CN103911428B - 用于检测等位基因变体的方法、组合物和试剂盒 - Google Patents

Abstract

在一些实施方式中，本发明大体上涉及用于区分不同等位基因之间的序列差异的组合物、方法和试剂盒。更具体地，在一些实施方式中，本发明提供了用于以高特异性和选择性定量包含丰富的（例如野生型）等位基因变体的样品中的稀少的（例如突变的）等位基因变体，例如SNP或核苷酸（NT）插入或删除的组合物、方法和试剂盒。特别地，在一些实施方式中，本发明涉及用于检测突变的高度选择性的方法，其被称作竞争性等位基因特异性TaqMan？PCR("cast-PCR")。

Description

用于检测等位基因变体的方法、组合物和试剂盒

本申请是申请号为201080021402.X、申请日为2010年3月26日、发明名称为“用于检测等位基因变体的方法、组合物和试剂盒”的中国发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉参考

本申请是2009年12月17日提交的美国申请号12/641,321的继续部分申请，并根据35U.S.C.119要求2009年11月5日提交的61/258,582、2009年10月20日提交的61/253,501、2009年10月14日提交的61/251,623、2009年6月12日提交的61/186,775以及2009年3月27日提交的61/164,230的优先权，所有这些文献通过引用方式全文并入本文。

背景技术

单核苷酸多态性（SNP）是人类基因组中最常见的遗传多样性的类型，其在人类基因组DNA中的发生频率为：在1,000个核苷酸中有大约1个SNP，或更低(Kwok,P-Y,AnnRevGenomHumGenet2001,2:235-258)。SNP牵涉于遗传病症、对不同疾病的易感性、对药物的不良反应的倾向性，以及用于法医研究。因此，SNP（或稀少突变）的检测为疾病早期诊断，例如检测血液中的循环癌细胞以进行出生前的诊断，以及用于检测混合的细胞群体中的疾病相关突变提供了巨大的潜在可能。

已经基于涉及杂交、连接或DNA聚合酶的方法开发了多种用于SNP基因分型的方法(Chen,X.,andSullivan,PF,ThePharmacogeonomicsJournal2003,3,77-96.)。例如，等位基因特异性聚合酶链式反应（AS-PCR）是广泛应用的用来检测DNA序列变异的策略(WuDY,UgozzoliL,PalBK,WallaceRB.,ProcNatlAcadSciUSA1989;86:2757-2760)。AS-PCR，如其名称所暗示，是基于PCR的方法，其中引物之一或两个引物被设计为在序列变异的位点处退火，这允许能够区分同一基因的不同的等位基因。AS-PCR利用了DNA聚合酶的保真度：相对于以匹配的3’碱基进行的引物延伸，以错配的3’碱基进行的引物延伸的效率要低得多，后者的效率为1/100至1/100,000(Chen,X.,andSullivan,PF,ThePharmacogeonomicsJournal2003;3:77-96)。延伸错配引物的困难导致减小的PCR扩增，这可以容易地被检出。

然而，AS-PCR的特异性和选择性高度依赖于PCR的指数扩增性质，这会迅速降低等位基因区分力度。虽然引物被设计为匹配特异性变体以选择性地仅扩增该变体，但是在实际中，经常发生显著的错配的扩增。此外，AS-PCR区分等位基因变体的能力会受到突变类型或者突变或SNP周围的序列的影响(AyyadevaraS,ThadenJJ,ShmooklerReisRJ.,AnalBiochem2000;284:11-18)，存在于样品中的等位基因变体的量的影响，以及备择等位基因（alternativeallele）之间的比例的影响。综合起来，这些因素常导致经常出现假阳性结果，这使很多研究人员尝试增大AS-PCR的可信性(OrouA,FechnerB,UtermannG,MenzelHJ.,HumMutat1995;6:163-169)(ImyanitovEN,BuslovKG,SuspitsinEN,KuliginaES,BelogubovaEV,GrigorievMY等人,Biotechniques2002;33:484-490)(McKinziePB,ParsonsBL.DetectionofrareK-rascodon12mutationsusingallele-specificcompetitiveblockerPCR.MutatRes2002;517:209-220)(LatorraD,CampbellK,WolterA,HurleyJM.,HumMutat2003;22:79-85)。

在一些情况下，通过使用基于SNP的含有锁核酸(LNA)(Latorra,D.等人,HumMut2003,2:79-85;Nakiandwe,J等人,PlantMethod2007,3:2)或修饰的碱基(Koizumi,M等人AnalBiochem.2005,340:287-294)的PCR引物，已经使AS-PCR的选择性从检测10个等位基因中的1个提高到检测100,000个等位基因中的1个。然而，这些碱基“模拟物”或修饰增加了分析的总体成本，并且经常需要深度的优化。

用于区分等位基因变体的另一种涉及探针杂交方法的技术是基因分型。然而，与AS-PCR一样，使用该方法的选择性受到局限，并且不适合于检测混合样品中的稀少(≥1,000个中的1个)等位基因或突变。

发明内容

在一些实施方式中，本发明大体上涉及用于区分不同等位基因之间的序列差异的组合物、方法和试剂盒。更具体地，在一些实施方式中，本发明提供了以高特异性定量包含丰富的（例如野生型）等位基因变体的样品中的稀少（例如突变）等位基因变体，例如SNP或核苷酸（NT）插入或删除的组合物、方法和试剂盒。特别地，在一些实施方式中，本发明涉及用于检测突变的高选择性方法，其被称作竞争性等位基因特异性TaqManPCR(competitiveallele-specificTaqManPCR("cast-PCR")。

在一个方面，本发明提供了用于鉴定和/或定量核酸样品中的等位基因变体的组合物。这些组合物中的一些可以包含：（a）等位基因特异性引物；（b）等位基因特异性封闭探针（blockerprobe）；（c）检测探针（detectorprobe）；和/或（d）基因座特异性引物。

在组合物的一些实施方式中，等位基因特异性引物包含靶标特异性部分和等位基因特异性核苷酸部分。在一些实施方式中，等位基因特异性引物还可以包含尾巴。在一些示例性实施方式中，所述尾巴位于等位基因特异性引物的5’末端。在其它实施方式中，等位基因特异性引物的尾巴具有重复的鸟苷和胞苷残基（富含GC）。在一些实施方式中，整个等位基因特异性引物的熔解温度（Tm）是大约50℃-67℃。在一些实施方式中，等位基因特异性引物的浓度是大约20-900nM。

在组合物的一些实施方式中，等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分位于3’末端。在一些实施方式中，等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的选择涉及使用高度区分性的碱基（例如，用于检测A/A,A/G,G/A,G/G,A/C或C/A等位基因)。在一些实施方式中，例如，当待检测的等位基因包括A/G或C/TSNP时，A或G被用作等位基因特异性引物的3’等位基因特异性核苷酸部分（例如，如果A或T是靶等位基因），或者C或T被用作等位基因特异性引物的3’等位基因特异性核苷酸部分（例如，如果C或G是靶等位基因）。在其它实施方式中，当检测和/或定量A/TSNP时，A被用作等位基因特异性引物的3’末端的区分性碱基。在其它实施方式中，当检测和/或定量C/GSNP时，G被用作等位基因特异性引物的3’末端的区分性碱基。

在组合物的一些实施方式中，等位基因特异性封闭探针在3’末端包含不可延伸的封闭部分。在一些示例性实施方式中，不可延伸的封闭部分是小沟结合剂(minorgroovebinder,MGB)。在一些实施方式中，靶等位基因的位置位于距离等位基因特异性封闭探针的不可延伸的封闭部分大约6-10个核苷酸处，例如大约6，大约7，大约8，大约9或大约10个核苷酸。在一些实施方式中，等位基因特异性封闭探针在5’末端包含MGB部分。在一些示例性实施方式中，等位基因特异性封闭探针在PCR过程中不被切割。在一些实施方式中，等位基因特异性封闭探针的Tm是大约58℃-66℃。

在组合物的一些实施方式中，等位基因特异性封闭探针和/或等位基因特异性引物包含至少一个修饰的碱基。在一些实施方式中，修饰的碱基可以增大匹配的与错配的靶序列之间的Tm差异，和/或降低错配引发效率，从而不仅改善测定特异性而且改善选择性。此类修饰的碱基包括，例如，8-氮杂-7-脱氮杂-dA(ppA)、8-氮杂-7-脱氮杂-dG(ppG)、2'-脱氧假异胞苷(isodC)、5-氟-2'-脱氧尿苷(fdU)、锁核酸(LNA)或2'-O,4'-C-亚乙基桥接核酸(ENA)碱基(另见，例如，图4B)。在一些实施方式中，修饰的碱基位于等位基因特异性封闭探针和/或等位基因特异性引物的(a)3’末端；(b)5’末端；(c)内部位置或(a)、(b)或(c)的任意组合。

在组合物的一些实施方式中，检测探针是基于序列的或基因座特异性的检测探针。在其它实施方式中，检测探针是5’核酸酶探针。在一些示例性实施方式中，检测探针可以包含MGB部分，报告子部分(例如FAM^TM,TET^TM,JOE^TM,VIC^TM或Green)，猝灭剂部分(例如BlackHoleQuencher^TM或TAMRA^TM)，和/或被动参照(passivereference)(例如ROX^TM)。在一些示例性实施方式中，根据美国专利号6,727,356(其公开内容通过引用方式全文并入本文)中描述的方法和原理设计检测探针。在一些示例性实施方式中，检测探针是探针(AppliedBiosystems,FosterCity)。

在组合物的一些实施方式中，组合物还可以包含聚合酶；三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)；适合用于扩增的其它试剂和/或缓冲剂；和/或模板序列或核酸样品。在一些实施方式中，聚合酶可以是DNA聚合酶。在一些其它实施方式中，聚合酶可以是热稳定性的，例如TaqDNA聚合酶。在其它实施方式中，模板序列或核酸样品可以是DNA，例如基因组DNA（gDNA）或互补性DNA（cDNA）。在其它实施方式中，模板序列或核酸样品可以是RNA，例如信使RNA（mRNA）。

在另一个方面，本公开物提供了用于扩增等位基因特异性序列的方法。这些方法中的一些可以包括下列一项或多项：（a）使等位基因特异性引物与包含第一等位基因（等位基因-1）的第一核酸分子杂交；（b）使等位基因特异性封闭探针与包含第二等位基因（等位基因-2）的第二核酸分子杂交，其中等位基因-2对应于与等位基因-1相同的基因座；（c）使检测探针与第一核酸分子杂交；（d）使基因座特异性引物与等位基因特异性引物的延伸产物杂交；和（e）PCR扩增包含等位基因-1的第一核酸分子。

在另一方面，本发明提供了用于检测和/或定量包含其它等位基因的汇集的或混合的样品中的等位基因变体的方法。这些方法中的一些可以包括下列一项或多项：（a）在第一反应混合物中，使第一等位基因特异性引物与包含第一等位基因（等位基因-1）的第一核酸分子杂交，以及在第二反应混合物中，使第二等位基因特异性引物与包含第二等位基因（等位基因-2）的第一核酸分子杂交，其中等位基因-2对应于与等位基因-1相同的基因座；（b）在第一反应混合物中，使第一等位基因特异性封闭探针与包含等位基因-2的第二核酸分子杂交，以及，在第二反应混合物中，使第二等位基因特异性封闭探针与包含等位基因-1的第二核酸分子杂交；（c）在第一反应混合物中，使第一检测探针与第一核酸分子杂交，以及，在第二反应混合物中，使第二检测探针与第一核酸分子杂交；（d）在第一反应混合物中，使第一基因座特异性引物与第一等位基因特异性引物的延伸产物杂交，以及，在第二反应混合物中，使第二基因座特异性引物与第二等位基因特异性引物的延伸产物杂交；和（e）PCR扩增第一核酸分子以形成第一组扩增子或扩增子的样品，以及，PCR扩增第二核酸分子以形成第二组扩增子或扩增子的样品；和（f）将第一组扩增子与第二组扩增子进行比较以定量包含等位基因-2的样品中的等位基因-1，和/或包含等位基因-1的样品中的等位基因-2。

在方法的一些实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性引物包含靶标特异性部分和等位基因特异性核苷酸部分。在一些实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性引物还可以包含尾巴。在一些实施方式中，整个第一和/或第二等位基因特异性引物的Tm是大约50℃-67℃。在一些实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性引物的浓度是大约20-900nM。

在方法的一些实施方式中，第一等位基因特异性引物的靶标特异性部分与第二等位基因特异性引物的靶标特异性部分包含相同的序列。在其它实施方式中，第一等位基因特异性引物的靶标特异性部分与第二等位基因特异性引物的靶标特异性部分是相同的序列。

在方法的一些实施方式中，尾巴位于第一和/或第二等位基因特异性引物的5’末端。在一些实施方式中，第一等位基因特异性引物的5’尾巴和第二等位基因特异性引物的5’尾巴包含相同的序列。在其它实施方式中，第一等位基因特异性引物的5’尾巴和第二等位基因特异性引物的5’尾巴是相同的序列。在其它实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性引物的尾巴富含GC。

在方法的一些实施方式中，第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分特异于SNP的第一等位基因（等位基因-1），并且第二等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分特异于同一SNP的第二等位基因（等位基因-2）。在方法的一些实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分位于3’末端。在一些实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的选择包括使用高度区分性的碱基（例如，用于检测A/A,A/G,G/A,G/G,A/C或C/A等位基因)。在一些实施方式中，例如，当待检测的等位基因包括A/G或C/TSNP时，A或G被用作第一和/或第二等位基因特异性引物的3’等位基因特异性核苷酸部分（例如，如果A或T是主要等位基因），或者C或T被用作第一和/或第二等位基因特异性引物的3’等位基因特异性核苷酸部分（例如，如果C或G是主要等位基因）。在其它实施方式中，当检测和/或定量A/TSNP时，A被用作第一和/或第二等位基因特异性引物的3’末端的区分性碱基。在其它实施方式中，当检测和/或定量C/GSNP时，G被用作第一和/或第二等位基因特异性引物的3’末端的区分性碱基。

在方法的一些实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性封闭探针在3’末端包含不可延伸的封闭部分。在一些示例性实施方式中，不可延伸的封闭部分是MGB。在一些实施方式中，靶等位基因的位置位于距离第一和/或第二等位基因特异性封闭探针的不可延伸的封闭部分大约6-10个核苷酸处，例如大约6，大约7，大约8，大约9或大约10个核苷酸处。在一些实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性封闭探针在5’末端包含MGB部分。在其它实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性封闭探针在PCR扩增过程中不被切割。在一些实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性封闭探针的Tm是大约58℃-66℃。

在方法的一些实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性封闭探针和/或第一和/或第二等位基因特异性引物包含至少一个修饰的碱基。在一些实施方式中，修饰的碱基可以增大匹配的和错配的靶序列之间的Tm差异，和/或降低错配引发效率，从而不仅改善测定特异性而且改善选择性。此类修饰的碱基包括，例如，8-氮杂-7-脱氮杂-dA(ppA)、8-氮杂-7-脱氮杂-dG(ppG)、2'-脱氧假异胞苷(isodC)、5-氟-2'-脱氧尿苷(fdU)、锁核酸(LNA)或2'-O,4'-C-亚乙基桥接核酸(ENA)碱基(另见，例如，图4B)。在一些实施方式中，修饰的碱基位于所述第一和/或第二等位基因特异性封闭探针和/或第一和/或第二等位基因特异性引物的(a)3’末端；(b)5’末端；(c)内部位置或(a)、(b)或(c)的任意组合。

在方法的一些实施方式中，通过在第一和/或第二等位基因特异性引物和/或第一和/或第二等位基因特异性封闭探针中加入修饰的碱基(相对于使用未修饰的等位基因特异性引物或封闭探针)来改善等位基因的区分之特异性。在一些实施方式中，特异性的改善是至少2倍。

在方法的一些实施方式中，等位基因的区分之特异性比使用封闭试剂的等位基因特异性PCR方法(ASB-PCR)来区分等位基因时的特异性高至少2倍(例如，至少2倍、3倍、4倍、5倍等等)。

在一些实施方式中，该方法还包括两步循环程序。在一些实施方式中，两步循环程序的第一步的循环数比第二步中使用的循环数少。在其它实施方式中，第一步中的循环数比第二步中的循环数少大约90%。在其它实施方式中，第一步中的循环数是3-7个循环；第二步中的循环数是42-48个循环。

在一些实施方式中，两步循环程序的第一步中使用的退火/延伸温度比第二步中使用的退火/延伸温度低1-3℃。在优选实施方式中，两步循环程序的第一步中使用的退火/延伸温度是56-59℃；第二步中使用的退火/延伸温度是60-62℃。

