CN1501982A - 等位基因的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供分离和鉴定基因组DNA样品中的等位基因，从而分离和鉴定单元型的方法和试剂盒。该方法通常涉及使对等位基因中的多态性位点特异的引物与该DNA样品杂交，将引物延伸一个或多个核酸，分离延伸的引物，并且利用延伸的引物鉴定等位基因。该方法还可以进行两个引物的连接，它们的分离以及接着在鉴定目标等位基因中的应用。该方法中还可以使用另一种引物作为延伸第一引物的封闭位点，以便复制和鉴定包含多态性位点的DNA片段。可以对延伸或没有延伸的引物进行标记，使得引物容易被分离和/或鉴定。

Description

等位基因的测定方法
技术领域
本发明涉及通过鉴定基因中一个或多个异源序列位点而分离和鉴定等位基因的方法。更具体地，本发明涉及使用一个或多个引物分离和鉴定等位基因的方法。
发明背景
个体之间序列差异最常见的形式是单核苷酸多态性，普遍公知为SNP。随着人体基因组计划的完成，估计SNP存在的平均数是每1000个核苷酸中有一个，但是在某些DNA区存在的频率更高一些。现在努力的焦点在于利用SNP来鉴定与疾病或药物反应有关的靶基因。但是，由于关联性不强，很多科学家和研究人员怀疑以个体SNP为基础对药物和疾病个性化的观点，从而单元型(Haplotype)分析的重要性浮现出来，成为SNP医学应用的关键方法。
单元型是个体SNP沿着给定DNA片段的组织形式，这是普遍公知的。单元型的经典定义是单一染色体中趋向于在给定种群中共同从一代遗传到下一代的紧密连锁基因座的等位基因组合。分子单元型测定的另一方面是连锁不平衡图谱的绘制，其现在被认为是疾病基因的定位克隆中的重要工具，随着复杂表型的遗传学刨析，很多种应用就变得显而易见了。
1989年以来，科学家们研究了各种分子单元型测定方法，他们利用基因组DNA的单分子稀释物(SMD)，以物理方法分离等位基因，或者通过等位基因特异性引物从杂合模板选择性扩增半合子DNA片段进行等位基因辨别。然而，只是针对短片段(大约500bp)开发了这些方法，但是最近分子单元型测定已应用于长范围的PCR(标记物间隔再扩大10-20倍)，并且使用CD4基因座作为开发这项分析方法的原型系统。也尝试过测定DNA序列单元型的其它方法，但是这些方法非常不成功、不可靠或者成本高。因此仍存在着对可靠、处理量大的经济型分子单元型测定方法的需要。
发明概述
本发明涉及通过鉴定基因中一个或多个异源序列位点来测定等位基因的方法。该方法可以用来测定具体基因的单元型，并且在很多领域具有应用价值，包括人白细胞抗原(HLA)类型的测定。本发明还涉及用于这种类型测定的试剂盒。
本发明包括分离等位基因特异性核酸分子的方法。向包含一个或多个异源序列位点的单链核酸分子中，加入一中或多中异源序列位点特异性核酸引物，并且使其杂交。在一个实施方案中，各引物的3′端对应于靶异源序列位点的多态性位点。在这样的实施方案中，可以使该3′端进行单碱基延伸，连接于5′端与该异源序列位点特异性引物的3′端相邻的第二引物，或者可以延伸数个碱基。然后分离延伸的或连接的异源序列位点特异性杂交引物和核酸分子，并根据需要回收，用于进一步的基因型测定。在另一个实施方案中，各引物包含位于引物内的一个或多个多态性碱基，这样能够选择性去除与少于100％互补碱基杂交的引物，而100％互补碱基杂交的那些引物不受影响。
本发明还涉及鉴定包含该等等位基因的核酸分子中的多个等位基因的方法。选择含有多个异源序列位点的单链核酸分子，向该核酸分子中加入两种引物，一种异源引物、一种同源引物。所述异源引物能够与位于同一核酸分子上5′异源序列位点的3′端的3′端异源序列位点杂交。所述异源引物的3′端碱基相应于所述异源序列位点的多态性碱基，这样只有在异源引物的3′端与所述单链核酸杂交时才发生延伸。所述同源引物能在位于5′异源序列位点的5′端位置与同一核酸分子杂交。这些引物与核酸分子杂交，并且延伸异源引物，这样就可复制位于引物之间的、核酸分子的所述5′异源序列位点，当延伸的异源引物达到同源引物时，同源引物起到终止异源引物延伸的作用。将核酸分子和延伸的异源引物变性，并分离和分析异源引物，以确定5′异源序列位点。利用这些信息确定新一套含有另一种异源引物和另一种同源引物的核酸引物，该新一套引物的异源引物能与5′异源序列位点杂交(该异源引物的3′端碱基相应于多态性碱基)，该5′异源序列位点位于相同核酸分子上另一个异源序列位点的3′端，该新一套引物的同源引物能在另一个异源序列位点的5′端与同一核酸分子杂交。重复前面的步骤，在每下一轮杂交/延伸中使用新的一套引物，直到在该核酸分子上鉴定出足够的异源序列位点，用来鉴定等位基因。可以用这种方式测定核酸分子的单元型。
