CN1560276A - 一组引物及其设计方法和在单核苷酸多态性检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一组用于扩增基因片段的引物，该组引物包括两对引物，两对引物或者是引物对中的上下游引物和模板完全配对；或者是引物对的上游引物或者下游引物之一和模板DNA完全配对，而另外一条和模板DNA不完全配对。如此设计而成的引物可通过巢式PCR对任意待测基因片段进行扩增后形成限制性内切酶Hind III、EcoR I或Bam HI的识别序列，并与RFLP相关联，以限制性内切酶Hind III、EcoR I或Bam HI对扩增片段进行酶切反应，最后根据酶切片段片段大小对SNP进行检定。

Description

一组引物及其设计方法和在单核苷酸多态性检测中的应用

技术领域

本发明涉及一组引物，尤其是一组利用PCR扩增和RFLP相关联的技术对待扩增基因片段上的单核苷酸多态性(SNP)位点进行检测分型的引物及其应用。

技术背景

随着人类基因组计划的完成，人们对基因功能的研究便不断的加强，并发现在人类基因组的DNA序列中每600个碱基中便有一个碱基是有多态性的，即人们常说的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)，并且发现这些位点含有重要的遗传学信息(Nila，P.Anthony，J.B.David，A.H.Wade，A.Barrett，J.M.Doshi，C.R.Hacker，C.R.Kautzer，D.H.Lee，C.M.David，P.M.Bich，T.N.Nguyen，M.C.Norris，J.B.Sheehan，N.S.David，S.R.P.Stokowski，D.J.Thomas，M.O.Trulson，K.R.Vyas，K.A.Frazer，S.P.A.Fodor，D.R.C.(2001)Blocks of Limited Haplotype DiversityRevealed by High-Resolution Scanning of Human Chromosome.Science，21，1719-23.)。SNPs尤其是cSNPs是反映个体遗传特征的十分有效的标记，并被作为连锁分析的遗传标记用于基因的定位与基因诊断，不同的研究者相继发现并应用了许多不同的实验方法，其中Brian，W.K.，Matthew，F.，Reyna，F.，Richard，M.K and Francis，B.(2002)Single nucleotide polymorohismseeking long term association with complex disease.Nucleic Acids Res.，30，3295-3311.提到的PCR-RFLP(Polymerase Chain Reaction-Restrictionfragment length polymorphism，聚合酶链式反应一限制性片段长度多态性)是较简洁并且相对经济的一种技术，但是在这一技术中需要在SNP位点的周围能有某个已经商业化的限制性内切酶的酶切位点，但是大多数的SNP位点却没有相应的限制性内切酶的识别序列。

目前市场上比较成熟而且比较经济的限制性内切酶有Hind III、EcoR I或者Bam H I等，而且这些限制性内切酶的活性较高，其他一些限制性内切酶大多存在价格昂贵或者酶切活性较低等不足。虽然有些报道，例如Xiao，J.H.，Hu，F.Xu.，H.Y.(1999)Provincial distribution of three HIV-1 resistantpolymorphisms(CCR5-Δ32，CCR2-64I，and SDF1-3’A)in China.Science inChina(Series C).29，556-560，对某些SNP位点周围的一个或者两个碱基进行改造，从而人为形成某个酶的切点，但是在这种情况下所形成的切点所需要的酶很大情况下是稀有的酶，这些酶的价格往往比较的高而且酶切效率也较低，而且对于不同SNP的引物而言，由于3’端的序列的差异因而需要不同的PCR扩增条件，需要实验者针对不同的引物尝试不同的PCR扩增条件，这又增加了实验者的负担同时由于需要尝试不同的PCR条件从而还浪费了很多的DNA资源。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是在于公开一组引物，尤其是一组可通过PCR和RFLP相关联对待测基因片段上的SNP进行检测分型的一组引物及其设计方法和应用。以解决现有技术中没有限制性酶切位点难以检测的SNP，或者是可用于检测的限制性内切酶价格昂贵的缺点。

本发明的技术构思是这样的：本发明所采取的方法是对PCR-RFLP中PCR引物进行改造来解决当RFLP中所涉及的限制性内切酶价格昂贵实验成本较高以及对不同的位点需要尝试不同的PCR扩增条件等问题；同时利用“巢式”PCR反应的原理对模板进行扩增，对扩增片段利用较常见且价格便宜的限制性内切酶进行切割，通过酶切片段电泳显示，判断该位点是野生型还是突变型。

