CN107699607A - 一种构建胎儿游离dna测序文库的试剂盒、方法及用途 - Google Patents

一种构建胎儿游离dna测序文库的试剂盒、方法及用途 Download PDF

Info

Publication number
CN107699607A
CN107699607A CN201610793220.3A CN201610793220A CN107699607A CN 107699607 A CN107699607 A CN 107699607A CN 201610793220 A CN201610793220 A CN 201610793220A CN 107699607 A CN107699607 A CN 107699607A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
pipes
kit
fetus dissociative
buffer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610793220.3A
Other languages
English (en)
Inventor
刘红彦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201610793220.3A priority Critical patent/CN107699607A/zh
Publication of CN107699607A publication Critical patent/CN107699607A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种构建胎儿游离DNA测序文库的试剂盒、方法与用途，包括各自独立包装的DNA聚合酶部分、PCR反应液部分以及引物液部分，其中引物液中含有一对特定的引物可以对胎儿游离DNA直接进行PCR扩增，确保每条染色体都有多个特定的DNA序列被扩增，覆盖基因组23对染色体，一次PCR扩增即可创建可读序列文库，整个PCR操作过程只需30分钟时间，以上扩增产物经纯化后获得的文库即可直接进行测序，大幅度简化了测序前的试验操作过程和显著降低了试验操作的技术要求，步骤简单，容易操作，普通技术人员即可操作，耗时短，效率高，所采用的试剂等材料易获得、成本低，可以广泛在基层医疗机构及欠发达地区的临床应用。

Description

一种构建胎儿游离DNA测序文库的试剂盒、方法及用途
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种构建胎儿游离DNA测序文库的试剂盒、方法及用途。
背景技术
染色体非整倍体是指相对于人的正常的46条染色体而言，细胞中的某一条或几条染色体数目增加或减少，与婴幼儿期显著的发病率和死亡率有着密切关系。非整倍体最常见的类型有常染色体21、18、13三体(又称T21、T18、T13)，性染色体有XXX、XXY、XYY，其中21三体综合征是胎儿非整倍体异常的最常见类型，每年的发病率为1/600-1/800，居染色体病发病的首位。目前21三体、18三体、13三体综合征的治疗缺乏有效方法，因此普及染色体疾病的产前筛查和产前诊断，对降低婴幼儿出生缺陷的发生有着非常重要的意义，有利于提高人口质量，实现优生优育。
目前，利用高通量测序技术对胎儿染色体非整倍体进行检测的方法相比传统方法具有明显优势。该方法只需抽取母体外周血进行检测，可以避免传统的侵入性方法可能给孕妇和胎儿带来的危害；另外直接检测母亲和胎儿的DNA序列，相比于检测血清蛋白标志物和超声波检测，准确性和灵敏度以及可靠性都大大提高。
如应用大规模平行测序技术(NGS)，通过孕妇血浆中胎儿游离DNA检测胎儿染色体非整倍体异常已经有许多报道。并且这一技术很快被其他研究得到证实。以往的研究表明，NGS通过孕妇外周血中胎儿游离DNA片段分析胎儿染色体非整倍体异常精确性可达到99％。然而，目前NGS检测胎儿非整倍体是应用非常复杂的建库准备程序，包括末端修复，接头链接，PCR预扩增，多步骤纯化和数据分析等步骤，需要有经验专业的技术人员并花费相当长的时间完成建库准备工作，又由于是对全基因组进行测序，测序结果的数据分析也比较复杂，因此存在步骤繁琐复杂，操作比较困难，时间长、效率比较低的问题，此外，专用的制备文库的试剂也非常昂贵，成本高。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的胎儿游离DNA测序文库的构建步骤繁琐复杂，操作困难，耗时长、效率低以及成本高的问题，从而提供一种简单易操作、效率高以及成本低的构建胎儿游离DNA测序文库的试剂盒、方法及用途。
