者进行诊断。
二、应用iTRAQ-2DLC-MS/MS技术筛选血清中差异蛋白质
1.样品制备
为增加蛋白组学实验的精密度和准确性，减少个体差异对实验结果的影响，每组由6个不同患者的等量血清制成混合样本，每组混合样本分别进行两种标记进行检测作为技术重复，结果取平均值。
分别取各组混合样本300μl经Agilent H-14多重亲和去除柱(Agilent，Gainesville,GA,USA) 去除高丰度蛋白质(主要包括白蛋白、IgG、IgA、纤维蛋白原、转铁蛋白、触珠蛋白、抗胰蛋白酶等)，，低丰度蛋白质组分浓缩后，Bradford法测定蛋白质浓度。取蛋白样品分别取10μg，进行SDS-PAGE预实验，样本‐80℃冰箱保存备用。
2.超滤辅助样品制备和酶解
每组取300μg样品进行酶解。①去除SDS减少对酶切影响：每份样品加入200μL UAbuffer (8M Urea，150mM Tris-HCl pH8.5)混匀，14000g室温离心30min，弃滤出液，重复3次。②烷基化：加入100μL碘乙酰胺(50mM IAA in UA)，600rpm振荡混匀1min，室温避光300rpm 孵育30min，14000g室温离心30min。③洗涤除去过量未反应的IAA：加入100μL UAbuffer，室温14000g离心30min，重复3次。④提供碱性酶切环境：加入100μL 1/10Dissolution buffer (100mM三乙基碳酸氢铵)，室温14000g离心30min，重复3次。最后弃滤出液并加入40μL胰酶(2μg Trypsin in 40μL 1/10 Dissolution buffer)，放置在恒温混匀仪上进行酶切(300rpm，18h， 37℃)。酶切后室温14000g离心30min收集滤出液，加入40μL25mM 1/10 Dissolution buffer，室温14000g离心30min，取滤液，OD280肽段定量。
3.iTRAQ标记
每组各取100μg酶解样本，参照iTRAQ reagent-8ples Multiplex kit(AppliedBiosystems SCIEX, Foster city,CA,USA)试剂说明书进行iTRAQ标记，标记方案见表1。
表1 iTRAQ标记方案
113 114 115 116 117 118 119 121
A1 B1 C1 D1 A2 B2 C2 D2
4.强阳离子交换色谱柱(Strong Cation Exchange Column，SCX)分级
将标记后的所有肽段进行混合，进行SCX预分级。色谱柱：4.6x100mm肽阳离子交换色谱柱(5μm，)(PolyLCInc，Maryland，USA)。缓冲液：Buffer A为10mM KH2PO4 pH 3.0，25％CAN；Buffer B为10mM KH2PO4 pH 3.0，500mM KCl，25％CAN。仪器：AKTA Purifier 100(GE Healthcare，产地，USA)。分级方案见表2。
表2 SCX分级方案
SCX分级后，收集穿流及洗脱分馏成分约30份，根据SCX色谱图合并成6份，冻干备用。上机前，用1ml 0.1％TFA(三氟乙酸)溶解，上样至平衡好的C18 Cartridge(Sigma)后，用0.1％TFA洗涤三次，除去盐分，最后用70％ACN-0.1％TFA溶液洗脱，冻干，再用0.1％FA复溶上机测试。
5.毛细管高效液相色谱
