作为脓毒症诊断标志物的LOC101927627及其应用
技术领域
本发明属于生物医学领域,涉及LOC101927627作为诊断脓毒症的分子标志物的应用。
背景技术
脓毒症是指由感染或者高度可疑感染灶引发全身炎症反应综合征(Systemicinflammatory response syndrome,SIRS),继而组织器官损伤的病理过程及临床症候群。脓毒症可以引起多脏器功能衰竭(严重脓毒症)和低血压(脓毒性体克),是入住重症监护病房(intensive care unit,ICU)患者的主要死亡原因之一,而且治疗费用相当高,给患者家庭带来了极大的经济负担。然而脓毒症目前主要靠临床诊断,且其早期临床表现无特异性,又缺乏及时可靠的预警诊断指标,因此人们致力于寻找一种或一类能够有效诊断脓毒症的生物标志物。
近年来常用于临床或研究的脓毒症相关生物标志物主要有C反应蛋白(Creactiveprotein,CRP)、降钙素原(procalcitonin,PCT)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、可溶性髓系细胞触发受体-1(soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1,sTREM-1)等。CRP是一种急性时相蛋白,对脓毒症的诊断特异性不高,不能反映脓毒症的严重程度,而且与预后的关系也饱受争议。PCT的浓度变化与感染严重程度及病原体类型相关,然而它在一些非感染性疾病中的浓度也会升高,临床应用有一定的局限性。研究提示IL-6,sTREM-1也参与了脓毒症的发生发展过程,但其诊断价值尚未得到证实,有待进一步的研究。总之,当前的脓毒症相关生物标志物多存有敏感性不高或特异性不强的不足,因此找出一种可以用于脓毒症早期预警诊断的生物标志物成为目前危重医学领域函待解决的重要问题之一。
随着转录组学和基因组学技术的不断发展,人们逐渐开始将探索的目光转向非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)。一系列的研究证实microRNAs在细胞分化和生长过程中担当着转录后调控的重要角色,然而人们对于数量庞大种类繁多1ncRNAs的功能却知之甚少。长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,1ncRNAs)是一类转录本长度超过200nt,不编码蛋白质的开放性阅读框。以往大家对疾病原因追本溯源的时候常会比较关注相关编码蛋白质基因的突变问题,认为ncRNAs不具有生物学功能,是基因组转录的“噪音”。但是这种思维模式现在已经有了很大的转变,近年来研究发现1ncRNAs可以在表观遗传、转录和转录后水平上调控基因的表达,是细胞生理活动各个重要环节的关键调控分子,参与了染色质修饰、核内运输、基因组印记、X染色体沉默以及转录干扰、转录激活等多个调控过程,与人类疾病的发生发展与诊治均存在着比较密切的关系。当前1ncRNAs的研究主要集中在肿瘤、神经精神性疾病等领域,但是并没有1ncRNAs与脓毒症关系的相关报道。
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种用于诊断脓毒症的长链非编码RNA标志物。本发明利用芯片和QPCR实验证明LOC101927627在脓毒症患者血液中的表达水平明显高于在健康对照人群中的水平,因此可以将LOC101927627作为诊断脓毒症的分子标志物。
为了实验上述目的,本发明采用了如下技术方案:
本发明提供了检测长链非编码RNA表达的试剂在制备脓毒症诊断产品中的应用;所述长链非编码RNA的编码基因Gene ID:101927627(NC_000013.11(109590442..109606219))。
本发明的长链非编码RNA在NCBI中的命名为LOC101927627。本发明的属于基因ID:101927627编码产物的LOC101927627可以具有不同长度的转录本:Genbank登录号XR_001750012.1(具有9193bp的长度)、Genbank登录号XR_001750014.1(具有9245p的长度)、Genbank登录号XR_001750015.1(具有8669p的长度)、Genbank登录号XR_001750013.1(具有8427p的长度)、Genbank登录号XR_001750016.1(具有7751p的长度)。
进一步,所述试剂包括利用SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测LOC101927627表达量时使用的试剂。
更进一步,所述试剂包括检测LOC101927627表达量时使用的PCR扩增引物。
在本发明的具体实施方案中,所述PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。
本发明提供了一种用于脓毒症诊断的产品,所述产品通过检测样本中前面所述的长链非编码RNA的表达来诊断脓毒症。
进一步,所述产品包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台;高通量测序平台是一种特殊的诊断工具,随着高通量测序技术的发展,对一个人的RNA表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的RNA表达谱,容易分析出哪个RNA的异常与疾病相关。因此,在高通量测序中获知LOC101927627表达异常与脓毒症相关也属于LOC101927627的用途,同样在本发明的保护范围之内。
所述试剂盒包括检测LOC101927627表达量的试剂,所述试剂包括与LOC101927627或其DNA序列结合的核酸,所述核酸包括SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测LOC101927627表达量时使用的引物和/或探针。