在一些实施方式中，该方法还包括预扩增步骤。在优选的实施方式中，预扩增步骤包括多重扩增反应，其使用至少两组完全的等位基因特异性引物和基因座特异性引物，其中每组适合于或有效于扩增目标特异性多核苷酸。在其它实施方式中，多重扩增反应的产物被分成第二单重扩增反应，例如cast-PCR反应，其中每个单重反应包含之前在多重反应中使用的至少一个引物组。在其它实施方式中，多重扩增反应进一步包含多个等位基因特异性封闭探针。在一些实施方式中，多重扩增反应进行适合将反应保持在线性扩增期内的循环数。

在方法的一些实施方式中，第一和/或第二检测探针是相同的。在一些实施方式中，第一和/或第二检测探针是不同的。在一些实施方式中，第一和/或第二检测探针是基于序列的或基因座特异性的检测探针。在其它实施方式中，第一和/或第二检测探针是5’核酸酶探针。在一些示例性实施方式中，第一和/或第二检测探针包含MGB部分，报告子部分(例如FAM^TM,TET^TM,JOE^TM,VIC^TM或Green)，猝灭剂部分(例如BlackHoleQuencher^TM或TAMRA^TM)，和/或被动参照(passivereference)(例如ROX^TM)。在一些示例性实施方式中，根据美国专利号6,727,356(其公开内容通过引用方式全文并入本文)中描述的方法和原理设计第一和/或第二检测探针。在一些示例性实施方式中，检测探针是探针。

在方法的一些实施方式中，第一基因座特异性引物和第二基因座特异性引物包含相同的序列。在一些实施方式中，第一基因座特异性引物和第二基因座特异性引物是相同的序列。

在方法的一些实施方式中，第一和/或第二反应混合物还可以包含聚合酶；dNTP；适合用于PCR扩增的其它试剂和/或缓冲剂；和/或模板序列或核酸样品。在一些实施方式中，聚合酶可以是DNA聚合酶。在一些实施方式中，聚合酶可以是热稳定性的，例如TaqDNA聚合酶。在其它实施方式中，模板序列或核酸样品可以是DNA，例如gDNA或cDNA。在其它实施方式中，模板序列或核酸样品可以是RNA，例如mRNA。

在方法的一些实施方式中，第一等位基因特异性封闭探针与第二等位基因特异性引物结合于相同的链或序列，同时第二等位基因特异性封闭探针与第一等位基因特异性引物结合于相同的链或序列。在一些实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性封闭探针分别用于降低从第二等位基因和/或第一等位基因产生的背景信号的量。在一些实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性封闭探针是不可延伸的并且优选分别与第二等位基因或第一等位基因退火，从而封闭例如可延伸的第一等位基因特异性引物与第二等位基因的退火，和/或可延伸的第二等位基因特异性引物与第一等位基因的退火。

在一些示例性实施方式中，第一等位基因是稀少的（例如少数）或突变的等位基因。在其它示例性实施方式中，第二等位基因是丰富的（例如多数）或野生型等位基因。

在另一方面，本发明提供了用于定量包含第二等位基因变体的样品中的第一等位基因变体的试剂盒，其包含：（a）第一等位基因特异性引物；（b）第二等位基因特异性引物；（c）第一基因座特异性引物；（d）第二基因座特异性引物；（e）第一等位基因特异性封闭探针；（f）第二等位基因特异性封闭探针；和（g）第一基因座特异性检测探针；和（h）第二基因座特异性检测探针。

在试剂盒的一些实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性引物包含靶标特异性部分和等位基因特异性核苷酸部分。在一些实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性引物还可以包含尾巴。在一些实施方式中，整个第一和/或第二等位基因特异性引物的Tm是大约50℃-67℃。在一些实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性引物的浓度是大约20-900nM。

在试剂盒的一些实施方式中，第一等位基因特异性引物的靶标特异性部分与第二等位基因特异性引物的靶标特异性部分包含相同的序列。在其它实施方式中，第一等位基因特异性引物的靶标特异性部分与第二等位基因特异性引物的靶标特异性部分是相同的序列。

在试剂盒的一些实施方式中，尾巴位于第一和/或第二等位基因特异性引物的5’末端。在一些实施方式中，第一等位基因特异性引物的5’尾巴和第二等位基因特异性引物的5’尾巴包含相同的序列。在其它实施方式中，第一等位基因特异性引物的5’尾巴和第二等位基因特异性引物的5’尾巴是相同的序列。在其它实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性引物的尾巴富含GC。

在试剂盒的一些实施方式中，第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分特异于SNP的第一等位基因（等位基因-1），并且第二等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分特异于同一SNP的第二等位基因（等位基因-2）。在公开的方法的一些实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分位于3’末端。在一些实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的选择包括使用高度区分性的碱基（例如，用于检测A/A,A/G,G/A,G/G,A/C或C/A等位基因)(图2)。在一些实施方式中，例如，当待检测的等位基因包括A/G或C/TSNP时，A或G被用作第一和/或第二等位基因特异性引物的3’等位基因特异性核苷酸部分（例如，如果A或T是主要等位基因），或者C或T被用作第一和/或第二等位基因特异性引物的3’等位基因特异性核苷酸部分（例如，如果C或G是主要等位基因）。在其它实施方式中，当检测和/或定量A/TSNP时，A被用作第一和/或第二等位基因特异性引物的3’末端的区分性碱基。在其它实施方式中，当检测和/或定量C/GSNP时，G被用作第一和/或第二等位基因特异性引物的3’末端的区分性碱基。

在试剂盒的一些实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性封闭探针在3’末端包含不可延伸的封闭部分。在一些示例性实施方式中，不可延伸的封闭部分是MGB。在一些实施方式中，靶等位基因的位置位于距离第一和/或第二等位基因特异性封闭探针的不可延伸的封闭部分大约6-10个核苷酸处，例如大约6，大约7，大约8，大约9或大约10个核苷酸。在一些实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性封闭探针在5’末端包含MGB部分。在其它实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性封闭探针在PCR扩增过程中不被切割。在一些实施方式中，第一和/或第二等位基因特异性封闭探针的Tm是大约58℃-66℃。

在试剂盒的一些实施方式中，等位基因特异性封闭探针和/或第一和/或第二等位基因特异性引物包含至少一个修饰的碱基。在一些实施方式中，修饰的碱基可以增大匹配的与错配的靶序列之间的Tm差异，和/或降低错配引发效率，从而不仅改善测定特异性而且改善选择性。此类修饰的碱基包括，例如，8-氮杂-7-脱氮杂-dA(ppA)、8-氮杂-7-脱氮杂-dG(ppG)、2'-脱氧假异胞苷(isodC)、5-氟-2'-脱氧尿苷(fdU)、锁核酸(LNA)或2'-O,4'-C-亚乙基桥接核酸(ENA)碱基(另见，例如，图4B)。在一些实施方式中，修饰的碱基位于所述第一和/或第二等位基因特异性封闭探针和/或第一和/或第二等位基因特异性引物的(a)3’末端；(b)5’末端；(c)内部位置或(a)、(b)或(c)的任意组合。

在试剂盒的一些实施方式中，第一和/或第二检测探针是相同的。在公开的试剂盒的一些实施方式中，第一和/或第二检测探针是不同的。在公开的试剂盒的一些实施方式中，第一和/或第二检测探针是基于序列的或基因座特异性的检测探针。在其它实施方式中，第一和/或第二检测探针是5’核酸酶探针。在一些示例性实施方式中，第一和/或第二检测探针包含MGB部分，报告子部分(例如FAM^TM,TET^TM,JOE^TM,VIC^TM或Green)，猝灭剂部分(例如BlackHoleQuencher^TM或TAMRA^TM)，和/或被动参照(passivereference)(例如ROX^TM)。在一些示例性实施方式中，根据美国专利号6,727,356(其公开内容通过引用方式全文并入本文)中描述的方法和原理设计第一和/或第二检测探针。在一些示例性实施方式中，检测探针是探针。

在试剂盒的一些实施方式中，第一基因座特异性引物和第二基因座特异性引物包含相同的序列。在一些实施方式中，第一基因座特异性引物和第二基因座特异性引物是相同的序列。

在试剂盒的一些实施方式中，第一和/或第二反应混合物还可以包含聚合酶；dNTP；适合用于PCR扩增的其它试剂和/或缓冲剂；和/或模板序列或核酸样品。在一些实施方式中，聚合酶可以是DNA聚合酶。在一些其它实施方式中，聚合酶可以是热稳定性的，例如TaqDNA聚合酶。

在一些实施方式中，本发明的组合物、方法和试剂盒提供了高度的等位基因区分特异性和选择性。在一些实施方式中，特异性和/或选择性的定量测定包括比较第一组扩增子与第二组扩增子之间的Ct值。在一些实施方式中，选择性的水平是：可以检出大约1,000,000个拷贝的另一种等位基因中的单一拷贝的给定的等位基因。

以上已经描述了本发明的多个实施方式，其通过使用下列一项或多项提供了等位基因变体的改善的检测和区分：（a）加尾的等位基因特异性引物；（b）低的等位基因特异性引物浓度；（c）设计为具有较低Tm值的等位基因特异性引物；（d）设计为靶向区分性碱基的等位基因特异性引物；（e）含有MGB的等位基因特异性封闭探针，其被设计为阻止从样品中的备选的并且潜在更丰富的等位基因变体进行扩增；和（f）等位基因特异性封闭探针和/或等位基因特异性引物，其被设计为包含修饰的碱基以增大匹配的与错配的靶序列之间的ΔTm。

虽然本文已经讨论了应用数种上述改进的具体实施方式，但是对本领域技术人员明显的是：根据待测样品的性质，可以对上述改进进行多种组合以达到有利的结果。因此，例如，在使用含有修饰的碱基的等位基因特异性引物以增大ΔTm的方法中，可以使用非MGB封闭探针；此类引物也可以被设计为靶向区分性碱基；并且可以在低引物浓度使用引物。因此，基于本公开物的替代性实施方式可用于实现适宜水平的等位基因检测。

本公开物提供了下列优点：在具体情况下本领域技术人员可以使用所列举的改进的任意组合。例如，本发明可以包括使用改进a、c、d和f；改进b、c和e的方法或反应混合物。

应该理解：上述一般性描述和下文的具体描述仅是示例性和解释性的，不是限制所要求保护的本发明。

并入本说明书并构成其一部分的附图诠释了本公开物的数个示例性实施方式，其与说明书一起用于解释某些教导。

附图说明

技术人员将理解：以下描述的附图仅是为了解释的目的。附图不是意在以任何方式限制本教导的范围。

图1显示了cast-PCR的说明性的实施方式的示意图。在一些实施方式中，cast-PCR的成分包括下列：一个基因座特异性TaqMan探针(LST)；两个MGB封闭剂：一个等位基因-1特异性MGB封闭剂(MGB1)和一个等位基因-2特异性MGB封闭剂(MGB2)；3个PCR引物：一个基因座特异性PCR引物(LSP)；一个等位基因-1特异性引物(ASP1)和一个等位基因-2特异性引物(ASP2)。

图2显示了cast-PCR的说明性的实施方式的示意图，其中使用等位基因特异性封闭探针，其包含高度区分性碱基以用于检测稀少的等位基因变体。高度区分性碱基可以包括，例如，A/A,A/G,G/A,G/G,A/C,C/A。最小区分性碱基可以包括，例如，C/C,T/C,G/T,T/G,C/T。在一些实施方式中，例如，为了检测A-G或C-TSNP,A和G被用作区分性碱基（如果A//T是等位基因变体，例如突变等位基因）；或者C和T被用作区分性碱基（如果C//G是等位基因，例如突变等位基因）。

图3显示了cast-PCR的说明性的实施方式的示意图，其中使用等位基因特异性封闭探针，其在5’末端具有MGB部分。在一些实施方式中，探针的3’末端的封闭部分可以包括，例如NH₂,生物素,MGB,PO₄和PEG。

图4A显示了cast-PCR的说明性的实施方式的示意图，其中使用MGB封闭探针或等位基因特异性引物中的修饰的碱基(G*代表ppG)。

图4B显示了MGB封闭探针或等位基因特异性引物的修饰的碱基的一些实例。

图5显示了cast-PCR的一个示例性实施方式的TaqMan样灵敏性和动态范围。

图6显示了使用cast-PCR方法可以检出的密码子12和13中的KRAS突变的序列。密码子12和13中的KRAS突变与转移性结肠直肠癌中对于西妥昔单抗或帕尼单抗的抗性相关(DiNicolantonioF等人,JClinOncol.2008;26:5705-12)。

图7显示了在一个示例性实施方式中，使用cast-PCR测定法检测KRAS突变的特异性。

图8显示了使用cast-PCR方法检测10⁶拷贝的野生型DNA中的单一拷贝的突变DNA的一个示例性实施方式。

图9显示了使用cast-PCR方法检测掺入到野生型样品中的突变样品(KRAS-G12A)的相对拷贝数。

图10显示了使用cast-PCR的一个示例性实施方式在肿瘤样品中检测的多种不同的肿瘤标志物(SNP)。

图11A-E显示了cast-PCR测定法中使用的示例性引物和探针的列表。以小写字母显示的核苷酸是引物的加尾部分。等位基因特异性引物(ASP)的核苷酸部分在每个引物的3’最末端，并且以加粗字体标出。封闭探针的等位基因位置(MGB)位于相对于封闭部分的多个内部位置，在一些情况下，以加粗字体标出。

图12显示了，在通过cast-PCR分析之前进行预扩增的样品的等位基因区分之特异性。

图13显示了，使用加尾的相对于不加尾的等位基因特异性引物进行的cast-PCR测定，等位基因区分之特异性。

图14显示了，通过cast-PCR分析的样品相对于通过ASB-PCR方法分析的样品，等位基因区分之特异性。

图15显示了，使用MGB封闭探针或磷酸酯封闭探针进行的cast-PCR测定，等位基因区分之特异性。

图16显示了，使用LNA修饰的等位基因特异性引物进行的cast-PCR测定，等位基因区分之特异性。

图17比较了，使用多种化学修饰的等位基因特异性引物进行的cast-PCR测定，等位基因区分之特异性。

图18A-B显示了预扩增和cast-PCR测定中使用的示例性等位基因特异性引物和探针的列表。

图19A-D显示了cast-PCR测定中使用的示例性引物和探针的列表，其中使用加尾的(ASP+尾巴)或非加尾的(ASP-尾巴)等位基因特异性引物(ASP+尾巴引物的加尾部分以小写字母标示出)。

图20A-C显示了ASB-PCR中使用的示例性引物和探针的列表。ASB-PCR中使用的封闭探针在封闭探针的3’末端包含磷酸酯基团(PHOS)。

图21A-C显示了，使用LNA修饰的等位基因特异性引物进行的cast-PCR测定中使用的示例性引物和探针的列表。在该示例性实施方式中，ASP的LNA修饰在3’末端(“+”表示LNA修饰的核苷酸，并且在括号中注明)。

图22显示了，使用其它的化学修饰的等位基因特异性引物进行的cast-PCR测定中使用的示例性引物和探针的列表。在该示例性实施方式中，ASP的化学修饰(例如ppA、ppG、fdU和isodC)在3’末端(化学修饰的核苷酸以括号显示)。

具体实施方式

I.绪论

目标等位基因的选择性扩增经常被一些因素复杂化，所述因素包括：备选的等位基因上的错配的等位基因特异性引物的错误引发和延伸。此类错误引发和延伸在检测聚集了过量的另一等位基因变体的样品中存在的稀少等位基因时尤其会产生问题。当足够过量时，其它等位基因变体的错误引发和延伸可以阻碍目标等位基因的检测。当使用基于PCR的方法时，含有备选的等位基因变体的样品中的特定等位基因的区分依赖于目标等位基因的选择性扩增，同时防止该样品中存在的其它等位基因的扩增或使其扩增最小化。

已经鉴定出了多个因素，其单独或组合在一起促成等位基因特异性PCR的增强的区分能力。如本文所公开，提供错配的与匹配的等位基因特异性引物之间的较大的ΔCt值的因素指示较大的区分等位基因变体的能力。人们发现此类因素改善使用本方法的等位基因变体的区分，包括，例如，使用下列一项或多项：（a）加尾的等位基因特异性引物；（b）低的等位基因特异性引物浓度；（c）设计为具有较低Tm值的等位基因特异性引物；（d）设计为靶向区分性碱基的等位基因特异性引物；（e）等位基因特异性封闭探针，其被设计为阻止从样品中的替代性的并且潜在更丰富的等位基因变体进行扩增；和（f）等位基因特异性封闭探针和/或等位基因特异性引物，其被设计为包含修饰的碱基以增大匹配的与错配的靶序列之间的ΔTm。

