CN107974497A - 利用飞行时间质谱技术的耳聋致病基因检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用飞行时间质谱技术的耳聋致病基因检测试剂盒,所述试剂盒包括检测12S rRNA、GJB2和SLC26A4基因至少以下26个突变位点的试剂:12S rRNAm.1494_C>T,12S rRNA m.1555A>G,GJB2c.35delG,GJB2c.257C>G,GJB2c.427C>T,GJB2c.176del16,GJB2c.9G>A,GJB2c.235delC,GJB2c.299‑300delAT,SLC26A4IVS4+2T>C,SLC26A4c.1673A>T,SLC26A4c.1520delT,SLC26A4c.2027T>A,SLC26A4c.1975G>C,SLC26A4c.1226G>A,SLC26A4c.1318A>T,SLC26A4c.1229C>T,SLC26A4c.281C>T,SLC26A4c.2168A>G,SLC26A4IVS7‑2A>G,SLC26A4c.1174A>T,SLC26A4c.235C>T,SLC26A4c.1340delA,SLC26A4_c.589G>A,SLC26A4c.916‑917insG和SLC26A4c.IVS15+5G>A。本发明的试剂盒突变检测位点多、通量高、操作简单周期短、高准确率、高稳定性和低成本。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,特别涉及一种利用飞行时间质谱技术的耳聋致病基因检测试剂盒。
背景技术
耳聋是最常见的出生缺陷性疾病之一,同时也是人类最常见的感觉功能障碍之一。研究表明,新生儿双侧听力障碍(≥40dB)发病率为1/500;到青春期,听力障碍发病率则增加至3.5/1000。根据2006年第二次残疾人抽样调查,耳聋人群是我国除肢体残疾外最大的残疾人群体,约为2780万,其中7岁以下的聋哑儿童达80万,1~14岁的聋儿达117万。2012年发布的《中国出生缺陷防治报告(2012)》中明确指出,2008~2010年全国先天听力障碍发生率分别为19.9/万、21.5/万和21.9/万,呈上升趋势。据估算,我国每年新增聋儿3万余名,如果加上迟发性耳聋及药物性耳聋患儿,则每年新增聋儿超过6万。听力障碍严重损害人的听觉言语功能,影响人的身心健康、生活质量,加重经济社会负担。
导致耳聋的常见病因中,环境因素约占40%,遗传因素约占60%,其中约70%遗传性耳聋为非综合征型,其余约30%为综合征型,非综合征型耳聋包括常染色体显性遗传性耳聋(DFNA)、常染色体隐性遗传性耳聋(DFNB)、X-连锁遗传性耳聋(DFNX)、Y-连锁遗传性耳聋(DFNY)及线粒体遗传性耳聋,其中常染色体隐性遗传是遗传性耳聋主要遗传方式。
遗传性耳聋具有高度的遗传异质性和广泛的种族差异。目前遗传性非综合征型耳聋已经有159个相关位点(locus)被定位,已鉴定发现了102个非综合征型耳聋基因;遗传性综合征型耳聋已经有58个相关位点被定位,已鉴定发现了49个综合征型耳聋基因(http://hereditaryhearingloss.org)。虽然遗传性耳聋所涉及的致病基因众多,但是根据国内外的分子流行病学调查研究,大部分遗传性耳聋主要是由几个常见的耳聋致病基因突变导致。在欧美人群中,最主要的耳聋致病基因是GJB2,最常见的突变位点是c.35delG,其它常见致病基因还有SLC26A4、MYO15A、OTOF、CDH23、GJB6等。在国内,已经有多个课题组开展了耳聋分子流行病学调查研究,特别是戴朴课题组在2003年成立了解放军总医院聋病分子诊断中心,在全国34个省市收集了1万多例非综合征型耳聋病例,对国内的遗传性耳聋分子流行病学开展了系统研究,这些研究明确了GJB2、SLC26A4、线粒体12S rRNA基因是我国遗传性耳聋主要致病基因。其中,GJB2基因是我国遗传性耳聋最主要致病基因,约21.6%耳聋患者携带该基因突变,最常见的突变是c.235delC;SLC26A4基因是前庭导水管扩大(EVAS)主要致病基因,是我国第二常见的耳聋致病基因,其最常见突变为IVS7-2A>G;线粒体12SrRNA基因是我国药物性耳聋主要致病基因,其最常见的突变为m.1555A>G。系统全面的耳聋分子流行病学调查数据为我国开展遗传性耳聋基因检测提供了科学的理论基础,并为耳聋的早期诊断、干预和预防提供了重要依据。
遗传性耳聋基因突变也存在多种形式:单碱基突变,是最常见的突变形式,如线粒体12S rRNA基因另一个常见的突变1494C>T;小片段插入或缺失,如GJB2基因常见突变c.299_c.300delAT;拷贝数变异(CNV),如GJB6基因大片段缺失del(GJB6-D13S1830);基因重组,如王秋菊等在DFNY1耳聋家系中发现1号染色体1q43区域一个~100kb片段插入到了Y染色体长臂近端。耳聋由于致病基因的高度遗传异质性及致病突变形式的多样性,导致在进行多基因、多位点、多样本分析时,常用传统检测技术要么操作繁琐、通量低,如PCR-SSCP、DHPLC和PCR-RFLP方法等,要么平台昂贵且耗费人力。正是由于耳聋基因自身的遗传学特征,即具有高度的遗传异质性又存在“热点”基因和“热点”突变,因此目前的耳聋基因检测技术主要分为两类,一是以“热点”基因和“热点”突变为检测目标的耳聋基因初筛检测技术,另一类是以全部耳聋相关基因或外显子组为检测目标的用于罕见耳聋致病基因鉴定技术,主要是新一代测序技术。目前国内开发的耳聋基因初筛的检测技术主要是以高通量、低成本、快速准确为目标。
从目前国内临床常见耳聋基因检测情况来看,现有的检测产品并不能满足临床耳聋基因诊断需求,特别是前庭导水管扩大(EVAS)主要致病基因SLC26A4的临床确诊率不能满足临床需求。SLC26A4基因较大,共有21个外显子,编码区有20个外显子,如果在只检出一个突变情况下,对其确诊最多需要做18个直接测序反应,成本和工作量都很大,因此增加SLC26A4基因的临床确诊率具有重要意义。