为此，本发明提供了一种构建胎儿游离DNA测序文库的试剂盒，包括各自独立包装的DNA聚合酶部分、PCR反应液部分以及引物液部分；所述引物液部分含有的引物如下：
上游引物F1：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNACACAGGGAGGGTTTGC*T-3’
下游引物R1:
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCATGGTGGGAACA*T-3’。
所述的试剂盒，所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的缓冲液、dNTPs以及ddH2O；所述DNA聚合酶部分含有高保真DNA聚合酶。
所述的试剂盒，每支所述试剂盒的配方为：
引物液,10μM,0.25μL；
高保真DNA聚合酶，0.5units，0.25μL；
扩增缓冲液，5μL
dNTP，10mM，0.5μL；
ddH2O，14μL。
本发明提供了一种胎儿游离DNA测序文库的构建方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的胎儿游离DNA，备用；
(2)以步骤(1)所得的基因组DNA为模板，利用所述的试剂盒对所述基因组DNA进行PCR扩增；
(3)对步骤(2)得到的PCR扩增产物进行纯化，即得。
所述的构建方法，所述DNA模板的加入量为1～10ng配制5μL。
所述的构建方法，所述步骤(2)中，PCR扩增程序如下：初始变性98℃30s，98℃变性10s，54℃～64℃退火30s，72℃延伸30s，10～12个循环，最后72℃延伸2min，4～10℃保存，备用。
所述的构建方法，所述步骤(3)中，所述纯化步骤为：
1)向含有PCR扩增产物的PCR管中加入50X 5μL的GC buffer，混匀后涡旋离心；
2)将步骤1)中获得的混匀的液体加入到离心柱中，于13000g下离心1min；
3)弃去步骤2)离心后得到的液体，然后向每个离心柱加入500μL的wash buffer，于13000g下离心1min，后重复一次；
4)将步骤3)中的所述离心柱的盖子打开，然后在16000g下离心4min，去除washbuffer；
5)向步骤4)中的所述离心柱内加40μl的elution buffer，室温放置3min后，于13000g下离心1min，收集DNA于EP管内-20℃保存，即得。
所述的构建方法，所述步骤(1)中，所述待测样本的胎儿游离DNA的提取步骤具体包括：a)采集孕妇外周血4ml，室温于17900g下离心5min，备用；
b)向步骤a)中采集的血浆1.2ml中加入Reagent 2为15μL、磁珠30μL、Reagent 1为100μL和Lysis buffer 2ml、；
c)将步骤b)中获得的混合液的装入BD管中12r/min，混匀20min；
d)将1.5ml、2ml离心管分别编写样本号；
e)将步骤c)中混匀20min的BD管置于磁力架上，吸附磁珠后弃去上清；
f)向步骤e)中的BD管加入500μL的wash buffer I，充分混匀后弃上清；
g)向步骤f)中的BD管加入500μL的wash buffer II，充分混匀后弃上清；
h)向步骤g)中的BD管加入550μL的wash buffer III，充分混合后弃上清；
i)将步骤h)中的BD管瞬离4000g-5000g后弃去残余液体；
j)向步骤i)中的BD管中加入42μL的elution buffer，充分混匀，55℃金属浴10min；
k)将步骤j)中的BD管瞬离4000g-5000g后，将所述BD管置于磁力架，吸取上清到1.5ml离心管内，即得待测样本的胎儿游离DNA。
所述待测样本为孕妇12周以后的孕妇外周血。
本发明提供了一种检测胎儿染色体非整倍性的方法，包括如下步骤：根据上述的方法构建所述胎儿游离DNA测序文库，进行测序分析，将可读序列转换成每百万可读序列数RPM，得到Z值，定义Z值≥3为非整倍体异常，X和Y染色体的读数Log2(X/Y)比值大于1.5，为正常的XX，小于-1.5为正常的XY，比值介于-0.5到1.5之间为异常的XXY。
本发明还提供了一种所述构建胎儿游离DNA测序文库的试剂盒、所述胎儿游离DNA测序文库的构建方法以及所述检测胎儿染色体非整倍性的方法在检测胎儿染色体非整倍体异常领域的用途。
本发明技术方案，具有如下优点：