本发明的技术方案：

本发明的PCR引物，有两种引物对构成：第一种引物对中的上下游引物和模板完全配对；第二种对引物对的上游引物或者下游引物之一和模板DNA完全配对，而另外一条和模板DNA不完全配对，与模板不完全配对的引物包含两个部分：第一部分为引物的和模板相关部分，位于引物的5’端；第二部分为和限制性内切酶识别序列相关部分，位于引物的3’端，并且其序列和模板不完全配对。上述引物的总长度在15-35bp之间，优选的为25-30bp。其中与模板不完全配对的那条引物，其与模板DNA相配对的部分为10-30bp，优选的为20-25bp，与模板DNA不相配对的部分为3-5bp，优选的为4-5bp。

PCR扩增时根据模板序列和限制性内切酶识别的核苷酸序列的差异，应用本发明时可以使用一对第一种引物对和一对第二种引物对的混合(第一组引物)，也可以仅使用两对第二种引物对(第二组引物)。如SNP位点的任意一侧的4-5个硷基中有一个或两个硷基与限制性内切酶的识别序列不相配对时，PCR扩增时使用一对第一种引物对和一对第二种引物对；如在SNP位点周围硷基中有三个或四个硷基和限制性内切酶识别序列不配对，则选用两对第二种引物对。所述的限制性内切酶优选的为Hind III，EcoRI或者Bam H I中的一种。

具体的针对某一待检基因片段的扩增引物在具体实施方式中详细列出。

本发明的引物可用于待检基因片段中单核苷酸的多态性位点检测，尤其是在突变位点周围大约30个碱基内没有其他的单一位点突变。而SNP位点的差异和一些疾病相关，因而可用于疾病相关基因的定位和疾病诊断和疾病筛选，因而可利用本发明中的引物及相关的PCR-RFLP进行疾病诊断试剂盒的研制开发。

使用本发明的引物，关联PCR和RFLP进行SNP检测分型，具体包括如下步骤：

1.引物设计

分析模板中SNP位点周围的序列特征，如SNP位点的任意一侧的4-5个硷基中有一个或两个硷基与限制性内切酶的识别序列不相配对时，PCR扩增时使用一对第一种引物对和一对第二种引物对；如在SNP位点周围硷基中有三个或四个硷基和限制性内切酶识别序列不配对，则选用两对第二种引物对。

2.PCR和RFLP关联检测

(1)PCR反应

(a)当用到第一组或第二组引物中的一对引物时步骤如下：

将5-15ng模板、PCR引物各1-30pmol、高温聚合酶1-5U，2μl缓冲液，混合反应，反应条件为：90-98℃，30秒，50-60℃30秒，72℃45秒，循环1-40次；此法所用高温聚合酶可以是Taq聚合酶、Tth聚合酶、Pfu聚合酶等。

(b)当用到第一组或者第二组引物中的两对引物时步骤如下

此时本发明方法涉及两次PCR反应，分别使用两组不同的引物，第一次PCR反应步骤为：将5-15ng模板、第一对PCR引物各1-30pmol、高温聚合酶1-5U，2μl高温聚合酶缓冲液，混合反应，反应条件为：90-98℃30秒，50-60℃30秒，72℃45秒，循环1-30次；此法所用高温聚合酶可以是Taq聚合酶、Tth聚合酶、Pfu聚合酶等。

第二次PCR反应步骤为：将第一次PCR反应产物稀释1-100倍，取1-10μl作为模板、第二对PCR引物各1-30pmol、高温聚合酶1-5U，2μl缓冲液，混合反应，反应条件为：90-98℃30秒，50-60℃30秒，72℃45秒，循环1-30次；此法所用高温聚合酶可以是Taq聚合酶、Tth聚合酶、Pfu聚合酶等。

(2)RFLP反应

将最终PCR产物取1-10μl，1-20μl缓冲反应液，限制性内切酶1-10U，25-65℃，孵育1-10小时，此法所用的限制性内切酶可以是Hind III，EcoR I或者Bam H I等。如果样本是SNP位点的某一特定分型，则其PCR产物序列将与限制性内切酶识别序列一致，则产物可以被该酶切成较小片段；如果样本是SNP位点的另一分型，则其PCR产物序列将与限制性内切酶识别序列不一致，则产物不能被该酶切成较小片段。