所述芯片包括检测LOC101927627表达量的试剂,所述试剂包括与LOC101927627或其DNA序列结合的核酸,所述核酸包括能够检测LOC101927627表达量的引物和/或探针。
所述试纸包括检测LOC101927627表达量的试剂,所述试剂包括与LOC101927627或其DNA序列结合的核酸,所述核酸包括能够检测LOC101927627表达量的引物和/或探针。
进一步,所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
进一步,本发明的所述样本来源于血液。
本发明还提供了一种诊断脓毒症的方法,所述方法包括如下步骤:
(1)获取受试者的样品;
(2)检测受试者样品中LOC101927627的表达水平;
(3)将测得的LOC101927627的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
(4)与健康对照相比,LOC101927627的表达水平显著升高,则该受试者被判断患有脓毒症、或判断该受试者患有脓毒症的风险高、或者脓毒症患者被判断为复发、或者脓毒症患者被判断为预后不良。
在本发明的上下文中,“诊断”包括判断受试者是否已经患病、判断受试者是否存在患病的风险、判断患者是否已经复发、判断患者对药物治疗的反应性、或者判断患者的预后情况。
附图说明
图1显示利用QPCR检测LOC101927627的差异表达情况的统计图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选差异表达分子
一、研究对象
收集3例医院呼吸科、急诊监护室脓毒症患者和3例健康志愿者。本研究通过医院伦理委员会审批,所有受试者及家属均获得充分告知并且签署知情同意书。
二、纳入标准
实验组:脓毒症患者。诊断符合SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS诊断标准(华盛顿脓毒症国际会议共识),即有明确或者疑似感染再加上以下一些指标:
1)全身状况:
发热(核心温度>38.3℃)或者低体温(核心温度<36℃>;
心率>90次/分或高于该年龄正常值2个标准差;
呼吸急促,呼吸频率>30次/分;
意识状态改变;
典型的水肿或者液体正平衡>20m1/kg,持续24小时以上;
非糖尿病患者出现高血糖(血糖>110mg/dl或7.7mmo1/L)。
2)炎性指标:
白细胞增多(>12000/μl)或者白细胞减少(<4000/μl)或白细胞计数正常但是不成熟白细胞比例>10%;
血浆CRP高于正常值2个标准差以上;
血浆降钙素原高于正常值2个标准差以上。
3)血流动力学指标:
低血压(收缩压90mmHg,平均动脉压<70mmHg,或成人收缩压下降>40mmHg,或低于该年龄正常值的2个标准差以下);
混合静脉血氧饱和度>70%;
心脏指数(cardiac index,CI)>3.5L/min/m2。
4)器官功能障碍指标:
低氧血症(氧合指数<300);
急性少尿(尿量<0.5ml/kg/h或者45mmo1/L,至少2小时);
肌醉增加>0.5mg/dl;
凝血功能异常(国际标准化比值>1.5或者活化部分凝血酶时间>60s);
肠梗阻(肠鸣音消失);
血小板减少(<100,000/μl);
高胆红素血症(血浆总胆红素>4mg/dl或70mmo1/L)。
5)组织灌注指标:
高乳酸血症(>3mmo1/L);
毛细血管再充盈时间延长或者皮肤粘膜出现斑点。
对照组:体检的健康志愿者。
三、排除标准:
1)肿瘤患者;
2)年龄<16周岁;
3)怀孕或者哺乳期;
4)合并HIV感染;
5)患者或者家属拒绝参与该研究。
四、实验步骤
1、提取全血总RNA
1.1匀浆处理:用含EDTA的抗凝真空管采集受试者lml血液,按照1:3的比例加入3m1 TRIpure LS Reagent(Bioteke),用漩涡混合器震荡涡旋15-20s以帮助,裂解血液中的细胞。同时打开高速低温离心机预冷。
1.2在15-30℃条件下孵育5min以使核蛋白体完全分解。
1.3加入0.6m1三氯甲烷,盖紧样品管盖,剧烈震荡15s并在室温下孵育3min。
1.4在4℃12000rpm的高速低温离心机上离心10min,之后样品会分为三层,此时RNA便溶在上层的水相中,将上清液移入到新的离心管中。
1.5加入等体积的75%的乙醇,轻柔颠倒混匀,可能会有沉淀,将沉淀和液体一起分次倒入套着收集管的吸附柱RA中。
1.6反复于4℃10000rpm离心45s,弃掉废液,直至所有沉淀与溶液都过柱。
1.7加入500μl去蛋白液RE(Bioteke),12000rpm离心45s,弃掉废液。
1.8加入700μl漂洗液RW(Bioteke),12000rpm离心60s,弃掉废液。
1.9于4℃12,000rpm离心2min,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
1.10取出吸附柱RA,放入RNase free的离心管中,加入80μl RNase free water(提前65-70℃热浴),室温下放置2min,12000rpm离心1min。
2、RNA质量检测
使用NanoDropND-1000型紫外分光光度计测定组织总RNA的浓度和纯度。
3、组织总RNA完整性测定
经1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,紫外透射光下观察,检测RNA的完整性。
4、Agilent2100测定RIN值。
lncRNA测序要求:样品需求量:≥200ng;样品浓度:C≥20ng/μL;样品纯度:RIN≥7.0,28S/18S≥1.0。
