CN101532051A - 一种检测adh2基因多态性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及一种检测ADH2基因多态性的方法。本发明通过ADH2基因及其多态相关碱基序列特征分析，用碱基错配创造酶切位点原理设计引物，其中一条引物根据突变位点邻近序列设计，引入错配碱基，使引物3’端和单碱基突变的一种突变型在PCR扩增后形成一个酶切位点，然后用相应内切酶进行酶切鉴定。经实验验证引物设计合理，PCR扩增顺利，扩增DNA片段可被内切酶HhaI、HinP1I和BstUI及其同工酶识别其多态类型，BSTUI酶切后电泳图条带清晰，易于辨认，所用内切酶价格便宜，易获得，经测序验证，不同基因型序列特征与预期结果一致。经人群样本验证该方法稳定可靠。

Description

一种检测ADH2基因多态性的方法

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种ADH2基因多态性(rs1229984)检测方法。

背景技术

研究报道，乙醇摄入人体后很快经口腔、食道、胃、肠等消化，其中肝脏是其代谢最主要的器官，有90％-98％酒精在肝脏代谢。在正常情况下，低血浓度的乙醇主要经ADH乙醇氧化体系代谢，长期饮酒时高浓度乙醇则主要经微粒体乙醇氧化体系代谢^[1]。在ADH系统中的ADH2和ADH3存在基因多态现象，并表达不同的酶活性，进而影响机体对乙醇的易感性，其中最主要是ADH2，所以出现不同基因型的饮酒者对乙醇的敏感性，耐受性，酒后反应，饮酒行为等也有所不同，且其基因型的不同与引发疾病密切相关，是目前国内外的一个研究热点^[2，3]。目前ADH2多态检测方法主要包括聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)^[4]、等位基因特异PCR技术(AS-PCR)^[3]、Taqman技术^[5]和对抗两对引物PCR技术(PCR-CTPP)^[6]等。现有技术均存在下述不足之处：Taqman等技术所需仪器和试剂花费巨大，通常为大型研究机构和公司使用；AS-PCR需两次PCR反应造成样品和试剂用量增加，其使用的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染染色步骤繁琐；PCR-CTPP方法应用中通过在引物的3’端区域引入一个人为不匹配碱基来提高延伸反应的特异性，且其多重PCR反应的特殊性均可导致非特异条带和体系不稳定等情况出现。

经典的PCR-RFLP方法由于其操作简便，快速，终点判断准确而在基因多态检测中最为常用，早期的ADH2基因多态检测中多用此方法，但其所需的MaeШ来源稀少且价格不菲，从而在一定程度上限制了相关研究的开展。因此，建立一种简便快速且经济的ADH2基因分型方法很有必要性。

研究表明，在SNP无限制性酶切位点或者限制性内切酶价格昂贵的情况下，可以通过设计包含酶切位点的错配引物来克服，即创造酶切位点法PCR(CreatedRestriction Site PCR，CRS-PCR)。其原理是根据单碱基突变位点的碱基替代情况设计引物，其中一条引物根据突变位点邻近序列设计，人为引入错配碱基，使得引物3’端和单碱基突变的一种突变型在PCR扩增后形成一个酶切位点，然后应用相应的内切酶进行酶切鉴定^[7，8]。

与本发明有关的现有技术的参考文献有：

1 张竹梅，边建超.乙醇代谢酶基因多态与肿瘤关系研究进展[J].中华医学遗传学杂志，2001，18(1)：62-65

2 郭坤亮，季克良，王昌禄.酒精代谢及其相关基因遗传多态性[J].酿酒科技，2005，13(7)：36-38

3 曹西蓉，吴德生.AS-PCR在ADH2、ALDH2基因多态型分析中的应用[J].环境与职业医学，2004，21(5)：371-373

4 SAITO K，YOKOYAMA T，YOSHIIKE N，et al.Do the ethanol metabolizingenzymes modify the relationship between alcohol consumption and bloodpressure？[see comment][J].Journal of Hypertension，2003，21(6)：1097-1105

5 HIRAKI A，MATSUO K，WAKAI K，et al.Gene-gene and gene-environmentinteractions between alcohol drinking habit and polymorphisms inalcohol-metabolizing enzyme genes and the risk of head and neck cancerin Japan[J].Cancer Science，2007，98(7)：1087-1091

6 TAMAKOSHI A HNKHWKKNSTIHHKTTTK.Duplex polymerase chain reaction withconfronting two-pair primers(PCR-CTPP)for genotyping alcoholdehydrogenase beta subunit(ADH2)and aldehyde dehydrogenase 2(ALDH2)[J].Alcohol & Alcoholism，2003，38(5)：407-410

7 张忠彬，朱人，夏昭林.应用CRS-RFLP技术检测hOGG1c.326位点的单核苷酸多态性[J].中国工业医学杂志，2004，17(5)：293-295

8 赵春江，李宁，邓学梅.应用创造酶切位点法检测单碱基突变[J].遗传，2003，25(3)：327-329

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术存在的缺陷，提供一种检测ADH2基因多态性(rs1229984)方法。

本发明采用CRS方法设计适合的引物并选定廉价的内切酶进行PCR-RFLP多态检测，即采用CRS-PCR-RFLP的检测方法对ADH2多态进行检测。

本发明应用碱基错配创造酶切位点原理设计引物，设计一对创造酶切位点引物扩增含多态的DNA片段，扩增后不同多态类型的DNA片段经限制性内切酶HhaI、HinP1I或者BstUI及其同工酶酶切后得电泳图谱，依据获得的电泳图谱条带类型判断ADH2基因多态类型。

本方法包括下述步骤：

1)序列搜索与多态位点确定，

确定ADH2多态位点为A/G多态rs1229984，位于第4染色体，第3外显子，基因组位置3240；

2)序列分析与引物设计，

上游P1：5’GGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATACA3’

下游P2：5’CACTAACCACGAGGTCATCTGCG3’

3)PCR扩增和RFLP分析；

4)基因型的判断；

5)ADH2基因多态结果鉴定。

本发明针对原有ADH2基因第3外显子3240位点多态(rs1229984)PCR-RFLP方法检测中内切酶价格昂贵且难以获得的缺点，应用碱基错配创造酶切位点原理设计引物，设计一对创造酶切位点引物扩增含多态位点的DNA片段，扩增后不同多态类型的DNA片段经限制性内切酶HhaI、HinP1I或BstUI酶切后能显示不同的电泳图谱，依据条带类型可判断多态类型。引物设计后通过实验表明PCR扩增顺利，Bsh1236I(BstUI的同工酶)酶切后电泳图谱条带清晰，易于辨认。本发明所采用的限制性内切酶HhaI、HinP1I和BstUI内切酶价格便宜，易于获得，可任选其一进行酶切实验。经测序验证不同基因型序列特征，结果与预期完全一致。

附图说明

图1是ADH2基因3240位点PCR产物经Bsh1236I酶切后电泳图谱，

其中，M：DNA分子量标准；泳道1，2：AG；泳道3：GG；泳道4：AA。

图2是ADH2基因3种多态测序图。

具体实施方式

实施例1

1、序列搜索与多态位点确定

根据NCBI的GENE和SNP数据库，获取ADH2基因全序列及多态位点信息，确定拟研究多态位点。所述的ADH2基因全序列和ADH2多态位点信息从下述网页获得：

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nuccore&id＝89161207，

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp ref.cgi？rs＝1229984，

根据上述网页的信息和有关文献，本发明确定ADH2多态位点为A/G多态(rs1229984)，位于第4染色体，第3外显子，基因组位置3240。

2、序列分析与引物设计

经序列分析得知：A/G多态可由Tsp45I、Ms1I和MaeIII三种内切酶(及其同工酶)识别，即A等位基因可被三种内切酶切开，而G等位基因不能被切开。如通过碱基错配PCR将多态位点后面第二位碱基A替换为G，则该多态可由HhaI、HinP1I和BstUI内切酶及其同工酶识别，即G等位基因可被两种内切酶切开，而A等位基因不能切开。HhaI、HinP1I和BstUI内切酶相比原有的三种内切酶具有价格优势(见表1)，而且无商品化的MaeIII，另外多家公司均无MaeIII。

表1 几种内切酶识别序列及其NEB公司价格

本发明根据上述分析选择错配碱基创造酶切位点方法设计引物，通过Bsh1236I(BstUI的同工酶)进行酶切识别。

首先根据序列确定上游引物的位置与长度，然后搜索适合的下游引物。本发明设计的引物如下述：

上游P1：5’GGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATACA3’

下游P2：5’CACTAACCACGAGGTCATCTGCG3’

设计引物及对应扩增序列如下述：

GGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATACA(上游引物5’-3’)

GGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATACAttttagaaacacaatttcaggaattt

gggtatgttaaattcatctagttacaatcttttctgaatctgaacagcttctctttattctgtagatggtggctg

taggaatctgt

CAGATGACCACGTGGTTAGTG

             GCGTCTACTGGAGCACCAATCAC(下游引物3’-5’)

其中，大写碱基为引物及其对应的基因组碱基，小写字母为PCR扩增的碱基序列，下划线A碱基为错配碱基用来消除引物二聚体和发夹结构，下划线C碱基为错配碱基用来创造酶切位点，黑体碱基a为多态位点碱基。扩增后加框部分序列由CACA或CGCA(其中第二个碱基A可为G代替即A/G多态)更改为CACG或CGCG，而HhaI和HinP1I识别CGCG序列，可用来判断基因型。扩增后多态位点处A开始四个碱基序列由ACAC或GCAC(其中第一个碱基A可为G代替即A/G多态)更改为ACGC或GCGC，而BstUI可识别GCGC序列，可用来判断基因型。HhaI、HinP1I酶切结果判断与BstUI电泳图谱相似。