上述因素，尤其是当组合使用时，能够影响等位基因特异性PCR的区分存在于样品中的不同等位基因的能力。因此，本公开物大体上涉及新的扩增方法，其被称作cast-PCR，该方法利用上述因素的组合以改善PCR过程中等位基因变体的区分（通过增大ΔCt值）。在一些实施方式中，本方法可以涉及高水平的选择性，其中可以检出至少1,000-1,000,000，例如大约1000-10,000，大约10,000-100,000，大约20,000至250,000，大约30,000至300,000，大约40,000至400,000，大约50,000至500,000，大约75,000至750,000，或大约100,000-1,000,000，或其中的任意部分范围的野生型分子背景中的1个突变分子。在一些实施方式中，涉及公开的方法的第一组扩增子与第二组扩增子之间的比较提供了下列倍数的特异性的改善：1,000-100,000,000倍的差异，例如大约1000-10,000，大约10,000-100,000，大约20,000至250,000，大约30,000至300,000，大约40,000至400,000，大约50,000至500,000，大约75,000至750,000，大约100,000-1,000,000，2,000,000至25,000,000，大约3,000,000至30,000,000，大约4,000,000至40,000,000，大约5,000,000至50,000,000，大约7,5000,000至75,000,000，或大约10,000,000至100,000,000倍的差异，或其中的任意部分范围。

II.定义

为了解释本说明书的目的，适用下列定义，在所有适当的情况下，单数形式的术语也包括复数形式，反之亦然。如果出现下文给出的任意定义与任何其它文献（包括通过引用方式并入本文的任何文献）中使用的该词语相矛盾的情况，为了解释本说明书及其相关的权利要求的目的，一律以下文给出的定义为准，除非明确指出了相反含义。

如本文使用的术语“等位基因”一般是指DNA区段例如同源染色体上的相同物理基因座上的备选DNA序列。等位基因可以指：单一细胞或生物体内的同源染色体上存在的相同物理基因座之间有差异的，或者多个细胞或生物体内的相同物理基因座之间有差异的DNA序列（“等位基因变体”）。在一些情况下，等位基因可以对应于特定物理基因座上的单核苷酸差异。在其它实施方式中，等位基因可以对应于核苷酸（单个或多个）插入或删除。

如本文使用的术语“等位基因特异性引物”是指与包含目标等位基因的序列杂交并且当用于PCR中时可以被延伸以完成第一链cDNA合成的寡核苷酸序列。等位基因特异性引物特异于给定的靶DNA或基因座的特定等位基因，并且可以被设计为检测靶序列中的少至1个核苷酸的差异。等位基因特异性引物可以包含等位基因特异性核苷酸部分、靶标特异性部分和/或尾巴。

如本文使用的术语“等位基因特异性核苷酸部分”或“等位基因特异性靶核苷酸”是指等位基因特异性引物中的这样的核苷酸：其可以在给定基因座上的一个等位基因（例如少数或突变等位基因）选择性杂交并延伸，排除掉相同基因座上的其它等位基因（例如，对应的多数或野生型等位基因）。

如本文使用的术语“靶标特异性部分”是指等位基因特异性引物中的与靶多核苷酸序列杂交的区域。在一些实施方式中，等位基因特异性引物的靶标特异性部分是在待测等位基因变体的5’的引发区互补于靶序列的引发区段。等位基因特异性引物的靶标特异性部分可以包含等位基因特异性核苷酸部分。在其它情况下，等位基因特异性引物的靶标特异性部分靠近3’等位基因特异性核苷酸部分。

如本文使用的术语“尾巴”或“5’尾巴”是指引物的非3’末端。该区域通常（虽然无需）包含不互补于待分析的靶多核苷酸序列的序列。5’尾巴的长度可以是下列任意项：大约2-30，2-5，4-6，5-8，6-12，7-15，10-20，15-25或20-30个核苷酸，或其中的任意范围。

如本文使用的术语“等位基因特异性封闭探针”（在本文中也称作“封闭探针”、“封闭剂”）是指这样的寡核苷酸序列：其结合至包含位于与等位基因特异性引物所结合的链相同、相对或互补的链上的特定等位基因变体的DNA的链，并减少或阻止该特定等位基因变体的扩增。如本文更详细地讨论，等位基因特异性封闭探针一般包含修饰，例如在核糖环的3’-OH处，所述修饰阻止引物被聚合酶延伸。等位基因特异性封闭探针可以被设计为与等位基因特异性引物所退火的链相同或相对的链退火，并且可以以封闭基团（例如“不可延伸的封闭部分”）在其3’末端进行修饰。因此，封闭探针可以被设计为，例如，紧密结合至野生型等位基因（例如丰富的等位基因变体），以抑制野生型等位基因的扩增，同时允许通过等位基因特异性引物的延伸在包含突变等位基因（例如稀少等位基因变体）的相同或相对链上发生扩增。在例示性的实施方式中，等位基因特异性封闭探针不包括标记物，例如荧光、放射活性或化学发光标记物。

如本文使用的术语“不可延伸的封闭部分”一般是指寡核苷酸序列例如探针和/或引物上的修饰，该修饰使其不能被聚合酶延伸，例如，当在PCR反应中与其互补序列杂交时。封闭部分的常见的实例包括寡核苷酸的核糖环3’-OH的修饰，其阻止聚合酶向寡核苷酸序列的3’末端添加另外的碱基。此类3’-OH修饰是本领域熟知的(见，例如,Josefsen,M等人,MolecularandCellularProbes,23(2009):201-223;McKinzie,P等人,Mutagenesis.2006,21(6):391-7;Parsons,B等人,MethodsMolBiol.2005,291:235-45;Parsons,B等人,NucleicAcidsRes.1992,25:20(10):2493-6;和Morlan,J等人,PLoSOne2009,4(2):e4584,其公开内容通过引用方式全文并入本文)。

如本文使用的术语“MGB”、“MGB基团”、“MGB化合物”或“MBG部分”是指小沟结合剂。当与寡核苷酸的3’末端缀合时，MGB基团能够作为不可延伸的封闭部分发挥作用。

MGB是结合于双链DNA的小沟内的分子。虽然不能提供所有已知的MGB化合物的一般性化学通式（因为此类化合物具有差异巨大的化学结构），但是一般而言，能够结合于DNA的小沟内的化合物具有月牙形的三维结构。多数MGB部分对双链DNA的B形式的富含A-T（腺苷和胸苷）的区域具有强烈的优选性。然而，显示出对富含C-G（胞苷和鸟苷）的区域的优选性的MGB化合物在理论上也是可能的。因此，包含衍生自具有针对C-G区域的优选性的小沟结合剂分子的基团或部分的寡核苷酸也在本发明的范围内。

一些MGB能够以10³M^-1或更高的结合常数结合于双链DNA的小沟内。可以通过完善建立的光谱学方法例如紫外（UV）和核磁共振（NMR）光谱并且也可以通过凝胶电泳来检测这种类型的结合。在小沟结合剂分子结合之后，UV光谱的偏移和利用“核欧沃豪斯”(NOSEY)效应的NMR光谱是用于该目的的特别熟知的和有用的技术。凝胶电泳检测MGB与双链DNA或其片段的结合，因为在发生此类结合之后，双链DNA的迁移性会改变。

在文献中已经描述了多种适宜的小沟结合剂。见，例如，Kutyavin等人的美国专利号5,801,155;Wemmer,D.E.,andDervanP.B.,CurrentOpinioninStructuralBiology,7:355-361(1997);Walker,W.L.,Kopka,J.L.andGoodsell,D.S.,Biopolymers,44:323-334(1997);Zimmer,C.&Wahnert,U.Prog.Biophys.Molec.Bio.47:31-112(1986)以及Reddy,B.S.P.,Dondhi,S.M.,andLown,J.W.,Pharmacol.Therap.,84:1-111(1999)(其公开内容通过引用方式全文并入本文)。根据本公开物的优选的MGB是DPI₃。此类MGB的合成方法和/或来源也是本领域熟知的(见，例如，美国专利号5,801,155;6,492,346;6,084,102;和6,727,356,其公开内容通过引用方式全文并入本文)。

如本文使用的术语“MGB封闭探针”、“MGB封闭剂”或“MGB探针”是在小沟结合剂部分的3’和/或5’末端另外与其结合的寡核苷酸序列和/或探针。与MGB部分缀合的寡核苷酸与单链和双链DNA靶标形成非常稳定的双链体，因此允许在基于杂交的测定中使用较短的探针。与未经修饰的DNA相比，MGB探针具有较高的熔解温度（Tm）和增加的特异性，尤其是当错配靠近杂交的双链体的MGB区域的时候(见，例如，Kutyavin,I.V等人,NucleicAcidsResearch,2000,Vol.28,No.2:655-661)。

如本文使用的术语“修饰的碱基”一般是指：与天然存在的核酸在结构上有差异的核酸中的碱基或碱基的化学键合的任意修饰。此类修饰可以包括核酸的碱基的化学结构或碱基的化学键合中的变化，或核酸的骨架结构中的变化(见，例如，Latorra,D等人,HumMut2003,2:79-85.Nakiandwe,J等人,PlantMethod2007,3:2)。

如本文使用的术语“检测探针”是指：指示扩增的多种信号传导分子中的任意种。例如，Green和其它DNA结合染料是检测探针。一些检测探针可以是基于序列的（在本文中也称作“基因座特异性检测探针），例如5’核酸酶探针。多种检测探针是本领域已知的，例如，本文中描述的探针(另外见美国专利号5,538,848)，多种茎环分子信标(见，例如，美国专利号6,103,476和5,925,517以及TyagiandKramer,NatureBiotechnology,1996,14:303-308)，无茎的或线性信标(见，例如，WO99/21881),PNAMolecularBeacons^TM(见，例如，美国专利号6,355,421和6,593,091)，线性PNA信标(见，例如，Kubista等人,2001,SPIE4264:53-58),非-FRET探针(见，例如，美国专利号6,150,097),探针(美国专利号6,548,250),茎环和双链Scorpion^TM探针(Solinas等人,2001,NucleicAcidsResearch29:E96和美国专利号6,589,743),鼓起的环探针(美国专利号6,590,091),假结探针(美国专利号6,589,250),cyclicon(美国专利号6,383,752),MGBEclipse^TM探针(EpochBiosciences),发夹探针(美国专利号6,596,490),肽核酸(PNA)点燃探针，自组装纳米颗粒探针和二茂铁修饰的修饰，其描述于例如美国专利号6,485,901;Mhlanga等人,2001,Methods25:463-471;Whitcombe等人,1999,NatureBiotechnology.17:804-807;Isacsson等人,2000,MolecularCellProbes.14:321-328;Svanvik等人,2000,AnalBiochem.281:26-35;Wolffs等人,2001,Biotechniques766:769-771;Tsourkas等人,2002,NucleicAcidsResearch.30:4208-4215;Riccelli等人,2002,NucleicAcidsResearch30:4088-4093;Zhang等人,2002Shanghai.34:329-332;Maxwell等人,2002,J.Am.Chem.Soc.124:9606-9612;Broude等人,2002,TrendsBiotechnol.20:249-56;Huang等人,2002,ChemRes.Toxicol.15:118-126;和Yu等人,2001,J.Am.Chem.Soc14:11155-11161。检测探针可以包含报告分子染料，例如，6-羧基荧光素(6-FAM)或四氯荧光素(TET)。检测探针还可以包含猝灭剂部分，例如四甲基若丹明(TAMRA),BlackHoleQuenchers(Biosearch),IowaBlack(IDT),QSY猝灭剂(MolecularProbes)和Dabsyl和Dabcel磺酸盐/羧酸盐猝灭剂(Epoch)。检测探针也可以包含两个探针，其中，例如，在一个探针上具有氟石，在另一个探针上具有猝灭剂，这两个探针在靶标上的杂交共同猝灭信号，或者在靶标上的杂交通过荧光的变化改变信号特征。检测探针还可以包含具有SO₃而非羧酸基团的荧光素染料的磺酸盐衍生物，亚磷酰胺形式的荧光素，亚磷酰胺形式的CY5(可以获自例如AmershamBiosciences-GEHealthcare)。

如本文使用的术语"基因座特异性引物"是指在PCR反应中与源自第一引物（例如等位基因特异性引物）的延伸的产物杂交并且能够实现所述产物的第二链cDNA合成的寡核苷酸序列。因此，在一些实施方式中，等位基因特异性引物作为正向PCR引物，基因座特异性引物作为反向PCR引物，反之亦可。在一些优选的实施方式中，基因座特异性引物以高于等位基因特异性引物的浓度存在。

如本文使用的术语“稀少等位基因变体”是指：相对于备选的等位基因变体，在样品中以较低水平存在的靶多核苷酸。稀少等位基因变体也可以被称作是“少数等位基因变体”和/或“突变等位基因变体”。例如，对于给定的SNP或基因，相对于另一个等位基因变体，稀少等位基因变体可以以小于1/10,1/100,1/1,000,1/10,000,1/100,000,1/1,000,000,1/10,000,000,1/100,000,000或1/1,000,000,000的频率存在。或者，每1,10,100,1,000μl样品或反应体积中，稀少等位基因变体可以是例如小于2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,50,75,100,250,500,750,1,000,2,500,5,000,7,500,10,000,25,000,50,000,75,000,100,000,250,000,500,000,750,000或1,000,000个拷贝。

如本文使用的术语“丰富的等位基因变体”可以指：在样品中以高于备选等位基因变体的水平存在的靶多核苷酸。丰富的等位基因变体也可以被称作是“多数等位基因变体”和/或“野生型等位基因变体”。例如，对于给定的SNP或基因，相对于另一个等位基因变体，丰富的等位基因变体可以以大于10X,100X,1000X,10,000X，100,000X，1,000,000X，10,000,000X,100,000,000X或1,000,000,000X的频率存在。或者，每1,10,100,1,000μl样品或反应体积中，丰富的等位基因变体可以是例如大于2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,50,75,100,250,500,750,1,000,2,500,5,000,7,500,10,000,25,000,50,000,75,000,100,000,250,000,500,000,750,000或1,000,000个拷贝。

如本文使用的术语“第一”和“第二”用于区分第一反应（例如“第一”反应；“第一”等位基因特异性引物）和第二反应（例如“第二”反应；“第二”等位基因特异性引物）的成分。习惯上讲，如本文所使用，第一反应扩增第一（例如，稀少的）等位基因变体；第二反应扩增第二（例如，丰富的）等位基因变体，反之亦可。

如本文使用的“第一等位基因变体”和“第二等位基因变体”可以涉及来自相同生物体的给定基因座的等位基因。例如，包含野生型等位基因的人类样品（例如细胞）中的情况可能是这样，其中一些野生型等位基因已经突变以形成少数或稀少等位基因。本教导中的第一和第二等位基因变体也可以指来自不同生物体的等位基因。例如，第一等位基因可以是经遗传修饰的生物体的等位基因，第二等位基因可以是野生型生物体的对应的等位基因。本教导中的第一等位基因变体和第二等位基因变体可以包含于gDNA以及mRNA和cDNA中，并且一般可以是由于例如SNP或核苷酸插入和/或删除突变而显示出序列变异性的任意靶核酸。

如本文使用的术语“热稳定性的”或“热稳定性的聚合酶”是指这样的酶：其是热稳定性的或热抗性的，并且催化脱氧核糖核苷酸聚合以形成互补于核酸链的引物延伸产物。当在PCR扩增中在升高的温度经历足以使单链核酸去稳定化或使双链核酸变性的时间时，本文中使用的热稳定性的DNA聚合酶不会发生不可逆的失活。酶的不可逆的变性是指实质上丧失酶的活性。优选地，热稳定性的DNA聚合酶在例如PCR扩增通常所需的条件下在大约90℃-100℃将不会不可逆地变性。

如本文使用的术语“PCR扩增（PCRamplifying）”或“PCR扩增”（PCRamplification）一般是指循环的聚合酶介导的核酸的指数扩增，其使用与互补链杂交的引物，如在例如Innis等人,PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress(1990)中所描述。已经开发了能够以包含荧光指示剂的成分进行热循环反应的装置，所述荧光指示剂能够发射指定波长的光束，读取荧光染料的强度，并且显示每个循环后荧光的强度。已经描述了包含热循环仪、光束发射器和荧光信号检测器的装置，例如，见美国专利号5,928,907;6,015,674;6,174,670;和6,814,934，包括但不限于ABI7700SequenceDetectionSystem(AppliedBiosystems,FosterCity,California),ABI5700SequenceDetectionSystem(AppliedBiosystems,FosterCity,California),ABI7300SequenceDetectionSystem(AppliedBiosystems,FosterCity,California),ABI7500SequenceDetectionSystem(AppliedBiosystems,FosterCity,California),StepOne^TMReal-TimePCRSystem(AppliedBiosystems,FosterCity,California)和ABI7900SequenceDetectionSystem(AppliedBiosystems,FosterCity,California)。

