CN111505315B - 一种蛋白组合式标志物在制备儿童哮喘诊断试剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种蛋白组合式标志物在制备儿童哮喘诊断试剂中的应用。蛋白标志物包括蛋白载脂蛋白C3、载脂蛋白E和血清淀粉样蛋白A。蛋白组合式儿童哮喘诊断试剂制备简单，可实现定量检测，需样本量少，取样检测简单易行，且可实现高通量检测，诊断灵敏度高，特异度高。

Description

一种蛋白组合式标志物在制备儿童哮喘诊断试剂中的应用

技术领域

本发明属于生物领域，特别涉及提供一种与补体和凝血级联反应通路相关的蛋白组合式标志物在制备儿童哮喘诊断试剂中的应用。

背景技术

支气管哮喘简称哮喘，是以持续的气道炎症、气道高反应性和气道重塑为特征的慢性呼吸道疾病。我国儿童哮喘发病率逐年增高，我国城市0～14岁儿童哮喘总的患病率较10年前上升了43.4％。虽然有2/3的哮喘患儿会随着年龄的增长症状消失，但仍有1/3的患儿发展成为成人哮喘。

目前儿童哮喘主要以临床症状、肺功能测定及治疗效果来诊断评估病情。临床症状方面，儿童尤其是学龄前的婴幼儿哮喘临床表现不典型，与其他咳嗽和间歇性喘息性疾病存在混淆诊断，如喘息性支气管炎、肺炎和上呼吸道感染等。肺功能检查方面，患儿的对肺功能检查的配合程度直接影响肺功能指标的结果，低龄儿童的配合程度影响肺功能指标的可靠性。治疗效果方面，部分儿童哮喘患者对皮质类固醇不敏感，抗生素治疗对儿童咳嗽变异性哮喘治疗效果不佳，且哮喘治疗的效果受药物剂量、用药方法及儿童用药依从性的影响，根据治疗效果来诊断儿童哮喘的可靠性有待提高。目前临床上需要能更灵敏特异诊断儿童哮喘的方法及试剂。

蛋白质是细胞内主要的功能性媒介，根据儿童哮喘不同时期以及病理状态下的蛋白质表达水平的不同，可筛选出与儿童哮喘相关的蛋白标志物。本发明运用同位素标记相对和绝对定量标记结合二维液相色谱串联质谱技术从血清中筛选到一组儿童哮喘蛋白标志物，并采用决策树建模法构建儿童哮喘诊断蛋白组合模型并应用于诊断试剂中。

发明内容

本发明的一个目的是提供检测蛋白组合式标志物的试剂在制备儿童哮喘诊断药物中的应用，该蛋白组合式标志物是首次提出的一种与补体和凝血级联反应通路密切联系的儿童哮喘疾病相关的且可获得定量检测结果的蛋白组合标志物，应用于儿童哮喘疾病诊断试剂可获得更高的诊断准确性。

本发明的儿童哮喘组合式蛋白标志物包括蛋白载脂蛋白C3(Apolipoprotein C-Ⅲ,ApoCⅢ)、载脂蛋白E(Apolipoprotein E,ApoE)和血清淀粉样蛋白A(Serum Amyloid A,SAA)。本发明首次将补体和凝血级联反应通路相关的载脂蛋白C3、载脂蛋白E和血清淀粉样蛋白A进行优化组合，提供的蛋白组合式标志物不同于单一蛋白标志物，也不能理解为单一蛋白的简单混合。

本发明的另一个目的是提供一种儿童哮喘诊断试剂。

上述儿童哮喘诊断试剂包括捕获抗体、检测抗体、链霉亲和素—藻红蛋白、标准品、质控品。

所述的捕获抗体为载脂蛋白C3捕获抗体、载脂蛋白E捕获抗体、血清淀粉样蛋白A捕获抗体；

检测抗体为载脂蛋白C3检测抗体、载脂蛋白E检测抗体、血清淀粉样蛋白A检测抗体，与捕获抗体相对应；

本发明的又一个目的是提供上述儿童哮喘诊断试剂的使用方法，具体是：

将捕获抗体固定到固相材料(可以是磁珠)表面，加入待测10μL血清样品，使捕获抗体结合待测样品中的标志物；将检测抗体进行生物素(Biotin)标记，其中所述的每一种检测抗体分别抗一种蛋白标志物且对应于捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该标志物的不同抗原表位；混合后构成“捕获抗体—蛋白—检测抗体”；“捕获抗体—蛋白—检测抗体”与链霉亲和素—藻红蛋白结合后，检测不同的荧光信号而确定待测样品中各蛋白标志物的含量；

