CN115786459B

CN115786459B - 一种应用于高通量测序检测实体瘤微小残留病的方法

Info

Publication number: CN115786459B
Application number: CN202211408610.6A
Authority: CN
Inventors: 王小强; 张超; 许青; 魏永杰; 陈婧; 李诗濛; 任用
Original assignee: Jiangsu Xiansheng Diagnostic Technology Co ltd; Jiangsu Xiansheng Medical Diagnosis Co ltd; Jiangsu Xiansheng Medical Devices Co ltd
Current assignee: Jiangsu Xiansheng Diagnostic Technology Co ltd; Jiangsu Xiansheng Medical Diagnosis Co ltd; Jiangsu Xiansheng Medical Devices Co ltd
Priority date: 2022-11-10
Filing date: 2022-11-10
Publication date: 2024-03-15
Anticipated expiration: 2042-11-10
Also published as: CN115786459A

Abstract

本申请属于分子诊断技术领域，具体涉及一种应用于高通量测序检测实体瘤微小残留病的方法，该方法基于患者个性化检测，具有特异性和灵敏度等优势，相比于现有技术，在样本水平能够实现低至0.004％的检测性能。

Description

一种应用于高通量测序检测实体瘤微小残留病的方法

技术领域

本申请属于基因测序领域，具体涉及一种应用于高通量测序检测实体瘤微小残留病的方法。

背景技术

微小残留病灶(Minimal Residual Disease，MRD)是指早中期癌症患者在经过根治性治疗后，仍存在于患者体内、但影像学方法无法检出的残留肿瘤细胞或者微小病灶，属于肿瘤进展的隐匿阶段。残留的癌细胞数量可能很少，暂时不会引起任何体征或症状，但它们可能导致未来肿瘤的进展或复发转移。实体肿瘤中的MRD也称分子残留病灶(MolecularResidual Disease)。MRD是一种生物标志物，阳性结果意味着癌症治疗后仍可检测到残留病灶，发现残余癌细胞，代表肿瘤持续存在和临床进展的可能，患者复发风险较高，预后较差；阴性结果表示癌症治疗后未检测到残留病灶，未发现残余癌细胞，患者复发风险较低，预后较好。近年来有大量的文献报道，MRD在肺癌、结直肠癌、乳腺癌、食管癌等多种实体瘤中都有较好的预后评估价值。

血液肿瘤的MRD检测样本通常为骨髓样本(抽吸)或者外周血样本(静脉)，实体瘤的MRD检测样本通常为外周血样本或者组织样本。影像学检测方法无法及时准确的检测到残存的癌细胞或微小病灶，而基于血浆ctDNA的MRD检测可以早于传统的临床或影像学方法鉴定出疾病复发，以提供提前干预的机会。

目前采用ctDNA检测MRD主要有两大技术路线：Tumor-informed assays策略(先对原发组织进行基因检测，然后定制个性化的panel对组织检出的位点进行监控)和Tumor-naive assays策略(采用预先设计的与癌症驱动基因相关的固定panel，结合ctDNA甲基化或片段组学等多组学方法进行检测)。根据文献报道的数据，采用个性化定制panel的Tumor-informed检测路线的性能要优于采用固定化panel的Tumor-naive的路线。

在目前已经发布的MRD个性化定制的产品中，基本采用的技术路线是：对肿瘤组织进行全外显子(或者大panel)检测，筛选出后续监控的体细胞突变位点，筛选出的位点设计多重PCR引物panel，对术后的血浆样进行检测，根据检出结果判断MRD的阴阳性。

由于cfDNA是由血液中的细胞脱落凋亡而释放的DNA片段，平均大小在167bp，而来源于肿瘤细胞的ctDNA片段大小则更短，主要的片段会在150bp以下，甚至低于60bp[6]。使用多重PCR扩增来对肿瘤相关基因区域进行富集，需要确保上下游引物都能找到有比较好的序列质量，避免二聚体，发夹结构，上下游引物之间的干扰等，尤其是多重PCR反应体系中各引物对之间的影响，因此很难避免有一些位点无法设计出合适的引物。另外，对于一些片段非常短的ctDNA片段，使用PCR扩增的方式很难保证有效的扩增，对于一些含有突变序列的频率较低的短片段，存在漏检的风险，无法达到较高的cfDNA建库转化效率，降低采用多重PCR检测方法的灵敏度。此外，多重PCR的方法一般需要进行加接头的PCR和富集PCR两轮扩增，使用循环数都比较高，实验室空间难免会存在气溶胶的污染，会产生比较高的背景信号，这些都会影响低频突变的检测。根据目前公布的数据，对于认可度比较高的，使用多重PCR检测方法，在50ng左右的cfDNA投入量下，监控16个位点，能达到的检测灵敏度在0.01％，对于MRD低频突变的检测要求还存在一些挑战。