如本文使用的术语“预扩增(pre-amplification)”或“预扩增(pre-amplify)”是指这样的过程：其中在多重PCR扩增反应中包括多个引物对，并且多重扩增反应进行有限次数的循环从而基于PCR的预扩增反应在PCR平稳和/或试剂耗竭之前停止。术语“基于PCR的预扩增”可以认为意指随后进行的第二扩增反应，通常比基于PCR的预扩增反应的重数水平(plexylevel)低。该第二扩增反应通常为多个分开的第二扩增反应，可以利用多重基于PCR的预扩增反应中使用的引物所编码的引物对。然而，每个第二扩增反应通常包括单一或少数的引物对。关于基于PCR的预扩增方法的另外的实例可以见，例如，美国专利号6,605,451和美国专利申请系列号10/723,520，其公开内容通过引用方式全文并入本文。

如本文使用的术语寡核苷酸的“Tm”或“熔解温度”是指单链寡核苷酸的群体中的50%的分子与它们的互补序列杂交并且群体中的50%的分子未与所述互补序列杂交时的温度（以摄氏度表示）。可以通过熔解曲线的方式通过经验确定引物或探针的Tm。在一些情况下，还可以使用本领域熟知的公式来计算(见，例如，Maniatis,T.等人,Molecularcloning:alaboratorymanual/ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.:1982)。

如本文使用的术语“灵敏性”是指在给定的测定法中能够被检出的模板的最小的量（拷贝数或质量）。如本文使用的术语“特异性”是指某测定法区分来自匹配模板和错配模板的扩增的能力。特异性经常表示为ΔCt=Ct_错配-Ct_匹配。特异性的改善或“特异性的改进”或“倍数差异”在本文中表示为2^{(ΔCt_条件1－ΔCt_条件2)}。术语“选择性”是指AS-PCR测定可用于测定混合物中的少数（通常是突变）等位基因而无来自多数（经常是野生型）等位基因的干扰的程度。选择性经常表示为比例或百分率。例如，能够在存在100个野生型模板的情况下检出1个突变模板的测定被称作具有1:100或1%的选择性。如本文使用的“测定的选择性“也可以计算为1/2^ΔCt或使用(1/2^ΔCtx100)以百分率表示。

如本文使用的术语“Ct”或“Ct值”是指循环阈值，代表PCR扩增测定的循环数：在该循环数时，来自指示扩增代数的报告分子的信号（例如荧光）首次变为在背景水平之上可检出。在一些实施方式中，循环阈值或Ct是PCR扩增变为指数时的循环数。

如本文使用的术语"德尔塔Ct"或"ΔCt"是指信号通过固定阈值时，两个不同样品或反应之间的循环数差异。在一些实施方式中，ΔC_t是达到指数扩增时，两个不同样品或反应之间的循环数差异。ΔC_t可用于鉴定“针对相应靶核酸序列的匹配的引物”与“针对相同的相应靶核酸序列的错配的引物”之间的特异性。

在一些实施方式中，错配的引物与匹配的引物之间的ΔC_t的计算被用作等位基因特异性PCR的区分能力的一个度量。一般地，任何增大“使用与靶序列（例如包含目标等位基因变体的序列）匹配的引物进行的扩增反应的C_t值”与“使用错配引物时的C_t值”之间的差异的因素都将导致更大的等位基因区分能力。

根据多个实施方式，可以使用PCR曲线的衍生物来测定C_t值。例如，可以在PCR曲线上进行第一、第二或第n衍生物方法以测定C_t值。在多个实施方式中，衍生物的特征可用于测定C_t值。此类特征可以包括但不限于：第二衍生物的正变形（positiveinflection），第二衍生物的负变形（negativeinflection），第二衍生物的零交叉，或第一衍生物的正变形。在多个实施方式中，可以使用阈值和基线法来测定C_t值。例如，可以使用衍生物方法建立PCR曲线的指数期上界（upperbound），同时测定PCR曲线的基线以建立PCR曲线的指数期的下界（lowerbound）。通过PCR曲线的上界和下界，可以建立阈值，从阈值可以确定C_t值。用于确定C_t值的其它方法是本领域已知的，例如但不限于，拟合点（fitpoint）法的多种实施方式，和sigmoidal法的多种实施方式(见，例如，美国专利号6,303,305;6,503,720;6,783,934,7,228,237和美国申请号2004/0096819；其公开内容通过引用方式全文并入本文)。

III.组合物、方法和试剂盒

在一个方面，本发明提供了用于鉴定和/或定量核酸样品中的等位基因变体的组合物。这些组合物中的一些可以包含：（a）等位基因特异性引物；（b）等位基因特异性封闭探针；（c）检测探针；和/或（d）基因座特异性引物，或其任意组合。在组合物的一些实施方式中，组合物还可以包含聚合酶，dNTP，适合用于PCR扩增的试剂和/或缓冲剂；和/或模板序列或核酸样品。在一些实施方式中，聚合酶可以是热稳定性的。

在另一个方面，本发明提供了组合物，其包含：（i）第一等位基因特异性引物，其中所述第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于靶序列的第一等位基因变体；和（ii）第一等位基因特异性封闭探针，其互补于包含第二等位基因变体的靶序列的区域，其中所述区域包含对应于第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置的位置，并且其中所述第一等位基因特异性封闭探针包含小沟结合剂。

在一些例示性实施方式中，组合物还可以包含基因座特异性引物，其互补于在第一等位基因变体的3’并且在相对链上的靶序列的区域。

在进一步的实施方式中，组合物还可以包括检测探针。

在其它实施方式中，进一步提供了用于预扩增的组合物，如下文进一步详细描述。

在另一个方面，本发明提供了用于扩增等位基因特异性序列的方法。这些方法中的一些可以包括：（a）使等位基因特异性引物与包含靶等位基因的第一核酸分子杂交；（b）使等位基因特异性封闭探针与包含备选等位基因的第二核酸分子杂交，其中所述备选等位基因对应于与靶等位基因相同的基因座；（c）使基因座特异性检测探针与第一核酸分子杂交；（d）使基因座特异性引物与等位基因特异性引物的延伸产物杂交；和（e）PCR扩增靶等位基因。

在另一个方面，本发明提供了用于检测和/或定量混合样品中的等位基因变体的方法。这些方法中的一些可以包括：（a）在第一反应混合物中，使第一等位基因特异性引物与包含第一等位基因（等位基因-1）的第一核酸分子杂交，以及在第二反应混合物中，使第二等位基因特异性引物与包含第二等位基因（等位基因-2）的第一核酸分子杂交，其中等位基因-2对应于与等位基因-1相同的基因座；（b）在第一反应混合物中，使第一等位基因特异性封闭探针与包含等位基因-2的第二核酸分子杂交，以及，在第二反应混合物中，使第二等位基因特异性封闭探针与包含等位基因-1的第二核酸分子杂交；（c）在第一反应混合物中，使第一检测探针与第一核酸分子杂交，以及，在第二反应混合物中，使第二检测探针与第一核酸分子杂交；（d）在第一反应混合物中，使第一基因座特异性引物与第一等位基因特异性引物的延伸产物杂交，以及，在第二反应混合物中，使第二基因座特异性引物与第二等位基因特异性引物的延伸产物杂交；和（e）PCR扩增第一核酸分子以形成第一组扩增子或扩增子的样品，以及，PCR扩增第二核酸分子以形成第二组扩增子或扩增子的样品；和（f）将第一组扩增子与第二组扩增子比较以定量包含等位基因-2的样品中的等位基因-1，和/或包含等位基因-1的样品中的等位基因-2。

在另一方面，本发明提供了用于检测和/或定量等位基因变体的方法。这些方法中的一些可以包括：（a）PCR扩增第一反应中的第一等位基因变体以形成第一扩增子，所述第一反应包括（i）低浓度的第一等位基因特异性引物，（ii）第一基因座特异性引物，和（iii）第一封闭探针；（b）PCR扩增第二反应中的第二等位基因变体以形成第二扩增子，所述第二反应包括（i）低浓度的第二等位基因特异性引物，（ii）第二基因座特异性引物，和（iii）第二封闭探针；和（d）比较第一扩增子与第二扩增子以定量包含第二等位基因变体的样品中的第一等位基因变体。

在另一方面，本发明提供了用于检测怀疑包含至少靶序列的第二等位基因变体的核酸样品中的靶序列的第一等位基因变体的方法。该方面的方法包括通过组合下列形成第一反应混合物：（i）核酸样品；（ii）第一等位基因特异性引物，其中第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于靶序列的第一等位基因变体；（iii）第一等位基因特异性封闭探针，其互补于包含第二等位基因变体的靶序列的区域，其中所述区域包含对应于第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置的位置，并且其中所述第一等位基因特异性封闭探针包含小沟结合剂；（iv）第一基因座特异性引物，其互补于在第一等位基因变体的3’并且在相对链上的靶序列的区域；和（v）第一检测探针。

接下来，使用第一基因座特异性引物和第一等位基因特异性引物在第一反应混合物中进行扩增反应，通常是PCR扩增反应，以形成第一扩增子。然后，通过第一检测探针与该扩增子结合后的可检测性质的变化来检测第一扩增子，从而检测核酸样品中的靶基因的第一等位基因变体。在一些例示性的实施方式中，检测探针是5’核酸酶探针。在一些例示性的实施方式中，可检测性质是荧光。

在一些实施方式中，第一等位基因特异性引物的5’靶区域的3’核苷酸部分是等位基因特异性核苷酸部分。在一些其它例示性的实施方式中，包括那些“第一等位基因特异性引物的5’靶区域的3’核苷酸部分是等位基因特异性核苷酸部分”的实施方式，等位基因特异性引物的封闭区域包括等位基因特异性核苷酸部分。此外，在例示性的实施方式中，第一等位基因特异性封闭探针包括小沟结合剂。此外，在一些例示性的实施方式中，等位基因特异性封闭探针不具有标记物，例如荧光标记物，或猝灭剂。

在一些例示性的实施方式中，通过评价第一检测探针的可检测性质的变化来测定第一等位基因变体的数量。

在一些例示性的实施方式中，方法还包括通过组合下列形成第二反应混合物：（i）核酸样品；（ii）第二等位基因特异性引物，其中第二等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于靶序列的第二等位基因变体；（iii）第二等位基因特异性封闭探针，其互补于包含第一等位基因变体的靶序列的区域，其中所述区域包含对应于第二等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置的位置，并且其中所述第二等位基因特异性封闭探针包含小沟结合剂；（iv）第二基因座特异性引物，其互补于在第二等位基因变体的3’并且在相对链上的靶序列的区域；和（v）第二检测探针。接下来，使用第二等位基因特异性引物和基因座特异性引物在第二反应混合物中进行扩增反应，以形成第二扩增子。然后通过检测探针的可检测性质的变化来检测第二扩增子。

在一些实施方式中，方法还包括将第一反应混合物中的第一检测探针的可检测性质的变化与第二反应混合物中的第二检测探针的可检测性质的变化进行比较。

在一些优选实施方式中，方法可以包括两步循环程序。在一些实施方式中，用于检测核酸样品中的靶序列中的等位基因变体的方法包括：形成包含下列的反应混合物：

i)核酸样品；

ii)等位基因特异性引物，其中所述等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于靶序列的第一等位基因变体；

iii)等位基因特异性封闭探针，其互补于包含第二等位基因变体的靶序列的区域，其中所述区域包含对应于所述等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置的位置，并且其中所述等位基因特异性封闭探针包含封闭部分；

iv)基因座特异性引物，其互补于在第一等位基因变体的3’并且在相对链上的靶序列的区域；和

v)检测探针；

b)使用两步循环程序PCR扩增靶序列，包括：

i）第一扩增步骤，其包括在第一退火/延伸温度进行第一数目的循环；和

ii)第二扩增步骤，其包括在第二退火/延伸温度进行第二数目的循环，其中

第一数目的循环少于第二数目的循环，并且第一退火/延伸温度低于第二退火/延伸温度；和

c)检测通过步骤b)产生的靶序列的扩增产物中的检测探针的可检测性质的变化。

在一些实施方式中，循环程序包括第一步扩增，其使用较低退火/延伸温度下的最初的循环数，然后是第二步扩增，其使用较高退火/延伸温度下的多个循环。由于cast-PCR等位基因特异性引物的较低的Tm(例如，53-56℃)，PCR在标准退火/延伸条件下(例如60-64)℃可能不是最佳的。因此，在最初的循环阶段可以使用较低的退火/延伸温度，其显著改善cast-PCR的效率。

在一些实施方式中，cast-PCR循环程序的第一步中使用的循环数少于第二步中使用的循环数。在cast-PCR方法的一些实施方式中，循环程序的第一步中使用的循环数是第二步中使用的总循环数的大约2%-20%,4%-18%,6%-16%,8%-14%,10%-12%,或其中任意百分数。在一些实施方式中，第一步使用1-10个循环，2-8个循环，3-7个循环，或4-6个循环，以及其中的任意循环数，例如2,3,4,5,6或7个循环。

在一些实施方式中，cast-PCR循环程序的第二步中使用的循环数大于第一步中使用的循环数。在cast-PCR方法的一些实施方式中，循环程序的第二步中使用的循环数是第一步中使用的循环数的5倍、6倍、8倍、10倍、12倍、18倍、25倍或30倍。在一些实施方式中，第二步使用30-50个循环，35-48个循环，40-46个循环，或其中的任意循环数，例如42,43,44,45或46个循环。

在一些实施方式中，第一步中使用的较低的退火/延伸温度比第二步中使用的退火/延伸温度低大约1℃，大约2℃，大约3℃，大约4℃或大约5℃。在一些优选实施方式中，第一步的退火/延伸温度是50℃至60℃,52℃至58℃,或54℃至56℃，例如53℃,54℃,55℃或55℃。在一些优选实施方式中，第二步的退火/延伸温度是56℃至66℃,58℃至64℃,或60℃至62℃,例如58℃,60℃,62℃或64℃。

在cast-PCR中使用这种两步PCR循环程序具有数个主要优点，使其比常规的AS-PCR方法更好。首先，通过降低匹配的靶标或等位基因的Ct值而改善了检测灵敏性。其次，通过增加匹配的与错配的序列的Ct值之间的ΔCt而改善了cast-PCR的特异性。最后，通过使得在多个测验之间具有相似的效率而改善了cast-PCR的均一性。

在一些实施方式中，两步循环程序改善了cast-PCR的效率（例如特异性和灵敏性）。在一些实施方式中，相对于无两步循环程序的cast-PCR反应运行的特异性，特异性增加2-8倍、3-7倍或4-6倍，或其中任意倍数（例如，3倍、4倍、5倍、6倍或7倍）。在其它实施方式中，相对于无两步循环程序的cast-PCR反应运行的灵敏性，灵敏性增加1-3倍（例如，1倍、2倍或3倍）。在一些实施方式中，相对于无两步循环程序的cast-PCR测定运行，使用两步循环程序的cast-PCR的测定运行之间的ΔCt的差异是1、2或3的ΔCt。

在另一个方面，本发明提供了包括下列的反应混合物：（i）核酸分子；（ii）等位基因特异性引物，其中等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于靶序列的第一等位基因变体；（iii）等位基因特异性封闭探针，其互补于包含第二等位基因变体的靶序列的区域，其中所述区域包含对应于等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置的位置，并且其中所述等位基因特异性封闭探针包含小沟结合剂；（iv）基因座特异性引物，其互补于在第一等位基因变体的3’并且在相对链上的靶序列的区域；和（v）检测探针。

在一些实施方式中，本发明的方法用于检测给定SNP或基因中的第一等位基因变体，其以小于第二等位基因变体的1/10,1/100,1/1,000,1/10,000,1/100,000,1/1,000,000,1/10,000,000,1/100,000,000或1/1,000,000,000以及其中任意部分范围的频率存在。在其它实施方式中，该方法用于检测第一等位基因变体，其以小于2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,50,75,100,250,500,750,1,000,2,500,5,000,7,500,10,000,25,000,50,000,75,000,100,000,250,000,500,000,750,000,1,000,000个拷贝/1,10,100,1,000μl样品或反应体积或其中任意部分范围的量存在。

在一些实施方式中，第一等位基因变体是突变体。在一些实施方式中，第二等位基因是野生型。在一些实施方式中，本方法可以包括检测至少1,000至1,000,000，例如大约1000至10,000，大约10,000至100,000，或大约100,000至1,000,000个或其中任意部分范围的野生型分子的背景中的1个突变体分子。在一些实施方式中，方法可以提供至少与基于的测定法相当的高灵敏性和效率。

在一些实施方式中，涉及所公开的方法的第一扩增子与第二扩增子的比较提供了1,000至1,000,000倍的倍数差异，例如大约1000至10,000倍，大约10,000至100,000倍，或大约100,000至1,000,000倍倍数差异或其中任意部分范围的特异性上的改进。在一些实施方式中，扩增子的大小是大约60-120个核苷酸的长度。

