CN108823302A - 一种耳聋基因突变检测的引物探针组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基因突变的检测产品，具体涉及一种耳聋基因检测的引物探针组合，所述引物探针组合包括检测引物探针，所述检测引物探针包括对耳聋基因突变检测特异性引物对和耳聋基因特异性分子信标探针；其中，所述耳聋基因的突变检测的位点为IVS7‑2、GJB2、12S rRNA‑1494和12S rRNA‑1555突变位点。本发明对耳聋基因突变具有特异性强、灵敏度高、操作简单快速等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，能够辅助临床治疗，具有重要价值。

Description

一种耳聋基因突变检测的引物探针组合及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种基因突变的检测产品，具体涉及一种耳聋基因突变检测的引物探针组合及其应用。
背景技术
耳聋病是临床上最常见的遗传性疾病之一，也是影响人类健康的常见疾病。据统计，中国听力语言残疾者有2780万人，占全国现有残疾人总数的34％，其中单纯听力残疾的有2004万人，并以每年2～3万新生聋儿的速度增长；北京市卫生局今年的新生儿耳聋基因筛查，全市近20万名新生儿当中，检测出近9000名常见耳聋基因阳性者，阳性率为4.55％。14岁以下儿童耳聋患病率超过3.5‰，但是目前的检出率仅为1‰，大量的患儿由于未能及时检出，错过了最佳治疗时间。在大量迟发性听力下降患者中，许多患者因自身基因缺陷而致病或因基因缺陷和多态性造成对环境因素的易感性增加而致病。遗传性耳聋中30％的遗传性耳聋病例属于综合征性耳聋，其余的为非综合征性耳聋(non syndromic hearingloss，NSHL)。
在目前已知的NSHL中，GJB2、SLC26A4、IVS7-2A>G、mtDNA 12SrRNA这4个位点是中国人最常见的耳聋突变位点。其中GJB2导致遗传性非综合征型耳聋最常见的基因，约20％的先天性耳聋患者与该基因相关，其中235delC突变在我国常见的耳聋致病性突变中占到78.79％。mtDNA 12SrRNA基因多个位点的突变可增强氨基糖甙类抗生素耳毒性的敏感性，导致药物性耳聋，其中已经公认且机制较为明确的当属A1555G与C1494T突变，氨基糖甙类抗生素可引发或加重此突变mtDNA携带者的听力损失。
目前，常用的技术是采用荧光PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)技术，该技术既保持了PCR技术灵敏、快速的特点，又克服了以往PCR技术中存在的假阳性污染和不能进行准确定量的缺点。基于分子信标(molecularbeacon,MB)探针的FQ-PCR是在定性PCR的基础上添加一条分子信标探针。分子信标探针是由环部和茎部组成的寡核苷酸链：环部是能与靶DNA碱基互补的寡核苷酸序列，是检测靶基因的部分，位于探针的中间；茎部即探针两臂，是由5’端标记的荧光剂、3’端标记的淬灭剂以及两臂反转配对的几个碱基组成。由于这种特定的茎环结构存在，荧光剂和淬灭剂之间可以发生荧光共振能量传递，荧光剂发出的荧光被淬灭剂吸收并以热的形式散发。在无特异性PCR发生时，分子信标探针仍保持原有的茎环结构，反应体系的荧光信号不改变；在特异性PCR发生时，分子信标探针的环序列与靶DNA特异性结合，形成一个比茎环结构更稳定的杂交双链体，杂交的结果使探针的5’端和3’端分离，荧光抑制作用消失，从而产生荧光信号的增强。
CN 106957904 A公开了一种检测药物性耳聋的PCR荧光分子信标探针，分别针对每个位点设计与野生型完全匹配的分子信标探针，通过高分辨率熔解曲线分析，检测随着温度升高各个通道的荧光强度变化情况，得到探针与不同基因型目的片段解链的Tm值，实现对样品分型的目的。但是，并不是只要根据相关位点设计的探针就能够实现检测，也有根据相关位点设计的引物和探针无法准确实现检测的情况出现。
目前我国大部分家庭只育有一个孩子，在孕前、产前、新生儿进行耳聋筛查，对耳聋患者进行病因分析，可以预防遗传病患儿的出生，对具有遗传缺陷的患者进行有针对性的治疗，避免药物性致聋的发生。因此，对耳聋高发突变位点相关基因的检测具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种耳聋基因突变检测的引物探针组合及其应用，所述试剂盒能够检测速度快，具有很高的特异性和灵敏度。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种耳聋基因突变检测的引物探针组合，所述引物探针组合包括检测引物探针，所述检测引物探针包括对耳聋基因突变检测特异性引物对和耳聋基因特异性分子信标探针；
