CN107190064B - 检测22个位点耳聋基因多态性的SNaPshot试剂盒 - Google Patents
检测22个位点耳聋基因多态性的SNaPshot试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种检测多种耳聋基因多态性的SNaPshot试剂盒，检测的耳聋基因多态性位点包括GJB2基因位点rs80338939、rs80338942、rs80338943、rs111033204、176_191del16、c.35dupG、508_511dupAACG；GJB3基因rs74315318、rs74315319；SLC26A4基因rs111033220、rs201562855、rs111033305、rs192366176、rs111033318、rs121908362、rs121908363、rs200455203、rs111033380、rs111033313、c.281C>T；线粒体DNArs267606619、rs267606617。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学诊断领域和遗传病领域。具体地，本发明提供了一种检测多种耳聋基因多态性的SNaPshot试剂盒。
背景技术
先天性耳聋是最常见的出生缺陷之一，也是最常见的人类感觉系统疾病，发病率为 0.1％-0.3％。60％的耳聋与遗传因素相关。在这些遗传因素中，主要包括GJB2、SLC26A4、GJB3 基因和线粒体DNAm.1555A>G和m.1494C>T位点。在中国新生儿耳聋基因突变筛查中，GJB2 基因突变具有较高的携带率，约2.6％，SLC26A4基因突变携带率约为1.9％，新生儿线粒体 DNA m.1555A>G均质突变占0.1％，GJB3基因突变仅在少数患者中发现。
GJB2基因编码的Cx26表达于耳蜗，位于内耳血管纹、基底膜和螺旋缘，与先天性遗传性中重度耳聋相关，GJB2基因突变后，K+进入内淋巴液的循环受到影响，导致常显或常隐感音神经性耳聋(DFNB1或DFNA3)。
GJB3基因编码的Cx31是缝隙连接蛋白的一员，在耳蜗和听神经内表达，突变可导致常显或常隐非综合性耳聋、周围神经疾病伴听力丧失。
SLC26A4基因主要引起中国人大前庭水管综合征，可结合颞骨CT进行检测。此病出生时听力可能正常，或有轻度至中重度的听力损失，因堕床、儿童玩耍或体育活动中的轻度碰撞或感冒可以造成明显的听力下降，其临床表现与发病年龄、耳聋程度以及是否伴有眩晕有密切的关系。
线粒体DNA突变为母系遗传，线粒体DNA m.1494C＞T、m.1555A＞G与氨基糖甙类药物致聋和非综合征型耳聋有关。
中国不同地区的非综合征型耳聋患者中，各基因的突变比例有所差异，主要突变基因为 GJB2基因，SLC26A4基因和线粒体DNA m.1555A>G和m.1494C>T位点，GJB3基因突变仅在少数患者中发现，GJB2基因主要突变方式为c.235delC，约占GJB2基因突变的63.6-76.8％，其次是c.299_300delAT和c.176_191del16约占8.7％-13.1％，c.508_511dupAACG约占 4.3％-6.3％。SLC26A4基因的主要突变为c.2168A>G和c.919-2A>G，约占SLC26A4基因突变的77.1％-84.67％，c.1975G>C和c.2162C>T等分别约占1％-2.5％。线粒体DNA耳聋基因主要突变为m.1555A>G，m.1494C>T。
由于其他测序检测方法多存在准确度，特异性，精密度不足的问题，目前的耳聋基因多态性检测一般仍然采用sanger法进行，其一次实验中仅能检测一个位点，而且花费时间较长。这种困难造成的耳聋基因多态性检测，特别是能覆盖广泛耳聋基因多态性位点的筛查难以普及，即使在北京，上海等城市，新生儿免费耳聋基因筛选也仅覆盖两个GJB2和SLC26A4 位点，需要自费数百元的进一步筛查也仅多4个位点，这样的筛查无疑会遗漏大量潜在的遗传性耳聋患者，对其今后的保健和治疗带来不利影响。此外，上述检测手段的局限也使得遗传病相关科研工作难以大规模开展。