若载脂蛋白E>48.28μg/mL或载脂蛋白E≤48.28μg/mL，载脂蛋白C3≤156.45μg/mL且血清淀粉样蛋白A>0.65μg/mL时，则该待测血清为哮喘者血清，反之不是。

本发明与现有技术比较，具有以下优点：

1.载脂蛋白C3、载脂蛋白E和血清淀粉样蛋白A在血清中分泌表达，制备的儿童哮喘诊断试剂可直接对粗样本(血清)进行检测，且需样本量少，取样检测简单易行，且可实现高通量检测。

2.蛋白组合式儿童哮喘诊断试剂制备简单，可实现定量检测；结合首次提出的与补体和凝血级联反应通路密切联系的蛋白组合式标志物儿童哮喘决策树模型后对儿童哮喘的诊断灵敏度高，特异度高。

附图说明

图1儿童哮喘患者和健康儿童血清ApoCⅢ水平；

图2儿童哮喘患者和健康儿童血清ApoE水平；

图3儿童哮喘患者和健康儿童血清SAA水平；

图4ApoCⅢ多肽序列DALSSVQESQVAQQAR的MS/MS图谱；

图5ApoE多肽序列WVQTLSEQVQEELLSSQVTQELR的MS/MS图谱；

图6SAA多肽序列AYWDIMISNHQNSDR的MS/MS图谱；

图7蛋白组合式标志物的儿童哮喘决策树模型。

具体实施方式

本发明提供一种与补体和凝血级联反应通路密切联系的蛋白组合式标志物应用于制备儿童哮喘诊断试剂，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过市购获得的常规产品。

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

本发明蛋白组合式标志物在制备儿童哮喘诊断试剂中的应用，包括以下步骤：

步骤(1)、采集儿童哮喘患者和健康儿童的血清样本，采用同位素标记相对和绝对定量标记结合二维液相色谱串联质谱技术共筛选到儿童哮喘78个差异蛋白(变化倍数>1.2或<0.8)；通过酶联免疫吸附法在儿童哮喘患者和健康儿童血清样本中验证差异蛋白，筛选到载脂蛋白C3、载脂蛋白E和血清淀粉样蛋白A在儿童哮喘患者血清中含量均显著高于健康儿童。

步骤(2)、采用决策树建模软件分析并比较权重组合，构建由载脂蛋白C3、载脂蛋白E和血清淀粉样蛋白A组合的儿童哮喘蛋白决策树模型。

步骤(3)、制备蛋白组合式儿童哮喘诊断试剂：包括以载脂蛋白C3抗体、载脂蛋白E抗体、血清淀粉样蛋白A抗体为捕获抗体；以含有生物素标记的检测抗体，每一种检测抗体分别抗一种相应的儿童哮喘蛋白标志物且对应于捕获抗体；链霉亲和素—藻红蛋白，其中的链霉亲和素与生物素特异性结合；标准品：包含载脂蛋白C3、载脂蛋白E和血清淀粉样蛋白A的标准品；质控品：包含阳性对照和阴性对照。根据“捕获抗体—蛋白—检测抗体”中检测抗体的含量，定量获得蛋白组合式标志物的含量。