有鉴于此，特提出本申请。

发明内容

为了解决上述问题，本申请采用针对不同实体肿瘤患者的个性化定制panel对患者进行微小残留病检测：使用全外显子对肿瘤组织进行测序，通过分析特定患者组织中的特异性变异，挑选主克隆位点后，创新性的采用杂交捕获探针的方案；同时设计一个包含耐药位点、用药敏感位点的小panel，二者混合进行检测；另外，结合使用超高文库转化率的建库方法，采用超高测序深度，对肿瘤患者术后血浆中微小残留病进行监控，为肿瘤患者的手术疗效、预后判断、复发风险提供诊断信息。整体技术路线如图1所示，具体技术方案入下。

本申请首先提供一种用于检测肿瘤微小残留病的建库和捕获方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)基于受试个体的体细胞突变筛选血浆cfDNA驱动突变；

2)基于驱动突变定制杂交捕获探针；

3)血浆cfDNA的高效建库；

4)文库杂交捕获。

进一步的，所述步骤1)中的筛选为：使用全外显子对受试个体的肿瘤组织进行测序，通过分析受试个体组织中的特异性变异，挑选适于血浆评价的cfDNA驱动突变，用于后续杂交捕获。

更进一步的，所述步骤1)的具体筛选方法为：

a、使用全外显子对受试个体的肿瘤组织进行测序，基于受试个体的WES体细胞变异检测结果，过滤低复杂区域和无义突变；

b、评估样本肿瘤纯度，

c、确定非性染色体变异的肿瘤细胞含量CCF，所述CCF确定为将变异等位基因频率与样本肿瘤纯度进行整合，确定肿瘤细胞含量；

d、基于肿瘤细胞含量CCF值，判断突变是否来自主克隆；

进一步优选的，当CCF≥0.75，判断该突变来自主克隆，否则为来自亚克隆；

e、根据与数据库比对，判断突变是否为驱动突变，并确定优先级分类；

更近一步优选的，

所述数据库包括但不限于COSMIC、OncoKB和sanger CGC；

所述优先级分类为根据如下确定：

优先级1：置信度高驱动突变，包括抑癌基因的失活突变与致癌基因的激活突变；

优先级2：推测的驱动突变，包括抑癌基因与致癌基因中的普通突变或其他失活突变；

优先级3：置信度低的突变驱动突变，包括其他发生在可能是驱动基因上的非同义突变。

6)根据突变优先级，按照优先级从高到低顺序，挑选来自主克隆的驱动突变，用于后续的杂交捕获测序。

进一步的，所述步骤2)中杂交捕获探针为针对步骤1)的cfDNA驱动突变的探针。

进一步的，所述步骤3)中的高效建库包括如下步骤：

a、末端修复，根据样本浓度添加rSAP末端修复酶进行末端修复；

b、第一轮连接反应，基于Ligation 1 adaptor进行第一轮连接反应；

c、第二轮连接反应，基于Ligation 2 adaptor进行第二轮连接反应；

d、PCR扩增，基于P5/P7 PCR扩增引物对连接产物进行扩增获得文库；

进一步的，所述Ligation 1 adaptor序列由如下两条序列退火形成：

序列1:5’-ACACGACGCTCTTCCGATC分子标签(Na)-3’-aminomodifer；

序列2:5’-分子标签(Nb)GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3’；

其中，Na和Nb是8bp互补配对的固定碱基；

所述Ligation 2 adaptor序列如5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGGAGAAGGCTAG-3’所示。

进一步的，所述步骤4)中的杂交捕获包括：基于步骤3)获得的文库，添加步骤2合成的定制探针，进行杂交捕获。

进一步的，所述步骤4)中的杂交捕获探针进一步包括固定捕获探针，进一步包括基于固定捕获探针的杂交捕获，所述固定捕获探针为基于肿瘤公共数据库中与药物敏感、耐药相关的热点突变设计的捕获探针。

进一步的，所述受试个体为实体肿瘤受试个体。

本申请还提供一种应用于高通量测序检测实体瘤微小残留病的方法，其特征在于，包括上述任一所述方法，并进一步包括测序和生信分析步骤。

本申请的有益技术效果：

1)本申请采用针对不同实体肿瘤患者进行个性化定制panel的方式对患者进行微小残留病检测，该方法具有检测特异性和灵敏度高的优势，特异性可以达到95％以上；检测灵敏度，在样本水平能够实现低至0.004％的检测性能。

