CN109536601B - 儿童哮喘血清特异miRNAs及决策树模型的建模方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开儿童哮喘血清特异miRNAs及决策树模型的建模方法。儿童哮喘血清特异miRNAs组合物包括hsa‑miR‑18a‑5p，hsa‑miR‑106a‑5p，hsa‑miR‑144‑3p和hsa‑miR‑375。儿童哮喘特异的血清miRNAs组合物，作为儿童哮喘生物标志物，是预警评估儿童哮喘的特异性强、敏感性高的新方法，对儿童哮喘预警具有重要的意义，同时为提高儿童哮喘的临床治疗效果检测提供了一种新的筛查和检测的评估方法。

Description

儿童哮喘血清特异miRNAs及决策树模型的建模方法
技术领域
本发明属于生物领域，特别涉及儿童哮喘血清特异miRNAs及决策树模型的建模方法。本发明适用于新的非侵入性的体外检测手段，用于儿童哮喘的预警以及治疗情况的评估。
背景技术
支气管哮喘(bronchial asthma)简称哮喘，是由多种因素引发的慢性呼吸道疾病。2018年全球哮喘防治倡议(GINA)的结果显示，全球有3亿人患有哮喘，每年有34.6万人死于哮喘。而作为儿童期常见的反复发作的喘鸣气喘性肺性疾病，2003年的国际儿童哮喘及过敏性疾病研究组织(ISAAC)调查结果显示全世界特别是亚太地区儿童哮喘患病率在逐年升高。我国的哮喘患者也逐年增加，尤其是儿童哮喘患者，已经从2000年的1.97％增加到了2010年的3.01％，在2000年的基础上上升了50％左右。
儿童哮喘虽然与成人哮喘具有相同的病理生理基础，但是由于儿童处于生长发育阶段，哮喘的反复作用会影响儿童的生长发育和正常生活，给家庭社会带来巨大的心理和经济负担。因此对儿童哮喘的灵敏特异的预警评估极其重要。目前临床上对儿童哮喘的主要诊断方法以临床症状、肺功能及治疗效果来诊断和评估病情。但是先天性喉喘鸣和慢性阻塞性肺病等疾病均能导致呼吸障碍、喘鸣或者气道炎症等类似于哮喘的症状，易于出现误诊。临床上主要采用抗炎、解除支气管痉挛、抗过敏的原则，以吸入糖皮质激素(ICS)治疗为主，对哮喘急性发作期的患儿治疗效果较好。但是长期大量使用激素治疗会造成儿童发育障碍。激素治疗的副作用也造成家长对激素用药的恐惧而导致哮喘治疗的不足。因此，目前临床上急需能够预警评估儿童哮喘病情更加灵敏特异的客观指标。
近年来研究表明，血清中的miRNAs能作为诊断疾病的候选生物学标志物，涉及前列腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、白血病及卵巢癌等多种肿瘤。由于miRNAs的稳定性好，不易在血液中被各种酶降解，而且miRNAs耐酸耐碱，更不受温度变化及置留时间的影响，比蛋白更适宜作为疾病的临床诊断标志物。随着第二代高通量测序技术的发展，miRNAs的研究得到了极大的提高。高通量测序技术可以用于发现新的miRNAs及检测已知miRNAs长度和序列的微小改变，具有速度快、成本低、覆盖度深、准确度和灵敏度高等优点。通过设计茎环结构的反转录引物和定量PCR引物，可以精确检测微量样品中miRNAs表达。Illumina测序和荧光定量PCR技术具有快速、简单、省时、检测灵敏度高，样品消耗少，是非常适合的检测儿童哮喘特异的血清miRNAs。
本发明涉及的四种miRNAs：hsa-miR-18a-5p(UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG)，hsa-miR-106a-5p(AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG)，hsa-miR-144-3p(UACAGUAUAGAUGAUGUACU)和hsa-miR-375(UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA)(miRNA序列来源于miRBase：www.mirbase.org)的研究基本上集中在肝癌、胃癌、宫颈癌、乳腺癌等肿瘤疾病中，除此之外高血压、糖尿病、精神分裂症等疾病中也有研究。但是对于哮喘或者哮喘相似性疾病中鲜有研究。hsa-miR-18a-5p已报道的研究中与哮喘相关的主要是下调糖皮质激素受体；hsa-miR-106a-5p已报道的与哮喘相关的研究主要是其在辅助性T淋巴细胞的分化中发挥作用，可以调节IL-10的表达从而影响促炎或者抑炎反应间的平衡；hsa-miR-144-3p已报道的与哮喘相关的研究主要是调节Creb1和Crtc1-3的表达来影响过敏性疾病；hsa-miR-375已报道的与哮喘相关的研究主要是可调节胸腺基质淋巴细胞生成素的水平，促进Th2炎症反应等。已有的报道中虽然有这四种miRNAs的研究，但少有用这些miRNAs来预警评估儿童哮喘，也没有用这四种miRNAs组合物来构建预警评估儿童哮喘模型。