本发明还涉及鉴定核酸分子中多个等位基因的方法，包括向一组小珠加入含有多个等位基因的核酸样品，每一个小珠连接有两个不同的引物，各小珠上至少一个引物是对一种独特等位基因的引物，使一种独特等位基因的至少一种引物与该核酸样品的一部分杂交。将杂交的引物扩增，延伸杂交引物，产生延伸的引物核酸。然后将杂交的核酸样品和引物变性，并从小珠上除去核酸样品。延伸的引物然后与小珠上的第二种引物杂交，并扩增该第二种引物。然后对含有双重扩增引物的小珠进行分析，确定核酸样品中存在的等位基因。
附图简要说明
图1是说明应用本发明的等位基因特异性引物延伸方法鉴定等位基因的示意图。
图2是说明应用引物大小标记方法的单碱基延伸多等位基因鉴定方法的示意图。
图2A是说明应用引物大小标记方法的单碱基延伸多等位基因鉴定方法的示意图。
图3是说明应用本发明的等位基因特异性连接和引物大小标记鉴定等位基因的示意图。
图4是说明应用本发明的杂交和引物大小标记鉴定等位基因的示意图。
图5是说明应用本发明的同源引物和异源引物组的多等位基因鉴定方法的示意图。
图6A-6F是说明应用本发明的包含多种引物的荧光小珠鉴定多个等位基因的方法示意图。
本发明的详细描述
本发明以美国临时专利申请No.60/228,994为基础(该专利全文在这里引作参考)，涉及确定等位基因标记的方法。
本申请自始至终使用下面的术语，并且定义如下：
等位基因：给定基因的变体形式。这样的变体包括单核苷酸多态性、插入、反转、易位和缺失。
抗生物素蛋白：从功能上以其高亲合力、特异性结合生物素的能力定义的蛋白质家族。抗生物素蛋白是相当小的寡聚体蛋白，由四个相同的亚基组成，每一个亚基带有一个单一的生物素结合位点。因此每摩尔抗生物素蛋白能结合4摩尔的生物素。抗生物素蛋白包括(a)两栖动物、爬行动物和鸟类产生的蛋白质，所述蛋白质存在于它们的蛋中，称为抗生物素蛋白，和(b)链霉菌属阿维丁链霉菌(Streptomycesavidinii)产生的蛋白质，称为链霉抗生物素蛋白。这里使用的″抗生物素蛋白″包括所有的上述蛋白。
生物素：这里使用的″生物素″包括生物素、其中生物素通过加入烷基被修饰的商业生物素产品、和生物素衍生物如活性酯、胺、酰肼和巯基，所述衍生物在聚合物上有额外的反应基团如胺、酰基和烷基离去基团、羰基和烷基卤化物或米歇尔型受体。
检测分子：一般通过外部能源使核酸可检测和/或去除的与核酸共价连接的分子。这样的分子可以包括染料、可变重量分子(包括聚腺苷酸尾和聚胸苷酸尾)、可以与小珠(包括磁小珠)连接的接头、生物素、抗生物素蛋白、地高辛配基、地高辛配基抗体和本领域公知的其它类似材料。
基因型：在基因座上携带的特定等位基因。
单元型：表示若干紧密连锁基因座的集体基因型，为同一染色体上等位基因的完全序列。
异源引物：在严格条件下与一个独特等位基因杂交的引物。
异源序列位点：在确定的序列位点具有不同序列的两个等位基因被称为具有异源序列位点。
同源引物：与亲代双方的等位基因都杂交的引物。
亲代等位基因：含有一套来自母系一边的染色体和一套来自父系一边的染色体的哺乳动物二倍体细胞的等位基因。
引物：能够与DNA模板杂交的寡核苷酸。
这里引述的所有的专利文献和参考文献在这里引作参考。
本发明的方法具有几点重要的优点。本发明的方法可以快速、低成本、精确测定等位基因，包括完整基因型和单元型测定。该方法能够分析的核酸长度是本领域公知的标准扩增方法(例如聚合酶链反应)所不能完全扩增的核酸片段长度。
本发明涉及分离和鉴定等位基因特异性核酸分子的方法。可以使用任何核酸分子，优选脱氧核糖核酸。可以鉴定和分离的等位基因特异性核酸分子包括多列基因(polyallelic genes)的等位基因、基因片段和非表达片段。
本发明的方法和试剂盒可以用于所有具有两个或多个异源序列位点、因此具有多种等位基因类型的二倍体遗传物质。可以应用本发明的带有多个等位基因之基因的例子是哺乳动物MHC基因如人白细胞抗原(HLA)I类和II类基因，哺乳动物T细胞受体基因，TAP，LMP，ras，非典型HLAI类基因，人补体因子C4和C2的基因，人HLA复合体中的Bf，和位于线粒体DNA、细菌染色体和病毒DNA中的基因。
在本发明的一个方法中，获得含有多个等位基因的核酸样品，每个等位基因带有独特的一套异源序列位点。通过本领域公知的任何方法扩增该核酸样品，一个实施方案是通过聚合酶链反应(PCR)，如Mullis的1988年7月28日公开的美国专利No.4,683,202中所述。然后将扩增的核酸样品变性为单链核酸。然后可以对这种单链核酸进行分析，通过本发明的各种方法测定存在的异源序列位点，确定存在的等位基因。