本发明选择了中国人群常见的3个耳聋致病基因(GJB2、SLC26A4、线粒体12SrRNA)共26个突变位点,建立了基于飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术的单一反应检测这26个突变位点的高通量检测方法,构建了一套中国人常见耳聋基因检测体系,并使用临床样本对该检测体系准确性及有效性进行评价。
发明内容
本发明提供了一种采用飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术建立一种快速、高通量的3个耳聋致病基因(GJB2、SLC26A4、线粒体12S rRNA)的26个突变位点检测的试剂盒。
本发明提供一种利用飞行时间质谱技术的耳聋致病基因检测试剂盒,所述试剂盒包括检测12S rRNA、GJB2和SLC26A4基因至少以下26个突变位点的试剂:12S rRNAm.1494_C>T,12S rRNA m.1555A>G,GJB2c.35delG,GJB2c.257C>G,GJB2c.427C>T,GJB2c.176del16,GJB2c.9G>A,GJB2c.235delC,GJB2c.299-300delAT,SLC26A4IVS4+2T>C,SLC26A4c.1673A>T,SLC26A4c.1520delT,SLC26A4c.2027T>A,SLC26A4c.1975G>C,SLC26A4c.1226G>A,SLC26A4c.1318A>T,SLC26A4c.1229C>T,SLC26A4c.281C>T,SLC26A4c.2168A>G,SLC26A4IVS7-2A>G,SLC26A4c.1174A>T,SLC26A4c.235C>T,SLC26A4c.1340delA,SLC26A4_c.589G>A,SLC26A4c.916-917insG和SLC26A4c.IVS15+5G>A。
在一种实施方式中,所述试剂盒还包括基因组DNA提取试剂盒。
在一种实施方式中,所述基因组DNA提取试剂盒是全血基因组DNA提取试剂盒、口腔拭子基因组DNA提取试剂盒或干滤纸血斑基因组DNA提取试剂盒。
在一种实施方式中,针对拟检测目标基因位点的区域设计特异性扩增引物对与延伸引物如下:12S rRNA m.1494_C>T:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:1,SEQ ID No:2;和SEQ ID No:3;GJB2c.35delG:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQID No:4,SEQ ID No:5;和SEQ ID No:6;GJB2c.257C>G:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:7,SEQ ID No:8;和SEQ ID No:9;GJB2c.427C>T:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:10,SEQ ID No:11;和SEQ ID No:12;GJB2c.176del16:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:13,SEQ ID No:14;和SEQ ID No:15;12S rRNAm.1555A>G:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:16,SEQ ID No:17;和SEQID No:18;SLC26A4IVS4+2T>C:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:19,SEQID No:20;和SEQ ID No:21;SLC26A4c.1673A>T:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:22,SEQ ID No:23;和SEQ ID No:24;SLC26A4c.1520delT:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:25,SEQ ID No:26;和SEQ ID No:27;GJB2c.9G>A:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:28,SEQ ID No:29;和SEQ ID No:30;SLC26A4c.2027T>A:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:31,SEQ ID No:32;和SEQ ID No:33;SLC26A4c.1975G>C:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:34,SEQ ID No:35;和SEQ ID No:36;GJB2c.235delC:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:37,SEQ ID No:38;和SEQ ID No:39;SLC26A4c.1226G>A:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:40,SEQ ID No:41;和SEQ ID No:42;SLC26A4c.1318A>T:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:43,SEQ ID No:44;和SEQ ID No:45;SLC26A4c.1229C>T:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:46,SEQ ID No:47;和SEQ ID No:48;SLC26A4c.281C>T:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:49,SEQ ID No:50;和SEQ ID No:51;SLC26A4c.2168A>G:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:52,SEQ ID No:53;和SEQ ID No:54;SLC26A4IVS7-2A>G:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:55,SEQ ID No:56;和SEQ ID No:57;SLC26A4c.1174A>T:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:58,SEQ ID No:59;和SEQ ID No:60;SLC26A4c.235C>T:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:61,SEQ ID No:62;和SEQ ID No:63;SLC26A4c.1340delA:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:64,SEQ ID No:65;和SEQ ID No:66;SLC26A4_c.589G>A:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:67,SEQ ID No:68;和SEQ ID No:69;GJB2c.299-300delAT:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:70,SEQ ID No:71;和SEQ ID No:72;SLC26A4c.916-917insG:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:73,SEQ ID No:74;和SEQ IDNo:75;SLC26A4c.IVS15+5G>A:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:76,SEQID No:77;和SEQ ID No:78。
相对于其他的突变检测技术,本发明的MassArray具有以下技术优势:
1)突变检测位点多,覆盖率高:MassArray一个反应可对多达26个的变异位点进行基因分型。本发明针对26个位点设计的多重PCR扩增引物和单碱基延伸引物,解决了同时对三个基因26个突变位点同时进行检测的多重PCR扩增引物和单碱基延伸的问题。从单一PCR到多重PCR,其实验设计的难度也随之翻倍,从来不是简单地单一PCR引物简单地叠加,需要发明人付出巨大的努力和辛苦。本发明的这些引物既不互相结合,也不与模板DNA上目标片段以外的区域结合。在本发明中发明人通过大量引物设计、筛选和反复的验证总结,获得了对于本发明中三个基因26个位点同时进行检测的引物,解决了多个靶点扩增条件不兼容的问题,完美地克服了上述多重PCR扩增中问题。在本发明中设计的引物实现了三个基因26个位点同时检测,并且这个26个位点之间检测不互相干扰,反应的特异性也很高。本发明所设计的引物对于本发明检测灵敏度的提高起到了至关重要的作用。
2)通量高,操作简单周期短:MassArray所采用的是384或者96芯片,可在一张芯片上完成多达384个反应的同时检测,按照每个反应20个位点计算,完成一张芯片检测相当于近8000个单位点单样本的检测反应。而且MassArray主要步骤只需要多重PCR扩增和单碱基延伸两步反应,操作过程简单,可在一天内完成。因此该方法适合于人群中进行大规模、大范围的基因突变筛查。
3)高准确率,高稳定性:MassArray方法直接检测单碱基延伸产物的分子量,通过分子量的变化直接判读分型结果,不需要荧光标记,避免了荧光标记的质量对结果的影响,而且检测系统为非杂交依赖性,不存在潜在杂交错配的干扰。
4)低成本:MassArray是基于时间飞行质谱分析检测的方法,直接检测DNA产物,在探针设计上不需要荧光标记,不需要化高昂的费用用于探针的荧光标记;而且其探针并非预制在芯片上,由于质谱检测的芯片是通用型的,不同的检测通过合成不同的引物和探针直接进行调整,检测灵活,降低了试剂根本。虽然质谱仪购置成本较贵,但是如用于大规模筛查,其平均每个样本的成本就很低。而且相对于Sanger测序、生物芯片技术,其检测成本更低,适合于做人群的突变携带者筛查。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案,下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明,显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都应当属于本申请保护的范围。
一、MassArray基本原理
时间飞行质谱技术全称基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术。主要特点是,PCR扩增后的产物,加入SNP序列特异延伸引物,在SNP位点上,延伸1个碱基。然后将制备的样品分析物与芯片基质共结晶,将该晶体放入质谱仪的真空管,而后用瞬时纳秒(10-9s)强激光激发,由于基质分子经辐射所吸收的能量,导致能量蓄积并迅速产热,从而使基质晶体升华,核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子,产生的离子多为单电荷离子,这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能,进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离,在真空小管中飞行到达检测器。MALDI产生的离子常用飞行时间(Time-of-Flight TOF)检测器来检测,离子质量越小,就越快到达。
时间飞行质谱技术用于基因分型的基本步骤为:第一,针对拟检测目标基因位点的区域设计特异性扩增引物对与延伸引物,一个反应体系中最大检测重数为36重;第二,对目标基因区域进行多重PCR扩增;第三,向扩增反应后的体系中加入虾碱性磷酸酶进行消化反应,去除多余的dNTP;第四,向体系中加入对应的延伸引物混合液,进行引物单碱基延伸反应;第五,对延伸反应产物进行树脂纯化,纯化完成后使用微量点样仪点样,并使样本与芯片上的基质共结晶;最后,利用MALDI-TOF-MS直接对延伸引物产物的分子量进行检测,判读结果需要通过Typer 4.0软件实现。