因为由于不同患者的个体差异，仅用1-2个miRNAs判断疾病显得极不可靠。而筛选出一组miRNAs，建立多个miRNAs的组合物可使结果更加可靠。所以儿童哮喘特异的血清miRNAs和组合物，作为儿童哮喘生物标志物，是预警评估儿童哮喘的特异性强、敏感性高的新方法，对儿童哮喘预警具有重要的意义，同时为提高儿童哮喘的临床治疗效果检测提供了一种新的筛查和检测的评估方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服目前儿童哮喘检测技术以及治疗评估的不足，建立一种用于儿童哮喘的预警以及治疗情况评估的血清miRNAs决策树模型。
本发明的儿童哮喘血清特异miRNAs组合物包括hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-106a-5p，hsa-miR-144-3p和hsa-miR-375。
本发明儿童哮喘血清特异miRNAs决策树模型的建模方法，包括以下步骤：
步骤(1)、针对儿童哮喘患者及健康对照者进行血清样本的采集，并保存于-80℃冰箱低温冷冻备用；
步骤(2)、采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits(Illumina,San Diego,USA)试剂盒进行文库构建；
步骤(3)、采用IlluminaHiseq 2000/2500进行测序分析以及初步筛查，获得多个miRNAs；
步骤(4)、以hsa-miR-16为内参基因，采用qRT-PCR检测步骤(3)初步筛选的miRNAs的表达水平；
步骤(5)、采用Biomarker Patterns Software 5.0软件分析并比较各miRNAs的权重组合，构建了四个血清miRNAs组成的儿童哮喘miRNAs决策树模型。
所述的方法，所述步骤(1)具体执行以下操作：收集血清样本共170例，95例儿童哮喘患者血清样本，75例健康对照者样本。所有参加者血清样本保存于-80℃冰箱低温冷冻备用。
所述的方法，所述步骤(2)具体执行以下操作：采用RNA抽提试剂盒miRNeasy MiniKit，按照说明书要求提取血清中的总RNA。儿童哮喘患者和健康对照者的血清总RNA要求：经NanoDrop-2000紫外分光光度计检测OD值，当A260/A280数值在1.8～2.0之间表示总RNA的纯度较好，小于1.8说明溶液中蛋白或者其他有机物的污染比较明显，大于2.0则可能总RNA已降解。
利用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits(Illumina,San Diego,USA)试剂盒进行文库构建。首先对提取的总RNA进行3’接头连接，然后5’接头连接，反转录扩增，PCR扩增，凝胶电泳。割胶时，以140bp条带的上沿，150bp条带的下沿为基准进行割胶。最后对cDNA文库进行纯化。
所述的方法，所述步骤(3)具体执行以下操作：采用IlluminaHiseq 2000/2500进行测序分析得到的初步结果，选取的miRNAs满足四个条件：①在儿童哮喘患者或健康对照者中检测miRNAs表达量至少达到10copies；②表达差异ratio≥1.5或ratio≤0.5，并且百分比含量高；③P值有显著差异(P value(chi square_2×2)≤0.05And P value(fishertest)≤0.05)；④根据本领域技术人员的经验(通过文献检索)人工筛选出与儿童哮喘相关的miRNAs。结果筛选出14个miRNAs：hsa-miR-17-5p，hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-19b-3p，hsa-miR-106a-5p，hsa-miR-144-3p，hsa-miR-375，hsa-miR-20a-5p，hsa-miR-25-3p，hsa-miR-127-3p，hsa-miR-153-3p，hsa-miR-192-5p，hsa-miR-199b-5p，hsa-miR-381-3p，hsa-miR-410-3p。序列来源于miRBase：www.mirbase.org。
所述的方法，所述步骤(4)具体执行以下操作：使用miRcute血清/血浆miRNA提取分离试剂盒提取血清中的总miRNAs。使用miRcute增强型miRNAcDNA第一链合成试剂盒将血清中的总miRNAs合成cDNA。用primer 5.0软件设计qRT-PCR的上游引物，下游通用引物来自于试剂盒。使用miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)，以has-miR-16为内参基因，采用qRT-PCR的方法检测儿童哮喘患者和健康对照者血清样本中以上14种miRNAs的表达水平。实验设立阴性对照和重复实验，阴性对照反应体系中加ddH2O，所有荧光定量PCR均做3次重复。