1)本申请结合超高转化效率的建库手段，尤其在低投入量条件下，文库建库效率能到80％以上，即使ctDNA片段较短也能连上接头完成建库，能够最大限度的保留文库中来自肿瘤细胞的信号。

2)本申请终文库的富集采用的杂交探针方法，相比于多重PCR方法，杂交探针只要有60bp以上的区域和文库分子匹配就能有效的进行捕获，因此对于较短的ctDNA片段能够更有效的富集。另外，WGS建库结合探针杂交捕获的方法，使用的PCR扩增循环数较少，减少了气溶胶污染对实验的影响，有助于检测灵敏度的提高。

3)在实际临床样本中，对于肿瘤占比低的样本，会出现组织WES检出位点偏少的情况，对应设计合成的杂交探针大小也较小(＜10kb)，捕获效率偏低，导致杂交失败。本申请在定制panel之外，设计合成了一个包含实体瘤常见耐药位点和药物敏感位点的固定小panel，与定制panel混合进行杂交捕获，既保证的了杂交panel的大小不影响杂交效率，同时能够对tumor-informed之外的热点突变进行监测，进一步提高了检测性能。

4)本申请所设计的基于体细胞突变筛选血浆cfDNA驱动突变的生信分析方法，能有效应用于本申请实体瘤微小残留病监测方法中。

附图说明

为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1、本申请整体技术路线图；

图2、血浆cfDNA高效率建库流程；

图3、不同建库效率的比较结果；

图4、本申请检测的特异性结果；

图5、本申请检测的灵敏度结果。

具体实施方式

下面将结合附图对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本申请而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。

除非在下文中另有定义，本申请具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本申请。

如本申请中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。

在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。

本申请中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。

此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本申请描述的实施方案能以不同于本申请描述或举例说明的其它顺序实施。

如下通过具体的实施例来解释本申请。

实施例1组织WES测序位点筛选方法确立

本实施例基于前期生信分析有话，确定了对WES测序后的体细胞突变进行筛选分类，挑选适合用于后续在血浆中监控的突变位点设计捕获探针的方法，具体方法步骤如下：

1)基于WES体细胞变异检测结果，过滤掉低复杂区域及无义突变，保留非同义突变；

2)基于ABSOLUTE软件进行样本肿瘤纯度评估，以及非性染色体变异的肿瘤细胞含量(Cancer Cell Fraction，CCF)计算，将变异等位基因频率与拷贝数和估计纯度进行整合确定肿瘤细胞含量。

3)根据计算在所分析的每个肿瘤区域内鉴定出的所有突变的CCF值，判断突变是否来自主克隆；基于统计分析，如果CCF(95％ CI)≥0.75，则判断该突变是来自主克隆，其他的则判断为来自亚克隆。

4)根据与主要数据库如COSMIC、OncoKB、sanger CGC等比对，判断突变是否为驱动突变。

根据如下分类方法确定驱动突变的挑选优先级：

优先级1：置信度高的驱动突变，包括抑癌基因的失活突变与致癌基因的激活突变(如终止密码子突变等)；

优先级2：推测的驱动突变，抑癌基因与致癌基因中的普通突变或其他失活突变(非发生在抑癌基因和致癌基因上)；

优先级3：置信度低的突变驱动突变，其他发生在可能是驱动基因上的非同义突变。

5)根据突变的优先级分类情况，按照优先级从低到高顺序，挑选来自主克隆的驱动突变，用于后续的杂交捕获测序。

实施例2、血浆cfDNA的高效建库方法建立

本实施例所述的高效建库方法是基于申请人前期优化确立，基础建库流程如图2所示，具体步骤如下：

1.末端修复

根据样本浓度，加入10-40ng待检测样本的cfDNA，加入LOW-TE补足体积至50μL。反应体系中末端修复酶4ul，反应buffer 6ul，总体积60ul，进行末端修复。反应体系如下：

组分	反应体积
		End Repair Buffer(Curtsmart)	6μL
End Repair enzyme(rSAP)	4μL
		cfDNA	10-40ng
LOW-TE	补至60μL