其中，所述耳聋基因的突变检测的位点为IVS7-2、GJB2、12S rRNA-1494和12SrRNA-1555突变位点。
本发明中，所示检测的突变位点具体为IVS7-2A>G、GJB2基因中的235delC、12SrRNA C1494T和12S rRNA C1555G，发明人主要通过这几个突变位点来检测遗传性非综合征型耳聋，其基本能实现目前遗传性非综合征型耳聋的检测。
本发明中，通过采用耳聋基因特异性分子信标探针来检测耳聋基因的四个突变位点，在PCR体系中加入荧光信标探针，并把PCR仪与荧光光谱仪相连，可以对PCR反应过程随时进行监测并进行精确定量，且耳聋基因特异性分子信标探针特异性强，茎环状结构的分子信标检测特异性更高，对靶序列中单个碱基的错配、缺失或插入突变均能检测出来。
根据本发明，所述耳聋基因特异性分子信标探针的长度为18-28bp，例如可以是18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp或28bp，优选为19-25bp。
本发明中，通过设置耳聋基因特异性分子信标探针的长度在18-28个bp，其包括环茎杆组成环部序列和茎杆部分，环茎杆组成环部序列在空间结构上呈发夹型，与靶DNA序列互补；茎杆部分由GC含量较高的与靶序列无关的互补序列构成，通过这样的碱基数量能够最准确的与所述耳聋基因突变位点匹配，用于检测耳聋基因突变。
根据本发明，所述耳聋基因特异性分子信标探针的3’端带有淬灭基团。
根据本发明，所述淬灭基团选自DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Phosphorothioate中的任意一种或至少两种的组合，优选为BHQ-1。
根据本发明，所述耳聋基因特异性分子信标探针的5’端带有荧光集团。
根据本发明，所述荧光基团为FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA中的任意一种或至少两种的组合，优选为FAM和/或NED。
本发明中，当分子信标处于自由状态时，发夹结构的两个末端靠近使F与Q靠近，F被淬灭；当有靶序列存在时，分子信标与靶序列结合，使分子信标的茎杆区被拉开，此时R荧光不能被淬灭，可检测到荧光信号。
根据本发明，所述耳聋基因特异性分子信标探针的5’端的3个碱基进行硫代修饰，发明人发现将前3个碱基进行硫代修饰，可以避免被非特异性酶切。
根据本发明，所述耳聋基因IVS7-2突变检测特异性引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.1-2所示，所述分子信标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体序列如下：
IVS7-2突变位点的上游引物(SEQ ID NO.1)为：AAAGTTCAGCATTATTTGGTTGACAAA；
IVS7-2突变位点的下游引物(SEQ ID NO.2)为：TCCATATGAAATGGCAGTAGCAATT；
IVS7-2突变位点的分子信标探针(SEQ ID NO.3)为：TGTTTTATTTCGGACGATAATTG.
根据本发明，所述耳聋基因GJB2突变检测特异性引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.4-5所示，所述分子信标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体序列如下：
GJB2突变位点的上游引物(SEQ ID NO.4)为：CAGGCTGCAAGAACGTGTGCTAC；
GJB2突变位点的下游引物(SEQ ID NO.5)为：TCTTCTCATGTCTCCGGTAGGCCA；
GJB2突变位点的分子信标探针(SEQ ID NO.6)为：CTATGGGCCTGCAGCTGAT.
根据本发明，所述耳聋基因12S rRNA-1494和12S rRNA-1555突变检测特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示，具体序列如下：
12S rRNA-1494突变位点的上游引物(SEQ ID NO.7)为：GAAATGGGCTACATTTTCTACCCCA；
12S rRNA-1494突变位点的下游引物(SEQ ID NO.8)为：TAAATGGTTTGGCTAAGGTTGTCT；
根据本发明，所述耳聋基因12S rRNA-1494的分子信标探针的核苷酸序列如SEQID NO.9所示，具体如下：CCGTCACTCTCCTCAAGTA；
根据本发明，所述耳聋基因12S rRNA-1555的分子信标探针的核苷酸序列如SEQID NO.10所示，具体如下：ATAGAGGAGGCAAGTCGTAACA.