所述的方法，所述步骤(5)具体执行以下操作：将差异miRNAs荧光定量PCR数据以hsa-miR-16为内参基因，对目标基因进行归一化处理。miRNAs相对表达量参考先前文献报道用2-△△Ct方法进行计算，△△Ct＝(Ct miRNA-Ct miR-16)实验组-(Ct miRNA-Ct miR-16)对照组平均值。然后将数据以EXCEL的格式导入Biomarker Patterns Software 5.0进行分析，结合各个峰的权重，比较不同miRNAs排列组合的判别分析结果，按照使用最少的组合，使评估检测样本的灵敏度和特异性达到最高效果的原则选出最佳排列组合。最后选出hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-106a-5p，hsa-miR-144-3p和hsa-miR-375四种miRNA组合物进行决策树建模。
本发明的另一个目的是提供上述构建的儿童哮喘miRNAs决策树模型的应用方法，具体是：
将待检测患者进行血清采样，然后获取以下四个miRNAs：hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-106a-5p，hsa-miR-144-3p和hsa-miR-375；输入至上述构建的儿童哮喘miRNAs决策树模型，上述miRNAs miRNAs相对表达量采用2-△△Ct方法进行计算，△△Ct＝(Ct miRNA-CtmiR-16)实验组-(Ct miRNA-Ct miR-16)对照组平均值。然后通过Biomarker PatternsSoftware 5.0分析判断是否为哮喘儿童：①当has-miR-18a-5p≤0.0076时；②当has-miR-18a-5p>0.0076，has-miR-106a-5p≤0.0934，且has-miR-144-3p≤0.0576时；③当has-miR-106a-5p≤0.0934，has-miR-144-3p>0.0576，has-miR-375≤0.0105且has-miR-18a-5p>0.0265时，这三种情况均判定为健康儿童。①当has-miR-18a-5p>0.0076，且has-miR-106a-5p>0.0934时；②当has-miR-18a-5p>0.0076，has-miR-106a-5p≤0.0934，has-miR-144-3p>0.0576，且has-miR-375>0.0105时；③当0.0076<has-miR-18a-5p≤0.0265，has-miR-106a-5p≤0.0934，has-miR-144-3p>0.0576，且has-miR-375≤0.0105时，这三种情况均判定为哮喘儿童。
本发明与其他儿童哮喘的诊断方法比较，具有以下优点：
一、本发明采用儿童哮喘患者具有差异的4个特征血清miRNAs组合起来进行对儿童哮喘血清的检测，提供的血清miRNAs组合物是预警评估儿童哮喘的新方法和新途径，并为进一步发现的儿童哮喘生物标志提供了基础；
二、与以往传统的肺功能检测等方法相比，本发明是一种在血清miRNAs水平上的检测，对儿童哮喘的早期预警和诊断提供了新标准；
三、该模型鉴别儿童哮喘与健康对照者的标准是：①当has-miR-18a-5p≤0.0076时；②当has-miR-18a-5p>0.0076，has-miR-106a-5p≤0.0934，且has-miR-144-3p≤0.0576时；③当has-miR-106a-5p≤0.0934，has-miR-144-3p>0.0576，has-miR-375≤0.0105且has-miR-18a-5p>0.0265时，这三种情况均判定为健康儿童。①当has-miR-18a-5p>0.0076，且has-miR-106a-5p>0.0934时；②当has-miR-18a-5p>0.0076，has-miR-106a-5p≤0.0934，has-miR-144-3p>0.0576，且has-miR-375>0.0105时；③当0.0076<has-miR-18a-5p≤0.0265，has-miR-106a-5p≤0.0934，has-miR-144-3p>0.0576，且has-miR-375≤0.0105时，这三种情况均判定为哮喘儿童。利用该模型对于儿童哮喘诊断的敏感度为95.00％，特异度为88.33％，诊断具有较高的准确性。因此本发明可实现提高对儿童哮喘的早期预警和早期诊断。
附图说明