Snapshot通过为不同位点设计不同长度的引物进行Snapshot反应，产物经电泳分离，荧光检测，Gene mapper分析，可一次性检测多个SNP位点，而且每次反应中仅需极少量DNA 样本。比一般PCR方法复杂的是，Snapshot检测体系，特别是多重Snapshot检测体系设计中需要考虑的因素众多：引物长度，Tm值，尾部结构选择，以及模板和引物的比例都可能造成非特异性扩增和随后的碱基误读。设计可靠的多重Snapshot检测体系需要对引物设计进行缜密考虑，大量验证并进行相应调整。
目前将该检测技术应用于耳聋SNP位点检测的实例仅有CN 103911452 A和CN102618624 A，前者的检测对象包括GJB2基因35、109、176-199、235、299-300位点，SLC26A4基因 1174、1226、1229、1975、2027、2162、2168、IVS7-2位点、线粒体DNA1494、1555、3243、7444位点的突变。后者的检测对象包括GJB2基因235、299-300位点，SLC26A4基因2168、IVS7-2位点，线粒体DNA1555、3243、7445位点。两者均已经获得授权。但仍有部分耳聋相关SNP位点，如c.508_511dupAACG,SLC26A4-919-2，GJB3的GJB3-547、538位点等没有被覆盖，其中的c.508_511dupAACG,SLC26A4-919-2还是我国人群中出现率较高的突变位点。设计能囊括更广泛耳聋相关位点，特别是现有的试剂盒未涉及的位点的Snapshot试剂盒，对于遗传性耳聋的预防和科研具有重要意义。
发明内容
本发明利用Snapshot技术一次性检测多个耳聋基因多态性位点，速度快并且节约时间和费用。可以检测到80％以上中国遗传性非综合征型耳聋人群，有助于及早发现携带耳聋基因突变的患儿(包括迟发性听力缺陷患儿)，为后期的诊断及治疗提供科学依据，有助于及时采取干预措施预防言语障碍的发生，有效地降低聋哑发病率。
一方面，本发明提供了一种检测多种耳聋基因多态性的SNaPshot试剂盒，检测的耳聋基因多态性位点包括GJB2基因位点rs80338939、rs80338942、rs80338943、rs111033204、 176_191del16、c.35dupG、508_511dupAACG；GJB3基因rs74315318、rs74315319；SLC26A4 基因rs111033220、rs201562855、rs111033305、rs192366176、rs111033318、rs121908362、 rs121908363、rs200455203、rs111033380、rs111033313、c.281C>T；12s rRNA基因(线粒体DNA)rs267606619、rs267606617。
进一步地，试剂盒中包含检测这些多态性位点的扩增引物和测序引物。
进一步地，扩增引物分为二管，其中管1的扩增引物一共有五对，分别为：
其中管2的扩增引物一共有六对，分别为：
进一步地，测序引物分为二管，其中管1的测序引物一共有12组，分别为：
其中管2的测序引物一共有10组，分别为：
进一步地，扩增引物在进行扩增时，扩增试剂比例如下：
其中，扩增引物的比例均为1：1；
进一步地，扩增产物在进行微测序时，测序试剂比例如下：
| 试剂 | 体积(μL) |
| SNaPshot Ready Mix | 1.25 |
| ddH<sub>2</sub>O | 4.25 |
| 5倍稀释的测序缓冲液 | 1.5 |
| 引物混合物 | 2 |
| total | 9.0 |
进一步地，扩增产物在进行微测序时，测序引物浓度比例如下：
管1各测序引物的浓度:
管2各测序引物的浓度:
| 引物名称 | 终浓度(pmol) | |
| 测序引物 | SNE1-DFN-235delC | 0.15 |
| 测序引物 | SNE1-DFN-delAT | 0.2 |
| 测序引物 | SNE1-DFN-dupAACG | 0.6 |
| 测序引物 | SNE4-SLC26A4-589 | 0.4 |
| 测序引物 | SNE4-SLC26A4-919-2 | 2 |
| 测序引物 | SNE3-SLC26A4-1707+5 | 0.5 |
| 测序引物 | SNE3-SLC26A4-2027 | 0.2 |
| 测序引物 | SNE3-SLC26A4-1975 | 0.4 |
| 测序引物 | SNE3-SLC26A4-2168 | 0.2 |