所述的方法，所述步骤(1)具体执行以下操作：采集15例儿童哮喘患者和15例健康儿童血清样本，采用Human 14多重亲和去除系统色谱柱去除样本中的14种高丰度蛋白后用胰蛋白酶酶解。采用iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit试剂盒进行标记，健康儿童的报告标签为113，儿童哮喘的报告标签为121。将标记后的所有肽段分别混合，进行SCX预分级。采用纳升流速HPLC液相系统Easy nLC对分级后的每份样品进行分离后，用Obitrap-Elite质谱仪进行质谱分析，使用软件Protein Discovery 1.4进行查库鉴定、定量和数据分析。软件抽提肽段报告离子峰强度值信息，肽段定量结果为参考样品所在标签的信号强度值与内标的信号强度值的比值。蛋白质定量结果为鉴定肽段定量结果的中位数，共检测到蛋白260个，总肽段1753个，唯一性肽段1379个。检索结果使用Protein FDR≤0.01，PSM FDR≤0.01筛选过滤，变化倍数<0.8为下调蛋白，变化倍数>1.2为上调蛋白，获得78个差异蛋白，在儿童哮喘血清中增加有39个蛋白，减少的有39个蛋白。选取儿童哮喘差异显著并与补体和凝血级联反应通路相关的蛋白，用酶联免疫吸附法检测120例儿童哮喘患者和40例健康儿童血清中的各蛋白含量。儿童哮喘患者载脂蛋白C3含量(330.94±231.80μg/mL)高于健康儿童(241.34±146.24μg/mL)，差异有统计学意义(P<0.05)；儿童哮喘患者载脂蛋白E含量(48.73±16.68μg/mL)高于健康儿童(34.24±11.99μg/mL)，P<0.001；儿童哮喘患者血清淀粉样蛋白A含量(1.61±0.87μg/mL)高于健康儿童(0.94±0.43μg/mL)，P<0.001。

所述的方法，所述步骤(2)具体执行以下操作：载脂蛋白C3、载脂蛋白E、血清淀粉样蛋白A经Biomarker Patterns Software 5.0软件分析并比较各蛋白的权重组合，构建了由这3个蛋白组合的儿童哮喘蛋白决策树模型。①当载脂蛋白E≤48.28，且载脂蛋白C3>156.45μg/mL时；②当载脂蛋白E≤48.28μg/mL，载脂蛋白C3≤156.45μg/mL，且血清淀粉样蛋白A≤0.65μg/mL时，这两种情况均判定为健康儿童。①当载脂蛋白E>48.28μg/mL时；②当载脂蛋白E≤48.28μg/mL，载脂蛋白C3≤156.45μg/mL，且血清淀粉样蛋白A>0.65μg/mL时，这两种情况均判定为哮喘儿童。通过该模型对120例儿童哮喘和40例健康儿童血清样本进行检测，该模型对于儿童哮喘的敏感度为79.2％，特异度为92.5％，阳性预测值为96.9％，Youden指数为0.717。10-倍交叉验证后，该模型对于儿童哮喘的敏感度为77.5％，特异度为80.0％。

所述的方法，所述步骤(3)具体执行以下操作：与蛋白特异性结合的捕获抗体通过蛋白直接免疫动物获取单克隆抗体和多克隆抗体；优选的，捕获抗体为单克隆抗体。将捕获抗体固定到固相材料表面，加入待测血清样品或不同浓度的载脂蛋白C3、载脂蛋白E和血清淀粉样蛋白A标准品，使捕获抗体结合待测样品中的标志物；将不同的检测抗体进行生物素标记，使检测抗体与捕获的标志物结合，与捕获抗体分别结合于该标志物的不同抗原表位。将“捕获抗体—蛋白—检测抗体”与链霉亲和素—藻红蛋白结合后，检测不同的荧光信号而确定待测样品中各蛋白标志物的含量，根据步骤(2)中的儿童哮喘蛋白决策树数学模型进行判别。

实施例1

儿童哮喘患者及健康儿童血清样本的采集：

采集135例儿童哮喘患者和55例健康儿童血清样本。取空腹周围静脉全血3mL，于4℃垂直放置1～2h，4000g离心10min后取血清，于-80℃冰箱分装备用，避免反复冻融。

实施例2

同位素标记相对和绝对定量标记结合二维液相色谱串联质谱技术筛选儿童哮喘差异蛋白：

随机取15例儿童哮喘和15例健康儿童血清样本等量混合成一个样本池。使用Human 14多重亲和去除系统色谱柱去除儿童哮喘患者和健康对照组血清样本池中的14种高丰度蛋白质，包括白蛋白、触珠蛋白、IgG、补体C3、转铁蛋白、抗胰蛋白酶、IgA、纤维蛋白原、转甲状腺素蛋白、α2-巨球蛋白、IgM、载脂蛋白AI、α1-酸性糖蛋白、载脂蛋白AII。去除高丰度蛋白后的各组样本收集低丰度洗脱峰并合并，使用15mL 5kDa超滤管进行超滤浓缩，并用25mmol/L碳酸氢铵溶液进行buffer置换，保持最后的总体积为40μL。向各组样本中加入40μL SDT(4％SDS,pH8.0 100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L DTT)裂解液，充分混匀，100℃加热5min，蛋白浓度定量后两组样品分别进样10μg，用SDS-PAGE分离，观察高丰度蛋白去除效果。