第二方面，本发明提供一种检测耳聋基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的引物探针组合物。
根据本发明，所述试剂盒还包括阴性质控、阳性质控和辅助试剂。
优选地，所述阴性质控为TE缓冲液。
优选地，所述阳性质控为293细胞基因组DNA。
优选地，所述辅助试剂为Taq酶、dNTPs、MgCl2和PCR反应缓冲液。
第三方面，本发明提供一种利用如第二方面所述的试剂盒用于检测耳聋基因突变的方法，包括以下步骤：
(1)提取样本DNA；
(2)向步骤(1)样本DNA中加入PCR缓冲液、Taq酶、dNTPs、MgCl2、耳聋基因突变检测特异性引物对、耳聋基因的特异性分子信标探针、阳性质控和阴性质控；
(3)PCR扩增。
根据本发明，所述MgCl2的浓度为1-8mM，例如可以是1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM或8mM，优选为2.5-6mM。
优选地，所述dNTPs的浓度为0.1-1mM，例如可以是0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM或1mM，优选为0.1-0.8mM。
优选地，所述Taq酶的浓度为0.02-0.08U/μl，例如可以是0.02U/μl、0.03U/μl、0.04U/μl、0.05U/μl、0.06U/μl、0.07U/μl或0.08U/μl。
优选地，所述耳聋基因突变检测特异性引物对的浓度为500-900nM，例如可以是500nM、550nM、580nM、600nM、650nM、680nM、700nM、750nM、800nM、850nM、880nM或900nM，优选为200-600nM。
优选地，所述耳聋基因特异性分子信标探针的浓度为100-150nM，例如可以是100nM、110nM、120nM、130nM、140nM或150nM。
优选地，所述阳性质控的浓度为1-5ng/μl，例如可以是1ng/μl、2ng/μl、3ng/μl、4ng/μl或5ng/μl，优选为2-3ng/μl。
根据本发明，步骤(3)所述的PCR扩增的条件为：
a)95℃预变性2min；
b)95℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸40s，45个循环；
c)40℃1min。
根据本发明，所述方法还包括荧光检测的步骤，所述检测温度为40-80℃，例如可以是40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、55℃、56℃、58℃、60℃、61℃、63℃、65℃、66℃、68℃、70℃、72℃、73℃、75℃、76℃、77℃、78℃或80℃。
本发明中，耳聋基因的PCR结果并不能够直接获得耳聋的诊断结果，而仅作为一种中间结果，还需要通过荧光检测，配合其他检测手段联合判断耳聋发生的可能性。
本发明中，反应与检测直接在封闭中进行，能够有效消除核酸交叉污染，试剂稳定性比同类产品要高。
根据本发明，所述荧光检测结果的判定如下：
对于IVS7-2突变位点，若结果检测熔链温度为51-56℃，则为野生型；若结果检测熔链温度为55-63℃，则为突变型；
对于GJB2和12S rRNA-1555突变位点，若结果检测熔链温度为58-63℃，则为野生型；若结果检测熔链温度为62-70℃，则为突变型；
对于12S rRNA-1494突变位点，若结果检测熔链温度为52-57℃，则为野生型；若结果检测熔链温度为56-64℃，则为突变型。
第四方面，本发明提供一种检测耳聋基因突变的装置，包括：
(1)提取单元：用于提取样本DNA；
(2)配制反应单元：与提取单元相连，用于配制反应体系；
(3)扩增单元：与所述配制反应单元相连，用于PCR扩增；
(4)荧光检测单元：与所述扩增单元相连，用于荧光检测结果。
优选地，所述反应体系包括PCR缓冲液、Taq酶、dNTPs、MgCl2、耳聋基因突变检测特异性引物对、耳聋基因特异性分子信标探针、阳性质控和阴性质控。
根据本发明，所述MgCl2的浓度为1-8mM，所述dNTPs的浓度为0.1-1mM，所述Taq酶的浓度为0.02-0.08U/μl，所述耳聋基因突变检测特异性引物对的浓度为500-900nM，所述耳聋基因特异性分子信标探针的浓度为100-150nM，所述阳性质控的浓度为1-5ng/μl。
本发明中，所述反应体系中各个组分的浓度可以根据检测耳聋不同突变位点的需求进行调整，在此不作特殊限定，本领域技术人员能够根据本申请给出的范围从而针对不同的样本调整各个组分的浓度，从而能够实现耳聋基因各个突变位点的检测。
第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的引物探针组合和/或如第二方面所述的试剂盒用于制备辅助临床诊断耳聋的试剂和/或药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