每份SCX分级合并样品采用纳升流速HPLC液相系统Easy nLC1000进行分离(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA,USA)。缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱以95％的A液平衡。样品由自动进样器上样到上样柱 (Thermo scientific EASY column，2cm×100μm，5μm-C18)进行富集样本和除盐，再经分析柱 (Thermo scientific EASY column，75μm×100mm，3μm-C18)分离，流速为250nl/min。相关液相梯度如下：0min-105min，B液线性梯度从0％到50％；105min-110min，B液线性梯度从 50％到100％；110min-120min，B液维持在100％。
6.质谱鉴定(MS/MS)
每份样品经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪(Thermo Finnigan)进行质谱分析。分析时长：120min；检测方式：正离子；母离子扫描范围：300-1800m/z，一级质谱分辨率：70,000at m/z 200，AGC target：3e6，一级Maximum IT：10ms，Number of scanranges： 1，Dynamic exclusion：40.0s。多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描(full scan)后采集10个碎片图谱(MS2 scan)，MS2 Activation Type:HCD，Isolation window： 2m/z，二级质谱分辨率：17,500at m/z 200，Microscans：1，二级Maximum IT：60ms， Normalized collision energy：30eV，Underfill ratio：0.1％。
7.数据分析
质谱分析原始数据为RAW文件，用软件Maxquant1.4.1.2和perseus1.4.1.3进行查库鉴定、定量和数据分析。本次使用数据库：Uniprot_human_141033_20141219(蛋白质序列共141033 条，下载日期为2014‐12‐19)。应用Maxquant软件(版本为1.4.1.2)进行LC-MS/MS质谱测序数据的蛋白数据库搜索及分析，相关参数如下表3。软件抽提肽段报告离子峰强度值信息进行定量分析，肽段定量结果为参考样品所在标签的信号强度值与内标信号强度值的比值，蛋白质定量结果为鉴定肽段定量结果的中位数。根据iTRAQ报告离子强度比值计算蛋白表达的倍数变化，≥1.20倍或≤0.83倍的蛋白将进行下一步进行研究；并用生物信息学方法对差异蛋白质进行GO分析，对蛋白质进行功能注释和分类；对差异蛋白质进行KEGG分析，获得蛋白质pathway。
表3应用Maxquant软件进行蛋白数据库搜索及分析的相关参数
注：结果过滤参数为：PSM FDR≤0.01Protein FDR≤0.01。
三，结合蛋白质差异比值和GO分析，对iTRAQ-2DLC-MS/MS技术筛选的显著差异蛋白进行验证；
通过iTRAQ-2DLC-MS/MS对所有标记蛋白进行标记、鉴定及相对定量分析，并进行2两次技术重复，本研究中共搜索到293个蛋白质。根据严重脓毒症确诊后与确诊前的iTRAQ报告离子强度比值计算蛋白表达的倍数变化，出共筛选出37个差异蛋白，其中19个蛋白上调 (≥1.20倍)，18个蛋白下调(≤0.83倍)。
对iTRAQ-2DLC-MS/MS技术筛选的显著差异蛋白进行验证；
根据iTRAQ筛选出蛋白表达的倍数差异、GO分析、是否有商品化的蛋白鉴定试剂盒等因素，共对11个筛选出的差异蛋白进行鉴定。