本发明的方法使用一种或多种引物。本发明的引物包含与目的序列杂交的核苷酸序列。在某些情况下，要求引物在能够于扩增期间延伸的条件下杂交。在另外一些情况下，要求杂交时100％互补匹配的引物具有比杂交时小于100％互补匹配的引物更高的Tm。一般情况下，本发明的引物可以是任何有效的长度，但是一般包含大约12-25个核苷酸或者至少18个核苷酸，优选长度是大约18-22个核苷酸。在本发明的方法中，需要鉴定对于样品中靶DNA独特的一个或多个引物序列，以便鉴定目的序列的多态性位点。很多多等位基因的这种多态性鉴定是本领域公知的。例如，HLA-A、HLA-B和HLA-C基因有大约222种已知的等位基因，这些等位基因的序列是本领域公知的。参见Arnett和Parham，组织抗原(Tissue Antigens)45：217-257页，1995，和Baxter-Lowe等，1997年12月30日公开的美国专利No.5,702,885。
本发明使用的描述核酸分子杂交的短语″在高度严格条件下杂交″指在低离子强度和高洗涤温度条件下杂交。短语″在低严格条件下杂交″指在高离子强度和低温条件下杂交。
影响严格性的变量包括，例如，温度、盐浓度、探针/样品同源性和洗涤条件。随着杂交温度的升高，其它都相同时，严格性提高。严格性提高使得非特异性杂交降低，即背景干扰小。核酸杂交的″高度严格条件″和″中等严格条件″在下面文献中有解释：Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel等，1998，Green Publishing Associatesand Wiley Interscience，NY，其中的教导内容引作参考。当然，技术人员明白，为了包括或排除探针和分析物之间不同的互补程度，为了达到要求的检测范围，杂交条件的严格性可以根据需要而变化。
在本发明中可以使用各种各样的检测分子。这些分子可以与一种或多种引物偶联，或者可以直接与在延伸步骤中插入到核酸中的ddNTPs偶联。这些分子可以包含检测所述分子的工具，例如染料、放射性标记等；或者它们可以包含分离所述分子的工具，例如生物素/抗生物素蛋白，磁性和/或荧光珠等；或者含有两者。例如当使用生物素/抗生物素蛋白时，可以用生物素标记一种或多种引物，这样当引物与单链核酸杂交时，产生的双链DNA中一条链带有生物素标记。然后该双链DNA可以与包被有抗生物素蛋白的固相载体结合。
本发明中使用的固相载体可以是本领域公知的任何这种载体，例如小珠、亲和色谱柱。优选的载体是磁珠形式。当载体是小珠形式时，通过用磁铁吸引小珠并在使双链核酸解离为单链核酸的条件下洗涤小珠，来分离扩增的核酸的两条链。通常在碱性条件下，一般是0.1M或0.15M NaOH，室温下，通过几次反复温育小珠约5-10分钟，进行解离作用。然后可以回收各条链并且进一步分析。
应用各种各样的分析技术鉴定分离的异源序列位点来确定等位基因。这些技术是本领域公知的，包括但不限于，电泳如聚丙烯酰胺凝胶电泳、流式细胞术、高压液相色谱、激光扫描和质谱法。这些技术可以手工操作或者通过自动系统操作。这样的自动系统是本领域公知的并且包括能扫描多种颜色荧光的自动测序仪或者毛细管电泳仪。
本发明的第一种方法已在图1和2中图示说明，该方法依赖于杂交的异源序列位点特异性引物的延伸。该方法特别适用于测定高度多态性染色体区中的等位基因或单元型特异性基因型信息。如图1所示，DNA样品扩增和变性之后产生单链DNA片段，加入在5′端用检测分子标记的一种或多种异源序列位点特异性引物。将异源序列位点特异性引物加入单链核酸分子中并且使其杂交。在优选的实施方案中，各引物的3′端与异源序列位点的多态性碱基互补。因此，如果引物与其中3′端碱基不互补的异源序列位点杂交的话，当使之处于延伸条件下时引物不会延伸。优选地，使用能区别单个核苷酸差异的酶。如图1所示，然后使杂交的引物延伸，只有与互补3′端碱基匹配杂交的引物才能延伸。然后通过检测分子去除引物，图1中以生物素为例说明。使用包被抗生物素蛋白的磁珠通过引物上的生物素去除引物。然后在与那些未经延伸的引物结合的DNA片段被去除的条件下洗涤杂交的引物/DNA片段。然后使延伸的双链核酸变性。分析不再与小珠结合的链，确定异源序列位点。
或者，本发明中使用的引物可以不在5′端与检测分子偶联，而是如前所述使引物杂交，使用与检测分子偶联的ddNTPs使那些与互补3′端杂交的引物进行单碱基延伸，如图2所示。利用延伸引物上的检测分子分离引物，然后使引物变性并进行分析，确定存在的异源序列位点。
使用以下的方法时，本发明还适用于使用能扫描四种颜色荧光的自动测序仪或者毛细管电泳仪的高通量单核苷酸多态性测定。也可以将同样的方法加以修改来测定单核苷酸多态性之外的其它遗传变异类型，包括多碱基多态性、插入、反转、易位和缺失。