二、DNA样品的制备
本发明中使用的DNA样品制备,可以采用全血基因组DNA提取方法,全血基因组DNA采用北京天根公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)进行提取。本发明中使用的DNA样品制备,也可以口腔拭子基因组DNA提取方法,口腔拭子基因组DNA采用北京天根公司的口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(DP322)进行提取。本发明中使用的DNA样品制备,也可以采用干滤纸血斑基因组DNA磁珠法进行提取。干血斑核酸磁珠法核酸提取试剂盒可以从北京康为世纪生物技术有限公司,长春志昂生物技术有限公司,常州金麦格生物技术有限公司以及广州美基生物技术有限公司购买,按照产品说明书进行操作。使用NanoDrop2000超微量分光光度计检测提取DNA浓度及纯度,提取DNA样本需要进行分装并置于-20℃长期保存。
三、PCR扩增引物及单碱基延伸引物设计合成
1.引物的设计
登录UCSC Genome Browser网站下载GJB2、SLC26A4、线粒体12S rRNA基因组序列及cDNA序列,将突变位点按特殊格式标出,选取候选突变前后各100bp长度序列,并将这段201bp序列里的高频SNP(common SNP)用简并碱基的形式标记出来,然后根据标记好的序列开始引物设计,具体的设计原则如下:
PCR扩增引物的设计要求:引物序列应设计在相对保守区域,避开SNP位点,除满足基本PCR引物的设计要求外,需要注意扩增产物的长度应在100~120bp,各引物的退火温度应尽量一致,大约在56℃左右。对于突变位点相对集中的位置,可以考虑设计一对PCR扩增引物。多重扩增的引物应充分考虑引物之间的相互干扰和引物二聚体的形成。
单碱基延伸引物的设计要求:延伸引物的长度应在17~28bp之间,3’端的10bp范围内的碱基必须与参考序列完全匹配,引物覆盖区域避免出现SNP位点,可以通过调整引物在突变位点到上游或者下游来获得符合要求的引物。质谱分析要求单碱基延伸产物的分子量差异大于15Da,允许在延伸引物的5’端加上1~5个与参考序列不匹配碱基以保证分子量能区分开。引物合成委托宝生物工程(大连)有限公司合成,采用PAGE方法进行引物纯化。
本发明工作的重点和难点是如何获得同时对三个基因26个突变位点同时进行检测的多重PCR扩增引物和单碱基延伸引物。从单一PCR到多重PCR,其实验设计的难度也随之翻倍。扩增一个片段需要三条引物,那么两个片段就需要六条,三个片段需要九条,以此类推。这些引物既不能互相结合,也不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合。此外,还要考虑同时检测不同的扩增子,要么就使不同扩增子大小不一以便凝胶电泳,要么就让它们带上不同荧光染料以便区分。另外,多重PCR中的不同扩增片段还会互相竞争资源,其结果是高丰度模板能够被很容易的检测到,而低丰度的模板彻底沦为背景。
在本发明中发明人通过大量引物设计、筛选和反复的验证总结,获得了对于本发明中三个基因26个位点同时进行检测的引物,解决了多个靶点扩增条件不兼容的问题,完美地克服了上述多重PCR扩增中问题。在本发明中设计的引物实现了三个基因26个位点同时检测,并且这个26个位点之间检测不互相干扰,反应的特异性也很高。
表1.本发明26个耳聋3个基因26突变位点的飞行时间质谱扩增引物及单碱基延伸引物序列
2.引物的稀释及质检
1)PCR引物储备液制备:稀释单管扩增引物至终浓度100μmol/L,加入去离子水混合后使得各位点引物浓度为0.5μmol/L。
2)单碱基延伸引物储备液制备:稀释单管扩增引物至终浓度500μmol/L,加入引物混合后使得各位点引物浓度为8μmol/L、10μmol/L、15μmol/L。
3)合成引物并进行引物分子量的质检:将引物合成公司合成的引物,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)进行质检,检测实际分子量与理论分子量是否一致,引物纯度是否达到实验要求。
3.多重PCR扩增反应
(1)从-20℃冰箱中取出试剂、待测DNA样本等置于室温融化,涡旋振荡15s,瞬时离心,确保管壁无液滴残留。PCR酶需要始终置于冰浴中;
(2)PCR反应体系见表2;
表2 多重PCR反应体系
(3)将配置好的反应体系振荡混匀,瞬时离心后加入到384孔PCR板中,并确保使反应体系加到反应孔底部;
(4)将待测样本1μl(10~50ng/μl)加入到反应孔底部,全部加完后立即用封板膜密封384孔板,并轻轻混匀或涡旋384孔板;
(5)1000rpm板式离心机离心1min,将PCR板放置于PCR仪中,设定反应程序如下:
(6)约3h后,取出384孔板,1000rpm板式离心机离心1min。在进行下一步实验前,反应产物应置于-20℃保存。
4.SAP酶消化反应
(1)从-20℃冰箱中取出上步反应产物,室温融化,4000rpm离心1min;
(2)取出SAP反应试剂,SAP酶需始终置于冰浴中,其它试剂置于室温融化,涡旋振荡15s后瞬时离心;
(3)SAP酶混合液配制见表3;
表3 SAP酶混合液配制
(4)将配制好的SAP酶混合液分装至384孔板中,每孔加入试剂量为2μl,移液完成后,小心盖上封口膜,并按压每个孔,防止PCR程序时出现蒸发等意外现象;
(5)将384板放置于PCR仪上进行SAP反应,SAP反应条件如下:
37℃ 40min
85℃ 5min
4℃ ∞
(6)约1h后,取出384孔板,1000rpm板式离心机离心1min。在进行下一步实验前,反应产物应置于-20℃保存。
5.单碱基延伸反应
(1)从-20℃冰箱中取出上步反应产物,室温融化,4000rpm离心1min;
(2)从-20℃冰箱中取iPLEX延伸反应试剂,将iPLEX酶需始终置于冰浴中,其它试剂置于室温融化,涡旋振荡15s后瞬时离心,去除管壁的液体;
(3)iPLEX反应体系配制见表4;
表4 iPLEX反应体系配制
(4)将配制好的iPLEX反应体系混合液分装到384孔板中,每孔加入iPLEX反应体系2μl;