(1)本发明所述的构建胎儿游离DNA测序文库的试剂盒，包括各自独立包装的DNA聚合酶部分、PCR反应液部分以及引物液部分，其中引物液中含有一对特定的引物，利用人类基因组中广泛分布的反转录转座子(retrotransposon)序列的特性，在L1反转录转座子序列内设计一个通用引物对胎儿游离DNA(cffDNA)直接进行PCR扩增，可以针对每条染色体都有的多个相同特定的DNA序列进行扩增，确保每条染色体都有多个特定的DNA序列被扩增，以保证每条染色体都被均匀的覆盖，可以覆盖基因组23对染色体，只需进行一次PCR扩增即可创建可读序列文库，整个PCR操作过程只需30分钟时间，以上扩增产物经纯化后获得的文库即可直接进行测序，大幅度简化了测序前的试验操作过程和显著降低了试验操作的技术要求，同时也使需要分析的序列成数量级的减少，测序后共获得的可准确定位到特定染色体上的12000余个序列，其中13、18、21和X染色体的序列能够准确区分cffDNA中胎儿的染色体拷贝数，步骤简单，容易操作，普通技术人员即可操作，耗时短，效率高，所采用的试剂等材料易获得、成本低，可以广泛在基层医疗机构及欠发达地区的临床应用。
(2)本发明所述的胎儿游离DNA测序文库的构建方法，包括如下步骤：(1)提取待测样本的胎儿游离DNA，备用；(2)以步骤(1)所得的基因组DNA为模板，利用所述的试剂盒对所述基因组DNA进行PCR扩增；(3)对步骤(2)得到的PCR扩增产物进行纯化，即得；通过上述方法构建胎儿游离DNA测序文库，即可直接进行测序，大幅度简化了测序前的试验操作过程和显著降低了试验操作的技术要求，同时也使需要分析的序列成数量级的减少，测序后共获得的可准确定位到特定染色体上的12000余个序列，其中13、18、21和X染色体的序列能够准确区分cffDNA中胎儿的染色体拷贝数，进行二代测序检测染色体非整倍体的变化特征，筛查胎儿非整倍体疾病，该技术克服了以往全基因组(NGS)NIPT技术的需要全基因组序列分析的局限性，步骤简单，容易操作，普通技术人员即可操作，耗时短，效率高，所采用的试剂等材料易获得、成本低，可以广泛在基层医疗机构及欠发达地区的临床应用。
(3)本发明所述的胎儿游离DNA测序文库的构建方法，所述步骤(2)中，PCR扩增程序如下：初始变性98℃30s，98℃变性10s，54℃～64℃退火30s，72℃延伸30s，10～12个循环，最后72℃延伸2min，4～10℃保存，备用；通过上述PCR扩增程序可创建可读序列文库，整个PCR操作过程只需30分钟时间，以上扩增产物经纯化后获得的文库即可直接进行测序，步骤简单，容易操作，普通技术人员即可操作，耗时短，效率高，所采用的试剂等材料易获得、成本低，可以广泛在基层医疗机构及欠发达地区的临床应用。
(4)本发明所述的检测胎儿染色体非整倍性的方法，利用人类基因组中广泛分布的反转录转座子序列的特性，在L1反转录转座子序列内设计一对通用引物，运用这一引物对(胎儿游离DNA)cffDNA直接进行PCR扩增便可创建可读序列文库进行二代测序检测染色体非整倍体的变化特征，筛查胎儿非整倍体疾病，克服了以往全基因组(NGS)NIPT技术的需要全基因组序列分析测序数据量大分析较麻烦，检测费用相对较高，需要专门的且价格高昂的试剂，对技术条件和操作人员要求均较高等问题，由于其花费大、耗时长、实验操作复杂，限制了NIPT在基层医疗机构及欠发达地区的临床应用，而本发明的方法大幅度简化了操作步骤和降低技术要求，具有快速、省时、低成本、高通量、操作简单和灵敏性高等优点，弥补了现有NIPT技术存在的花费大、耗时、试验操作复杂等缺陷，且该方法对21、18、13号染色体非整倍体的检测灵敏性达100％，运用本方法建立的目的区域扩增结合靶向序列测序的无创产前检测胎儿非整倍体的技术与运用全基因组无创产前检测技术实验结果一致，证明了本方法的精准性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例2中的PCR扩增产物的电泳图谱；
图2是本发明效果例2的测序分析覆盖范围图；
图3是本发明效果例2的特异序列的聚类分析图(常染色体)(根据定位在每个染色体区域z-score，制作的热图heatmap)；
图4是本发明效果例2的特异序列的聚类分析图(性染色体)(根据定位在每个染色体区域z-score，制作的热图heatmap)。
具体实施方式
本发明所使用的主要试剂如下：
dNTPs生产厂家为Life technologies，型号为Catalog number:R7250；
高保真DNA聚合酶生产厂家为New England Biolabs，型号为Catalog#:M0491S；
琼脂糖生产厂家为sigma，型号为V900510。
6x Glycerol Gel Loading Dye I(BPB)生产厂家为上海生工,型号为B548316,