3.PCR扩增和RFLP分析

仪器：9600型PCR仪(PE公司)，微型电泳槽(Pharmacia Biotech，EPS1000)，Gel Doc 2000凝胶成像仪(Bio-RAD公司)。试剂：2×PCR mix(MBI公司)，限制性内切酶Bsh1236I(MBI公司)，琼脂糖(BBI公司)，引物由上海Sangon公司合成。

经知情同意提取397例人外周血基因组DNA用于实验验证。各取50ng的基因组DNA，每个引物0.2μmol/L，1×PCRmix，ddH₂O组成25μl反应体系。PCR反应条件为首先94℃预变性5min，然后94℃变性30s，根据引物Tm值取60℃退火20s，72℃延伸20s，共30个循环后72℃延伸10min。PCR扩增后，取PCR产物10μl，加入5u内切酶和2μl10×酶切缓冲液和ddH₂O组成20μl反应体系，37℃水浴中酶切2～16h后，电泳后于凝胶成像仪观察成像。

4.基因型的判断

ADH2位点扩增后出现165bp片断，经Bsh1236I酶切后可出现165bp、142bp、23bp三种片断(其中23bp电泳图中不能看到)。检测结果发现ADH2出现野生型、杂合型和突变型三种基因型。酶切后基因型判断：野生型AA为165bp，杂合型AG有165bp和142bp两种片段，突变型GG为142bp。酶切图谱见图1。

5.ADH2基因多态结果鉴定

ADH2野生型、杂合型和突变型PCR产物随机各取一例进行测序鉴定(上海生工生物工程有限公司)。测序结果如图2，其中AA，GG，AG三种基因型测序图谱按对应位置上下依次排列，并将AA型测序图所对应的碱基序列显示在第一行。测序图中每个峰代表一个碱基，而不同颜色代表不同的碱基类型，A为绿色，T为红色，C为蓝色，G为黑色。其中单下划线字母A对应多态碱基所在位置，结果AA型测序显示多态位点为A，GG型显示为G，AG型显示为双峰，即AG杂合子。双下划线字母G为错配碱基所形成的序列，原序列中A在PCR扩增后改变为G，从而可与附近碱基形成酶切位点。测序结果与预期结果完全一致。

6.ADH2基因多态人群分布与Hardy-Weinberg遗传平衡检验

检测397例测试者ADH2基因多态性，其中ADH2野生型216例(54.41％)，杂合型158例(占38.80％)，突变型23例(占5.80％)。该基因多态分布经Hardy-Weinberg遗传平衡检验，均达到遗传平衡(P>0.05)。其频率与相关研究结果相似(张竹梅，刘茶珍，边建超，等.洛阳市汉族群体ADH2和ALDH2的基因多态性研究.遗传，2002，24(5)：532-536)。

Claims (5)

1、一种检测ADH2基因多态性的方法，其特征是应用碱基错配创造酶切位点原理设计引物，设计一对创造酶切位点引物扩增含多态的DNA片段，扩增后不同多态类型的DNA片段经限制性内切酶HhaI、HinP1I或者BstUI及其同工酶酶切后得电泳图谱，依据获得的电泳图谱条带类型判断ADH2基因多态类型。

2、按权利要求1所述的ADH2基因多态性检测方法，其特征是包括下述步骤：

1)序列搜索与多态位点确定，

确定ADH2多态位点为A/G多态rs1229984，位于第4染色体，第3外显子，基因组位置3240；

2)序列分析与引物设计，

上游P1：5’GGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATACA 3’

下游P2：5’CACTAACCACGAGGTCATCTGCG 3’

3)PCR扩增和RFLP分析；

4)基因型的判断；

5)ADH2基因多态结果鉴定。

3、按权利要求2所述方法，其中所述的PCR扩增和RFLP分析步骤是：取50ng的基因组DNA，每个引物0.2μmol/L，1×PCRmix，ddH₂O组成25μl反应体系，PCR反应条件为首先94℃预变性5min，然后94℃变性30s，根据引物Tm值取60℃退火20s，72℃延伸20s，共30个循环后72℃延伸10min；

PCR扩增后，取PCR产物10μl，加入5u内切酶和2μl 10×酶切缓冲液和ddH₂O组成20μl反应体系，37℃水浴中酶切2～16h后，电泳后于凝胶成像仪观察成像。

4、按权利要求2所述方法，其中所述的基因型的判断步骤是：ADH2位点扩增后出现165bp片断，经Bsh1236I酶切后出现165bp、142bp和23bp三种片断，判断为ADH2的野生型、杂合型和突变型三种基因型；经酶切后基因型判断为：野生型AA为165bp，杂合型AG有165bp和142bp两种片段，突变型GG为142bp。

5、按权利要求2所述方法，其中所述的ADH2基因多态鉴定步骤是：

ADH2野生型、杂合型和突变型PCR产物随机各取一例进行测序鉴定，

其中AA，GG，AG三种基因型测序图谱按对应位置上下依次排列，AA型测序显示多态位点为A，GG型显示为G，AG型显示为双峰，即AG杂合子。

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