经鉴定8种蛋白在非严重脓毒症组与严重脓毒症组间未见显著性差异，分别是：谷胱甘肽过氧化物酶3(P＝0.701)、α1抗胰蛋白酶(P＝0.837)、APOE(P＝0.451)、IgA(P＝0.211)、IgG (P＝0.565)、IgM(P＝0.117)、KAP(P＝0.464)、LAM(P＝0.876)；
经鉴定3种蛋白在非严重脓毒症组与严重脓毒症组间具有显著性差异，分别是：与非严重脓毒症组相比，严重脓毒症组载脂蛋白CIII水平显著降低(P＝0.012)，β2微球蛋白(P＝0.000)、血管细胞黏附分子1(P＝0.006)显著升高。仅有载脂蛋白CIII和β2微球蛋白进入Logistic回归方程，Logit(p)＝—0.08943—0.009521×(载脂蛋白CIII的蛋白浓度)+0.09736×(β2微球蛋白的浓度)，获得Logit(p)值，通过p＝exp[Logit(p)]/(1+exp[Logit(p)])换算得到p值，若p值大于等于0.5，即判定为严重脓毒症。
ELISA检测过程为：
一，采集外周血，待血块凝固收缩后，离心，收集血清；
二，将所得的血清用样本稀释液按比例稀释，分别加入各自酶标板孵育；
三.用清洗缓冲液洗板，拍干酶标板，分别加入稀释的生物素标记抗体，孵育；
四，用清洗缓冲液洗涤，加入稀释的辣根过氧化物酶标记亲和素，孵育后用清洗缓冲液洗涤；
五，各反应孔中加入新配制的TMB底物溶液，避光孵育；
六，各反应孔中加入终止液终止反应，在ELISA检测仪上检测各孔OD值；
七，计算各样本蛋白浓度。
免疫比浊法的检测过程为：
血清样本经通过免疫比浊法检测在AU5821全自动生化分析仪(Beckman coulter，美国) 检测。血清样本中的β2-MG与乳胶粒凝集包被的β2-MG抗体结合，产生的浊度与β2-MG浓度成正比。
由以上的筛选试验得出结果：标志物，包括：载脂蛋白CIII，β2微球蛋白；
载脂蛋白CIII(Apolipoprotein CIII，APOC3，SwissProt:P02656)主要由肝脏合成，负责转运极低密度脂蛋白和高密度脂蛋白，在富含甘油三酯的脂蛋白代谢中起关键作用，是脂蛋白酯酶和肝酯酶的抑制剂，并干扰脂蛋白与细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合；
β2微球蛋白(Beta-2-microglobulin，β2-MG，SwissProt:P61769)是一种内源性低分子量血清蛋白质，由淋巴细胞和其他大多数的有核细胞分泌，在免疫应答中起重要作用。
再通过筛选出的2种特征性差异蛋白，建立2种特征性差异蛋白在严重脓毒症患者早期预警中的联合检测模型。
由以上实验得出的结论，找到了一种在严重脓毒症早期预警检测的方法；
如图1所示，一种蛋白质类脓毒症标志物在严重脓毒症早期预警的应用，包括：
标志物，包括：载脂蛋白CIII，β2微球蛋白；
采集外周血，待血块凝固收缩后，离心，收集血清；将所得的血清按照ELISA检测方法或免疫比浊检测方法，计算各样本蛋白浓度，
带入Logistic逐步模型的回归方程：
Logit(p)＝—0.08943—0.009521×(载脂蛋白CIII的蛋白浓度)+0.09736×(β2微球蛋白的浓度)
获得Logit(p)值，通过P＝exp[Logit(p)]/(1+exp[Logit(p)])换算得到p值，若p值大于等于 0.5，即判定为严重脓毒症。
△为了验证本发明对严重脓毒症的早期预警上具有优秀的灵敏性和特异性，做如下验证实验；
采用SPSS 22软件包进行受试者工作特征曲线验证，两个标志物联合检测具有高灵敏度和特异性，曲线下面积为0.725(表4)。
表4两个差异蛋白质鉴别严重脓毒症的受试者工作曲线
蛋白质 截断值 敏感性(％) 特异性(％) 曲线下面积
APOC3(μg/mL) <54.53 44.0 78.9 0.628