在一些实施方式中，方法还可以包括用于预扩增cast-PCR反应的另外的步骤，如下文更详细地描述。

在另一个方面，本发明提供了用于定量包含备选的第二等位基因变体的样品中的第一等位基因变体的试剂盒，其包含：（a）第一等位基因特异性引物；（b）第二等位基因特异性引物；（c）第一基因座特异性引物；（d）第二基因座特异性引物；（e）第一等位基因特异性封闭探针；（f）第二等位基因特异性封闭探针；和（g）聚合酶。在公开的试剂盒的一些实施方式中，所述试剂盒还包含第一基因座特异性检测探针和第二基因座特异性检测探针。

在另一方面，本发明提供了包括两个或更多个容器的试剂盒，包含独立分配于所述两个或更多个容器中的一个中的下列成分：（i）第一等位基因特异性引物，其中第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于靶序列的第一等位基因变体；和（ii）第一等位基因特异性封闭探针，其互补于包含第二等位基因变体的靶序列的区域，其中所述区域包含对应于第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置的位置，并且其中所述第一等位基因特异性封闭探针包含小沟结合剂。

在一些例示性的实施方式中，试剂盒还可以包括基因座特异性引物，其互补于在第一等位基因变体的3’并且在相对链上的靶序列的区域。

在其它实施方式中，试剂盒还可以包含检测探针。

在一些实施方式中，试剂盒还可以包括用于预扩增的另外的成分，如下文更详细地描述。

在一些实施方式中，组合物、方法和/或试剂盒可用于在诊断中检测循环的细胞。在一个实施方式中，组合物、方法和/或试剂盒可用于检测血液中的肿瘤细胞以进行早期癌症诊断。在一些实施方式中，组合物、方法和/或试剂盒可用于癌症或疾病相关的遗传变异或体细胞突变检测和验证。在一些实施方式中，组合物、方法和/或试剂盒可用于对四、三和二-等位基因的SNP进行基因分型。在其它实施方式中，组合物、方法和/或试剂盒可用于鉴定单核苷酸或多核苷酸插入或删除突变。在一些实施方式中，组合物、方法和/或试剂盒可用于从混合的DNA样品中进行DNA分型，以进行QC和人类鉴定测定，就细胞污染物进行细胞系QC，等位基因的基因表达分析，病毒分型/稀少病原体检测，从汇集的样品中检测突变，检测血液中的循环的肿瘤细胞，和/或出生前诊断。

在一些实施方式中，组合物、方法和/或试剂盒与多种仪器例如来自AppliedBiosystems(FosterCity,CA)的SDS仪器相容。

等位基因特异性引物

设计为具有低Tm的等位基因特异性引物(ASP)显示出增强的等位基因变体的区分。在一些实施方式中，等位基因特异性引物是短的寡聚物，其长度是大约15-30，例如大约16-28，大约17-26，大约18-24，或大约20-22或其中任意范围的核苷酸。在一些实施方式中，等位基因特异性引物的Tm是大约50℃至70℃，例如大约52℃至68℃，大约54℃至66℃，大约56℃至64℃，大约58℃至62℃，或其中任意温度(例如53℃,54℃,55℃,56℃)。在其它实施方式中，等位基因特异性引物的Tm比扩增过程中使用的PCR循环条件的退火/延伸温度高大约3℃至6℃。

低的等位基因特异性引物浓度也可以改善选择性。等位基因特异性引物浓度降低至900nM以下能够增大匹配的与错配的序列的ΔCt。在所公开的组合物的一些实施方式中，等位基因特异性引物的浓度是大约20nM至900nM，例如大约50nM至700nM，大约100nM至500nM，大约200nM至300nM，大约400nM至500nM，或其中任意范围。在一些例示性的实施方式中，等位基因特异性引物的浓度是大约200nM至400nM。

在一些实施方式中，等位基因特异性引物可以包含特异于目标靶等位基因的等位基因特异性核苷酸部分。等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于基因的一个等位基因，但不互补于该基因的另一个等位基因。换言之，等位基因特异性核苷酸部分结合基因的一个或多个可变核苷酸位置，所述位置是已知为对于基因的不同等位基因变体而言包括不同核苷酸的核苷酸位置。等位基因特异性核苷酸部分的长度至少是1个核苷酸。在例示性的实施方式中，等位基因特异性核苷酸部分的长度是1个核苷酸。在一些实施方式中，等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分位于等位基因特异性引物的3’末端。在其它实施方式中，等位基因特异性核苷酸部分位于等位基因特异性引物的3’最末端的大约1-2,3-4,5-6,7-8,9-11,12-15或16-20个核苷酸处。

被设计为靶向区分性碱基的等位基因特异性引物也可以改善等位基因变体的区分。在一些实施方式中，等位基因特异性核苷酸部分的核苷酸靶向高度区分性碱基(例如，用于检测A/A,A/G,G/A,G/G,A/C或C/A等位基因)。较低区分性的碱基，例如，可以包括检测C/C,T/C,G/T,T/G,C/T等位基因。在一些实施方式中，例如，当待测等位基因包括A/G或C/TSNP时，A或G可以用作等位基因特异性引物的3’等位基因特异性核苷酸部分(例如，如果A或T是主要等位基因)，或者，C或T可以用作等位基因特异性引物的3’等位基因特异性核苷酸部分(例如，如果C或G是主要等位基因)。在其它实施方式中，当检测和/或定量A/TSNP时，A可以用作等位基因特异性引物的3’末端的核苷酸特异性部分(例如，等位基因特异性核苷酸部分)。在其它实施方式中，当检测和/或定量C/GSNP时，G可以用作等位基因特异性引物的3’末端的核苷酸特异性部分。

在一些实施方式中，等位基因特异性引物可以包含特异于目标多核苷酸序列（或基因座）的靶标特异性部分。在一些实施方式中，靶标特异性部分与目标靶多核苷酸序列大约75-85%,85-95%,95-99%或100%互补。在一些实施方式中，等位基因特异性引物的靶标特异性部分可以包含等位基因特异性核苷酸部分。在其它实施方式中中，靶标特异性部分位于等位基因特异性核苷酸部分的5’。靶标特异性部分的长度可以是大约4-30，大约5-25，大约6-20，大约7-15，或大约8-10个核苷酸。在一些实施方式中，靶标特异性部分的Tm比用于PCR循环的退火/延伸温度低大约5℃。在一些实施方式中，等位基因特异性引物的靶标特异性部分的Tm是大约51℃至60℃，大约52℃至59℃，大约53℃至58℃，大约54℃至57℃，大约55℃至56℃，或大约50℃至大约60℃。

在所公开的方法和试剂盒的一些实施方式中，第一等位基因特异性引物的靶标特异性部分和第二等位基因特异性引物的靶标特异性部分包含相同的序列。在其它实施方式中，第一等位基因特异性引物的靶标特异性部分和第二等位基因特异性引物的靶标特异性部分是相同的序列。

在一些实施方式中，等位基因特异性引物包含尾巴。包含尾巴的等位基因特异性引物使引物的总体长度减小，从而降低Tm但不显著影响测定的灵敏性。

在一些例示性的实施方式中，尾巴位于等位基因特异性引物的5’末端。在一些实施方式中，尾巴位于等位基因特异性引物的靶标特异性部分和/或等位基因特异性核苷酸部分的5’。在一些实施方式中，尾巴与目标靶多核苷酸序列大约65-75%，大约75-85%，大约85-95%，大约95-99%，或大约100%非互补。在一些实施方式中，尾巴的长度可以是大约2-40，例如大约4-30，大约5-25，大约6-20，大约7-15，或大约8-10个核酸。在一些实施方式中，尾巴富含GC。例如，在一些实施方式中，尾巴序列包含大约50%-100%，大约60%-100%，大约70%-100%，大约80%-100%，大约90%-100%，或大约95%-100%G和/或C核苷酸。

等位基因特异性引物的尾巴的构型可以是多种不同方式，包括但不限于这样的构型：在引物延伸后，尾巴区域是可获得的，以杂交至引物延伸产物中的互补性序列（如果存在）。因此，例如，等位基因特异性引物的尾巴可以杂交至由于基因座特异性引物的延伸而产生的延伸产物中的互补性序列。

在所公开的方法和试剂盒的一些实施方式中，第一等位基因特异性引物的尾巴和第二等位基因特异性引物的尾巴包含相同的序列。在其它实施方式中，第一等位基因特异性引物的5’尾巴和第二等位基因特异性引物的5’尾巴是相同的序列。

等位基因特异性封闭探针

等位基因特异性封闭探针(或ASB)(在本文中有时称作"封闭探针")可以被设计为短的寡聚物，其是单链，长度是100个或更少的核苷酸，更优选50个或更少的核苷酸，再更优选30个或更少的核苷酸，最优选20个或更少的核苷酸，下限是大约5个核苷酸。

在一些实施方式中，封闭探针的Tm是58℃至70℃,61℃至69℃,62℃至68℃,63℃至67℃,64℃至66℃，或大约60℃至大约63℃,或其中的任意范围。在其它实施方式中，等位基因特异性封闭探针的Tm比扩增过程中使用的PCR循环条件的退火/延伸温度高大约3℃至6℃。

在一些实施方式中，封闭探针在PCR过程中不被切割。在一些实施方式中，封闭探针在它们的3’末端包含不可延伸的封闭部分。在一些实施方式中，封闭探针在它们的3’末端、5’末端和/或其中任意内部位置处还可以包含其它部分（包括但不限于另外的不可延伸的封闭部分，猝灭剂部分，荧光部分等）。在一些实施方式中，等位基因的位置位于距离等位基因特异性封闭探针的不可延伸的封闭部分大约5-15，例如大约5-11，大约6-10，大约7-9，大约7-12，或大约9-11，例如大约6，大约7，大约8，大约9，大约10，或大约11个核苷酸处（当与它们的靶序列结合时）。在一些实施方式中，不可延伸的封闭部分可以是但不限于胺(NH₂),生物素,PEG,DPI₃或PO₄。在一些优选的实施方式中，封闭部分是小沟结合剂(MGB)部分(本发明的寡核苷酸-MGB缀合物在本文中有时被称作"MGB封闭探针"或"MGB封闭剂")。

如本文所公开，在等位基因特异性封闭探针中使用MGB部分能够增加等位基因特异性PCR的特异性。该效应的一种可能性是：由于它们与单链或双链核酸的互补序列的强亲和性杂交和强烈结合，MGB能够降低连接的寡核苷酸的Tm(见，例如，Kutyavin,I等人,NucleicAcidsRes.,2000,Vol.28,No.2:655-661)。包含MGB部分的寡核苷酸具有严格的几何学要求，因为寡核苷酸与MGB部分之间的接头必须足够灵活以允许MGB在DNA双链形成后定位于小沟内。因此，相对于常规DNA封闭探针，MGB封闭探针能够提供匹配的与错配的等位基因之间的更大的Tm差异。

一般地，MGB部分是结合于双链DNA的小沟内的分子。虽然不能提供所有已知的MGB化合物的一般性化学通式（因为此类化合物具有差异巨大的化学结构），但是一般而言，能够结合于DNA的小沟内的化合物具有月牙形的三维结构。多数MGB部分对双链DNA的B形式的富含A-T（腺苷和胸苷）的区域具有强烈的优选性。然而，

显示出对富含C-G（胞苷和鸟苷）的区域的优选性的MGB化合物在理论上也是可能的。因此，包含衍生自具有针对C-G区域的优选性的小沟结合剂分子的基团或部分的寡核苷酸也在本发明的范围内。

一些MGB能够以10³M-¹或更高的结合常数结合于双链DNA的小沟内。可以通过完善建立的光谱学方法例如紫外（UV）和核磁共振（NMR）光谱并且也可以通过凝胶电泳来检测这种类型的结合。在小沟结合剂分子结合之后，UV光谱的偏移和利用“核欧沃豪斯”(NOSEY)效应的NMR光谱法是用于该目的的特别熟知的和有用的技术。凝胶电泳检测MGB与双链DNA或其片段的结合，因为在发生此类结合之后，双链DNA的迁移性会改变。

在文献中已经描述了多种适宜的小沟结合剂。见，例如，Kutyavin等人美国专利号5,801,155;Wemmer,D.E.,andDervanP.B.,CurrentOpinioninStructuralBiology,7:355-361(1997);Walker,W.L.,Kopka,J.L.andGoodsell,D.S.,Biopolymers,44:323-334(1997);Zimmer,C.&Wahnert,U.Prog.Biophys.Molec.Bio.47:31-112(1986)以及Reddy,B.S.P.,Dondhi,S.M.,andLown,J.W.,Pharmacol.Therap.,84:1-111(1999)。在一组实施方式中，MGB选自：CC1065类似物,lexitropsin,偏端霉素,纺锤菌素,贝尼尔,多卡米星,喷他脒,4,6-二氨基-2-苯基吲哚和吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮□。根据本公开物的优选的MGB是DPI₃(见美国专利号6,727,356，其公开内容通过引用方式全文并入本文)。

已经描述了适合于将MGB通过接头连接至寡核苷酸或探针的方法，见例如美国专利号5,512,677;5,419,966;5,696,251;5,585,481;5,942,610;5,736,626;5,801,155和6,727,356(其公开内容通过引用方式全文并入本文)。例如，可以使用自动化寡核苷酸合成方法从具有可切割接头的固体支持物合成MGB-寡核苷酸缀合物。在其它实例中，可以基本上根据Lukhtanov等人BioconjugateChern.,7:564-567(1996)(其公开内容通过引用方式全文并入本文)的程序从MGB修饰的固体支持物制备MGB探针。根据这些方法，可以将一个或多个MGB部分连接于寡核苷酸的5’末端、3’末端和/或任意内部部分。

MGB部分在MGB-寡核苷酸缀合物中的位置可以影响此类缀合物的区分力特性。双链内的非配对区域可能导致错配碱基附近的小沟的形状的变化。由于MGB最适合于在完美匹配的DNA双链的小沟内，所以导致小沟形状变化的错配将降低MGB与含有错配的区域的结合强度。因此，MGB的使此类杂交体稳定化的能力将被降低，从而增强MGB-寡核苷酸缀合物的将错配与完美匹配的双链区别开的能力。另一方面，如果错配位于与MGB-寡核苷酸缀合物互补的区域之外，则预期相同长度的未缀合的以及MGB-缀合的寡核苷酸的区分能力大约是相同的。由于，寡核苷酸探针区分单一碱基对错配的能力依赖于其长度，所以较短的寡核苷酸在区分错配方面更加有效。在本文上下文中使用MGB-寡核苷酸缀合物的第一个优点在于以下事实：由于MGB缀合物的显著的稳定化效应，可以使用相对于现有技术中所使用的那些短得多的寡核苷酸（即20-mer或更短），其具有更大的区分能力。结果是，等位基因特异性封闭探针的较大的ΔTm能够改进AS-PCR测定的特异性和选择性。

在5’末端具有MGB的封闭探针相对于仅在3’末端具有封闭部分(例如，MGB,PO₄,NH₂,PEG或生物素)的其它封闭探针具有另外的优点。这至少是因为：在5’末端具有MGB（除了在3’末端具有阻止延伸的封闭部分之外）的封闭探针在PCR扩增过程中将不被切割。因此，在整个PCR过程中，探针浓度可以维持在恒定水平，这可以辅助维持封闭非特异性引发的有效性，从而增加cast-PCR测定法的特异性和选择性(图3)。

在一些实施方式中，如图4A所示，等位基因特异性引物和/或等位基因特异性封闭探针可以包含一个或多个不同于天然存在的碱基(即腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶)的修饰的核碱基或核苷碱基。在一些实施方式中，修饰的碱基仍能够有效地与含有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶部分的核酸单元杂交。在一些实施方式中，修饰的碱基可以增大匹配的与错配的靶序列之间的Tm差异，和/或降低错配引发效率，从而不仅改善测定的特异性，还改善其选择性。

修饰的碱基被认为是通过添加或删除一个或多个官能团、杂环结构中的差异（即将碳取代为杂原子，反之亦可）和/或向碱基连接一个或多个接头臂结构而与天然存在的碱基相区别的那些碱基。在一些实施方式中，在本发明的寡核苷酸引物和探针中也可以包括天然存在的碱基、修饰的碱基和碱基类似物的所有互变异构的形式。

修饰的碱基的一些实例可以包括，例如，下列一般类别：碱基类似物7-脱氮杂嘌呤及其衍生物和吡唑并嘧啶及其衍生物(描述于PCTWO90/14353;和美国申请号09/054,630，其公开内容通过引用方式全文并入本文)。该类型的碱基类似物的实例包括，例如，鸟嘌呤类似物6-氨基-1H-吡唑[3,4-d]嘧啶-4(5H)-酮(ppG)、腺嘌呤类似物4-氨基-1H-吡唑[3,4-d]嘧啶(ppA)，和黄嘌呤类似物1H-吡唑[4,4-d]嘧啶-4(5H)-6(7H)-二酮(ppX)。这些碱基类似物，当存在于本发明的一些实施方式的寡核苷酸中时，加强杂交并可以改善错配的区分。