(5)每孔加入7μl SAP反应后产物到384孔板中,瞬时离心;
(6)移液完成后,小心盖上封口膜,并按压每个孔,防止PCR程序时出现蒸发等意外现象;
(7)将384孔板置于PCR仪上进行单碱基延伸反应,反应条件如下:
6.iPLEX单碱基延伸产物脱盐,树脂纯化
(1)将适量的树脂放在384/6mg的dimple板上,dimple板下垫一张干净的白纸,用刮板将树脂在dimple板上铺开,确保与有实验样本的384板对应的孔中都有树脂;
(2)树脂进入dimple的板孔中后,等待10~30分钟,务必让树脂干燥,否则树脂不容易从dimple板中脱落;
(3)向384样本板的每个有样本的孔中加入25μl的水。然后将384板封上膜,混匀,瞬时离心;
(4)向每个样品孔中加入6mg的树脂。让384板与dimple板上的数字都位于上面,将384样品板倒扣在dimple板上,384板的右侧边缘顶住dimple板右侧的小钢柱,保证孔对孔,固定好两板的位置,防止错位,然后将两者一起翻转过来,轻磕dimple板底,让树脂从dimple板的孔中脱落到相对应的384板的孔中;
(5)将384板的膜封好,放在静音混匀仪上15分钟,让树脂与样品充分混合;
(6)离心,4000转/min,5min,离心后禁止翻转384板。
7.芯片点样
芯片点样依照说明书进行,芯片点样包括以下步骤:
(1)点样仪准备工作
(2)编板(Mapping)
(3)主菜单中选择方法
(4)放置芯片和384板在正确的位置
(5)转移(转移过程中禁止打开点样仪顶门)
(6)点样完成后整理仪器,取出芯片和384板,换无水乙醇,泡针。
8.Mass Array上机分析
(1)Assay导入
(2)样本表格输入
(3)建板
(4)上机分析
(5)检测结果的判读
单碱基延伸产物通过质谱检测,获得延伸产物的分子量,分析软件计算延伸引物自身的分子量以及延伸产物可能的分子量的差值,与软件内预先设定好的每个突变位点延伸引物及可能突变碱基ddNTP的分子量进行比对。通过软件自动分析判断,获得延伸后的相应碱基过程中PCR扩增、单碱基延伸的质量进行评价,根据峰图质量,软件自动判别为五个质量等级:A、B、C、D、N,质量依次递减,N代表延伸引物未发生延伸反应,通常理想结果为A。
三、基于时间飞行质谱技术的常见耳聋致病基因检测方法准确性评价
为了验证本研究所建立的基于时间飞行质谱技术单一反应检测3个常见耳聋致病基因(GJB2、SLC26A4、线粒体12S rRNA)26个突变位点的检测方法准确性,使用该检测体系对327个已知突变的非综合征型耳聋样本进行了检测,这327个样本所携带的突变涵盖了本研究要检测的3个基因全部26个位点,每个位点至少有8个以上阳性突变样本,其中GJB2基因4个位点(c.176_191del16、c.235delC、c.427C>T、c.9G>A),以及SLC26A4基因3个位点(c.1174A>T、c.1229C>T、IVS7-2A>G)有纯合突变样本,这2个基因其余位点均只有杂合突变样本MALDI-TOF-MS检测结果显示,GJB2、SLC26A4、线粒体12S rRNA基因26个突变位点在327个已知突变样本中均相应的得到检出,其检测结果与临床基因诊断结果一致,符合率100%。
四、基于MALDI-TOF-MS技术的3个常见耳聋致病基因26突变位点检测方法在373例非综合征型耳聋患者基因检测中的应用
使用上面建立的基于MALDI-TOF-MS技术的3个常见耳聋致病基因26突变位点检测方法,对373例非综合征型耳聋患者进行检测,373例非综合征型耳聋患者中210例患者至少携带一个突变,占受检人群的56.03%(209/373),其中携带复合或纯合突变可以确诊的患者155例,占受检人群的38.87%(145/373),耳聋基因携带者即无法确诊患者64例,占受检人群的17.16%(64/373),检测结果为阴性患者164例,占受检人群的43.97%(164/373),其中有4例存在多个基因突变,分别为GJB2基因c.235delC,c.299-300delAT复合杂合突变/SLC26A4基因IVS7-2A>G突变携带者1例,GJB2基因c.235delC/SLC26A4基因IVS7-2A>G突变携带者2例,GJB2基因c.235delC纯合突变/SLC26A4基因IVS4+2T>C突变携带者1例,GJB2基因c.299-300delAT杂合突变/SLC26A4基因IVS7-2A>G纯合突变携带者1例。GJB2基因235delC和SLC26A4基因IVS7-2A>G是两个最常见突变位点。
本研发明基于飞行时间质谱技术建立了单一反应检测3个常见耳聋基因(GJB2、SLC26A4、线粒体12S rRNA)26个突变热点的高通量、低成本耳聋基因检测方法,临床样本检测结果表明该技术体系具有高度的准确性。本研究利用该技术体系对来自于临床的373例非综合征型耳聋样本进行了检测,突变检出率为56.03%(209/373),确诊率为38.87%(145/373),结果表明该方法在临床上应用是可行的。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质,因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的,而不是意欲限制本发明的范围,本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到,或者能够确认使用不超过常规实验,在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 国家卫生计生委科学技术研究所
<120> 利用飞行时间质谱技术的耳聋致病基因检测试剂盒
<130> BR3592
<160> 78
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgttggatg acgatagccc ttatgaaac 29
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgttggatg gtccaagtgc actttccag 29