图1为儿童哮喘hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-144-3p和hsa-miR-375诊断模型；
图2为各节点中儿童哮喘和健康对照的比例。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1
儿童哮喘患者及健康对照者血清样本的采集和临床检测：
收集血清样本共170例，95例儿童哮喘患者血清样本，75例健康对照者样本。所有参加者血样为晨起空腹抽取，采用一次性真空不抗凝采血管，采集周围静脉全血3.0mL，4℃垂直放置1-2h，使血液凝结，4000g离心10min取血清，在4℃环境中，吸上清后分装成各200μL，保存于-80℃冰箱低温冷冻备用。
实施例2
采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits(Illumina,San Diego,USA)试剂盒进行文库构建：
为减少研究中的样本个体差异的影响，每组样本15例等量混合形成一个样本池。15例儿童哮喘患者和15例健康对照的血清样本分别混合后应用RNA抽提试剂盒miRNeasyMini Kit，按照说明书要求提取血清中的总RNA。在溶解的200μL血清样本中加入5倍样本体积的QIAzol裂解液，室温孵育10min；加入200μL氯仿，剧烈振荡摇匀后室温放置5min，4℃12000g离心15min；取上清加入1.5倍的无水乙醇，混匀后上柱，4℃12000g离心15s，弃下层液体；重复上步骤一次；柱子中加入700μL RWT，4℃12000g离心15s，弃掉下层液体；柱子加入500μL RPE，4℃12000g离心15s，弃掉下层液体；重复上步骤一次；将纯化柱放置在新的套管中4℃12000g离心2min后，转至新的1.5mL EP管中,加30～50μLRNAfree水至纯化柱的膜上，室温放置1min，4℃12000g离心15s后弃去纯化柱，保留离心后的样品。取2μL用于Nanodrop定量。经Nanodrop-2000紫外分光光度计检测OD值，A260/A280＞1.8。
利用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits(Illumina,San Diego,USA)试剂盒进行文库构建。首先对提取的总RNA进行3’接头连接，然后5’接头连接，3’和5’接头连接的小RNA用于反转录PCR创建DNA文库。接着进行PCR扩增，凝胶电泳。割胶时，以140bp条带的上沿，150bp条带的下沿为基准进行割胶。最后对cDNA文库进行纯化：凝胶纯化后，对cDNA进行洗脱，通过乙醇沉淀浓缩。将胶切碎加300μL Ultra-Pure Water于45℃溶解2h后用5μm的过滤器过滤，600g下离心过滤器10s。溶解液中里加入(2μL Glycogen，975μL 80％乙醇)，-80℃沉淀1h后，于4℃20000g离心20min，去上清后室温下用500μL 70％乙醇洗涤颗粒，将颗粒于37℃加热板下5～10min到干为止，用10μL10mMTris-Hcl,pH8.5重新悬置颗粒。
实施例3
采用IlluminaHiseq 2000/2500进行测序分析，初步筛查儿童哮喘患者和健康对照者的血清差异表达的miRNAs：
构建好的文库使用IlluminaHiseq 2000/2500进行测序，测序读长为单端1×50bp。采用ACGT 101-miR(LC Sciences,Houston,Texas,USA)，该软件的分析流程如下：原始数据经过质控处理后得到clean reads，clean reads去除3’接头并进行长度筛选，保留碱基长度在18～26nt的序列。再将剩余序列比对各种RNA数据库序列(不包含miRNA)，如mRNA数据库、RFam数据库(包含rRNA,tRNA,snRNA,snoRNA等)和Repbase数据库(重复序列数据库)，并进行过滤，最后获得的数据即有效数据，进行miRNA鉴定和预测分析和miRNA的差异性分析。
测序分析得到的初步结果：在儿童哮喘患者血清中检测到1395个miRNAs，健康对照者中检测到1189个miRNAs；儿童哮喘患者和健康对照者共有111个差异表达的血清miRNAs，在儿童哮喘患者中有90个miRNAs表达量上调，21个miRNAs表达量下调。选取的miRNAs满足四个条件：①在儿童哮喘患者或健康对照者中检测miRNAs表达量至少达到10copies；②表达差异ratio≥1.5或ratio≤0.5，并且百分比含量高；③P值有显著差异(Pvalue(chi square_2×2)≤0.05And P value(fisher test)≤0.05)；④通过文献检索，筛选出与儿童哮喘相关的miRNAs。结果筛选出14个miRNAs：hsa-miR-17-5p，hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-19b-3p，hsa-miR-106a-5p，hsa-miR-144-3p，hsa-miR-375，hsa-miR-20a-5p，hsa-miR-25-3p，hsa-miR-127-3p，hsa-miR-153-3p，hsa-miR-192-5p，hsa-miR-199b-5p，hsa-miR-381-3p，hsa-miR-410-3p。