| 测序引物 | SNE3-SLC26A4-2162 | 0.6 |
进一步地，该试剂盒使用方法包括步骤：
DNA提取；
扩增产物纯化；
延伸产物纯化；
测序分析。
附图说明
图1、2分别为几个位点的Snapshot检测实例。
图3为扩增片段sanger测序实例。
图4为两管中的Snapshot检测结果实例(阴性)。
具体实施方式
实施例1 检测过程
1.检测的具体实施过程
1.1 DNA提取
以人血的采集样本进行DNA提供，具体参考公司有关《血液基因组DNA提取标准操作流程》，提取完毕的DNA计算其浓度并稀释至5-10μg/mL。
1.2 试剂准备
a)配置二倍的Master Mix，这其中包括dNTP、MgCl2、热启动超保真DNA聚合酶、缓冲液，室温融化后，短暂离心；准备好合适数量的PCR反应管。
b)配制引物混合物：各引物的比例均为＝1:1，震荡混匀；短暂离心后备用。
c)反应体系配制
d)震荡混匀，短暂离心后，分装23μL至标记好的PCR反应管。转移至标本制备区。
1.3 加样
a)若样品及质控品保存在-20℃，使用前置室温解冻，并短暂离心。
b)向分装好的PCR反应管中加入10ngDNA模板，并进行稀释。
c)盖好管盖后，震荡混匀，短暂离心，转移至PCR扩增区。
1.4 PCR扩增
置PCR管放于PCR仪上。反应程序设置如下：
95℃5min；95℃30s；55℃30s；72℃1min；45个循环；72℃5min；25℃保温；
1.5 PCR扩增产物纯化
取2ul的ExoSAP-IT分装到200ul EP管，每管加入PCR产物5ul，混匀微离，按以下程序进行PCR：7ul 37℃15min；80℃15min；4℃forever
1.6 SNaPshot PCR扩增
a)反应结束后取出8连管，配制引物混合物，比例如下：
b)按以下体系配置：
| 试剂 | 体积(μL) |
| SNaPshot Ready Mix | 1.25 |
| ddH<sub>2</sub>O | 4.25 |
| 5倍稀释的测序缓冲液 | 1.5 |
| 引物混合物 | 2 |
| total | 9.0 |
c)对纯化后2管的扩增产物分别进行Snapshot延伸，加入1ul纯化产物，混匀微离，按以下程序进行PCR：96℃10s；96℃10s；50℃5s；60℃30s；25个循环；4℃保温；
1.7 SNE产物纯化
a)往SNaPshot PCR产物中加入FastAP 1ul、buffer2ul、7ul水、10ulSNaPshot PCR产物，按以下程序进行PCR：
b)37℃10min；75℃5min；1个循环；4℃保温；
1.8 电泳
SAP处理完的产物1ul+8.8ul HiDi+0.2ul 120Liz 95℃变性3min，冰上冷却，上机.
2.结果分析与解释
2.1 结果分析方法
分析采用GENEMAPPERID V4.1软件进行初步分析，确定SNP位点。
分析完毕的结果需要保存，GENEMAPPERID V4.1软件文件格式及SNaPshot峰图各保存一份。
2.2 结果分析
GeneMapper4.1软件分析，结果如附图1。
3.QC规则
本检测共设立两个质控，质控判断标准参考检测SOP：
1.POS，为阳性对照，一般选择1或多个位点为杂合突变的样本。
2.NTC，为无模板对照。
4.引物特异性
1)本发明所设计的所有引物的扩增片段均覆盖了相应的检测位点，无其它同源基因，详细信息参考附表2；
2)本发明使用扩增引物分别对检测样本进行扩增，并采用Sanger测序法进行测序，测序结果显示，各引物扩增片段与基因参考序列吻合(见附表3，仅显示部分结果)。
3)本发明使用SNaPshot测序引物对相应的扩增产物进行微测序，测序结果显示，各产物峰的相对位置及测序反应掺入的碱基与预期相符，且无其它干扰峰(见附表4，仅显示部分结果)。
5.准确度
本检测准确度定义为本检测方法检测结果同其它实验室或已知结果的一致性。
本申请共纳入64例DNA样本，采用SNaPshot测序法进行检测，检测结果见表3。所有检测结果均符合预期，计算得到本检测准确度为100％。
备注：
1.样本R377由本实验室完成检测，检测结果与CAP返回结果一致，结果可见CAP结果报告页；
2.其他样本的已知结果是指采用Sanger测序法确定的结果。
3.NMD＝NO MUTATION DETECTED.