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cacaccgccc gtcac 15
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgttggatg caatgctggt ggagtgtttg 30
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgttggatg gtcttttcca gagcaaac 28
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgtttgttca caccccc 17
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgttggatg ctcccacatc cggctatggg 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgttggatg ttcgatgcgg accttctggg 30
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaactaggag cgctggc 17
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acgttggatg gtggacctac acaagcagca 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acgttggatg gaagacgtac atgaaggcgg 30
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccgcttcgaa gatgaccc 18
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acgttggatg catttttcgc attatgatcc 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acgttggatg tgtgggagat ggggaagtag 30
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggaagtagtg atcgtagc 18
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acgttggatg gtccaagtgc actttccag 29
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acgttggatg acgatagccc ttatgaaac 29
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cttaccatgt tacgacttg 19
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acgttggatg cctatcctga catactttat c 31
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acgttggatg agccaaaaca ctttaaacat g 31
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caagacatat ctcagttgg 19
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acgttggatg gattcttaga ttttccagtc 30
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acgttggatg aaacaaattt ctagggata 29
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gagtcctatt ttctatggca 20
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
acgttggatg actagctggc cttatatttg 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acgttggatg ctgggtttta cgttactcac 30
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gggccttata tttggactgt 20
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
acgttggatg gtcttttcca gagcaaac 28
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
acgttggatg caatgctggt ggagtgtttg 30
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ccagagtaga agatggattg 20
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
acgttggatg cagaaaacca gaaccttacc 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
acgttggatg ctgagcttcc agtcaaagtg 30
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aaaccagaac cttaccaccc gc 22
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
acgttggatg cagaaaacca gaaccttacc 30