5x TBE buffer生产厂家上海生工，型号为B548102-0500；
EB染色试剂盒生产厂家为上海生工，型号为E607322-0100；
本发明所使用的主要设备如下：
离心机生产厂家为eppendorft，型号为_5804R；
电泳仪生产厂家为北京六一仪器厂，型号为：DYY6C型；
水平电泳槽生产厂家为BioExpress，型号为E-4110-1；
凝胶成像系统生产厂家为北京六一仪器厂，型号为WD-9430C；
微波炉生产厂家为Galanz，型号为P70D20P(WO)；
微量进样器生产厂家eppendroft,型号为10μL，100μL，
实施例1
本实施例所述的构建胎儿游离DNA测序文库的试剂盒，包括各自独立包装的DNA聚合酶部分、PCR反应液部分以及引物液部分；所述引物液部分含有的引物如下：
上游引物F1：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNACACAGGGAGGGTTTGC*T-3’；
下游引物R1:
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCATGGTGGGAACA*T-3’。
每支所述试剂盒的配方为：
引物液,10μM,0.25μL；
高保真DNA聚合酶，0.5units，0.25μL；
扩增缓冲液，5μL
dNTP，10mM，0.5μL；
ddH2O，14μL。
本实施例还提供了利用上述试剂盒构建胎儿游离DNA测序文库的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的胎儿游离DNA，所述待测样本的胎儿游离DNA的提取步骤具体包括：a)采集孕妇外周血4ml，室温于17900g下离心5min，备用；
b)向步骤a)中采集的血浆1.2ml中加入Reagent 2为15μL、磁珠30μL、Reagent 1为100μL和Lysis buffer 2ml；
c)将步骤b)中获得的混合液的装入BD管中以12r/min进行旋转，混匀20min；
d)将1.5ml、2ml离心管分别编写样本号；
e)将步骤c)中混匀20min的BD管置于磁力架上，吸附磁珠后弃去上清；
f)向步骤e)中的BD管加入500μL的wash buffer I，充分混匀后弃上清；
g)向步骤f)中的BD管加入500μL的wash buffer II，充分混匀后弃上清；
h)向步骤g)中的BD管加入550μL的wash buffer III，充分混合后弃上清；
i)将步骤h)中的BD管瞬离4000g-5000g后弃去残余液体；
j)向步骤i)中的BD管中加入42μL的elution buffer，充分混匀，55℃金属浴10min；
k)将步骤j)中的BD管瞬离4000g-5000g后，将所述BD管置于磁力架，吸取上清到1.5ml离心管内，即得待测样本的胎儿游离DNA，备用；
(2)以步骤(1)所得的基因组DNA为模板，所述DNA模板的加入量为1-10ng配制5μL，利用上述的试剂盒对所述基因组DNA进行PCR扩增；
PCR扩增程序如下：初始变性98℃30s，98℃变性10s，54℃～64℃退火30s，72℃延伸30s，10～12个循环，最后72℃延伸2min，4～10℃保存，备用；
(3)对步骤(2)得到的PCR扩增产物进行纯化，所述纯化步骤为1)向含有PCR扩增产物的PCR管中加入50X 5μL的GC buffer，混匀后涡旋离心；
2)将步骤1)中获得的混匀的液体加入到离心柱中，于13000g下离心1min；
3)弃去步骤2)离心后得到的液体，然后向每个离心柱加入500μL的wash buffer，于13000g下离心1min，后重复一次；
4)将步骤3)中的所述离心柱的盖子打开，然后在16000g下离心4min，去除washbuffer；
5)向步骤4)中的所述离心柱内加40μl的elution buffer，室温放置3min后，于13000g下离心1min，收集DNA于EP管内-20℃保存，即得。
本实施例提供了一种检测胎儿染色体非整倍性的方法，包括如下步骤：根据上述的方法构建所述胎儿游离DNA测序文库，进行测序分析，将可读序列转换成每百万可读序列数RPM，得到Z值，定义Z值≥3为非整倍体异常，X和Y染色体的读数Log2(X/Y)比值大于1.5，为正常的XX，小于-1.5为正常的XY，比值介于-0.5到1.5之间为异常的XXY。
实施例2
本实施例所述的构建胎儿游离DNA测序文库的试剂盒，包括各自独立包装的DNA聚合酶部分、PCR反应液部分以及引物液部分；所述引物液部分含有的引物如下：