本发明的另一种方法依赖于等位基因特异性连接。图3说明了这种方法。如图3所示，将异源序列位点特异性引物加入含有一个或多个异源序列位点的单链DNA片段中。所述异源序列特异性引物的各引物的3′端与一个异源序列位点的多态性碱基互补，并且使其与所述DNA片段杂交。然后加入连接引物，并使其与所述DNA片段杂交。各连接引物具有与所述DNA片段之一的一部分互补的序列，使得连接引物的5′端直接邻接异源序列位点特异性引物的3′端。如果该异源序列位点特异性引物不与所述DNA片段杂交，则当处于连接条件下时，连接引物不能与异源序列位点特异性引物连接。如果可能，则引物被连接起来，然后使之处于足以使没有连接的引物变性但是不足以使与DNA片段杂交的连接的引物变性的温度条件下。一般情况下，当使用20个核苷酸的引物时，这样的温度是大约60℃。然后可以通过本领域公知的任何方法去除杂交的连接引物。如图3所示，一套引物可以连接有检测分子，如生物素。检测分子可以连接在异源序列特异性引物上或连接在连接引物上。此外，可以将所描述的不同方法组合，如图3所示，通过一种方法检测一个异源序列位点处的多态性，通过这里描述的其它方法测定其它位点处的多态性。也如图3所示，一种或多种引物可以有可变重量的分子与各引物的5′端偶联，这样，没有两个引物具有相同的分子量。这种可变重量的分子可以是在杂交/扩增步骤中不反应的任何合适的材料，包括多聚同型核酸尾，例如聚腺苷酸尾(poly A)。这样的聚腺苷酸尾的长度差是2-4个碱基，但是可以是在标准分离仪器例如凝胶电泳上足以分离具poly A尾引物的任何不同长度。
图4说明本发明的另一种方法。根据这样的方法，将一套异源序列特异性引物加入包含多个异源序列位点的DNA片段中。各引物具有至少一个多态性碱基，其位于各引物之内，这样，在引物与DNA片段杂交之后，杂交中有错配碱基的那些引物的Tm比没有错配碱基的那些引物的Tm低。然后利用Tm的这种差异来去除少于100％互补杂交的那些引物。这样的碱基错配一般发生于引物序列中心附近。去除少于100％互补杂交的引物/DNA片段缀合物之后，分析留下的缀合物，测定特异性异源序列位点，确定具体的等位基因。这可以用各种各样的方法进行。根据图4所示，所有的引物都可以连接可变重量的分子。各特异性异源序列位点的所有引物可以连接特定的可变重量的分子。在一个或多个特异性异源序列位点的各多态性的各引物连接不同的检测分子。按照检测分子将杂交的引物分成各个组，并通过进一步测定各组引物中存在哪一种可变重量分子，来确定等位基因特异身份。
本发明的另一种方法能够测定核酸长片段上的多个异源序列位点，所述核酸长片段可能太长，用常规方法例如PCR不能完全扩增。如图5所示，选择含有多个异源序列位点的单链核酸分子。向该核酸分子中加入两种引物，一种异源引物和一种同源引物。异源引物能与位于相同核酸分子上的5′异源序列位点的3′端的3′异源序列位点杂交。所述异源引物的3′端碱基相应于所述异源序列位点的多态性碱基，这样只有在异源引物的3′端与所述单链核酸杂交时才发生延伸。所述同源引物能与同一核酸分子在5′异源序列位点的5′端位置杂交。引物与核酸分子杂交，并延伸异源引物，以便复制位于引物之间的核酸分子的5′异源序列位点。将核酸分子和延伸的异源引物变性，并分离和分析异源引物，确定5′异源序列位点。利用这种信息鉴定新的一套含有异源引物和同源引物的核酸引物，该新的一套引物的异源引物能与5′异源序列位点杂交(该异源引物的3′端碱基相应于多态性碱基)，所述5′异源序列位点位于同一核酸分子上另一个异源序列位点的3′端，该新的一套引物的同源引物能与位同一核酸分子于另一个异源序列位点的5′端的位置杂交。重复前面的步骤，以下每一轮杂交/延伸中使用一套新的引物，直到鉴定出足够量的用来鉴定等位基因的核酸分子上的异源序列位点。可以用这种方式测定核酸分子的单元型。
如图6A-6F所示，本发明还涉及鉴定核酸分子中多个等位基因的方法。如图6A所示，该方法包括，向一组小珠加入含有多个等位基因的核酸样品，每个小珠连接有两个不同的引物，各小珠上的至少一个引物是对一种独特等位基因的引物。然后如图6B所示，使该核酸反应，以便使独特等位基因的至少一种引物与该核酸样品的一部分杂交。使杂交的引物扩增，以延伸杂交的引物，产生延伸的引物核酸，如图6C所示。参见图6D，然后将杂交的核酸样品和引物变性，从小珠上除去核酸样品。延伸的引物然后与小珠上的第二种引物杂交(6E)，并扩增该第二种引物(6F)。然后对含有双重扩增引物的小珠进行分析，确定核酸样品中存在的等位基因。为了容易从小珠上去除引物，引物可以具有裂解位点。
本发明还涉及用于实施本发明所述方法的试剂盒。在大多数基础实施方案中，本发明的试剂盒包含关于实施上述方法的说明。另外，试剂盒可以含有至少一种或几种本发明方法中使用的必要的试剂，例如一套或几套位点特异性扩增引物、聚合酶链反应缓冲剂、双脱氧核苷酸(其中一种或多种是根据需要被标记的)、核酸扩增试剂、产生单链核酸片段所用试剂、一种或多种异源序列位点特异性引物(根据需要与至少一种检测分子偶联)、一种或多种连接引物、用于连接邻近杂交引物的试剂、包含一种或多种检测分子的小珠和一个或多个无菌微管。
从下面的实施例会更好地理解本发明。但是，本领域技术人员容易理解，所讨论的具体方法和结果只是为了详细说明本发明而不是要限制本发明。