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
acgttggatg ctgagcttcc agtcaaagtg 30
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gatatagctc cacagtcaag ca 22
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
acgttggatg ctcccacatc cggctatggg 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
acgttggatg ttcgatgcgg accttctggg 30
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
aatgacgaag atcagctgca gg 22
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
acgttggatg atccagtctc ttccttagga 30
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
acgttggatg ctgttgttcc tacctgtgtc 30
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tgtggccacc actgctcttt ccc 23
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
acgttggatg atctctgctg cgattgtgat 30
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
acgttggatg gaaattatgc aatcggtatg 30
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
agatcgccat tcttgccctg ggg 23
<210> 46
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
acgttggatg atccagtctc ttccttagga 30
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
acgttggatg ctgttgttcc tacctgtgtc 30
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
cctccagtgc tctcctggac ggcc 24
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
acgttggatg taccttgcag cgtggccact 30
<210> 50
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
acgttggatg catcttggag tggctcccc 29
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gtttgcagcg tggccactag ccca 24
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
acgttggatg ctggagcaat gcgggttctt 30
<210> 53
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
acgttggatg gatttcactt ggttctgtag a 31
<210> 54
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
acctgtagat agagtatagc atca 24
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
acgttggatg acacaaaatc ccagtcccta 30
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
acgttggatg ggttggctcc atatgaaatg 30
<210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
agaatggcag tagcaattat cgtc 24
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
acgttggatg atccagtctc ttccttagga 30
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
acgttggatg ctgttgttcc tacctgtgtc 30
<210> 60
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gaaagaagaa tcctgagaag atgt 24
<210> 61
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
acgttggatg taccttgcag cgtggccact 30
<210> 62
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
acgttggatg catcttggag tggctcccc 29
<210> 63
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
gtcactaagc agccattcct tgactc 26
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