另外，在一些实施方式中，根据本发明的寡核苷酸缀合物的一个或多个核苷酸亚基中可以存在修饰的糖或糖类似物。糖的修饰包括但不限于：向糖的2',3'和/或4'碳原子连接取代基，糖的不同差向异构体形式，糖苷键的α-或β-构型中的差异，以及其它异头变化。糖部分包括但不限于戊糖、脱氧戊糖、己糖、脱氧己糖、核糖、脱氧核糖、葡萄糖、阿拉伯糖、戊呋喃糖、木糖、来苏糖和环戊基。

锁核酸(LNA)类型的修饰，例如，通常包括对于核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的戊糖的改变，其将糖限制或“锁定”为在A-形式的DNA中见到的N-类型的构象。在一些实施方式中，这种锁定可以通过1,2:5,6-二-O-异亚丙基-α-D-别呋喃糖中的2'-O,4'-C亚甲基键来实现。在其它实施方式中，这种改变则作为合成锁定的核苷酸亚磷酰胺单体的基础(见，例如，WengelJ.,Acc.Chem.Res.,32:301-310(1998),美国专利号7,060,809;Obika,etal.,TetrahedronLett39:5401-5405(1998);Singh,etal.,ChemCommun4:455-456(1998);Koshkin,etal.,Tetrahedron54:3607-3630(1998),各自的内容通过引用方式全文并入本文)。

在一些优选实施方式中，修饰的碱基包括8-氮杂-7-脱氮杂-dA(ppA)、8-氮杂-7-脱氮杂-dG(ppG)、2'-脱氧假异胞苷(isodC)、5-氟-2'-脱氧尿苷(fdU)、锁核酸(LNA)或2'-O,4'-C-亚乙基桥接核酸(ENA)碱基。可用于本发明的修饰的碱基的其它实例描述于图4B，并描述于美国专利7,517,978(其内容通过引用方式全文并入本文)。

很多修饰的碱基，包括，例如，LNA、ppA、ppG、5-氟-dU(fdU)是商业上可获得的，并且可用于本领域熟知的寡核苷酸合成方法。在一些实施方式中，也可以使用本领域熟知的标准化学方法进行修饰的引物和探针的合成。例如，在一些实施方式中，可以通过下列方式导入修饰的部分或碱基：(a)使用修饰的核苷作为DNA合成支持物；(b)修饰的核苷作为亚磷酰胺；(c)DNA合成中的试剂(例如，当掺入DNA序列中时，以苄胺处理可转化的amidite；或(d)通过合成后修饰。

在一些实施方式中，将引物或探针合成为：修饰的碱基位于3’末端。在一些实施方式中，修饰的碱基位于距离等位基因特异性引物或封闭探针的3’末端1-6个核苷酸处，例如2、3、4或5个核苷酸。在一些优选实施方式中，将引物或探针合成为：修饰的碱基位于等位基因特异性引物或封闭探针的3’最末端。

本发明的寡核苷酸缀合物中也可以存在修饰的核苷酸间键合。此类修饰的键合包括但不限于：肽、磷酸酯、磷酸二酯、磷酸三酯、烷基磷酸酯、烷烃膦酸酯、硫代磷酸酯（thiophosphate）、硫代磷酸酯（phosphorothioate）、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、取代的氨基磷酸酯等。碱基、糖和/或核苷酸间键合的数种其它修饰（与它们在用作探针和/或引物的寡核苷酸中的用途相容）对于本领域技术人员是显而易见的。

另外，在一些实施方式中，掺入到本发明的等位基因特异性引物和/或封闭探针的寡核苷酸中的核苷酸单元可以具有通过连接臂共价结合于一个或多个碱基的交联官能（烷基化试剂）。

在方法和试剂盒的一些实施方式中，第一等位基因特异性封闭探针与第一等位基因特异性引物结合于相同的链或序列，而第二等位基因特异性封闭探针与第一等位基因特异性引物结合于相对链和/或互补序列。

检测探针

在一些实施方式中，检测探针被设计为短的寡聚物，其为大约15-30个核苷酸，例如大约16，大约18，大约22，大约24，大约30或其中的任意数值。在一些实施方式中，检测探针的Tm是大约60℃至70℃，大约61℃至69℃，大约62℃至68℃，大约63℃至67℃，或大约64℃至66℃，或其中任意温度。

在一些实施方式中，检测探针是基因座特异性检测探针(LST)。在其它实施方式中，检测探针是5’核酸酶探针。在一些例示性的实施方式中，检测探针可以包含MGB部分，报告子部分(例如，FAM^TM,TET^TM,JOE^TM,VIC^TM或Green)，猝灭剂部分(例如，BlackHoleQuencher^TM或TAMRA^TM)，和/或被动参照(例如，ROX^TM)。在一些例示性的实施方式中，根据美国专利号6,727,356(其公开内容通过引用方式全文并入本文)描述的原理和方法设计检测探针。在一些例示性的实施方式中，检测探针是探针(AppliedBiosystems,FosterCity)。在例示性的实施方式中，可以根据美国专利号6,727,356(其公开内容通过引用方式全文并入本文)描述的原理和方法设计基因座特异性检测探针。例如，产生荧光的探针可以这样制备：在单链DNA的3’末端具有猝灭剂并且在5’末端具有荧光团。在此类实例中，TaqDNA聚合酶的5’核酸酶活性可以切割DNA链，从而将荧光团与猝灭剂分离并释放荧光信号。在一些实施方式中，检测探针在PCR扩增的引物延伸步骤中与模板链杂交(例如，在60℃-65℃)。在其它实施方式中，MGB共价连接于基因座特异性检测探针的猝灭剂部分（例如通过接头）。

在所公开的方法和试剂盒的一些实施方式中，第一和第二检测探针是相同的序列和/或包含相同的序列。

基因座特异性引物

在一些实施方式中，基因座特异性引物(LSP)被设计为短的寡聚物，其为大约15-30个核苷酸，例如大约16，大约18，大约22，大约24，大约30或其中的任意数值。在一些实施方式中，基因座特异性引物的Tm是大约60℃至70℃，大约61℃至69℃，大约62℃至68℃，大约63℃至67℃，或大约64℃至66℃，或其中任意范围。

在所公开的方法和试剂盒的一些其它实施方式中，第一基因座特异性检测探针和/或第二基因座特异性检测探针包含相同的序列或者是相同的序列。

另外的成分

适合于实施本发明的聚合酶是本领域熟知的，并且可以从多个来源获得。热稳定性的聚合酶可以获自例如多种商业上可获得的嗜热细菌(例如，从美国典型微生物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection),Rockville,Md获得)，使用本领域普通技术人员熟知的方法(见，例如，美国专利号6,245,533)。可以根据标准的微生物学技术，使用本领域普通技术人员熟知的适合于特定物种的活性培养物生长的培养基和温育条件使细菌细胞生长(见，例如，Brock,T.D.,andFreeze,H.,J.Bacteriol.98(1):289-297(1969);Oshima,T.,andImahori,K,Int.J.Syst.Bacteriol.24(1):102-112(1974))。适合用作热稳定性聚合酶来源的有嗜热细菌：粞热水生菌（Thermusaquaticus）、极端嗜热菌（Thermusthermophilus）、Thermococcuslitoralis、Pyrococcusfuriosus、Pyrococcuswoosii和Pyrococcus属的其它种、脂肪嗜热芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、嗜酸热硫化叶菌（Sulfolobusacidocaldarius）、嗜酸热原体（Thermoplasmaacidophilum）、Thermusflavus、红栖热菌（Thermusruber）、Thermusbrockianus、新阿波罗栖热袍菌（Thermotoganeapolitana）、海栖热袍菌（Thermotogamaritima）和Thermotoga属的其它种，以及Methanobacteriumthermoautotrophicum，以及这些物种的中的每一个的突变体。优选的热稳定性的聚合酶可以包括但不限于：TaqDNA聚合酶，TneDNA聚合酶，TmaDNA聚合酶，或其突变体、衍生物或片段。

核酸的多种来源和/或制备方法

所公开的组合物、方法和/或试剂盒中的核酸样品的来源包括但不限于，人类细胞，例如循环的血液，口腔上皮细胞，培养的细胞和肿瘤细胞。另外，其它的哺乳动物组织，血液和培养的细胞也是模板核酸的合适的来源。此外，病毒、噬菌体、细菌、真菌和其它微生物可以作为用于分析的核酸的来源。DNA可以是基因组的或者可以克隆于质粒、噬菌体、细菌人工染色体（BAC）、酵母人工染色体（YAC）或其它载体中。可以从相关细胞直接分离RNA，或者可以在体外从合适的RNA启动子引发而制备，或者可以通过体外转录制备。本发明可用于检测基因组DNA中的变异，可以是人类的、动物的或其它。其特别可用于遗传性或获得性疾病或病症的分析。一个具体用途是用于检测遗传性疾病。

在一些实施方式中，模板序列或核酸样品可以是gDNA。在其它实施方式中，模板序列或核酸样品可以是cDNA。在其它实施方式中，如在通过RT-PCR同时分析基因表达的情况下，模板序列或核酸样品可以是RNA。DNA或RNA模板序列或核酸样品可以提取自任意类型的组织，包括例如，福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤样品。

预扩增

在另一方面，提供了另外的组合物、方法和试剂盒，它们用于“加强”或预扩增cast-PCR扩增反应。在一些实施方式中，cast-PCR反应的预扩增用于具有非常低的核酸拷贝数的有限量的样品。

在一些实施方式中，所述“加强”组合物、方法和试剂盒涉及两步扩增过程，其包括：第一预扩增反应(见，例如，美国专利号6,605,451和7,087,414和美国申请公开号2004/0175733，其公开内容通过引用方式全文并入本文)，然后是第二扩增(即cast-PCR)反应。

在一些实施方式中，cast-PCR预扩增反应中使用的预扩增组合物包含：

i)核酸样品；和

ii)至少两组引物，其中每组包含(a)第一等位基因特异性引物和第二等位基因特异性引物，其中所述第一和第二等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分分别互补于靶序列中的给定SNP的第一等位基因和第二等位基因；和(b)基因座特异性引物，其互补于在第一和第二等位基因的3’并且在相对链上的所述靶序列的区域；其中至少两组引物各自特异于不同的靶序列。

在一些实施方式中，cast-PCR预扩增方法包括：

a)在单一管中形成包含下列的第一反应混合物：

i)核酸样品；和

ii)至少两组引物，其中每组包含(a)第一等位基因特异性引物和第二等位基因特异性引物，其中所述第一和第二等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分分别互补于靶序列中的给定SNP的第一等位基因和第二等位基因；和(b)基因座特异性引物，其互补于在第一和第二等位基因的3’并且在相对链上的所述靶序列的区域；其中至少两组引物各自特异于不同的靶序列；

b)使用适合于将反应保持在线性期内的循环数扩增所述不同的靶序列；

c)将步骤b)的扩增产物分入至少两个单独的管；

d)向步骤c)的分开的产物中各加入：

i)步骤a)中使用的至少一组引物，

ii)等位基因特异性封闭探针，其互补于包含第二等位基因变体的靶序列的区域，其中所述区域包含对应于所述第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置的位置，并且其中所述第一等位基因特异性封闭探针包含小沟结合剂；和

iv)检测探针，

以在至少两个单独的管中形成第二和第三反应混合物；

e)扩增所述第二和第三反应混合物中的所述靶序列；和

f)检测通过步骤e)产生的所述靶序列的每个扩增产物中的检测探针的可检测性质的变化，从而检测所述核酸样品中的靶基因的等位基因变体。

在一些实施方式中，第一反应是多重反应，并且所述第二反应是单重反应。在一些优选实施方式中，多重反应涉及使用至少两组完全引物(例如，包含1个正向等位基因-1-特异性引物，1个正向等位基因-2-特异性引物，和1个反向基因座特异性引物的组)，其中每组适合于或有效于扩增目标特异性多核苷酸。在其它实施方式中，第一步中获得的多重产物被分成优化的第二单重cast-PCR扩增反应，其中每个包含之前在第一多重步骤中使用的至少一个引物组，然后使用如本文描述的cast-PCR方法进行PCR扩增。

在其它优选实施方式中，第一多重反应是cast-PCR扩增反应(虽然可以使用其它本领域熟知的扩增方法，例如但不限于，PCR、RT-PCR、NASBA、SDA、TMA、CRCA、连接酶链式反应等)。在一些实施方式中，第一多重反应包括多个等位基因特异性引物和基因座特异性引物，其中每组特异于特定的目标等位基因并根据本文描述的cast-PCR方法来设计。与产生单一扩增序列的单重cast-PCR反应不同，通过利用多个不同的引物组，多重cast-PCR扩增反应可以允许在单一反应中同时扩增多个不同的目标序列。由于多个不同的序列在单一反应中同时被扩增，所以多重扩增能够有效增加可用于下游cast-PCR测定的样品的浓度或数量。因此，在一些优选实施方式中，相对于使用原始样品，使用预扩增的cast-PCR样品可以进行显著更多的分析或测定。

多重扩增中使用的不同扩增引物对的数目不是关键性的，可以少至2个，多至数十、数百、数千个，甚至更多。因此，取决于特定条件，多重扩增允许同时扩增少至2个，多至数十、数百、数千个，甚至更多个目标多核苷酸。

使用多重扩增进行的扩增循环数可以取决于很多因素，特别是所需的扩增程度。所需的扩增程度继而又可以取决于下列因素，例如，使用随后的cast-PCR测定法待扩增的多核苷酸样品的数量或待检测的等位基因或突变的数目。

在优选实施方式中，可能需要使多重扩增保持不超过指数期或线性。的确，在一些实施方式中，可能需要使多重扩增进行适合于使反应保持在指数期或线性期内的循环数。使用缩短的多重反应轮次可以产生具有大约100-1000倍增加的加强的产物拷贝数的样品。

在很多实施方式中，预扩增提供了进行那些需要更多样品或较高浓度的样品(相对于最初可获得的)的cast-PCR测定或分析的能力。例如，在10X，100X，1000X，10,000X等多重扩增之后，可以分别使用1/10，1/100，1/1000，1/10,000的样品体积来进行随后的cast-PCR单重测定。在一些实施方式中，这允许就最大灵敏性优化每个单重cast-PCR反应，并且对于所分析的每个等位基因，仅需要一种检测方法。这对于cast-PCR分析可以具有显著益处，因为，在一些实施方式中，其允许使用商售现货cast-PCR试剂和试剂盒汇集在一起并用于多重扩增反应，无需针对任何给定靶序列就重新设计和/或重新优化cast-PCR测定进行任何深入努力或限制。此外，在一些实施方式中，使用已经就cast-PCR分析优化的试剂和试剂盒进行多重扩增的能力允许产生与随后的单重cast-PCR测定理想关联或匹配的多重扩增反应。

在一个方面，提供了试剂盒，其包括至少一个分离的容器，所述容器包含独立分配于至少一个单独容器中的下列成分：（i）第一等位基因特异性引物，其中所述第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于靶序列的第一等位基因变体；（ii）第二等位基因特异性引物，其中所述第二等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于靶序列的第二等位基因变体；和（iii）共同的基因座特异性引物。

以下实施例旨在解释而非限制本发明。

实施例

I.一般的cast-PCR测定设计：

用于下列实施例的cast-PCR测定的一般方案显示于图1。对于所分析的每个SNP，将等位基因特异性引物(ASP)设计为靶向第一等位基因（即等位基因-1）和第二等位基因（即等位基因-2）。用于分析等位基因-1的cast-PCR测定反应混合物包括5’加尾的等位基因-1特异性引物(ASP1)，一个MGB等位基因-2封闭探针(MGB2)，一个共同的基因座特异性TaqMan探针(LST)和一个共同的基因座特异性引物(LSP)。用于分析等位基因-2的cast-PCR测定反应混合物包括5’加尾的等位基因-2特异性引物(ASP2)，一个MGB等位基因-1封闭探针(MGB1)，一个共同的基因座特异性TaqMan探针(LST)和一个共同的基因座特异性引物(LSP)。

II.反应条件：

每个测定反应混合物(共10μl)包含1XTaqManGenotypingMasterMixture(AppliedBiosystems,FosterCity,CA;P/N437135),0.5ng/μL基因组DNA或1,000,000个拷贝的质粒DNA(或如所标示),300nM(除非另有指明)加尾的或在一些情况下未加尾的等位基因特异性引物(用于检测等位基因-1的ASP1，或用于检测等位基因-2的ASP2),200nMTaqMan探针(LST),900nM基因座特异性引物(LSP),150nM等位基因特异性MGB封闭探针(用于检测等位基因-2的MGB1，或用于检测等位基因-1的MGB2)。将反应物在384孔平板中在95℃温育10分钟；然后5个循环的“在95℃温育15秒；在58℃温育1分钟”；然后45个循环的“在95℃温育15秒；在60℃温育1分钟”。所有的反应按照一式两份或更多个重复份在ABIPRISMSequenceDetectionSystem中根据生产商的说明书进行。