实施例
本实施例涉及应用三种策略来验证不同等位基因的捕获，所述不同的等位基因与HLA基因中特定的多态性有关：i)杂交；ii)单碱基延伸；和iii)连接。
使用这些条件的每一种作为建立一项有助于鉴定合适的等位基因、从而鉴定与该等位基因有关的特定多态性的测试方法的试验。后两种方法是以酶为基础的测试，要求使用Taq连接酶和Thermus测序酶，利用这些酶区别单链DNA上特定位点单个核苷酸差异的能力。已观察到，这些方法对分辨所研究的特定等位基因中的单核苷酸多态性或突变足够灵敏。
1.A.杂交
一种检测方法是捕获的特异靶物与寡核苷酸偶联的微球杂交，并且分析该复合体。如下所述进行反应。对要捕获的等位基因进行两轮杂交。第一轮杂交使用不同的纯合DNA和杂合DNA以及识别特定序列的特异寡核苷酸偶联小珠。第二轮杂交使用另一套识别靶物中特异序列的小珠，证实捕获的等位基因的存在。但是，开始先进行单轮杂交作为测定寡核苷酸偶联微球对靶物中不同等位基因的特异性的对照实验。
使用从UCLA登记处获得的各种基因组DNA样品(UCLA 210，UCLA 230和UCLA 243)，使用有义引物5′A200A和反义引物3′A322-1扩增HLA-A基因座的158 bp DNA片段。对于该实施例，应用标准扩增方法制备该158 bp片段。在该实施例中用来扩增纯合DNA和杂合DNA的引物是：
5′A200A 5′-ACA GCG ACG CCG CGA GCC A-3′，位置182-200，有义引物
3′A322-1 5′-CCTCGCTCTGGTTGTAGTA-3′，位置322-340，反义引物
通过不对称PCR制备用于连接、单碱基延伸或杂交的单链DNA(ss)。除了加入的有义引物浓度比反义引物低50倍之外，不对称PCR的条件如上所述。反义引物是生物素化的，产生5′端生物素标记的单链PCR片段。
或者，使用5′-3′外切酶、T7基因6外切酶制备ssDNA。在这种情况下，在寡核苷酸合成期间通过在PCR引物的5′端引入4硫代磷酸酯键来保护目的链。T7外切酶将引物的5′端不包含硫代磷酸酯碱基的链降解
1.B.单碱基延伸反应(SBER)
该实施例中单碱基延伸反应(SBER)使用延伸引物，设计该引物使其3′端在邻近多态性碱基处退火。该实施例的延伸方法使用Thermo测序酶或者Klenow大片段聚合酶，分别在循环或非循环反应中引入多态性碱基。
使用单碱基延伸反应试图捕获特异等位基因；使用引物混合物(PM)H001和H002进行等位基因特异性PCR(ASPCR)。使用这两个引物混合物在多态性位点引入特定碱基。两个PM使用共同的5′引物(agcgacgccgcgagcca)，但是使用等位基因特异性3′引物。使用杂合DNA时，PM H001在相应的多态性位点处特异性引入″C″(ccaagagcgcaggtcctcg)碱基，而PM H002特异性地引入″A″(ccaagagcgcaggtcctct)。
如上所述进行延伸反应。来自延伸反应的产物被纯化并且与链霉抗生物素蛋白磁珠结合。链霉抗生物素蛋白对生物素的高结合亲和性使得生物素标记的靶物分子的分离快速而有效。将复合体洗涤数次，以减小任何非结合标记的可能性，该非结合标记是可能影响实验的下一步反应的因素。
对多种不同的样品进行试验，以通过ASPCR验证捕获的等位基因。使用PMH001和H002进行5次ASPCR。典型的延伸反应方法的实验条件和阴性对照如下：延伸反应中使用的实验样品是生物素化的A或C。假设测序酶会正确地引入特定碱基，因此来自捕获的特异等位基因的正确信号将会在使用引物混合物的基础上被检测。两个阴性对照和SBER中实验样品具有相同的成分，只是从反应中取消了ddNTPs A或C。另一个阴性对照只使用没有标记的ddNTPs A、C、G和T。使用引物混合物H001和H002，通过ASPCR验证下面各组反应的上清液。测试的上清液分如下5组：延伸之后、延伸产物与磁珠结合之后、洗涤数次之后、和高温下从磁珠洗脱产物之后。
循环反应
每20μl反应使用100ng HLA A基因座的单链(ss)DNA，如上所述对基因组DNA PCR扩增后获得该单链DNA；向反应混合物加入2μM延伸引物、125nM各没有标记的双脱氧终止子(ddG、T、A或C)、和500nM的生物素-标记的ddNTP(A或者C，取决于要在多态性位点引入的特异碱基)、10X酶反应缓冲剂(稀释至1X的终浓度)和5单位的测序酶。反应在94℃下进行1分钟，接着进行40个循环的94℃10秒和60℃30秒。在72℃10分钟进行最终的延伸循环，并在4℃下保持，此为本实施例中的延伸反应。
非循环反应