设置反应条件如下：37℃，30min，4℃，hold。

反应结束后，取出PCR管，瞬时离心，分装150μL(2.5x)已室温平衡的XP Beads至离心管中，涡旋混匀，室温孵育10min(在磁珠孵育过程中，准备后续连接试剂)。使用80％乙醇清洗一次后，室温干燥1-3min。

2.第一轮连接

向上述制备的离心管中加入30uL配置好的第一轮连接反应试剂，涡旋混匀，进行第一次连接反应。第一轮连接反应试剂体系如下：

设置反应条件如下：20℃，15min；65℃，15min；4℃，hold。

此处Ligation 1 adaptor由两条序列退火形成，具体入下

其中Na和Nb是8bp互补配对的固定碱基。

3.第二轮连接

第一轮连接反应过程中，配制第二轮连接反应体系试剂：

其中Ligation 2 adaptor序列为5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGGAGAAGGCTAG-3’。

第一轮连接反应结束后，取出PCR管，瞬时离心，分装10uL配置好的第二轮连接反应试剂，涡旋混匀，进行第二次连接反应。

设置反应条件如下：65℃，30min；4℃，hold。

第二轮连接反应结束后，取出PCR管，瞬时离心，加入100uL(2.5x)已室温平衡的PEG/NaCl溶液至离心管中，涡旋混匀，室温孵育10min。使用80％乙醇清洗一次后，室温干燥3-5min。向离心管中加入22uL无核酸酶水，室温孵育5min后，取出20ul上清。

4.PCR扩增

按照如下体系配制PCR扩增反应：

其中index P5/P7 PCR扩增引物从IDT公司购买。

PCR扩增反应条件如下：

PCR反应结束后，加入65μL(1.3X)已平衡至室温的XP磁珠进行纯化，获得cfDNA预文库。使用qubit试剂定量文库浓度，使用4200tapestation检测文库片段大小。

实施例3与传统方法的建库效果比较

样本：一例HD827标准品，投入100ng建库；一例临床cfDNA样本，投入30ng。

建库：同时使用本申请实施例2建库方法和三方N公司的商品化的cfDNA试剂盒建库方法进行建库。三方公司的建库试剂盒流程包括：末端修复、接头连接纯化、PCR扩增、文库纯化等步骤。

杂交捕获：预文库经质检合格后，依据实施例1方法，根据HD827标准品WES结果设计合成包含60个位点的探针；根据cfDNA对应组织WES结果设计合成包含40个位点的探针；同时，挑选肿瘤公共数据库中与药物敏感、耐药相关的热点突变设计合成固定小panel探针。标准品位点对应探针和组织WES对应的探针分别与包含热点突变的固定的小panel探针混合使用，按照杂交捕获试剂盒标准操作流程进行捕获。具体步骤包括：

1.预文库混合：每个文库投入500ng，标准品文库与cfDNA文库分别杂交。

2探针杂交：每个文库pool中加入5μL Human Cot DNA和2μL Bloking Oligos进行真空浓缩干燥，干燥后的文库干粉使用Hybridization Master Mix(包括8.5uLHybridization Buffer，2.7uL Hybridization Buffer Enhancer)重悬后，加入4uL杂交探针(定制化panel与固定panel等比例混合)，充分混匀后，开始杂交反应。杂交反应条件：95℃，30s；65℃，16h。

3.磁珠捕获：完成杂交后，使用Capture beads，进行两次65℃清洗，三次室温清洗，使用20uL无核酸酶水将磁珠重悬。

4.终文库PCR和产物纯化:在捕获后的文库中加入25uL HiFi HotStartReadyMix，5uL P5/P7 primer(5μM)进行PCR扩增，PCR扩增条件：

扩增后终文库使用75μL(1.5X)XP beads进行纯化后，使用30uL无核酸酶水洗脱，使用qubit试剂定量文库浓度，使用4200tapestation检测文库片段大小。

5.测序：使用illumina Novaseq 6000进行测序，生信分析。

生信分析结果如下表和图3所示，可见，本申请优化后的方法，建库效率显著优于现有商品化试剂盒，尤其在低投入量条件下，文库转化效率能到80％以上。

实施例4、本申请检测方法的检测灵敏度和特异性评价

1.标准品全外显子测序

使用horizon公司的gDNA标准品HD827作为突变样本，使用Coriell公司的野生型标准品NA12878作为野生型样本，分别进行全外显子测序。

分别对HD827和NA12878的全外显子数据进行生信分析，基于实施例1方法，以NA12878作为背景，挑选HD827中发生突变，且频率CCF在75％以上的位点。最终挑选得到60个符合要求的位点，设计并合成定制探针，与包含热点突变的固定的小panel混合使用(2ul+2ul)，对稀释的HD827进行检测。