(1)本申请在PCR体系中加入荧光信标探针，并把PCR仪与荧光光谱仪相连，可以对PCR反应过程随时进行监测并进行精确定量，且荧光信标探针特异性强，与线性寡核苷酸探针相比，茎环状结构的分子信标检测特异性更高，对靶序列中单个碱基的错配、缺失或插入突变均能检测出来，特别适合做SNP分析；
(2)本申请涵盖了重要的耳聋相关基因，通过本申请可以检测相关基因的突变情况，检测结果精准，灵敏度高，低至1拷贝核酸也能检测，且内标定量的线性范围比Taqman探针宽2个数量级，从103/ml～1011/ml血清；
(3)本申请能够有效消除核酸交叉污染，反应与检测直接在封闭中进行，试剂稳定性比同类产品要高；
(4)本申请可用于正常听力人群孕前、产前筛查、新生儿听力筛查、及耳聋患者的病因诊断，为优生优育提供建议和指导，防止遗传性耳聋患儿的出生，同时对耳聋基因携带者进行针对性的治疗、给予个性化的用药，避免或减缓、降低其听力损失；
(5)本申请对仪器设备的要求低，单通道的荧光定量PCR仪即可胜任检测工作，利于大规模的市场推广应用。
附图说明
图1本发明IVS7-2野生样本、突变样本熔解曲线结果图；
图2本发明GJB2野生样本、突变样本熔解曲线结果图；
图3本发明12S rRNA 1494野生样本、突变样本熔解曲线结果图；
图4本发明12S rRNA 1555野生样本、突变样本熔解曲线结果图；
图5为本发明IVS7-2检测限熔解曲线结果图；
图6为本发明GJB2检测限熔解曲线结果图；
图7为本发明12S rRNA 1494检测限熔解曲线结果图；
图8为本发明12S rRNA 1555检测限熔解曲线结果图；
图9为对比例和实施例引物和探针的熔解曲线结果图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1试剂盒的组装
引物探针组合的设计，具体序列如下表1所示：
表1
阴性质控品：所述阴性质控为TE缓冲液；
阳性质控品：耳聋基因突变质粒；
辅助试剂：Taq酶、dNTPs、MgCl2和PCR反应缓冲液；
将上述组分、说明书及离心管组装后装入试剂盒中。
实施例2检测耳聋基因突变的装置的组装
本实施例提供一种检测耳聋基因突变的装置，包括：
(1)提取单元：用于提取样本DNA；
(2)配制反应单元：与提取单元相连，用于配制反应体系；
其中，所述反应体系包括PCR缓冲液、Taq酶、dNTPs、MgCl2、耳聋基因突变检测特异性引物对、耳聋基因特异性探针、扩增阻断探针、内参引物对、内参探针、阳性质控和阴性质控；
所述MgCl2的浓度为1-8mM，所述dNTPs的浓度为0.1-1mM，所述Taq酶的浓度为0.02-0.08U/μl，所述耳聋基因突变检测特异性引物对的浓度为500-900nM，所述耳聋基因特异性分子信标探针的浓度为100-150nM，所述阳性质控的浓度为1-5ng/μl；
(3)扩增单元：与所述配制反应单元相连，用于PCR扩增；
(4)荧光检测单元：与所述扩增单元相连，用于荧光检测结果。
实施例3耳聋基因突变检测
采用实施例1中的试剂盒和实施例2中的装置进行耳聋基因突变检测，包括如下步骤：
(1)样本DNA提取：
适用样本为指尖毛细管全血，用柱式血液DNA提取试剂盒或其他适当的提取方法，所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其DNA OD260/OD280的值应在1.7～1.9，浓度应在0.5～20ng/μl之间(若浓度低于0.5ng/μl，建议用酒精沉淀浓缩提取的DNA，使之浓度符合要求；若浓度高于20ng/ul，应用TE予以适当稀释至规定的浓度范围)；
(2)配制体系，具体的体系组成如下表2所示：
表2
向上述反应体系中加入步骤(1)提取的DNA样本20μl，加入至对应的PCR反应孔中，封上荧光定量PCR级别的封闭膜或盖上管盖，以2000rpm/min，离心30s，以确保反应混合液全部离入管底；
(3)将步骤(2)体系放入PCR仪，进行PCR扩增，具体的扩增条件如表3所示：
表3
运行PCR反应程序，保存文件；
(4)结果判定：
所述PCR结果突变的结果如图1-4所示；
从图1-4可以看出，IVS7-2野生样本的熔链温度在51℃-56℃，突变样本的熔链温度比野生样本高4℃-7℃；GJB2野生样本的熔链温度在58℃-63℃，突变样本的熔链温度比野生样本高4℃-7℃；12SrRNA-1494野生样本的熔链温度在52℃-57℃，突变样本的熔链温度比野生样本高4℃-7℃；12SrRNA-1555野生样本的熔链温度在58℃-63℃，突变样本的熔链温度比野生样本高4℃-7℃；