当使用Klenow大片段聚合酶反应进行延伸时，第一步要求延伸引物与单链DNA杂交。100ng的ssDNA与20μM的延伸引物退火。引物和DNA在90℃下混合5分钟，然后缓慢冷却到室温，这样生成杂交物。该过程持续大约1小时。下一步包括加入特异性没有标记的和标记的生物素ddNTPs(1.5μM)和5U Klenow大片段，并在37℃下温育30分钟。延伸结束后，向反应混合物中加入1.5μl的0.5M EDTA。
使用QIAQUICK柱(Qiagen)纯化延伸产物(循环或非循环的)，去除没有被掺入的生物素。将10μl链霉抗生物素蛋白包被的磁珠(于2X结合缓冲液10mM Tris pH7.5，1mM EDTA，2.0mM NaCl中)与20μl纯化的延伸产物在室温下混合20分钟。对磁珠施加磁场，弃除没有结合的延伸产物。用1ml相同的结合缓冲液将磁珠洗涤至少两次，通过在95℃下加热2分钟将目的链从磁珠上洗脱下来。
然后使用特异引物对洗脱的链进行等位基因特异性PCR(ASPCR)来证实特异性等位基因的多态性。同时进行合适的对照实验以验证该结果。
1.C.连接方法
该实施例涉及利用在与单链DNA模板退火之前两种引物之间的连接。本实施例的实施是基于这样的理解：与ssDNA完全匹配的两种引物的连接会生成强的双螺旋，因此可耐受较高温度洗涤(高于各引物的Tm)。而错配模板将难以耐受高于引物Tm的温度洗涤，因此其本身会从双螺旋游离出来并且最终被洗掉。
使两种引物彼此邻近，其中一种引物是等位基因特异性或异源序列引物，其在3′端有一个多态性位点，在5′端有一个生物素标记。第二种引物是连接引物，其在5′端有一个介导连接的磷酸基团。假设两种引物在与ssDNA模板杂交之前被连接在一起，但是本发明方法不依赖于该假设。20μl反应混合物含有10μl(100ng)特异ssDNA、1μl各种引物(1μM)、2μl 10X连接缓冲液和10U Taq连接酶。
混合物在热循环仪中在90℃下加热2分钟，接着在37℃下温育30分钟，此时通过加入EDTA终止反应。使用QIAQUICK柱纯化混合物，去除所有的没有结合的引物和生物素，它们是等位基因特异性PCR反应中的非特异性因素。
如上所述，纯化的复合体与链霉抗生物素蛋白包被的磁珠结合。在高严格洗涤条件下洗涤复合体。通过提高洗涤缓冲液的温度(55-95℃)控制洗涤的严格性，以便达到分离等位基因特异性DNA片段的阈值温度。利用识别所捕获等位基因的多态性位点的引物，通过等位基因特异性PCR，进一步验证洗脱的模板。
2.单元型测定的杂交方法
HLA A基因座特异性多态性的不同寡核苷酸与用于杂交方法的不同组的小珠(Luminex)偶联。选择与寡核苷酸偶联小珠杂交的模板，以提供完全的序列同源性。根据厂商说明(Luminex Corp.)进行小珠与特异性寡核苷酸的偶联。Luminex小珠-探针偶联物与上面制备的PCR片段杂交。用于分离等位基因特异性PCR片段的探针序列是：
L5′A107A    1AGGTATTTCT ACACCTCCGTG
L5′A107C    1AGGTATTTCT CCACATCCGTG
洗掉没有杂交的PCR模板，并从Luminex小珠上洗脱与5′A107A或5′A107C特异性杂交的PCR片段。有和没有间隔区(即寡核苷酸序列中间含有另外20个随机碱基)的不同大小的寡核苷酸，与不同的小珠组偶联，并与不同的模板杂交，测定不同等位基因的特异性。引物标识中的数字与小珠上偶联的不同寡核苷酸相关联，并且表明特异性等位基因的多态性位点。例如，107 A或C表示多态性位点在107位碱基处，其中每个等位基因在107位有一个A或者C。
杂交反应程序如下：17μl的ssDNA在95℃下变性5分钟，接着加入33μl特异性寡核苷酸偶联的小珠(5000小珠/每种寡核苷酸)(与模板互补)，并在55℃下温育30分钟。当使用有间隔区的寡核苷酸时，杂交温度提高至65℃，以保证特异性。将小珠混合物充分涡流混合并超声处理，在加入ssDNA之前升至要求的杂交温度。杂交之后，将混合物在2000xg下离心；用1.5X TMAC(3M TMAC，0.1％SDS，50mM Tris-Cl，pH8.0，4mM EDTA pH8.0)洗涤两次，每次用1ml，弃除上清液。
向复合体加入20μl的H2O，在95℃下洗脱与寡核苷酸偶联磁珠结合的捕获模板5分钟。对1μl洗脱的模板进行不对称PCR，获得更大丰度的洗脱模板，用于第二轮杂交。
用与捕获模板互补的第二套小珠进行第二轮杂交，作为验证模板准确性的试验。向各试管加入120ng链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白(SA-PE)并在杂交温度下再温育5分钟之后，在Luminex 100流式细胞仪上测定样品。获得的荧光信号量是生物素与SA-PE相互反应的真实表现。该方法是一种定量测试方法，阳性信号的量以对于给定反应获得的最大数目表示。
第二轮杂交使用的其它等位基因-特异性Luminex小珠-探针如下：
用于证实等位基因特异性分离的Luminex小珠-探针：