acgttggatg atctctgctg cgattgtgat 30
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
acgttggatg gaaattatgc aatcggtatg 30
<210> 66
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
ttatgcagag aagcagggtt atacct 26
<210> 67
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
acgttggatg gctagagtcc tgattgcca 29
<210> 68
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
acgttggatg tacttgtaag ttcattacc 29
<210> 69
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
cttgtaagtt cattacctgt ataattc 27
<210> 70
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
acgttggatg ctcccacatc cggctatggg 30
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
acgttggatg ttcgatgcgg accttctggg 30
<210> 72
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
tggccatgca cgtggcctac cggagac 27
<210> 73
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
acgttggatg acacaaaatc ccagtcccta 30
<210> 74
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
acgttggatg ggttggctcc atatgaaatg 30
<210> 75
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
gaggccctat tcctatagaa gtaattg 27
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
acgttggatg gattcttaga ttttccagtc 30
<210> 77
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
acgttggatg aaacaaattt ctagggata 29
<210> 78
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
aagaaaacaa atttctaggg ataaaata 28
Claims (4)
1.一种利用飞行时间质谱技术的耳聋致病基因检测试剂盒,其特征在于所述试剂盒包括检测12S rRNA、GJB2和SLC26A4基因至少以下26个突变位点的试剂:12S rRNA m.1494_C>T,12S rRNA m.1555A>G,GJB2 c.35delG,GJB2 c.257C>G,GJB2 c.427C>T,GJB2c.176del16,GJB2 c.9G>A,GJB2 c.235delC,GJB2 c.299-300delAT,SLC26A4 IVS4+2T>C,SLC26A4 c.1673A>T,SLC26A4 c.1520delT,SLC26A4 c.2027T>A,SLC26A4 c.1975G>C,SLC26A4 c.1226G>A,SLC26A4 c.1318A>T,SLC26A4 c.1229C>T,SLC26A4 c.281C>T,SLC26A4 c.2168A>G,SLC26A4 IVS7-2 A>G,SLC26A4 c.1174A>T,SLC26A4 c.235C>T,SLC26A4 c.1340delA,SLC26A4_c.589G>A,SLC26A4 c.916-917insG和SLC26A4 c.IVS15+5G>A。
2.根据权利要求1所述的利用飞行时间质谱技术的耳聋致病基因检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括基因组DNA提取试剂盒。
3.根据权利要求2所述的利用飞行时间质谱技术的耳聋致病基因检测试剂盒,其特征在于,所述基因组DNA提取试剂盒是全血基因组DNA提取试剂盒、口腔拭子基因组DNA提取试剂盒或干滤纸血斑基因组DNA提取试剂盒。
4.根据权利要求1所述的利用飞行时间质谱技术的耳聋致病基因检测试剂盒,其特征在于针对拟检测目标基因位点的区域设计特异性扩增引物对与延伸引物如下:
12S rRNA m.1494_C>T:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:1,SEQ IDNo:2;和SEQ ID No:3;
GJB2 c.35delG:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:4,SEQ ID No:5;和SEQ ID No:6;
GJB2 c.257C>G:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:7,SEQ ID No:8;和SEQ ID No:9;
GJB2 c.427C>T:多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是:SEQ ID No:10,SEQ ID No:11;和SEQ ID No:12;
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