上游引物F1：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNACACAGGGAGGGTTTGC*T-3’；
下游引物R1:
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCATGGTGGGAACA*T-3’。
每支所述试剂盒的配方为：
引物液,10μM，0.25μL；
高保真DNA聚合酶，0.5units，0.25μL；
扩增缓冲液，5μL
dNTP，10mM，0.5μL；
ddH2O，14μL。
本实施例还提供了利用上述试剂盒构建胎儿游离DNA测序文库的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的胎儿游离DNA，所述待测样本的胎儿游离DNA的提取步骤具体包括：a)采集孕妇外周血4ml，室温于17900g下离心5min，备用；
b)向步骤a)中采集的血浆1.2ml中加入Reagent 2为15μL、磁珠30μL、Reagent 1为100μL和Lysis buffer为2ml、；
c)将步骤b)中获得的混合液的装入BD管中按12r/min旋转，混匀20min；
d)将1.5ml、2ml离心管分别编写样本号；
e)将步骤c)中混匀20min的BD管置于磁力架上，吸附磁珠后弃去上清；
f)向步骤e)中的BD管加入500μL的wash buffer I，充分混匀后弃上清；
g)向步骤f)中的BD管加入500μL的wash buffer II，充分混匀后弃上清；
h)向步骤g)中的BD管加入550μL的wash buffer III，充分混合后弃上清；
i)将步骤h)中的BD管瞬离4000g-5000g后弃去残余液体；
j)向步骤i)中的BD管中加入42μL的elution buffer，充分混匀，55℃金属浴10min；
k)将步骤j)中的BD管瞬离4000g-5000g后，将所述BD管置于磁力架，吸取上清到1.5ml离心管内，即得待测样本的胎儿游离DNA，备用；
(2)以步骤(1)所得的基因组DNA为模板，所述DNA模板的加入量为1-10ng配制5μL，利用上述的试剂盒对所述基因组DNA进行PCR扩增；
PCR扩增程序如下：初始变性98℃30s，98℃变性10s，54℃～64℃退火30s，72℃延伸30s，10～12个循环，最后72℃延伸2min，4～10℃保存，备用；
将步骤(2)获得的PCR扩增产物进行电泳，得到电泳图谱，所述凝胶电泳包括如下步骤：
所述凝胶电泳体系包括：电泳仪(DYY6C型，北京六一仪器厂)，电泳槽(E-4110-1，BioExpress)，紫外透射反射仪(WD-9430C，北京六一仪器厂)，微波炉(Galanz)，微量进样器(eppendroft)，琼脂糖(V900510，sigma)，6x Glycerol Gel Loading Dye I(BPB)(B548316,上海生工),5x TBE buffer(B548102-0500,上海生工)，EB染色试剂盒(E607322-0100，上海生工)
所述凝胶电泳的具体步骤：
A)将琼脂糖胶放入电泳槽内加入电泳缓冲液；
B)取步骤(2)的PCR扩增产物与6X Glycerol Gel Loading Dye I按5：1混匀后，用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加6μL；
C)电泳，调电压至200V，电泳20min-30min，当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳；
D)取出凝胶，在凝胶成像系统下观察并拍照。
由上述步骤所得的电泳图谱，如图1所示，M为分子量标准，在230bp位置可以见到微弱的目的条带，验证了本发明的试剂盒可以对待测样本的胎儿游离DNA中的特定片段进行扩增。
效果例
本实施例分别取已知染色体异倍体的样本10ng与正常二倍体染色体的样本10ng进行混合配制，混合后异倍体DNA含量分别为1％、5％、10％和15％，以上述混合物为DNA模板，以实施例1中的试剂盒对所述基因组DNA进行PCR扩增，然后对所述扩增产物进行纯化，扩增产物纯化后进行二代测序，采用DNASTAR分析软件(Lasergene Genomics Suite 12,DNASTAR)对测序结果进行序列分析，结果显示成功检测出23对染色体目的区域，测序分析覆盖范围见图2。低于10次的可读序列被筛除，平均测序深度为510X(58-1066)，共获得可定位到基因组内序列12232个，采用Z分数的算法，以确定结果是否有染色体异常，首先将可读序列转换成RPM(每百万可读序列数)，然后计算Z值，定义的Z值≥3会被认定为三体，见图3，该图表明，本发明方法可以检测到三体，而且，如果将两个甚至三个不同的三体样本混合起来，这种检测方法仍可以同时检测到这几种三体。研究显示这种检测体系可以检测到≥10％的胎儿DNA的浓度。为了确定性别染色体异常，将女性样本作为对照，X和Y染色体的读数Log2(X/Y)比值大于1.5，认定为正常的XX，小于-1.5认定为正常的XY，-0.5与1.5之间认定为异常的XXY，见图4。