两组样品各取300μg，每份样品加入200μL UA buffer混匀，转移至30kDa超滤管中，14000g室温离心30min，弃滤出液，重复3次。加入100μL IAA(50mmol/L IAA in UA)，于恒温混匀仪上600rpm振荡混匀1min，避光室温300rpm孵育30min，14 000g室温离心30min。加入100μL UA buffer，室温14 000g离心30min，重复3次。加入100μL 1/10Dissolutionbuffer(500mmol/L TEAB)，室温14 000g离心30min，重复3次。最后弃滤出液并加入40μLTrypsin buffer(2μg Trypsin in 40μL 1/10Dissolution buffer)，放置恒温混匀仪上(300rpm，18h，37℃)。室温14000g离心30min收集滤出液，换新收集管，加入40μL 25mmol/L1/10Dissolution buffer，室温14 000g离心30min，取滤液，OD280肽段定量。两组样品分别取约100μg采用iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit试剂盒分别进行标记，其中健康儿童的报告标签为113，儿童哮喘的报告标签为121。将标记后的所有肽段分别混合，进行采用蛋白纯化系统AKTA Purifier 100(GE Healthcare)进行SCX预分级。每次SCX分级后，收集穿流及洗脱片段约40份，根据SCX色谱图合并成6份，冻干后C18 Cartridge(Sigma)脱盐。采用纳升流速HPLC液相系统Easy nLC对分级后的每份样品进行分离。缓冲液：0.1％甲酸水溶液为A液，0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)为B液。95％的A液平衡色谱柱。采用自动进样器上样到Thermo scientific EASY column(2cm×100μm 5μm-C18)上样柱，经Thermoscientific EASY column(75μm×100mm 3μm-C18)分析柱分离，流速为250nL/min。液相梯度为：0～105min，B液线性梯度从0％～50％；105～110min，B液线性梯度从50％～100％；110～120min，B液维持在100％。经毛细管高效液相色谱分离后的每份样品用Obitrap-Elite质谱仪进行质谱分析。分析时长为120min，检测方式为正离子，母离子扫描范围为300～1800m/z，一级质谱分辨率为70 000at m/z 200，AGC target为3e6，一级Maximum IT为10ms，Number of scan ranges为1，Dynamic exclusion为40.0s。多肽及其碎片的质量电荷比采集方法：每次全扫描后采集10个碎片图谱(MS2 scan)，MS2 Activation Type为HCD，Isolation window为2m/z，二级质谱分辨率为17 500at m/z 200，Microscans为1，二级Maximum IT为60ms，Normalized collision energy为30eV，Underfill ratio为0.1％。用软件Protein Discovery1.4进行查库鉴定、定量和数据分析。软件抽提肽段报告离子峰强度值信息，肽段定量结果为参考样品所在标签的信号强度值与内标的信号强度值的比值。蛋白质定量结果为鉴定肽段定量结果的中位数。健康儿童与儿童哮喘的蛋白表达倍数变化用iTRAQ报告离子强度比计算，共检测到两组总蛋白为260个，总肽段有1753个，唯一性肽段有1379个。对健康儿童和儿童哮喘比较，选择变化倍数<0.8或>1.2的蛋白质，共有78个差异蛋白(表1)，在儿童哮喘血清中增加有39个蛋白，减少的有39个蛋白。

表1同位素标记相对和绝对定量标记结合二维液相色谱串联质谱技术筛选儿童哮喘差异蛋白

   

   

   

   

   