实施例4
以hsa-miR-16为内参基因，采用qRT-PCR检测初步筛选的miRNAs的表达水平：
使用miRcute血清/血浆miRNA提取分离试剂盒提取血清中的总miRNAs。每200μL血清加入900μL裂解液MZA，振荡混匀30sec至完全匀浆后室温放置5min；加入200μL氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置5min，12000rpm，4℃，离心15min，把500μL水相转移到离心管中；加1mL无水乙醇混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute，室温放置2min,12000rpm离心30sec后弃废液，保留吸附柱miRelute；向吸附柱miRelute中加入700μL去蛋白液MRD，室温静置2min，12000rpm离心30sec后弃废液；向吸附柱miRelute中加入500μL漂洗液RW，室温静置2min，12000rpm离心30sec后弃废液，重复操作一次；12000rpm离心2min，弃收集管，将吸附柱miRelute置于超净工作台上通风片刻以充分晾干；将吸附柱miRelute转入一个新的RNase-Free 1.5mL离心管中，向吸附膜中心位置加30μLRNase-Free ddH2O，室温放置2min，12000rpm离心2min；用离心管中离心下来的液体，再加到吸附柱中心位置，室温放置2min，12000rpm离心2min，即为提取的miRNA。
用miRcute增强型miRNAcDNA第一链合成试剂盒进行反转录。反转录反应体系：总RNA 8μL，2×miRNA RT Reaction Buffer10μL，miRNA RT ENzyme Mix2μL，总体积20μL。分两步方法进行，第一步：42℃，60min；第二步：95℃，3min；反应完毕后，保存于4℃冰箱。
使用miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)进行荧光定量。上游引物通过primer 5.0软件设计，引物的退火温度Tm值约在65℃，GC含量约40％-60％，引物长度约25bp左右。下游通用引物来自miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBRGreen)(Tiangen)。使用通用的下游引物和miRNAs特异的上游引物进行荧光定量扩增。荧光定量PCR体系：RNase-free ddH2O 7.2μL，2×miRcute Plus miRNA premix(with SYBR&Rox)10μL，上游引物(10μM)0.4μL，下游引物(10μM)0.4μL，Template(cDNA)2μL，总体积20μL。混匀后稍离心，在CFX 96(BIORAD)中进行荧光定量PCR反应，反应参数设置为：95℃15min，然后95℃20s，60℃34s，共40个循环。实验设立阴性对照和重复实验，阴性对照反应体系中加ddH2O，所有荧光定量PCR均做3次重复。
引物的特异性检测：以内参hsa-miR-16在儿童哮喘患者血清样本中扩增为例，观察扩增情况，扩增曲线平滑且随着循环数的增加，荧光信号具有明显的对数期，而空白对照无连续曲线生成，说明扩增情况良好。对扩增的hsa-miR-16产物做溶解曲线，有且只有一个明显的单峰，而无模板对照无明显波峰出现，说明经扩增后产物是特异的hsa-miR-16，反应无污染，结果准确，可靠。
实施例5
采用Biomarker Patterns Software 5.0软件构建血清miRNAs组成的儿童哮喘miRNAs决策树模型：
miRNAs荧光定量PCR数据分析是以在血清样本中存在稳定表达的miR-16作为内参对照，miRNAs相对表达量参考先前文献报道用2-△△Ct方法进行计算，△△Ct＝(Ct miRNA-CtmiR-16)实验组-(Ct miRNA-Ct miR-16)对照组平均值。将差异miRNAs荧光定量PCR数据以EXCEL的格式导入Biomarker Patterns Software 5.0进行分析，结合各个峰的权重，比较不同miRNAs排列组合的判别分析结果，按照使用最少的组合，使诊断划分样本的灵敏度和特异性达到最高效果的原则选出最佳排列组合，最后同时输出原始判别和10-倍交叉验证的结果，选出最佳诊断miRNAs模型。