3.结果检测

取酶切产物1-5μl与1-10μl上样缓冲液混合，通过0.5-3.0％的琼脂糖凝胶电泳读取结果。

本发明的引物不但可以用于PCR和RFLP关联单个SNP位点检测分型，还可以用于PCR和RFLP关联对多个SNP位点检测分型，以及用于单个SNP位点和多个SNP位点检测分型的试剂盒。

本发明的优点和效果：

1.本发明解决了用PCR和RFLP关联对SNP检测分型中出现的无法找到限制性内切酶的识别序列即酶切位点的问题；

2.本发明解决了在用PCR和RFLP关联对SNP检测分型中出现酶切位点所涉及的限制性内切酶的价格表较昂贵实验成本比较高的问题；

3.本发明解决了在用PCR和RFLP关联对SNP检测分型中出现的对不同的位点需要尝试不同的PCR扩增条件的不足；

4.本发明利用“巢式”PCR解决了模板DNA资源浪费的问题。

5.根据SNP相关的遗传性疾病的说明，利用本发明，在检测连锁分析的遗传标记SNP用于基因的定位与基因诊断上如：儿童性早熟，成人多囊肾，心血管疾病和神经性疾病等将有很好的效果。

附图说明

图1为将7份已知样本以本发明方法处理后的电泳结果。

图2为以CYP3A4(Gene ID#2242280)为例，将其序列改造为限制性内切酶Barn H I的识别位点GGATCC，改造后的PCR产物测序结果。

图3为单位点检测分型。

图4为多位点检测分型。

具体实施方式

                      实施例1

1.引物的设计：

当SNP位点附近序列只有2个位点和已知酶的识别序列不一致时以GnRH(rs1567126)基因上位点之一为例进行说明，该位点附近的序列为：3’G/TTGC GTGGAA GGCTGCTCCA GCCAGCACTG GTCCTATGGACTGCGCCCTG GAGG 5’，引物设计如下：

该序列和限制性内切酶Hind III的识别序列5’AAGCTT 3’有2个不配对的碱基分别在3’末端的第5位和6位，上面序列用横线标出部分，在设计和模板不完全配对的一条引物时，引物的第二部分便根据Hind III能识别的序列将这两个碱基5位G改为A，第6位碱基T改为A。

原来的DNA序列	G/TTGC GTGGAAGGCTGCTCCAGCCAGCACTGGTCCTATGGA CTGCGCCCTG
		第一对引物	5′CAG GAC ACT GGGCAT CTG GGA TAAATC TCT 3′
5′CTC AAA TTC AGT GGA CTA CCC CTTGGA AAG 3′
	第二对引物		5′AAC TCC TAG CTG TCC TTA TTC TACTGA ATT 3′
5′GGT CAT GAT TGA CCT CGG AAG G AACGT 3′
		限制性内切酶	Hind III
PCR产物的长度	189bp

2.当SNP位点附近序列有3个位点和已知酶的识别序列不一致时

以CYP3A4^*1B例，针对此序列和限制性内切酶Hind III的识别序列进行改造：

限制性内切酶Hind III识别序列为：AAGCTT

CYP3A4^*1B位点附近的序列为：5’TGG CAT AAA ATC TAT TAAATC TGT T CT CCT C/TTC TCT C 3’其中和限制性内切酶Hind III识别序列不相同的碱基有3个，横线标出，第二对引物中和模板DNA不完全配对的引物中改造的一个碱基下划线标出，另外一条不完全和模板DNA配对的引物改造剩余的两个碱基的引物下划线标出。

原来的DNA序列	TGG CAT AAA ATC TAT TAA ATC TGT T CT CCTC/TTC TCT C
		第一对引物	5′GAA GTC ACC AGA AAG TCA GAA GGATGC ATA 3′
5′TGG CAT AAA ATC TAT TAA ATC TGT TCAGCT 3′
	第二对引物		5′GTT TGG AAG GAT GTG TAG GAG TCT TCTAGG 3′
5′TGG CAT AAA ATC TAT TAA ATC TGT T AAGCT 3′
		限制性内切酶	Hind III
PCR产物的长度	163bp