挑取差异显著且与补体和凝血级联反应通路相关的差异蛋白载脂蛋白C3、载脂蛋白E和血清淀粉样蛋白A用酶联免疫吸附法在120例儿童哮喘患者和40例健康儿童血清样本中验证，儿童哮喘患者载脂蛋白C3含量(330.94±231.80μg/mL)高于健康儿童(241.34±146.24μg/mL)，差异有统计学意义(P<0.05，图1)；儿童哮喘患者载脂蛋白E含量(48.73±16.68μg/mL)高于健康儿童(34.24±11.99μg/mL)，P<0.001(图2)；儿童哮喘患者血清淀粉样蛋白A含量(1.61±0.87μg/mL)高于健康儿童(0.94±0.43μg/mL)，P<0.001(图3)。图4为ApoCⅢ多肽序列DALSSVQESQVAQQAR的MS/MS图谱，图5为ApoE多肽序列WVQTLSEQVQEELLSSQVTQELR的MS/MS图谱，图6为SAA多肽序列AYWDIMISNHQNSDR的MS/MS图谱。

实施例3

蛋白组合式标志物的儿童哮喘决策树模型：

载脂蛋白C3、载脂蛋白E、血清淀粉样蛋白A经Biomarker Patterns Software 5.0软件分析并比较各蛋白的权重组合，构建了由这3个蛋白组合的儿童哮喘蛋白决策树模型(图7)。①当载脂蛋白E≤48.28，且载脂蛋白C3>156.45μg/mL时；②当载脂蛋白E≤48.28μg/mL，载脂蛋白C3≤156.45μg/mL，且血清淀粉样蛋白A≤0.65μg/mL时，这两种情况均判定为健康儿童。①当载脂蛋白E>48.28μg/mL时；②当载脂蛋白E≤48.28μg/mL，载脂蛋白C3≤156.45μg/mL，且血清淀粉样蛋白A>0.65μg/mL时，这两种情况均判定为哮喘儿童。通过该模型对120例儿童哮喘和40例健康儿童血清样本进行检测，该模型对于儿童哮喘的敏感度为79.2％，特异度为92.5％，阳性预测值为96.9％，Youden指数为0.717。10-倍交叉验证后，该模型对于儿童哮喘的敏感度为77.5％，特异度为80.0％(表2)。

表2蛋白组合式标志物的儿童哮喘决策树模型诊断价值

实施例4

儿童哮喘诊断试剂制备：

制备蛋白组合式儿童哮喘诊断试剂包括以载脂蛋白C3抗体、载脂蛋白E抗体、血清淀粉样蛋白A抗体为捕获抗体；以含有生物素标记的检测抗体，每一种检测抗体分别抗一种相应的儿童哮喘蛋白标志物且对应于捕获抗体；链霉亲和素—藻红蛋白，其中的链霉亲和素与生物素特异性结合；标准品：包含载脂蛋白C3、载脂蛋白E和血清淀粉样蛋白A的标准品；质控品：包含阳性对照和阴性对照。根据“捕获抗体—蛋白—检测抗体”中检测抗体的含量，定量获得蛋白组合式标志物的含量。制备步骤：与蛋白特异性结合的捕获抗体通过蛋白直接免疫动物获取单克隆抗体和多克隆抗体；优选的，捕获抗体为单克隆抗体。将捕获抗体固定到固相材料表面，加入待测血清样品或不同浓度的载脂蛋白C3、载脂蛋白E和血清淀粉样蛋白A标准品，使捕获抗体结合待测样品中的标志物；将不同的检测抗体进行生物素标记，使检测抗体与捕获的标志物结合，与捕获抗体分别结合于该标志物的不同抗原表位。将“捕获抗体—蛋白—检测抗体”与链霉亲和素—藻红蛋白结合后，检测不同的荧光信号而确定待测样品中各蛋白标志物的含量，根据步骤(2)中的儿童哮喘蛋白决策树数学模型进行判别。

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种与补体和凝血级联反应通路相关的蛋白组合式标志物在制备儿童哮喘诊断试剂中的应用，其特征在于该蛋白组合式标志物包括蛋白载脂蛋白C3、载脂蛋白E和血清淀粉样蛋白A。

2.一种儿童哮喘诊断试剂，其特征在于包括捕获抗体、检测抗体、链霉亲和素—藻红蛋白、标准品和质控品；

所述的捕获抗体为载脂蛋白C3捕获抗体、载脂蛋白E捕获抗体和血清淀粉样蛋白A捕获抗体；

检测抗体为载脂蛋白C3检测抗体、载脂蛋白E检测抗体和血清淀粉样蛋白A检测抗体，与捕获抗体相对应。

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