L5′A107A    1AGGTATTTCTACACCTCCGTG
L5′A107C    1AGGTATTTCTCCACATCCGTG
L5′A153A    1CTTCATCGCAGTGGGCTAC
L5′A153C    1CTTCATCGCCGTGGGCTAC
L5′A249T    1GCAGGAGGGTCCGGAGTAT
L5′A249G    1GCAGGAGGGGCCGGAGTAT
L5′A291C    1GAAGGCCCACTCACAGACT
L5′A291G    1GAAGGCCCA GTCACAGACT
表1.预期的杂交之后等位基因特异性反应模式
模板DNA名称  Luminex小珠-探针反应模式
 HLA-A等位基因 L5’A107A L5’A107C L5’A249G L5’A249T L5’A291C L5’A291G
UCLA 210(纯合子) A*0206，- + - - + + -
UCLA 230(杂合子) A*2402101 - + + - + -
 A*3401   +   - +  -  -  +
UCLA 243(纯合子)  A*2402101，- - - - - - -
表2.观察到的杂交之后等位基因特异性反应模式
模板DNA名称 探针 L5’A107A L5’A107C L5’A249G L5’A249T L5’A291C L5’A291G
UCLA 210(纯合子) L5’A107A (+)  166 (-)  50 (-)  124 (+)  279 (+)  234 (-)  21
L5’A107C (-)  152 (-)  60 (-)  137 (-)  330 (-)  223 (-)  29
UCLA 230(杂合子) L5’A107A (+)  63 (+)  111 (+)  90 (-)  56 (+)  94 (-)  27
L5’A107C (-)  52 (+)  87 (+)  70 (-)  55 (+)  57 (-)  13
UCLA 243(纯合子) L5’A107A (-)  13 (-)  57 (-)  37 (-)  23 (+)  96 (-)  14
L5’A107C (-)  15 (+)  83 (+)  60 (-)  36 (+)  124 (-)  13
阴性对照 7 9 14 19 6 9
表3.使用阴性对照观察到的杂交之后等位基因特异性反应模式
模板DNA名称 没有探针(对照) L5’A107A L5’A107C L5’A249G L5’A249T L5’A291C L5’A291G
UCLA 210(纯合子) (+)  65 (-)  29 (-)  65 (+)  124 (+)  97 (-)  19
UCLA 230(杂合子) (+)  63 (+)  111 (+)  90 (-)  56 (+)  30 (-)  68
UCLA 243(纯合子) (-)  12 (-)  216 (-)  100 (-)  23 (+)  213 (-)  10
阴性对照 7 9 14 19 6 9
上面表中的结果证明了成功的等位基因特异性杂交，因为等位基因特异性数目比非等位基因特异性反应的大。
正如本领域技术人员明理解的，对于任何和所有的目的，特别是就提供书面描述来说，这里公开的所有的范围包括任何和所有可能的次级范围及其组合。容易理解，所有列出的范围是对相同范围分为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等的充分公开和描述。作为非限制性例子，这里讨论的各范围容易分为下三分之一、中间的三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还明白，所有例如″至多″、″至少″、″大于″、″小于″等描述是指可以如上所述接着分成次级范围的范围。
尽管只是描述了几个优选的实施方案，本领域普通技术人员明白可以修饰和改变该实施方案而不脱离本发明中心精神和范围。因此，上面描述的优选的实施方案在所有的方面均为举例说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由权利要求书指明，而不是由前面的说明书限定，而且落在权利要求含义之内和等同范围之内的所有变化都包含在本发明范围内。
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Claims (21)

1.一种分离带有特定等位基因的核酸分子的方法，包括：
(a)将包含异源序列位点的核酸与至少一种对该异源序列位点特异的核酸引物杂交，生成杂交的核酸序列，其中所述至少一种特异性核酸引物只有当其与该异源序列位点杂交时才能延伸；
(b)将杂交的核酸序列置于允许所述至少一种核酸引物延伸的条件下；和