图3为将6份已知样本以本发明方法处理后的电泳结果，泳道6为CYP3A4^*1B位点纯合子AA，泳道4则为该位点杂合子GA，其余泳道的为该位点GG纯合子，此结果与已知情况相符。

                        实施例2

对一个SNP位点进行检测：以GnRH(Gene ID rs 1567126)位点为例，具体实施步骤如下：

1.引物设计

按照实施例1的方法进行引物设计，结果如下：

原来的DNA序列	G/TTGC GTGGAAGGCTGCTCCAGCCAGCACTGGTCCTATGGA CTGCGCCCTG
		第一对引物	5′CAG GAC ACT GGG CAT CTG GGA TAAATC TCT 3′
5′CTC AAA TTC AGT GGA CTA CCC CTTGGA AAG 3′
	第二对引物		5′AAC TCC TAG CTG TCC TTA TTC TACTGA ATT 3′
5′GGT CAT GAT TGA CCT CGG AAG G AACGT 3′

2.PCR反应条件：两次PCR

第一次PCR反应：针对第一对引物以及从人外周血中提取的DNA为模板，电泳定量模板的浓度为5-15ng/μl。20μl的反应体系中反应混合液为200μM dATP，200μM dTTP，200μM dCTP，200μM dGTP，2mM MgCl₂，2U Taq DNA聚合酶，上下游引物各30Pmol，反应条件为：94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒，循环30次；

第二次PCR反应：20μl的反应体系中反应混合液为200μM dATP，200μM dTTP，200μM dCTP，200μM dGTP，2mM MgCl₂，2U Taq DNA聚合酶，第一次PCR产物稀释5倍后取1μl作为模板，第二对引物各1-30pmol，第二对引物中的一条引物的3’末端含2个和模板不配对的碱基。反应条件采用两步退火：94℃30秒，67℃10秒，56℃30秒，72℃45秒，循环30次；

3.PCR产物酶切，即RFLP的检测：

将最终PCR产物取1-10μl，1-20μl缓冲反应液，限制性内切酶HindIII 1-10U，25-65℃，孵育1-10小时。如果样本是SNP位点的某一特定分型如TT，则其PCR产物序列将与限制性内切酶识别序列一致，则产物可以被该酶切成较小片段；如果样本是SNP位点的另一分型GG或者GT，则其PCR产物序列将与限制性内切酶识别序列不一致或者部分不一致，则产物不能或者部分不能被该酶切成较小片段。

4.3.0％琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示，泳道1和6为GnRH位点纯合子GG，泳道2，3，4和5则为该位点纯合子TT，泳道7为该位点杂合子GT，此结果与已知情况相符。由于30bp的小片段在3.0％的琼脂糖凝胶上，紫外检测不出，因而只有133bp的片段可见。

                         实施例3

以CYP3A4^*1、CYP3A4^*4、CYP3A4^*5、CYP3A4^*6、JSNP为例，对多个SNP位点进行检测分型。

1.引物设计

CYP3A4*1原来的DNA序列	TGG CAT AAA ATC TAT TAA ATC TGT T CT CCT C/TTC TCT C
		第一对引物	5′GAA GTC ACC AGA AAG TCA GAA GGATGC ATA 3′
5′TGG CAT AAA ATC TAT TAA ATC GCC TCTATC 3′
	第二对引物		5′GTT TGG AAG GAT GTGTAG GAG TCT TCTAGG 3′
5′TGG CAT AAA ATC TAT TAA ATC GCC TC A AGC 3′
		限制性内切酶	Hind III

PCR产物的长度(bp)	132
		JSNP原来的DNA序列	gcagttttacccaataaggtgagtggatgg(t)acatggagaaggaggg
第一对引物	5′CAC ATC AGA ATG TAA CGA CCC CCA GTGTAC 3′
		5′GGT TTC ACC TCC TCC CTC CTT CTC CA GGT C 3’
	第二对引物		5′CGT GGC CCA ATC AAT TAT CTT TAT TTTTGC 3′
5′GGT TTC ACC TCC TCC CTC CTT CTC CGGAT C 3′
		限制性内切酶	BamH I
PCR产物的长度(bp)	154