鉴定结果：
儿童哮喘患者及健康对照者血清样本的采集和临床检测
收集血清样本共170例，95例儿童哮喘患者血清样本，75例健康对照者样本。所有参加者血样为晨起空腹抽取，采用一次性真空不抗凝采血管，采集周围静脉全血3.0mL，4℃垂直放置1-2h，使血液凝结，4000g离心10min取血清，在4℃环境中，吸上清后分装成各200μL，保存于-80℃冰箱低温冷冻备用。最终入选的样本保证年龄、性别无统计学意义。儿童哮喘组和健康对照组的临床基本信息见表1。
表1样本的临床资料分析
Figure BDA0001915592780000081
两组间性别、年龄比较差异无统计学意义(年龄t＝1.7422，P＝0.0833；性别χ2＝0.777，P＝0.427)。
儿童哮喘患者特异的血清miRNAs的测序分析及筛查
用Illumina测序筛查技术分析了15例儿童哮喘患者和15例健康对照者血清miRNAs，得到的初步结果，在儿童哮喘患者血清中检测到1395个miRNAs，健康对照者中检测到1189个miRNAs；儿童哮喘患者和健康对照者血清中miRNAs的统计见表2；小RNAs的种类见表3。儿童哮喘患者和健康对照者共有111个差异表达的血清miRNAs，在儿童哮喘患者中有90个血清miRNAs表达量上调见表4，21个血清miRNAs表达量下调见表5。
表2应用Illumina测序筛查技术分析儿童哮喘患者和健康对照者中miRNAs的统计
Figure BDA0001915592780000091
表3应用Illumina测序筛查技术分析儿童哮喘患者和健康对照者血清中小RNAs的种类
Figure BDA0001915592780000092
表4测序分析在儿童哮喘患者血清中表达水平升高的miRNAs
Figure BDA0001915592780000093
Figure BDA0001915592780000101
Figure BDA0001915592780000111
Figure BDA0001915592780000121
表5测序分析在儿童哮喘患者血清中表达水平降低的miRNAs
Figure BDA0001915592780000122
选取的miRNAs满足四个条件：①在儿童哮喘患者或健康对照者中检测miRNAs表达量至少达到10copies；②表达差异ratio≥1.5或ratio≤0.5，并且百分比含量高；③P值有显著差异(P value(chi square_2×2)≤0.05And P value(fisher test)≤0.05)；④通过文献检索，筛选出与儿童哮喘相关的miRNAs。筛选出14个miRNAs：hsa-miR-17-5p，hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-19b-3p，hsa-miR-106a-5p，hsa-miR-144-3p，hsa-miR-375，hsa-miR-20a-5p，hsa-miR-25-3p，hsa-miR-127-3p，hsa-miR-153-3p，hsa-miR-192-5p，hsa-miR-199b-5p，hsa-miR-381-3p，hsa-miR-410-3p见表6。其中hsa-miR-410-3p在儿童哮喘中表达下调，其余13个miRNAs均表达上调。
表6应用Illumina测序技术初步筛查儿童哮喘患者和健康对照者血清中差异表达miRNAs
Figure BDA0001915592780000131
构建血清miRNAs的儿童哮喘决策树模型
进一步采用决策树建模，hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-144-3p和hsa-miR-375经Biomarker Patterns Software 5.0软件分析并比较各miRNAs的权重组合，构建了由这4个miRNAs组成的儿童哮喘miRNAs诊断模型(图1)。该模型鉴别儿童哮喘与健康对照者的标准是：最后选出hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-106a-5p，hsa-miR-144-3p和hsa-miR-375四种miRNA组合物进行决策树建模。①当has-miR-18a-5p≤0.0076时；②当has-miR-18a-5p>0.0076，has-miR-106a-5p≤0.0934，且has-miR-144-3p≤0.0576时；③当has-miR-106a-5p≤0.0934，has-miR-144-3p>0.0576，has-miR-375≤0.0105且has-miR-18a-5p>0.0265时，这三种情况均判定为健康儿童。