综上结果显示，应用本发明构建的胎儿游离DNA测序文库进行检测胎儿染色体非整倍性的方法，已知异倍体有效样本15例，准确检出15例染色体非整倍体样本：3例T21，3例T18，1例T13,1例混合T21+T18+T13，1例T21+T13，1例T21+T18，3例XXY，2例XYY。该方法对21、18、13号染色体非整倍体的检测灵敏性100％，运用本发明的方法与运用全基因组无创产前检测技术实验结果一致，证明了本技术的精准性，与以往的NIPT技术相比，所具有的优点和积极效果还包括：1、操作简单：该技术仅需要简单的技术培训，具有基本的实验室技能的技术人员均能完成本实验流程。2、节省成本：此技术采用市场上常用试剂，可显著降低成本开支。3、易推广：本技术的简单性、无创、快速、低成本性预示着随着临床数据的积累，有利于在中等风险及低风险孕妇人群中应用，有利于NIPT技术在基层医疗机构及偏远欠发达地区的临床广泛开展。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种构建胎儿游离DNA测序文库的试剂盒，其特征在于，包括各自独立包装的DNA聚合酶部分、PCR反应液部分以及引物液部分；所述引物液部分含有的引物如下：
上游引物F1：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACAC GACGCTCTTCCGATCTNNNNACACAGGGAGGGTTTGC*T-3’；
下游引物R1:
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGT TCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCATGGTGGGAACA*T-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的缓冲液、dNTPs以及ddH2O；所述DNA聚合酶部分含有高保真DNA聚合酶。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，每支所述试剂盒的配方为：
引物液,10μM，0.25μL；
高保真DNA聚合酶，0.5units，0.25μL；
扩增缓冲液，5μL
dNTP，10mM，0.5μL；
ddH2O，14μL。
4.一种胎儿游离DNA测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)从外周血血浆提取待测样本的胎儿游离DNA，备用；
(2)以步骤(1)所得的基因组DNA为模板，利用权利要求1-3任一所述的试剂盒对所述基因组DNA进行PCR扩增；
(3)对步骤(2)得到的PCR扩增产物进行纯化，即得。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述DNA模板的加入量为1-10ng配制5μL。
6.根据权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增程序如下：初始变性98℃30s，98℃变性10s，54℃～64℃退火30s，72℃延伸30s，10～12个循环，最后72℃延伸2min，4～10℃保存，备用。
7.根据权利要求4-6任一项所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述纯化步骤为：
1)向含有PCR扩增产物的PCR管中加入50×5μL的GC buffer，混匀后涡旋离心；
2)将步骤1)中获得的混匀的液体加入到离心柱中，于13000g下离心1min；
3)弃去步骤2)离心后得到的液体，然后向每个所述离心柱加入500μL的wash buffer，于13000g下离心1min，后重复一次；
4)将步骤3)中的所述离心柱的盖子打开，然后在16000g下离心4min，去除washbuffer；
5)向步骤4)中的所述离心柱内加40μL的elution buffer，室温放置3min后，于13000g下离心1min，收集DNA于EP管内-20℃保存，即得。