其中CYP3A4^*4序列，改造前：TAAGGTGAGTGGATG GCATGCGGAT，改造为限制性内切酶Bam H I的识别位点GGATCC，改造后的PCR产物测序结果如图2所示。

第一对或者第二对PCR引物各一对共5对引物，同时加入PCR反应体系，即所谓的”巢式”PCR，同样进行两次PCR扩增

第一次PCR反应：分别针对五对引物，以及从人外周血中提取的DNA为模板，电泳定量模板的浓度为10ng/μl。20μl-的反应体系中反应混合液为200μM dATP，200μM dTTP，200μM dCTP，200μM dGTP，2mM MgCl₂，2U Taq DNA聚合酶，5对上下游引物各3Pmol，其中下游引物3’末端含有1-2个和模板DNA不配对的碱基，反应条件为两步退火：94℃30秒，67℃10秒，56℃30秒，72℃45秒，循环30次；

第二次PCR反应：20μl的反应体系中反应混合液为200μM dATP，200μMdTTP，200μM dCTP，200μM dGTP，2mM MgCl₂，2U Taq DNA聚合酶，第一次PCR产物稀释5倍后取1μl作为模板，分别进行目标片段的扩增，第二对引物各30Pmol，下游引物的3’末端含至少2个和模板不配对的碱基。反应条件采用两步退火：94℃30秒，67℃10秒，56℃30秒，72℃45秒，循环30次；

3.PCR产物酶切，即RFLP的检测：

将最终PCR产物取1-10μl，1-20μl缓冲反应液，各自不同的限制性内切酶1-10U，25-65℃，孵育1-10小时。如果样本是SNP位点的某一特定分型，则其PCR产物序列将与限制性内切酶识别序列一致，则产物可以被该酶切成较小片段；如果样本是SNP位点的另一分型，则其PCR产物序列将与限制性内切酶识别序列不一致，则产物不能或者部分不能被该酶切成较小片段。

4. 3.0％琼脂糖凝胶电泳检测，如图4所示各自不同的限制性内切酶酶切各自不同的PCR反应产物的结果。自右1至左10相临两泳道分别是PCR产物和他们相应的限制性内切酶结果。泳道1、3、5、7、9分别为位点CYP3A4^*1、CYP3A4^*4、CYP3A4^*5、CYP3A4^*6、JSNP使用本发明方法两次PCR产物的电泳结果，泳道2、4、6、8、10为位点CYP3A4^*1、CYP3A4^*4、CYP3A4^*5、CYP3A4^*6、JSNP上述PCR产物经限制性内切酶酶切产物电泳结果，由图可以看出以上样本均为野生型，与结果相符。

Claims (18)

1.一组用于扩增基因片段的引物，其特征在于该组引物包括两对引物，这两对引物分别为下述引物对中的一种：

第一种引物对中的上下游引物和模板完全配对；第二种引物对的上游引物或者下游引物之一和模板DNA完全配对，而另外一条和模板DNA不完全配对。

2.一组如权利要求1所述的引物，其特征在于第二种引物对中与模板不完全配对的那条引物包含两个部分，第一部分为引物和模板相关部分，位于引物的5’端；第二部分为和限制性内切酶识别序列相关部分，位于引物的3’端，并且其序列和模板不完全配对。

3.一组如权利要求1所述的引物，其特征在于引物的总长度在15-35bp之间。

4.一组如权利要求3所述的引物，其特征在于引物的总长度在25-30bp之间。

5.一组如权利要求1-3任一项所述的引物，其特征在于其中与模板DNA不完全配对的那条引物，其与模板DNA相配对的部分为10-30bp，与模板DNA不相配对的部分为3-5bp。

6.一组如权利要求5所述的引物，其特征在于其中与模板DNA不完全配对的那条引物，其与模板DNA相配对的部分为为20-25bp，与模板DNA不相配对的部分为4-5bp。