从图5-8可以看出，IVS7-2试剂检测10ng/反应的293细胞基因组DNA，在野生型熔链温度区间内有明显的熔解曲线峰，且熔链温度在51℃-56℃之间；GJB2试剂检测10ng/反应的293细胞基因组DNA，在野生型熔链温度区间内有明显的熔解曲线峰，且熔链温度在58℃-63℃之间；12SrRNA-1494试剂检测10ng/反应的293细胞基因组DNA，在野生型熔链温度区间内有明显的熔解曲线峰，且熔链温度在52℃-57℃之间；12SrRNA-1555试剂检测10ng/反应的293细胞基因组DNA，在野生型熔链温度区间内有明显的熔解曲线峰，且熔链温度在58℃-63℃之间。
实施例4
与实施例1、3相比，仅仅所述耳聋基因分子信标探针的长度为15bp，其他组分和条件与实施例1、3相同。
结果显示，发现该实施例PCR结果无荧光，无法完成PCR。
实施例5
与实施例1、3相比，仅仅所述耳聋基因分子信标探针的长度为30bp，其他组分和条件与实施例1、3相同。
结果显示，发现该实施例PCR结果无荧光，无法完成PCR。
实施例6
与实施例1、3相比，仅仅所述耳聋基因特异性分子信标探针的浓度为80nM，其他组分和条件与实施例1、3相同。
结果显示，实施例PCR结果检测限参考品10ng/反应的293细胞基因组DNA不能稳定检出。
实施例7
与实施例1、3相比，仅仅所述耳聋基因特异性分子信标探针为180nM，其他组分和条件与实施例1、3相同。
结果显示，实施例PCR结果检测限参考品10ng/反应的293细胞基因组DNA不能稳定检出。
对比例1
与实施例1、3相比，仅仅所述引物探针组合不同，根据突变位点随机设计了一组引物和探针，具体序列如下表4所示：
表4
其他组分和条件与实施例1、3相同，进行运行PCR反应程序，结果与实施例1对比如图9所示。
从图9可以看出，本实施例PCR结果可以看出，其溶解温度与野生型重合，其不能够准确的检测出位点的突变。
综上所述，本申请的耳聋基因检测试剂盒涵盖了重要的耳聋相关基因，通过本申请可以检测相关基因的突变情况，检测结果精准，试剂稳定性比同类产品要高。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 无锡市申瑞生物制品有限公司
<120> 一种耳聋基因突变检测的引物探针组合及其应用
<130> 2018
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 1
aaagttcagc attatttggt tgacaaa 27
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 2
tccatatgaa atggcagtag caatt 25
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 3
tgttttattt cggacgataa ttg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 4
caggctgcaa gaacgtgtgc tac 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 5
tcttctcatg tctccggtag gcca 24
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 6
ctatgggcct gcagctgat 19
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 7
gaaatgggct acattttcta cccca 25
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 8
taaatggttt ggctaaggtt gtct 24
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 9
ccgtcactct cctcaagta 19
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 10
atagaggagg caagtcgtaa ca 22

Claims (10)

1.一种耳聋基因检测的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括检测引物探针，所述检测引物探针包括对耳聋基因突变检测特异性引物对和耳聋基因特异性分子信标探针；
其中，所述耳聋基因的突变检测的位点为IVS7-2、GJB2、12S rRNA-1494和12S rRNA-1555突变位点。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述耳聋基因分子信标探针的长度为18-28bp，优选为19-25bp；
优选地，所述耳聋基因特异性分子信标探针的3’端带有淬灭基团；
优选地，所述淬灭基团选自DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Phosphorothioate中的任意一种或至少两种的组合，优选为BHQ-1；