8.根据权利要求4-7任一项所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述待测样本的胎儿游离DNA的提取步骤具体包括：
a)采集孕妇外周血4mL，室温于17900g下离心5min，备用；
b)向步骤a)中采集的血浆1.2mL中加入Reagent 2为15μL、磁珠30μL、Reagent 1为100μL和Lysis buffer 2mL、；
c)将步骤b)中获得的混合液的装入BD管中12r/min，混匀20min；
d)将1.5ml、2ml离心管分别编写样本号；
e)将步骤c)中混匀20min的BD管置于磁力架上，吸附磁珠后弃去上清；
f)向步骤e)中的BD管加入500μL的wash buffer I，充分混匀后弃上清；
g)向步骤f)中的BD管加入500μL的wash buffer II，充分混匀后弃上清；
h)向步骤g)中的BD管加入550μL的wash buffer III，充分混合后弃上清；
i)将步骤h)中的BD管瞬离4000g-5000g后弃去残余液体；
j)向步骤i)中的BD管中加入42μL的elution buffer，充分混匀，55℃金属浴10min；
k)将步骤j)中的BD管瞬离4000g-5000g后，将所述BD管置于磁力架，吸取上清到1.5ml离心管内，即得待测样本的胎儿游离DNA。
9.一种检测胎儿染色体非整倍性的方法，其特征在于，包括如下步骤：根据权利要求4-8任一项所述的方法构建所述胎儿游离DNA测序文库，进行测序分析，将可读序列转换成每百万可读序列数RPM，得到Z值，定义Z值≥3为非整倍体异常，X和Y染色体的读数Log2(X/Y)比值大于1.5，为正常的XX，小于-1.5为正常的XY，比值介于-0.5到1.5之间为异常的XXY。
10.一种权利要求1-3任一项所述的试剂盒、权利要求4-8任一项所述的构建方法以及权利要求9所述的方法在检测胎儿染色体非整倍体异常领域的用途。
CN201610793220.3A 2016-08-31 2016-08-31 一种构建胎儿游离dna测序文库的试剂盒、方法及用途 Pending CN107699607A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610793220.3A CN107699607A (zh) 2016-08-31 2016-08-31 一种构建胎儿游离dna测序文库的试剂盒、方法及用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610793220.3A CN107699607A (zh) 2016-08-31 2016-08-31 一种构建胎儿游离dna测序文库的试剂盒、方法及用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107699607A true CN107699607A (zh) 2018-02-16

Family

ID=61168964

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610793220.3A Pending CN107699607A (zh) 2016-08-31 2016-08-31 一种构建胎儿游离dna测序文库的试剂盒、方法及用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107699607A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108504653A (zh) * 2018-04-12 2018-09-07 东莞博奥木华基因科技有限公司 一种母体外周血血浆快速分离方法及其应用
CN109628567A (zh) * 2018-12-28 2019-04-16 国家卫生计生委科学技术研究所 一种用于检测胎儿染色体非整倍性的无创性产前检测系统

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104293783A (zh) * 2014-09-30 2015-01-21 天津诺禾致源生物信息科技有限公司 适用于扩增子测序文库构建的引物、构建方法、扩增子文库及包含其的试剂盒
CN104350158A (zh) * 2012-03-26 2015-02-11 约翰霍普金斯大学 快速非整倍性检测

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104350158A (zh) * 2012-03-26 2015-02-11 约翰霍普金斯大学 快速非整倍性检测