7.一组如权利要求1-3任一项所述的引物，其特征在于该组引物的序列为：

第一对引物：5′CAG GAC ACT GGG CAT CTG GGA TAA ATC TCT 3′

            5′CTC AAA TTC AGT GGA CTA CCC CTT GGA AAG 3′

第二对引物：5′AAC TCC TAG CTG TCC TTA TTC TAC TGA ATT 3′

            5′GGT CAT GAT TGA CCT CGG AAG G AA CGT 3′

8.一组如权利要求1-3任一项所述的引物，其特征在于该组引物的序列为：

第一对引物：5′GAA GTC ACC AGA AAG TCA GAA GGA TGC ATA 3′

            5′TGG CAT AAA ATC TAT TAA ATC TGT TCA  GCT 3′

第二对引物：5′GTT TGG AAG GAT GTG TAG GAG TCT TCT AGG 3′

            5′TGG CAT AAA ATC TAT TAA ATC TGT T AA GCT 3′

9.一组如权利要求1-3任一项所述的引物，其特征在于该组引物的序列为：

第一对引物：5′GAA GTC ACC AGA AAG TCA GAA GGA TGC ATA 3′

            5′TGG CAT AAA ATC TAT TAA ATC GCC TCT  ATC 3′

第二对引物：5′GTT TGG AAG GAT GTG TAG GAG TCT TCT AGG 3′

            5′TGG CAT AAA ATC TAT TAA ATC GCC TC A AGC 3′

10.一组如权利要求1-3任一项所述的引物，其特征在于该组引物的序列为：

第一对引物：5′CAG GAC ACT GGG CAT CTG GGA TAA ATC TCT 3′

            5′CTC AAA TTC AGT GGA CTA CCC CTT GGA AAG 3′

第二对引物：5′GCC CAT CAC CCA GTA GAC AGT CAC TAA ATA 3′

            5′TCT TCC ATT CTT CAT CCT CAG ATC CG G AT C 3′

11.一组如权利要求1-3任一项所述的引物，其特征在于该组引物的序列为：

第一对引物：5′AGT GTG ATA GAA GGT GAT CTA GTA GAT CTG 3′

            5′GAA AGT TGA TTA GTG GTT GCA TAT GAT GAT 3′

第二对引物：5′TGA CTG GAC ATG TGG GTT TCC TGT TGC GTG 3′

            5′CAG TTA TTT TTA AGA GAG AAA GAT AAA TTA 3′

12.一组如权利要求1-3任一项所述的引物，其特征在于该组引物的序列为：

第一对引物：5′ACA CAT TCT CAA ATG AAA GTC CCT ATC AGG 3′

            5′TGG GAC TCA GTT TCT TTT GAA  CTC TGA  AAG 3′

第二对引物：5′GAC CAC GCT GTG ATT ACT TCT GAC TTC AGG 3′

            5′TGG GAC TCA GTT TCT TTT  CAA CTC TG G AA T 3′

13.一组如权利要求1-3任一项所述的引物，其特征在于该组引物的序列为：

第一对引物：5′CAC ATC AGA ATG TAA CGA CCC CCA GTG TAC 3′

            5′GGT TTC ACC TCC TCC CTC CTT CTC CA G GT C 3’

第二对引物：5′CGT GGC CCA ATC AAT TAT CTT TAT TTT TGC 3′

            5′GGT TTC ACC TCC TCC CTC CTT CTC CGG  AT C 3′

14.一组如权利一切1-13任一项所述引物的设计方法，其特征在于该组引物包括两对引物，这两对引物分别为下述引物对中的一种：

第一种引物对中的上下游引物和模板完全配对；第二种引物对的上游引物或者下游引物之一和模板DNA完全配对，而另外一条和模板DNA不完全配对；

其中第二种引物对中与模板不完全配对的那条引物包含两个部分，第一部分为引物和模板相关部分，位于引物的5’端；第二部分为和限制性内切酶识别序列相关部分，位于引物的3’端，并且其序列和模板不完全配对。

15.一组如权利要求1-13任一项所述引物在SNP检测中的应用，其中SNP位点可为1-5个。

16.一种如权利要求15所述的应用，其特征在于通过引物，对待测基因片段进行PCR扩增，然后通过限制性内切酶进行酶切，根据酶切片段的长度，进行SNP的检定。

17.一种如权利要求16所述的应用，其特征在于所述的PCR扩增为巢式PCR扩增。

18.一种如权利要求16所述的应用，其特征在于所述的限制性内切酶为HindIII、EcoR I或Bam HI中的一种。

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