以下实施例中用于cast-PCR扩增反应的两步循环程序不同于常规的等位基因特异性PCR(AS-PCR)。两步循环程序包括：在较低的退火/延伸温度(e.g.,58℃)进行最初的5个循环，然后在较高的退火/延伸温度(例如60℃)进行45个标准循环。由于cast-PCR等位基因特异性引物的较低的Tm(例如53-56℃)，在标准的退火/延伸条件下(例如60℃)PCR不是最佳的。因此，在最初的5个循环中使用的较低的退火/延伸温度增大了总体的cast-PCR效率。

III.核酸样品：

设计并从BlueHeron(Bothell,WA)订购包含特定SNP序列的质粒(关于以下一些实施例中所用的包含SNP的质粒的列表，见表1)。根据生产商的说明书，使用TaqManRNasePAssay(AppliedBiosystems,FosterCity,CA;P/N4316838)定量质粒，并用作模板(见表1，RNaseP对照)以验证给定的测定法的灵敏性、线性动态范围、特异性和选择性。

基因组DNA购自CoriellInstituteforMedicalResearch(Camden,NJ;NA17203,NA17129,NA17201)。根据生产商的说明书，使用TaqManSNPGenotypingAssays(AppliedBiosystems,FosterCity,CA;P/N4332856)验证靶SNP的基因型。

IV.修饰的寡核苷酸

修饰的碱基购自BerryandAssociates(ppA:P/NBA0239;ppG:P/NBA0242;fdU:P/NBA0246;isodC:P/NBA0236)或Exicon(LNA-TAmidite:P/NEQ-0064;LNA-mCAmidite:P/NEQ-0066;LNA-GAmidite:P/NEQ-0082;LNA-AAmidite:P/NEQ-0063)。根据生产商的说明书，合成在3’末端包含修饰的核苷酸的寡核苷酸。

表1：质粒SNP序列（以括号标示出了靶等位基因）

数据分析：

自动化基线和0.2的人工阈值用于计算循环阈值(C_t)，循环阈值定义为：荧光超过固定阈值时的分数的循环数目。总共运行50个循环的PCR反应。对于cast-PCR反应，在较低的退火/延伸温度进行5个循环的预运行，然后在较高的退火/延伸温度再进行45个循环。匹配的与错配的序列之间的扩增反应的ΔC_t定义为cast-PCR的特异性(ΔC_t=C_t错配-C_t匹配)。错配与匹配靶标之间的ΔC_t越大，测定的特异性越好。2^ΔCt值用于估计区分能力（或选择性），其等于1/2^ΔCt，或者，在一些情况下，计算为百分率(1/2^ΔCtx100)。

实施例1：加尾的引物改善等位基因变体的区分

以下实施例证明：应用包含尾巴的等位基因特异性引物显著改善等位基因变体的区分。

在传统AS-PCR中，3’核苷酸错配的区分高度依赖于SNP周围的序列和等位基因的性质。匹配的与错配的引物的扩增反应之间的ΔCt是变化的。为了改善匹配的与错配的序列的扩增之间的区分，将等位基因特异性引物设计为在它们的5’末端包含尾巴，然后测试它们在AS-PCR测定中的适合性。

使用如上描述的一般性实验设计和反应条件进行测定（只不过其中不包括封闭探针，并且加入加尾的或非加尾的等位基因特异性引物），使用0.5ng/uL的基因组DNA作为核酸模板，所述基因组DNA包含hsv11711720SNP，其中包含三个等位基因中的一个(A、C或T)(见表2A)。三个基因型标示于表2B中。根据表3所示的序列设计引物和探针。

表2A：hsv11711720SNP的基因组DNA序列（在括号中标示出了靶等位基因）

表2B：hsv11711720SNP的基因组DNA序列的基因型

基因组DNA号	基因型
		NA17203	AA
NA17129	CC
		NA17201	TT

表3：用于基因组DNA的引物和探针的列表和序列：常规等位基因特异性引物("ASP")；加尾的等位基因特异性引物("tailASP")；基因座特异性TaqMan探针(LST)；基因座特异性引物(LSP)。以小写字母显示的核苷酸是引物的加尾部分。每个等位基因特异性引物的核苷酸特异性部分在每个引物的3’最末端（以加粗字母标示）。

引物/探针号	序列(5’至3’)	Tm(℃)
			17129-ASP	ATATTTAGTTTGACTCACCTTCCCAGC	63.2
17129-tailASP	accACTCACCTTTCCCAGC	63.0

17203-ASP	ATATTTAGTTTGACTCACCTTCCCAGA	62.0
			17203-tailASP	accACTCACCTTTCCCAGA	63.7
17201-ASP	ATATTTAGTTTGACTCACCTTCCCAGT	62.2
			17201-tailASP	accACTCACCTTTCCCAGT	64.0
LST	(6-FAM)-TGGACAAGCACTGAAAGA-(MGB)	67.4
			LSP	GCAGGAGTTGTTGAAATGAAAATGTTG	62.5

如表4所示，当使用非加尾ASP("ASP-tail")时，3’核苷酸错配的区分高度依赖于等位基因的性质，因为观察到相当大范围的ΔCt值（取决于3’末端碱基的性质）。匹配的与错配的核苷酸("NT")之间的ΔCt值的范围是-0.1至10。然而，使用加尾的ASP(ASP+tail)，3’核苷酸错配的区分显著改善。事实上，如表4所示，当使用加尾的ASP时，匹配的与错配的核苷酸之间的ΔCt值总是等于或大于10。使用加尾的ASP扩增匹配序列的Ct值与使用传统或非加尾ASP时是相当的。这些结果表明：加尾的ASP能够改善AS-PCR的特异性，但可能不改善检测的灵敏性。

表4：加尾的等位基因特异性引物("ASP")显著改善等位基因变体的区分。基于使用加尾的与未加尾引物时的Ct值的差异(2^{(ΔCt(ASP+尾 巴)-(ΔCt(ASP-尾巴)})计算特异性("倍数差异")。还标示出了ASP(+/-尾巴)的3’等位基因特异性核苷酸部分的错配核苷酸和靶等位基因("NT错配")。

实施例2：低的引物浓度改善等位基因变体的区分

使用如上所述的一般性实验设计和反应条件，在存在1,000,000个拷贝的包含多个SNP靶序列（见表1）的质粒DNA和200nM或800nM加尾的ASP（如所指明）的情况下，进行测定。根据图11A所示的序列设计测定引物和探针。

加尾的ASP的浓度对于区分等位基因变体的影响总结于表5。匹配的与错配的引物的扩增反应之间的ΔCt证明：较低的加尾的ASP浓度改善等位基因变体的区分。

表5：使用不同浓度的加尾的等位基因特异性引物的测定结果

实施例3：设计为具有降低的Tm的引物改善了等位基因变体的区分

使用如上所述的一般性实验设计和反应条件，在存在1,000,000个拷贝的包含多个SNP靶序列（见表1）的质粒DNA的情况下，使用具有较高Tm(～57℃)的加尾的ASP或具有较低的Tm(～53℃)的加尾的ASP进行测定。根据图11B-E所示的序列设计测定引物和探针(关于较高的TmASP，见图11B；关于较低的TmASP，见图11C)。

等位基因特异性引物的Tm对于区分等位基因变体的影响总结于表6。具有较低的Tm的等位基因特异性引物的ΔCt显著高于具有较高的Tm的等位基因特异性引物。设计为具有降低的Tm的等位基因特异性引物改善了等位基因变体的区分，在一些情况下达到118倍，平均为大约13倍的差异。

表6：使用具有较低Tm(～53℃)或具有较高Tm(～57℃)的加尾的ASP的ΔCt值。

实施例4：使用封闭探针改善了等位基因变体的区分

以下实施例证明：在AS-PCR反应中，使用MGB封闭探针改善了针对靶序列的3’核苷酸错配的和匹配的引物之间的区分。

使用如上所述的一般性cast-PCR方案和反应条件，使用1,000,000个拷贝的包含多个SNP靶序列（见表1）的质粒DNA，在存在MGB封闭探针或不存在MGB封闭探针的情况下，进行测定。根据图11C-E所示的序列设计测定引物和探针。

为了改善AS-PCR的选择性，合成在3’末端包含MGB基团的封闭探针(见，例如，Kutyavin,I.V.等人,NucleicAcidsResearch,2000,Vol.28,No.2:655-661,美国专利号5,512,677;5,419,966;5,696,251;5,585,481;5,942,610和5,736,626)。

使用MGB封闭探针的cast-PCR的结果显示于表7。具有MGB封闭探针的cast-PCR之间的ΔCt高于不含MGB封闭探针的情况。如所示，MGB封闭探针改善了等位基因变体的区分。

表7：MGB封闭探针改善等位基因变体的区分

实施例5：设计为靶向区分性碱基的引物改善了等位基因变体的区分

使用如上所述的一般性cast-PCR方案和反应条件，使用1,000,000个拷贝的包含多个SNP靶序列（见表1）的质粒DNA进行测定。根据图11C-E所示的序列设计测定引物和探针。

根据表8总结的数据，cast-PCR的区分依赖于所分析的等位基因的性质。如表8所示，对于等位基因-1的错配的与匹配的序列之间的ΔCt不同于对于等位基因-2的错配的与匹配的序列之间的ΔCt。然而，在所检测的所有4个SNP中，相对于T碱基，A和G碱基对于等位基因-1和等位基因-2都是高度区分性的。

表8：设计为靶向区分性碱基的引物改善了等位基因变体的区分

实施例6：cast-PCR的灵敏性和动态范围的确定

在该实施例中，通过使用多个拷贝数的靶质粒进行cast-PCR来确定cast-PCR的灵敏性和动态范围。

使用如上所述的一般性cast-PCR和反应条件，使用1X10⁰(1个拷贝)至1X10⁷个拷贝的包含NRAS-181CASNP靶序列(见表1)的质粒DNA进行测定。根据图11C-E所示的序列设计测定引物和探针。

如图5所示，使用加尾的引物和MGB封闭探针对于cast-PCR的灵敏性没有不利影响，因为cast-PCR的灵敏性与不使用加尾的引物或封闭探针的TaqMan测定是相当的。此外，图5显示：cast-PCR测定法显示出在至少7个log内的线性动态范围。

实施例7：cast-PCR的特异性的确定

在本实施例中，在存在相应的封闭探针的情况下，通过比较使用针对给定等位基因的匹配的或错配的ASP来扩增KRAS的特定等位基因，来确定cast-PCR的特异性。

使用如上所述的一般性cast-PCR方案和反应条件，使用1X10⁶个拷贝的包含KRAS-183ACSNP靶序列（见表1）的两个等位基因中的任一个的质粒DNA，进行测定。根据图11C-E显示的序列设计测定引物和探针。

图7左侧的图板显示：在存在A2封闭探针的情况下，使用匹配的（A1）引物，或者，在存在A1封闭探针的情况下，使用错配的（A2）引物在等位基因-1DNA上进行的cast-PCR的扩增图。右侧图板显示了类似的实验，其中在等位基因-2DNA上进行cast-PCR。如图7总结的数据所示，在所测的KRAS-183AC的两个等位基因上进行的cast-PCR中观察到超过20的大的ΔCt值。这对应于通过计算2^ΔCt(对于等位基因-1和等位基因-2分别是9X10⁶和2X10⁶)而确定的特异性。此外，计算选择性(1/2^ΔCt)表明：对于等位基因-1和等位基因-2，分别观察到1/1.1X10⁷和1/5.0X10⁷的值。

实施例8：cast-PCR能够检出1,000,000个拷贝的野生型DNA中的单一拷贝的突变DNA

在本实施例中，测定了cast-PCR选择性，即cast-PCR在过量的野生型DNA中检测稀少的突变体DNA的能力。

使用如上文所述的cast-PCR方案和反应条件，使用与1X10⁶个拷贝的野生型KRAS-183AC质粒DNA（见表1）混合的多种拷贝数的突变体KRAS-183AC质粒DNA(1个拷贝至1X10⁶个拷贝)进行测定。根据图11C-E所示的序列设计测定引物和探针，使用野生型或突变体等位基因特异性引物和相应的MGB封闭探针进行cast-PCR反应。

图8显示：cast-PCR能够检测少至1个拷贝的突变体DNA序列，即使是当被一百万倍过量的野生型序列包围时。

实施例9：cast-PCR区分肿瘤细胞DNA与正常细胞DNA的选择性

在本实施例中，通过在样品中进行测定来确定cast-PCR的选择性，其中在所述样品中，多个数量的肿瘤细胞基因组DNA与来自正常细胞的基因组DNA混合或“掺入”其中。使用QIAmpDNAMiniPrepKits(Qiagen)提取DNA样品。从SW48细胞系提取野生型DNA，从H1573细胞系提取突变体DNA。

突变体DNA包含KRAS-G12A突变(见图6)。掺入在样品中的肿瘤细胞DNA的百分率是0.5%至100%。cast-PCR用于检测肿瘤细胞DNA的存在（当以这些百分率存在时）。

使用如上所述的一般性cast-PCR方案和反应条件进行测定，使用30nggDNA/反应。根据对应于如图18A-B所示的KRAS-G12ASNPID的序列设计测定引物和探针。

如图9所示，即使肿瘤细胞DNA相对于正常细胞DNA仅以0.5%的水平存在，使用cast-PCR也能容易地检出。

实施例10：使用cast-PCR检测肿瘤样品中的肿瘤细胞

在本实施例中，使用cast-PCR检测并测定肿瘤样品中肿瘤细胞的百分率。获得多种正常和肿瘤样品，并通过cast-PCR测定与癌症相关的多个SNP的存在，如图10所示。

使用如上所述的一般性cast-PCR方案和反应条件，使用源自正常或肿瘤样品的5nggDNA或1.5ngcDNA进行测定。根据如图11C-E所示的序列设计对应于图10所示的SNP的测定引物和探针。

显示于图10的结果表明：cast-PCR具有低假阳性率，如cast-PCR未能检测正常样品中的突变细胞的存在所证明。相反，cast-PCR能够提供多种肿瘤样品中的肿瘤细胞的百分率的测定，其范围是：在含有NRAS-183ATSNP的肿瘤样品中仅为2%以下，直至在含有CTNNB1-134CTSNP的样品中是大于80%。

实施例11：在cast-PCR中使用预扩增

以下实施例证明：预扩增与cast-PCR方法的组合能够从有限量的基因组DNA模板中检测出多个等位基因。

在进行cast-PCR扩增之前，针对7个不同的KRAS突变进行多重反应(见表9)。

通过将下列物质组合进入一个反应中而在单一管中制备10μl多重反应：针对7个不同KRASSNP(如图18A-B所列出)中的每一个的45nM各等位基因特异性引物(包括等位基因-1-特异性引物和等位基因-2-特异性引物)和45nM各基因座特异性引物，0.1ng/μL基因组DNA，和1xPreampMasterMix(AppliedBiosystems,FosterCity,CA;P/N437135)。然后将该10μl预扩增反应在96-或384-孔平板中在AppliedBiosystems9700Thermocyler中在95℃温育10分钟，然后是10个循环的“95℃15秒、60℃4分钟、99.9℃10分钟”，然后置于4℃。然后，将190μl0.1xTEpH8.0加入到每个10μl预扩增反应中(20倍稀释)。然后将稀释的预扩增反应产物直接用于随后的cast-PCR反应或在-20℃储存至少1周，然后使用。

表9：KRASSNP序列(靶等位基因以括号标出)

预扩增之后，将稀释的预扩增产物等份分装进入单重cast-PCR反应。对于7个不同KRAS突变中的每一个，使用如上所述的一般的实验设计和反应条件(见实施例的第II部分)进行各个测定。对于测定，使用10μLcast-PCR反应，其包含：作为核酸模板的1μL20倍稀释的预扩增反应产物(如上所述制备)；或作为对比，包含0.07ng基因组DNA。所有的测定引物和探针都根据图18A-B所示的序列来设计。

如图12所示，对于不进行预扩增的测定，所测的7个KRAS突变的平均ΔCt是12.0，而对于使用了预扩增的测定，平均ΔCt是17.0。因此，对于有预扩增的反应和无预扩增的反应，二者之间的ΔΔCt是大约5倍的改进，也就是灵敏性的32倍的增加。