优选地，所述耳聋基因特异性分子信标探针的5’端带有荧光集团；
优选地，所述荧光基团为FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA中的任意一种或至少两种的组合，优选为FAM和/或NED；
优选地，所述耳聋基因特异性分子信标探针的5’端的3个碱基进行硫代修饰。
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述耳聋基因IVS7-2突变检测特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述分子信标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
优选地，所述耳聋基因GJB2突变检测特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示，所述分子信标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
优选地，所述耳聋基因12S rRNA-1494和12S rRNA-1555突变检测特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示；
优选地，所述耳聋基因12S rRNA-1494的分子信标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
优选地，所述耳聋基因12S rRNA-1555的分子信标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
4.一种检测耳聋基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3中任一项所述的引物探针组合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控、阳性质控和辅助试剂；
优选地，所述阴性质控为TE缓冲液；
优选地，所述阳性质控为293细胞基因组DNA；
优选地，所述辅助试剂为Taq酶、dNTPs、MgCl2和PCR反应缓冲液。
6.一种利用如权利要求4或5所述的试剂盒用于检测耳聋基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取样本DNA；
(2)向步骤(1)样本DNA中加入PCR缓冲液、Taq酶、dNTPs、MgCl2、耳聋基因突变检测特异性引物对、耳聋基因的特异性分子信标探针、阳性质控和阴性质控；
(3)PCR扩增。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述MgCl2的浓度为1-8mM，优选为2.5-6mM；
优选地，所述dNTPs的浓度为0.1-1mM，优选为0.1-0.8mM；
优选地，所述Taq酶的浓度为0.02-0.08U/μl；
优选地，所述耳聋基因突变检测特异性引物对的浓度为500-900nM；
优选地，所述耳聋基因特异性分子信标探针的浓度为100-150nM；
优选地，所述阳性质控的浓度为1-5ng/μl，优选为2-3ng/μl。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的PCR扩增的条件为：
a)95℃预变性2min；
b)95℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸40s，45个循环；
c)40℃1min；
优选地，所述方法还包括荧光检测的步骤；
优选地，所述检测温度为40-80℃；
优选地，所述荧光检测结果的判定如下：
对于IVS7-2突变位点，若结果检测熔链温度为51-56℃，则为野生型；若结果检测熔链温度为55-63℃，则为突变型；
对于GJB2和12S rRNA-1555突变位点，若结果检测熔链温度为58-63℃，则为野生型；若结果检测熔链温度为62-70℃，则为突变型；
对于12S rRNA-1494突变位点，若结果检测熔链温度为52-57℃，则为野生型；若结果检测熔链温度为56-64℃，则为突变型。
9.一种检测耳聋基因突变的装置，其特征在于，包括：
(1)提取单元：用于提取样本DNA；
(2)配制反应单元：与提取单元相连，用于配制反应体系；
(3)扩增单元：与所述配制反应单元相连，用于PCR扩增；
(4)荧光检测单元：与所述扩增单元相连，用于荧光检测结果；
优选地，所述反应体系包括PCR缓冲液、Taq酶、dNTPs、MgCl2、耳聋基因突变检测特异性引物对、耳聋基因特异性分子信标探针、阳性质控和阴性质控。
10.一种如权利要求1-3中任一项所述的引物探针组合和/或如权利要求4或5所述的试剂盒用于制备辅助临床诊断耳聋的试剂和/或药物中的应用。
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