β2-MG(mg/L) >3.7 66.2 59.7 0.683
APOC3+β2-MG 64.9 71.9 0.725
由此结果可知，差异蛋白联合检测相比单品种差异蛋白检测的特异性具有实质性进步的灵敏度和特异性，且联合蛋白检测的曲线下面积(AUC)值相比单蛋白检测的曲线下面积(AUC) 值要大得多，所以具有更好的诊断价值。
本发明通过iTRAQ-2DLC-MS/MS方法对严重脓毒症确诊前后的血清样本进行检测和分析，筛选并鉴定出2种特征性差异蛋白在严重脓毒症患者的联合检测模型，提高严重脓毒症的早期预警的敏感性和特异性，预测脓毒症病情的进展，为临床早期干预提供了参考依据，最终实现降低脓毒症死亡率。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种蛋白质类脓毒症标志物，其特征在于，包括：载脂蛋白CIII，β2微球蛋白。
2.一种蛋白质类脓毒症标志物在严重脓毒症早期预警的应用，其特征在于，
通过标志物的水平获得评价严重脓毒症的预警价值，若载脂蛋白CIII水平显著降低(P＝0.012)；β2微球蛋白水平显著升高(P＝0.000)；则具有严重脓毒症的预警作用；
标志物，包括：载脂蛋白CIII，β2微球蛋白。
3.根据权利要求2所述的一种蛋白质类脓毒症标志物在严重脓毒症早期预警的应用，其特征在于，评价严重脓毒症的预警价值的数值具体通过如下过程得到：
采集外周血，待血块凝固收缩后，离心，收集血清，分别检测载脂蛋白CIII、β2微球蛋白；
载脂蛋白CIII水平通过ELISA方法检测；
稀释后血清样本加入已包被的ELISA酶标板，孵育；
用清洗缓冲液洗板，拍干酶标板，分别加入稀释的生物素标记抗体，孵育；
用清洗缓冲液洗涤，加入稀释的辣根过氧化物酶标记亲和素，孵育后用清洗缓冲液洗涤；
各反应孔中加入新配制的TMB底物溶液，避光孵育；
各反应孔中加入终止液终止反应，在ELISA检测仪上检测各孔OD值，计算各样本载脂蛋白CIII蛋白的浓度；
血清样本在全自动免疫分析仪上通过免疫比浊法检测β2微球蛋白水平；
将两种蛋白水平带入Logistic逐步模型的回归方程，经计算后评价严重脓毒症的预警价值。
4.根据权利要求3所述的一种蛋白质类脓毒症标志物在严重脓毒症早期预警的应用，其特征在于，检测各样本蛋白浓度水平，带入Logistic逐步模型的回归方程，将载脂蛋白CIII和β2微球蛋白经计算后进入方程，用于评价是否为严重脓毒症；
所述Logistic逐步模型的回归方程为：
Logit(p)＝—0.08943—0.009521×(载脂蛋白CIII的蛋白浓度)+0.09736×(β2微球蛋白的浓度)
获得Logit(p)值，通过p＝exp[Logit(p)]/(1+exp[Logit(p)])换算得到p值，若p值大于等于0.5，即判定为严重脓毒症。
5.一种蛋白质类脓毒症标志物的筛选方法，其特征在于，包括如下过程：
一，筛选及验证血清蛋白的患者病例入组，
差异蛋白筛选阶段包括四组混合血清样本：非严重脓毒症组、严重脓毒症组，严重脓毒症患者确诊前样本、严重脓毒症患者确诊后样本；
二，差异蛋白验证阶段：非脓毒症组，脓毒症组，严重脓毒症组；
应用iTRAQ-2DLC-MS/MS技术筛选血清中差异蛋白质；
将保存的血清样本经高速离心、去除杂质、去除高丰度蛋白预处理后，经酶解的蛋白质片段用于iTRAQ标记，通过2DLC-MS/MS分析筛选出差异峰，得出各组蛋白表达水平；
比较四组混合血清样本，共搜索到293个蛋白质；根据iTRAQ报告离子强度比值计算蛋白表达的倍数变化，筛选出37个差异蛋白，其中19个蛋白上调(≥1.20倍)，18个蛋白下调(≤0.83倍)；
三，对iTRAQ-2DLC-MS/MS技术筛选的显著差异蛋白进行验证；