表3准确度实验数据表
6.检测特异性及检测灵敏度
本申请检测的检测特异性定义为阴性符合率，检测灵敏度定义为阳性符合率。
本检测使用的引物对64例样本进行检测，所有DNA样本均同其它实验室结果或由认证组织进行评估，详细结果见表3。检测结果为阴性(耳聋基因22位点均未检测到突变)的样本完全一致，本检测的检测特异性为100％。检测结果为阳性(耳聋基因22位点任意一位点检测到突变或均检测到突变，均认为此样本为突变阳性)的样本完全一致，突变位点及类型也完全一致，本检测的检测灵敏度为100％。
表4检测特异性及检测灵敏度
7.精密度
本检测的精密度定义为对标本进行重复检测得到同一结果的能力。
7.1 批内精密度
本检测对2例阳性样本(其中DFN-POS-1已知结果为GJB2:c.235delC；DFN-POS-2已知结果为12SrRNA:m.1555A>G)进行了3复孔检测，结果显示，同一样本不同孔间的检测结果一致。本检测的批内精密度为100％。
表5批内精密度
7.2 批间精密度(Precision-Between Runs)
本检测对2例阳性样本(其中DFN-POS-1已知结果为GJB2:c.235delC；DFN-POS-2已知结果为12SrRNA:m.1555A>G)进行了四次检测。同一样本不同批次的检测结果一致。本检测批内精密度为100％。
表6批间精密度
注：I：仪器编号；T：技术员
上述数据证明了本申请方法。准确性、特异性均可以满足检测要求，可以在临床上替代 Sanger测序法。
本申请的方法通过科学设计和搭配引物分组，实现了在两个反应管中全面检测大部分耳聋基因突变，可以以不高于现有方法的成本检测比现有方法多得多的位点(2-4个：22个)，也比现有专利技术进步明显(CN 103911452 A 17个：22个，其中包含了c.508_511dupAACG, SLC26A4-919-2，GJB3的GJB3-547、538位点等CN 103911452 A中遗漏的位点)具有良好的市场价值和重要的医学意义。
附表:引物扩增片段
SEQUENCE LISTING
<110> 金域
<120> 检测22个位点耳聋基因多态性的SNaPshot试剂盒
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gagaagtctc cctgttctgt cc 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acaaagcagt ccacagtgtt g 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cctgttcagc ctcatcttca ag 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgttattgcc tgggtctgga t 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gacgttaggt caaggtgtag cc 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gccaggtttc aatttctatc g 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cccaaatacc gagtcaagga at 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tctcaatctg ccaacatctt acc 23
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gttgtcatcc agtctcttcc ttag 24
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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agccttcctc tgttgccatt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gagaagtctc cctgttctgt cc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
acaaagcagt ccacagtgtt g 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tctcgtatcc agcagcaatg 20
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gggttccagg aaattacttt gt 22
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
aattgtggta agtagaatat gtagttagaa 30
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aaggagtatc agtgaaatga agct 24
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ttctatggca atgtcgatgg tt 22
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ctacacaaag ggaagagggt cta 23
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gaactctgag cttccagtca a 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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gcccatgtat ttgccctgtt 20
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tggagcaatg cgggttctt 19
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cttgagattt cacttggttc tgtag 25
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gagtgtttgt tcacaccccc 20
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ttttttttcg actttgtctg caacaccc 28
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tttttttttt ttttttctgc aacaccctgc agccag 36
<210> 26
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt gcagacgatc ctggggggg 59
<210> 27
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttcgtgga ctgctacatt gcc 53
<210> 28
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tttttttttt tttttagtag gtgaagattt tcttct 36
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
cagtacactt accatgttac aacttgt 27
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
tttttttttt tcgtacacac cgcccgtcac 30
<210> 31
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tttttttttt tttttttttt tttttcttac cttgcagcgt ggccactagc cca 53
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
caccactgct ctttcccgca 20
<210> 33
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
tttttttttt tttttttttt tttttgtggc caccactgct ctttccc 47
<210> 34
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
tttttttttt ttttttcaag agaagaatcc tgagaagatg t 41
<210> 35
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
tttttttttt ttttttttta tctcccacat ccggctatgg gcc 43
<210> 36
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
tttttttttt tttttttttt ttttttgcca tgcacgtggc ctaccggaga c 51
<210> 37
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
tttttttttt tttttttttt tttttttttt ctccatgcag cggctggtga agtgcaacg 59
<210> 38
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
ttgccagtgc cctgactctg ctggtt 26
<210> 39
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
tttttttttt tttttttttt tttatggcag tagcaattat cgtc 44
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
aatgtatcaa gtccacagta a 21
<210> 41
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
tttttttttt ttttaccaga accttaccac ccgc 34
<210> 42
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttgat atagctccac agtcaagca 59
<210> 43
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
tttttttttt tacttggttc tgtagataga gtatagcatc a 41
<210> 44
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
tttttttttt tttttttttt tttttagaaa ggacacattc tttttga 47
Claims (1)
1.一种检测多种耳聋基因多态性的SNaPshot试剂盒，检测的耳聋基因多态性位点包括GJB2基因位点rs80338939、rs80338942、rs80338943、rs111033204、176_191del16、c.35dupG、508_511dupAACG；GJB3基因rs74315318、rs74315319；SLC26A4基因rs111033220、rs201562855、rs111033305、rs192366176、rs111033318、rs121908362、rs121908363、rs200455203、rs111033380、rs111033313、c.281C>T；12s rRNA基因rs267606619、rs267606617；所述试剂盒包含检测这些多态性位点的扩增引物和测序引物；
其中扩增引物分为二管，其中管1的扩增引物一共有五对，分别为：
管2的扩增引物一共有六对，分别为：
测序引物分为二管，其中管1的测序引物一共有12条，分别为：
管2的测序引物一共有10条，分别为：
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