(c)将没有杂交的核酸序列和没有经历延伸的核酸引物与所述进行了核酸序列延伸的杂交的核酸序列分离。
2.权利要求1的方法，其中所述至少一种核酸引物的3′端相应于所述异源序列位点中的多态性碱基的位置，并且所述核酸引物只有在所述至少一种核酸引物的3′端与所述异源序列位点中所述多态性碱基互补和杂交时才能进行延伸。
3.权利要求2的方法，其中一种引物或一种延伸引物用检测分子标记，并且(d)该方法进一步包括利用检测分子分离所述经过延伸的杂交的核酸序列。
4.权利要求1的方法，进一步包括：
(d)在与所述至少一种核酸引物杂交之前扩增所述包含异源序列位点的核酸分子；和
(e)鉴定所述异源序列位点。
5.权利要求1的方法，其中所述异源序列位点包括单核苷酸多态性。
6.一种用于分离带有特定等位基因的核酸分子的试剂盒，该试剂盒包括关于实施权利要求1的方法的说明。
7.一种分离带有特定等位基因的核酸分子的方法，包括：
(a)将包含一个或多个异源序列位点的核酸与至少一种对所述异源序列位点特异的核酸引物和一种连接引物杂交，生成杂交的核酸序列，其中所述至少一种核酸引物的3′端相应于所述异源序列位点中多态性碱基的位置，而连接引物的5′端邻近所述至少一种核酸引物的3′端；
(b)将所述至少一种核酸引物和连接引物置于允许所述至少一种核酸引物和所述连接引物连接的条件下；和
(c)分离其中引物已连接的杂交的核酸序列。
8.权利要求7的方法，其中所述至少一种核酸引物和连接引物中的一种用检测分子标记，并且(c)该方法进一步包括利用检测分子分离经过延伸的杂交的核酸序列。
9.权利要求8的方法，其中所述至少一种核酸引物包括多个具有不同序列的引物，并且各序列与特定检测分子结合，以至于没有两个序列与相同的检测分子结合。
10.一种用于分离带有特定等位基因的核酸分子的试剂盒，该试剂盒包括关于实施权利要求7的方法的说明。
11.一种分离带有一个特定等位基因的核酸分子的方法，包括：
(a)将包含一个或多个异源序列位点的核酸与至少一种对所述异源序列位点特异的核酸引物杂交，生成杂交的核酸复合体；和
(b)将没有完全互补杂交的杂交核酸复合体与完全互补杂交的杂交核酸复合体分离。
12.权利要求11的方法，进一步包括测定所述含有一个或多个异源序列位点的核酸的序列。
13.权利要求11的方法，其中步骤(b)包括将杂交的核酸复合体加热至所述不完全互补杂交的核酸复合体发生解离，而完全互补杂交的核酸复合体不发生解离的温度。
14.权利要求11的方法，其中所述至少一种核酸引物是用检测分子标记的。
15.一种用于分离带有特定等位基因的核酸分子的试剂盒，该试剂盒包括关于实施权利要求11的方法的说明。
16.一种分离带有特定等位基因的核酸分子的方法，包括：
(a)将包含至少一个5′端异源序列位点和一个3′端异源序列位点的核酸与对所述3′端异源序列位点特异的一种异源引物和一种同源引物杂交，生成杂交的核酸序列，其中所述异源引物的3′端相应于所述3′端异源序列位点中多态性碱基的位置，而所述同源引物能在位于5′端异源序列位点的5′端的位置处与该核酸杂交，所述异源引物只有在所述异源引物的3′端与所述3′端异源序列位点中所述多态性碱基互补和杂交时才能进行延伸；
(b)延伸所述杂交的异源引物，以产生异源引物和同源引物之间的核酸序列，其包含5′端异源序列位点；和
(c)测定5′端异源序列位点的性质。
17.权利要求16的方法，进一步包括：
(d)利用5′端异源序列位点的性质，制备另一种异源引物和另一种同源引物，其中所述另一种异源引物的3′端相应于所述5′端异源序列位点中多态性碱基的位置，所述5′端异源序列位于另一个5′端异源序列的3′端，所述同源引物能在位于另一个5′端异源序列位点的5′端位置处与该核酸杂交，所述异源引物只有在所述异源引物的3′端与所述5′端异源序列位点中所述多态性碱基互补和杂交时才能进行延伸；
(e)将核酸序列与所述另一种异源引物和所述另一种同源引物杂交；并且
(f)将步骤(a)至(e)重复一次或多次。
18.权利要求16的方法，进一步包括确定所述核酸分子的单元型。
19.一种用于分离带有特定等位基因的核酸分子的试剂盒，该试剂盒包括关于实施权利要求16的方法的说明。
20.一种鉴定核酸分子中等位基因的方法，包括：
(a)将包含多个异源序列位点的核酸与至少一种引物杂交，产生杂交的核酸，其中所述至少一种引物与小珠连接；
(b)将所述杂交的引物延伸，产生延伸的引物；
(c)将核酸与延伸的引物解离；
(d)将延伸的引物和与小珠连接的第二种引物杂交；
(e)将所述第二引物延伸，产生第二种延伸引物；和
(f)用所述延伸引物、第二种延伸引物或者两者，鉴定核酸的异源序列位点。
21.一种用于鉴定核酸分子中等位基因的方法，该方法包括关于实施权利要求20的方法的说明。
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