经鉴定3种蛋白在非严重脓毒症组与严重脓毒症组间具有显著性差异，分别是：与非严重脓毒症组相比，严重脓毒症组载脂蛋白CIII水平显著降低(P＝0.012)，β2微球蛋白(P＝0.000)、血管细胞黏附分子1(P＝0.006)显著升高；
经鉴定8种蛋白在非严重脓毒症组与严重脓毒症组间未见显著性差异，分别是：谷胱甘肽过氧化物酶3(P＝0.701)、α1抗胰蛋白酶(P＝0.837)、APOE(P＝0.451)、IgA(P＝0.211)、IgG(P＝0.565)、IgM(P＝0.117)、KAP(P＝0.464)、LAM(P＝0.876)。
6.根据权利要求5所述的一种蛋白质类脓毒症标志物的筛选方法，其特征在于，应用iTRAQ-2DLC-MS/MS技术筛选血清中差异蛋白质时，每组混合样本分别进行两种标记检测作为技术重复，结果取平均值。
7.根据权利要求5所述的一种蛋白质类脓毒症标志物的筛选方法，其特征在于，应用iTRAQ-2DLC-MS/MS技术筛选血清中差异蛋白质的具体过程包括：
每组样品由多个不同患者的等量血清制成混合样本；
分别取各组混合样本经Agilent H-14多重亲和去除柱去除高丰度蛋白质；低丰度蛋白质组分浓缩后，Bradford法测定蛋白质浓度；取蛋白样品进行SDS-PAGE预实验，样本保存备用；
对预处理后的样品进行酶切，得到酶解样本；
取酶解样本，用iTRAQ标记；
将标记后的所有肽段进行混合，进行用强阳离子交换色谱柱分级；
将每份SCX分级后的样品合并，采用纳升流速HPLC液相系统进行分离；
每份样品经毛细管高效液相色谱分离后用质谱仪进行质谱分析；
将质谱分析的原始数据进行查库鉴定、定量和数据分析。
8.根据权利要求7所述的一种蛋白质类脓毒症标志物的筛选方法，其特征在于，
对预处理后的样品进行酶切，得到酶解样本的具体过程包括：
处理样本，去除SDS；
加入IAA，对样本进行烷基化处理；
洗涤除去过量未反应的IAA；
提供碱性酶切环境后进行酶切，OD280肽段定量，得到酶解样本。
9.根据权利要求7所述的一种蛋白质类脓毒症标志物的筛选方法，其特征在于，
将标记后的所有肽段进行混合，进行SCX分级的具体过程包括：
将标记后的所有肽段进行混合，进行SCX预分级；
色谱柱：4.6x100mm肽阳离子交换色谱柱，缓冲液：缓冲液A为10mM KH2PO4 pH 3.0，25％CAN；缓冲液B为10mM KH2PO4 pH 3.0，500mM KCl，25％CAN；
待SCX预分级完成后，收集穿流及洗脱分馏成分，再根据SCX色谱图合并重组，冻干备用；
上机前，用三氟乙酸溶解，上样至平衡好的C18填料的固相萃取小柱后，用三氟乙酸洗涤三次，除去盐分，最后用ACN和三氟乙酸混合溶液洗脱，冻干，再用FA复溶上机测试。
10.根据权利要求7所述的一种蛋白质类脓毒症标志物的筛选方法，其特征在于，将质谱分析的原始数据进行查库鉴定、定量和数据分析的具体过程为：
质谱分析原始数据为RAW文件，用软件Maxquant1.4.1.2和perseus1.4.1.3进行查库鉴定、定量和数据分析；本次使用数据库：Uniprot_human_141033_20141219，应用Maxquant软件进行LC-MS/MS质谱测序数据的蛋白数据库搜索及分析，软件抽提肽段报告离子峰强度值信息进行定量分析，肽段定量结果为参考样品所在标签的信号强度值与内标信号强度值的比值，蛋白质定量结果为鉴定肽段定量结果的中位数；根据iTRAQ报告离子强度比值计算蛋白表达的倍数变化，若是≥1.20倍或≤0.83倍的蛋白将进行下一步进行研究；并用生物信息学方法对差异蛋白质进行GO分析，对蛋白质进行功能注释和分类。
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