CN104293783A (zh) * 2014-09-30 2015-01-21 天津诺禾致源生物信息科技有限公司 适用于扩增子测序文库构建的引物、构建方法、扩增子文库及包含其的试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
邓宇: "《动物疫病分子诊断技术》", 31 December 2013, 四川大学出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108504653A (zh) * 2018-04-12 2018-09-07 东莞博奥木华基因科技有限公司 一种母体外周血血浆快速分离方法及其应用
CN109628567A (zh) * 2018-12-28 2019-04-16 国家卫生计生委科学技术研究所 一种用于检测胎儿染色体非整倍性的无创性产前检测系统

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105695567B (zh) 一种用于检测胎儿染色体非整倍体的试剂盒、引物和探针序列及检测方法
CN107541791A (zh) 血浆游离dna甲基化检测文库的构建方法、试剂盒及应用
CN109825586B (zh) 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法
CN107190064B (zh) 检测22个位点耳聋基因多态性的SNaPshot试剂盒
CN109504780B (zh) 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法
CN109777877B (zh) 基于ptbp1甲基化辅助诊断脑动脉瘤的检测试剂盒及其应用
CN104711362A (zh) 一种利用囊胚期胚胎细胞进行胚胎染色体异常检测的方法
CN115786459B (zh) 一种应用于高通量测序检测实体瘤微小残留病的方法
WO2021128659A1 (zh) 特异性引物探针组合及其适于血液直接扩增结合荧光pcr法检测叶酸代谢能力基因的应用
CN107955836A (zh) 用于肺癌相关基因shox2甲基化检测的引物对、试剂盒及方法
CN112280865A (zh) 一种用于检测肝癌的试剂组合，试剂盒及其用途
CN108220453A (zh) 一种无创产前亲权鉴定方法及其试剂盒
WO2015196752A1 (en) A method and a kit for quickly constructing a plasma dna sequencing library
CN107699607A (zh) 一种构建胎儿游离dna测序文库的试剂盒、方法及用途
Li et al. The cornerstone of integrating circulating tumor DNA into cancer management
CN105802969A (zh) lncRNA ENST00000581794.1及制剂或诊断剂或药物或试剂盒和应用
CN103911439A (zh) 系统性红斑狼疮羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法和应用
KR102559124B1 (ko) Flt3 유전자 증폭용 조성물 및 이의 용도
CN110923306A (zh) 基于数字pcr无创产前检测胎儿21-三体综合征的引物、探针、试剂盒及方法
CN112410414B (zh) 孕妇血清外泌体miRNA标志物在制备胎儿先心病早期诊断产品中的应用及试剂盒
CN111944893B (zh) 与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物及其应用
CN110951857B (zh) 基于数字pcr无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的方法及试剂盒
CN112899358A (zh) 一种无创产前胎儿染色体非整倍体的检测方法及其试剂盒
CN107190073B (zh) hsa_circRNA_104907在唐氏综合征的诊断、治疗及预后中的应用
CN107190074B (zh) hsa_circRNA_103127在唐氏综合征的诊断、治疗及预后中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180216