①当has-miR-18a-5p>0.0076，且has-miR-106a-5p>0.0934时；②当has-miR-18a-5p>0.0076，has-miR-106a-5p≤0.0934，has-miR-144-3p>0.0576，且has-miR-375>0.0105时；③当0.0076<has-miR-18a-5p≤0.0265，has-miR-106a-5p≤0.0934，has-miR-144-3p>0.0576，且has-miR-375≤0.0105时，这三种情况均判定为哮喘儿童。通过该模型，80例儿童哮喘样本和60例健康对照，60例健康对照样本被判读正确的为53例，80例儿童哮喘样本被判读正确的为76例，该模型对于儿童哮喘诊断的敏感度为95.00％，特异度为88.33％(表7)，各节点中儿童哮喘和健康对照的比例见图2。10-倍交叉验证后，该模型对于儿童哮喘诊断的敏感度为80.60％，特异度为81.66％。
表7儿童哮喘miRNAs诊断模型的诊断价值表7儿童哮喘miRNAs诊断模型的诊断价值
Figure BDA0001915592780000141
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.儿童哮喘血清特异miRNAs组合物，其特征在于由hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-106a-5p，hsa-miR-144-3p和hsa-miR-375组成。
2.儿童哮喘血清特异miRNAs决策树模型的建模方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤（1）、针对儿童哮喘患者及健康对照者进行血清样本的采集，并保存于-80℃冰箱低温冷冻备用；
步骤（2）、采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits试剂盒进行文库构建；
步骤（3）、采用IlluminaHiseq 2000/2500进行测序分析以及初步筛查，获得多个miRNAs；
步骤（4）、以hsa-miR-16为内参基因，采用qRT-PCR检测步骤（3）初步筛选的miRNAs的表达水平；
步骤（5）、采用Biomarker Patterns Software 5.0软件分析并比较各miRNAs的权重组合，构建了四个血清miRNAs组成的儿童哮喘miRNAs决策树模型；
所述步骤（3）具体执行以下操作：采用IlluminaHiseq 2000/2500进行测序分析得到的初步结果，选取的miRNAs满足四个条件：①在儿童哮喘患者或健康对照者中检测miRNAs表达量至少达到10 copies；②表达差异ratio≥1.5或ratio≤0.5，并且百分比含量高；③P值有显著差异，chi square_2×2≤0.05 且fisher test ≤0.05；④筛选出与儿童哮喘相关的miRNAs，筛选出14个miRNAs：hsa-miR-17-5p，hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-19b-3p，hsa-miR-106a-5p，hsa-miR-144-3p，hsa-miR-375，hsa-miR-20a-5p，hsa-miR-25-3p，hsa-miR-127-3p，hsa-miR-153-3p，hsa-miR-192-5p，hsa-miR-199b-5p，hsa-miR-381-3p，hsa-miR-410-3p；
所述步骤（5）具体执行以下操作：将差异miRNAs荧光定量PCR数据以hsa-miR-16为内参基因，对目标基因进行归一化处理；miRNAs相对表达量采用2−△△Ct方法进行计算，△△Ct =(Ct miRNA - Ct miR-16) 实验组- (Ct miRNA- Ct miR-16) 对照组平均值；然后将数据以EXCEL的格式导入Biomarker Patterns Software 5.0进行分析，结合各个峰的权重，比较不同miRNAs排列组合的判别分析结果，按照使用最少的组合，使评估检测样本的灵敏度和特异性达到最高效果的原则选出hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-106a-5p，hsa-miR-144-3p和hsa-miR-375四种miRNA组合物进行决策树建模。
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