2.HD827梯度稀释样本打断建库

使用NA12878作为阴性对照，将HD827中目的突变稀释到频率为0.006％，0.004％，0.002％等不同梯度，使用超声打断仪打断到170bp左右，进行纯化后使用qubit定量，设置不同投入量使用本申请实施例2中的高效建库方法进行建库。

稀释频率	投入量(ng)
		0.006％	20
0.004％	40、20
		0.003％	40

3.定制探针+固定探针的杂交捕获

预文库质检合格后，使用IDT公司定制的杂交捕获探针(7k大小)与包含热点突变的固定的小panel混合使用(2ul+2ul)，按照杂交捕获试剂盒标准操作流程进行捕获。

具体步骤包括：

1)预文库混合：每个文库投入500ng，4个文库混杂一个pool。

2)探针杂交：每个文库pool中加入5μL Human Cot DNA和2μL Bloking Oligos进行真空浓缩干燥，干燥后的文库干粉使用Hybridization Master Mix(包括8.5uLHybridization Buffer，2.7uL Hybridization Buffer Enhancer)重悬后，加入4Ul(2ul+2ul)杂交探针，充分混匀后，开始杂交反应。杂交反应条件：95℃，30s；65℃，16h。

3)磁珠捕获：完成杂交后，使用Capture beads，进行两次65℃清洗，三次室温清洗，使用20uL无核酸酶水将磁珠重悬。

4)终文库PCR和产物纯化:在捕获后的文库中加入25uL HiFi HotStartReadyMix，5uL P5/P7 primer(5μM)进行PCR扩增。PCR扩增条件：

5)测序：使用illumina Novaseq 6000进行测序，生信分析。每个样本文库测2G数据，测序深度可达200000X。

生信分析结果：

1)质控结果如下：

/>

2)检测特异性：

特异性评价如如图4所示，以2个位点检出作为cut-off条件下，本申请的检测特异性能够达到95％以上。

3)检测灵敏度：

灵敏度的检测结果如图5所示，在20ng投入量条件下，监控40个位点，样本水平的检出限可以达到0.004％；在40ng投入量条件下，监控35个位点，样本水平的检出限惊人的达到0.004％。

上述实验结果表明：使用本申请的技术流程，采用相应的高效建库方法，突变位点选择策略，探针设计组合条件，在20-40ng投入量条件下，在样本水平可以实现低至0.004％检测性能，效果远超现有的技术水平，适于临床推广。

前述对本申请的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本申请限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本申请的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本申请的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本申请的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims

1.一种制备肿瘤微小残留病基因文库的方法，其特征在于，所述方法由如下步骤组成：

1)基于受试个体的体细胞突变筛选血浆cfDNA驱动突变；

2)基于驱动突变定制杂交捕获探针；

3)血浆cfDNA的高效建库；

4)文库杂交捕获；

所述步骤1)的具体筛选为：

b、评估样本肿瘤纯度；

d、基于肿瘤细胞含量CCF值，判断突变是否来自主克隆；

当CCF≥0.75，判断该突变来自主克隆，否则为来自亚克隆；

所述数据库包括但不限于COSMIC、OncoKB和sanger CGC；

所述优先级分类为根据如下确定：

优先级3：置信度低的突变驱动突变，包括其他发生在可能是驱动基因上的非同义突变；

f、根据突变优先级，按照优先级从高到低顺序，挑选来自主克隆的驱动突变，用于后续的杂交捕获测序；

所述步骤4)中的杂交捕获包括：基于步骤3)获得的文库，添加步骤2)合成的定制探针，进行杂交捕获；进一步包括基于固定捕获探针的杂交捕获，所述固定捕获探针为基于肿瘤公共数据库中与药物敏感、耐药相关的热点突变设计的捕获探针。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的高效建库包括如下步骤：

b、第一轮连接反应，基于Ligation 1adaptor进行第一轮连接反应；

c、第二轮连接反应，基于Ligation 2adaptor进行第二轮连接反应；

所述Ligation 1adaptor序列由如下两条序列退火形成：

序列1:5’-ACACGACGCTCTTCCGATC分子标签Na-3’-aminomodifer；

序列2:5’-分子标签Nb-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3’；

其中，Na和Nb是8bp互补配对的固定碱基；

所述Ligation 2adaptor序列如5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGGAGAAGGCTAG-3’所示。

3.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，所述受试个体为实体肿瘤受试个体。