5、去除rRNA
细胞内一部分(>24%)的长链非编码RNA都是缺少传统poly A尾的,因此采用去除rRNA的方式建库可以获得更加全面的lncRNA信息。
6、片段化RNA
Illumina平台是针对短序列片段进行测序,去除rRNA得到的mRNA和lncRNA是完整的RNA序列,平均长度可能达几kb,因此需要对其进行随机打断。利用金属离子,可以将RNA随机断裂成200bp左右的小片段。
7、反转合成cDNA
在逆转录酶的作用下,利用随机引物,以mRNA为模板反转合成一链cDNA,进行二链合成时,dNTPs试剂中用dUTP代替dTTP,使cDNA第二链中碱基包含A/U/C/G。
8、连接adaptor
双链的cDNA结构为粘性末端,加入End Repair Mix将其补成平末端,随后在3’末端加上一个A碱基,用于连接Y字形的接头。
9、UNG酶消化cDNA二链
在PCR扩增前,用UNG酶将cDNA第二链消化,从而使文库中仅包含cDNA第一链。
10、Illumina Hiseq2500上机测序
Illumina Hiseq2500测序平台,进行2*150bp测序。
11、生物信息学分析
测序数据获得以后的rawdata分析过程如下所示:
(1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim,trim掉质量<20的碱基,并且删掉N大于10%的reads;
(2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为GRCh38.p7,fasta和gff文件下载自NCBI;
(3)cuffquant定量mRNA的表达量并标准化输出;cuffquant定量lncRNA的表达量并标准化输出;
(4)cuffdiff比较对照组跟疾病组lncRNA和mRNA的表达差异。
12、结果
显著差异lncRNA筛选条件:FDR<0.01。用以上标准筛选得到以下结果:与健康对照组相比,脓毒症组血液中差异表达LncRNA为74个,其中上调的为59个,下调的为15个。
实施例2大样本验证筛选出的差异表达分子
基于前期测序的结果,根据P value的大小,我们选择LOC1019276277进行验证。
1、样本收集
按照实施例1的方法收集45例脓毒症患者的外周血以及45例健康人群的外周血。
2、在转录水平上进行验证
试剂:反转录试剂盒(DDR037A)购自宝生物工程(大连)有限公司。荧光实时(Real-time)定量PCR(polymerase chain reaction)所用的SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseHPlus)试剂盒为日本Takara公司生产。
2.1提取血液总RNA
步骤同实施例1。
2.2逆转录
以提取的总RNA(1μg)为模板,加入以下反应体系,具体为:5×Buffer4μL,RT Enzyme Mix 1μL,Oligo dT Primer(50μM)1μL,Random 6mers(100μM)1μL,以无RNA酶的ddH2O将反应体积补足为20μL。将上述混合液置于37℃15min,85℃5s,即获得cDNA。该cDNA可用于lncRNA Real-time PCR检测。
2.3QPCR
按照日本Takara公司的Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书进行操作。
反应体系:SYBR Premix Ex TaqTM(2×)25μL,ROX Reference Dye(50×)1μL,PCR上游引物(10μM)1μL,PCR下游引物(10μM)1μL,cDNA 4μL,灭菌ddH2O 18μL。
反应程序:95℃20s预变性,按95℃10s变性、49.2℃20s退火、70℃10s延伸过程循环40次,获得Ct值。
结果釆用相对定量法,运用公式2-△△ct计算。实验重复3次。
引物设计:根据LOC1019276277序列,通过NCBI的引物设计工具(Primer BLAST)设计针对cDNA的引物,引物序列如下所示:上游引物:5’-AATGGATGTGAGTTAGAG-3’(SEQ IDNO.1);下游引物:5’-TATTATGTATTCGCTGATTC-3’(SEQ ID NO.2)。
根据GAPDH(内参基因)序列设计引物,上游引物:5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.3);5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.4)。
3、结果
结果显示,45例脓毒症患者中全部患者血液中的LOC1019276277表达水平显著高于健康对照组的平均水平。统计结果如图1所示,与健康对照组相比,脓毒症患者血液中LOC1019276277表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> 作为脓毒症诊断标志物的LOC101927627及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatggatgtg agttagag 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tattatgtat tcgctgattc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctctggtaaa gtggatattg t 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtggaatca tattggaaca 20