在理想情况下(PCR效率=100%)，靶基因的拷贝数在10个循环中增加大约1000倍。在这些条件下，如果预扩增反应中的起始拷贝数是0.1ng/μL(或大约33个拷贝/μL)，则在10个循环后，拷贝数增加至大约33,000个拷贝/μL。在上文的实施例中，20倍稀释的预扩增产物的拷贝数估计是大约1,650个拷贝/μL。因此，将1μL1,650个拷贝/μL稀释的预扩增产物加入到cast-PCR反应中之后(最终体积为10μL)，cast-PCR产物的浓度是大约165个拷贝/μL。基于该估计，来自1ng/μL基因组DNA的10μL预扩增产物可以稀释至最多200倍，并仍然提供最多2000μL核酸模板以用于随后的cast-PCR反应。

实施例12：加尾的ASP对于cast-PCR特异性的影响

使用如上所述的一般的cast-PCR方案和反应条件(见实施例的第II部分)进行测定，使用1x10⁶个拷贝的含有多个SNP靶序列的质粒DNA(见表10)。根据图19A-D显示的序列设计测定用的引物和探针。对于所分析的每个SNP，封闭探针、基因座特异性探针和基因座特异性引物是相同的，只有等位特异性引物是变化的(例如加尾的或不加尾的)。

表10：质粒SNP序列(靶等位基因以括号标出)

使用非加尾的ASP的cast-PCR和使用加尾的ASP的cast-PCR的结果总结于图13。在具有无加尾引物的cast-PCR反应中，所测的12个突变的平均ΔCt是10.3，而在使用加尾引物的cast-PCR反应中，所测的12个测定的平均ΔCt是16.3。因此，使用加尾的ASP的cast-PCR与使用非加尾的ASP的cast-PCR之间的平均ΔΔCt是大约6.0，对于使用ASP+尾引物的反应，特异性的改进为大约64倍。

实施例13：cast-PCR和ASB-PCR之间的比较

比较了使用cast-PCR方法的测定和使用其它的具有封闭试剂的等位基因特异性PCR[Allele-SpecificPCRwithaBlockingreagent(ASB-PCR)]方法的测定对于等位基因的区分(见，例如Morlanetal.,2009)。

使用如上所述的一般方案和反应条件进行cast-PCR测定，使用1x10⁶个拷贝的含有多个SNP靶序列的质粒DNA(见表10)。使用如上所述的一般实验设计和反应条件(见实施例的第II部分)进行测定。根据图19B-D所示的序列设计测定用的引物和探针。

使用1x10⁶个拷贝的含有多个SNP靶序列的质粒DNA(见表10)、900nM非加尾的等位基因特异性引物(Tm58～62℃)、3600nM等位基因特异性磷酸酯封闭剂(Tm58～62℃)、200nM基因座特异性TaqMan探针(Tm70～74℃)和900nM基因座特异性引物(Tm60～63℃)进行ASB-PCR测定。

根据图20A-C所示的序列设计ASB-PCR测定用的引物和探针。将ASB-PCR反应在384孔平板中在95℃温育10分钟，然后是50个循环的“92℃20秒、60℃45秒”。所有的反应根据生产商的说明书按照一式四份在ABIPRISMSequenceDetectionSystem中进行。

该实施例的结果总结于图14。在ASB-PCR测定中，12个不同突变的平均ΔCt是14.1。在cast-PCR测定中，这12个突变的平均ΔCt是16.3。ASB-PCR与cast-PCR之间的平均ΔΔCt是2.2，这表示cast-PCR的特异性比ASB-PCR测定法高大约4.6倍。

实施例14：在cast-PCR中MGB与磷酸酯封闭剂的比较

比较了在cast-PCR测定中使用MGB封闭探针与使用其它类型的封闭探针，例如PO₄封闭探针(例如，Morlanetal.,2009)。

使用如上描述的一般性cast-PCR方案和反应条件进行所有测定(见实施例的第II部分)，使用1x10⁶个拷贝的含有多个SNP靶序列的质粒DNA(见表10)，只不过反应含有150nm等位基因特异性MGB封闭探针或150nm等位基因特异性3’磷酸酯封闭探针。根据图19B-D所示的序列(对于使用MGB封闭探针的cast-PCR)，或根据图19B-C和图20C所示的序列(对于使用磷酸酯封闭探针的cast-PCR；“PHOS1”封闭等位基因-1；“PHOS2”封闭等位基因-2)，设计测定用的引物和探针。

使用磷酸酯封闭探针或使用MGB封闭探针的测定结果总结于图15。在使用磷酸酯封闭探针进行的cast-PCR测定中，12个不同突变的平均ΔCt是15.1。与此对比，在使用MGB封闭探针进行的cast-PCR测定中，这12个突变的平均ΔCt稍高，其ΔCt是15.8。

实施例15：使用LNA修饰的ASP改善cast-PCR的特异性

使用如上描述的一般性实验设计和反应条件(见实施例的第II部分)进行LNA修饰的cast-PCR测定，使用0.5ng/μL基因组DNA。根据图21A-C所示的序列设计测定用的引物和探针。对于所分析的每个SNP，封闭探针、基因座特异性探针和基因座特异性引物是相同的，仅有等位基因特异性引物是变化的(即在3’末端含有或不含LNA修饰)。

ASP的LNA修饰对于cast-PCR的特异性的影响总结于图16。对于使用LNA修饰的等位基因特异性引物进行的12个cast-PCR测定，平均ΔCt是16.3。与此相比，在使用无修饰的等位基因特异性引物进行的cast-PCR测定中，这12个突变的平均ΔCt显著较高，是18.5。基于ΔΔCt，使用LNA修饰的等位基因特异性引物进行的那些测定的特异性增加了大约4倍。

实施例16：使用其它修饰的ASP改善cast-PCR的特异性

使用如上描述的一般性实验设计和反应条件(见实施例的第II部分)，使用其它的化学修饰的ASP，使用1x10⁶个拷贝的含有多个SNP靶序列的质粒DNA(见表10)，进行cast-PCR测定。根据图22所示的序列设计测定用的引物和探针。对于所分析的每个SNP，封闭探针、基因座特异性探针和基因座特异性引物是相同的，仅有等位基因特异性引物是变化的(即在3’末端含有或不含化学修饰，即ppA、ppG、isodC或fdU)。

使用非修饰的ASP的cast-PCR测定和使用修饰的ASP的cast-PCR测定的结果总结于表17。如所示，在3’末端具有焦磷酸酯修饰(ppA或ppG)的等位基因特异性引物使ΔCt增加2-3，测定法的特异性大约增加4-6倍。

注意到，除非明确地且清楚明白地限于单一指称，否则如本说明书和随附的权利要求中所使用的单数形式"一个(a)"、"一个(an)"和"该(the)"包括复数指称。除非另有指明，否则"或"意思是"和/或"。"包含(comprise)"、"包含(comprises)"、"包含(comprising)"、"包括(include)"、"包括(includes)"和"包括(including)"可相互替换，不是意在限制。此外，当一个或多个实施方式的描述使用术语"包含"时，本领域技术人员将理解，在一些具体的情况下，可以使用词语"基本上由……组成"和/或"由……组成"替代性地描述该实施方式。

本文使用的各部分的标题仅是为了组织性目的，不应解释为限制所描述的主题。本申请中引用的所有文献或文献的一部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文在此明确地为了任意目的通过引用方式全文并入本文。如果出现并入的一篇或多篇文献定义的术语与本申请中的术语定义相矛盾的情况，以本申请为准。

如果尚未并入，则本文引用的所有文献，包括专利、专利申请、论文、书籍等，以及其中的参考文献，在此通过引用方式全文并入本文。

本发明涉及以下内容：

1.用于检测怀疑包含至少靶序列的第二等位基因变体的核酸样品中的靶序列的第一等位基因变体的方法，包括：

a）通过组合：

i)核酸样品；

ii)第一等位基因特异性引物，其中所述第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于靶序列的第一等位基因变体；

iii)第一等位基因特异性封闭探针，其互补于包含第二等位基因变体的靶序列的区域，其中所述区域包含对应于所述第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置的位置，并且其中所述第一等位基因特异性封闭探针包含小沟结合剂；

iv)第一基因座特异性引物，其互补于在第一等位基因变体的3’并且在相对链上的靶序列的区域；和

v)第一检测探针；

形成第一反应混合物；

b）使用第一基因座特异性引物和第一等位基因特异性引物在第一反应混合物中进行扩增反应，以形成第一扩增子；和

c）通过检测第一检测探针的可检测性质的变化来检测第一扩增子，从而检测核酸样品中的靶基因的第一等位基因变体。

2.项目1的方法，还包括使用第一检测探针的可检测性质的变化来定量第一等位基因变体。

3.项目1的方法，还包括：

d）通过组合：

i）核酸样品；

ii）第二等位基因特异性引物，其中第二等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于靶序列的第二等位基因变体；

iii）第二等位基因特异性封闭探针，其互补于包含第一等位基因变体的靶序列的区域，其中所述区域包含对应于第二等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置的位置，并且其中所述第二等位基因特异性封闭探针包含小沟结合剂；

iv）第二基因座特异性引物，其互补于在第二等位基因变体的3’并且在相对链上的靶序列的区域；和

v）第二检测探针，

形成第二反应混合物；

e）使用第二等位基因特异性引物和基因座特异性引物在第二反应混合物中进行扩增反应，以形成第二扩增子；和

f）通过测定检测探针的可检测性质的变化来检测第二扩增子，从而检测核酸样品中的靶基因的第二等位基因变体。

4.项目3的方法，还包括将第一反应混合物中的第一检测探针的可检测性质的变化与第二反应混合物中的第二检测探针的可检测性质的变化进行比较。

5.项目1或3的方法，其中所述第一、第二、或第一和第二等位基因特异性引物和/或所述第一、第二、或第一和第二等位基因特异性封闭探针包含至少一个修饰的碱基。

6.项目5的方法，其中所述修饰的碱基是8-氮杂-7-脱氮杂-dN(ppN)碱基类似物，其中N是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）或胸腺嘧啶（T）。

7.项目5的方法，其中所述修饰的碱基是锁核酸(LNA)碱基。

8.项目5的方法，其中所述修饰的碱基是fdU或isodC碱基。

9.项目5的方法，其中所述修饰的碱基是增大匹配的与错配的靶序列或核苷酸之间的Tm的任意修饰的碱基。

10.项目5的方法，其中所述修饰的碱基位于所述等位基因特异性引物和/或等位基因特异性封闭探针的(a)3’末端；(b)5’末端；(c)内部位置或(a)、(b)或(c)的任意组合。

11.项目5的方法，其中所述检测的特异性通过在所述第一、第二、或第一和第二等位基因特异性引物和/或所述第一、第二、或第一和第二等位基因特异性封闭探针中加入所述修饰的碱基而相对于不加入所述修饰的碱基时被改善。

12.项目11的方法，其中所述改善是至少2倍。

13.项目1或3的方法，其中相对于使用ASB-PCR方法检测核酸样品中的等位基因变体的特异性，所述检测的特异性改善至少2倍。

14.项目1或3的方法，其中所述扩增反应的进行包括两步循环程序。

15.项目14的方法，其中所述两步循环程序的第一步中的循环数小于第二步中使用的循环数。

16.项目14的方法，其中第一步中的循环数比第二步中的循环数少大约90%。

17.项目14的方法，其中第一步中的循环数是3-7个循环；并且第二步中的循环数是42-48个循环。

18.项目14的方法，其中所述两步循环程序的第一步中使用的退火/延伸温度比第二步中使用的退火/延伸温度低1-3℃。

19.项目14的方法，其中所述两步循环程序的第一步中使用的退火/延伸温度是56-59℃；并且第二步中使用的退火/延伸温度是60-62℃。

20.项目1的方法，其中所述步骤(a)之前有预扩增步骤。

21.项目20的方法，其中所述预扩增步骤包括多重扩增反应，其使用至少两组完全的等位基因特异性引物和基因座特异性引物，其中每组适合于或有效于扩增目标特异性多核苷酸。

22.项目21的方法，其中所述多重扩增反应的产物被分成第二单重扩增反应，其中每个单重扩增反应包含之前在所述多重反应中使用的至少一个引物组。

23.项目21的方法，其中所述多重扩增反应进一步包含多个等位基因特异性封闭探针。

24.项目21的方法，其中所述多重扩增反应进行适合将反应保持在线性扩增期内的循环数。

25.反应混合物，其包含：

a）核酸分子；

b）等位基因特异性引物，其中所述等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于靶序列的第一等位基因变体；

c）等位基因特异性封闭探针，其互补于包含第二等位基因变体的靶序列的区域，其中所述区域包含对应于所述等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置的位置，并且其中所述等位基因特异性封闭探针包含小沟结合剂；

d）基因座特异性引物，其互补于在第一等位基因变体的3’并且在相对链上的靶序列的区域；和

e）检测探针。

26.项目25的反应混合物，其中所述等位基因特异性引物和/或所述等位基因特异性封闭探针包含至少一个修饰的碱基。

27.项目26的反应混合物，其中所述修饰的碱基是8-氮杂-7-脱氮杂-dN(ppN)碱基类似物，其中N是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）或胸腺嘧啶（T）。

28.项目26的反应混合物，其中所述修饰的碱基是锁核酸(LNA)碱基。

29.项目26的反应混合物，其中所述修饰的碱基是fdU或isodC碱基。

30.项目26的反应混合物，其中所述修饰的碱基是增大匹配的与错配的靶序列或核苷酸之间的Tm的任意修饰的碱基。

31.项目26的反应混合物，其中所述修饰的碱基位于所述等位基因特异性引物和/或等位基因特异性封闭探针的(a)3’末端；(b)5’末端；(c)内部位置或(a)、(b)或(c)的任意组合。

32.组合物，其包含：

a）第一等位基因特异性引物，其中所述第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于靶序列的第一等位基因变体；

b）第一等位基因特异性封闭探针，其互补于包含第二等位基因变体的靶序列的区域，其中所述区域包含对应于所述第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置的位置，并且其中所述第一等位基因特异性封闭探针包含小沟结合剂。

33.项目32的组合物，还包含基因座特异性引物，其互补于在第一等位基因变体的3’并且在相对链上的靶序列的区域。

34.项目32或33的组合物，其中所述第一等位基因特异性引物和/或所述第一等位基因特异性封闭探针包含至少一个修饰的碱基。

35.项目34的组合物，其中所述修饰的碱基是8-氮杂-7-脱氮杂-dN(ppN)碱基类似物，其中N是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）或胸腺嘧啶（T）。

36.项目34的组合物，其中所述修饰的碱基是锁核酸(LNA)碱基。

37.项目34的组合物，其中所述修饰的碱基是fdU或isodC碱基。

38.项目34的组合物，其中所述修饰的碱基是增大匹配的与错配的靶序列或核苷酸之间的Tm的任意修饰的碱基。

39.项目34的组合物，其中所述修饰的碱基位于所述等位基因特异性引物和/或等位基因特异性封闭探针的(a)3’末端；(b)5’末端；(c)内部位置或(a)、(b)或(c)的任意组合。

40.包括两个或更多个容器的试剂盒，所述容器包含独立分配于两个或更多个容器中的一个中的下列成分：

a）第一等位基因特异性引物，其中所述第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于靶序列的第一等位基因变体；和

b）第一等位基因特异性封闭探针，其互补于包含第二等位基因变体的靶序列的区域，其中所述区域包含对应于所述第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置的位置，并且其中所述第一等位基因特异性封闭探针包含小沟结合剂。

41.项目40的试剂盒，还包含基因座特异性引物，其互补于在第一等位基因变体的3’并且在相对链上的靶序列的区域。

42.项目41的试剂盒，其中所述第一等位基因特异性引物和/或所述第一等位基因特异性封闭探针包含至少一个修饰的碱基。

43.项目42的试剂盒，其中所述修饰的碱基是8-氮杂-7-脱氮杂-dN(ppN)碱基类似物，其中N是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）或胸腺嘧啶（T）。

44.项目42的试剂盒，其中所述修饰的碱基是锁核酸(LNA)碱基。

45.项目42的试剂盒，其中所述修饰的碱基是增大匹配的与错配的靶序列和/或核苷酸之间的Tm的任意修饰的碱基。

46.项目42的试剂盒，其中所述等位基因特异性封闭探针在所述等位基因特异性封闭探针的3’末端、5’末端和/或内部位置包含MGB部分。

47.用于检测核酸样品中的靶序列中的第一等位基因变体的方法，包括：

a)形成包含下列的反应混合物：

i)核酸样品；

ii)等位基因特异性引物，其中所述等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于靶序列的第一等位基因变体；

iii)等位基因特异性封闭探针，其互补于包含第二等位基因变体的靶序列的区域，其中所述区域包含对应于所述等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置的位置，并且其中所述等位基因特异性封闭探针包含封闭部分；

iv)基因座特异性引物，其互补于在第一等位基因变体的3’并且在相对链上的靶序列的区域；和

v)检测探针；

b)使用两步循环程序PCR扩增靶序列，包括：

i）第一扩增步骤，其包括在第一退火/延伸温度进行第一数目的循环；和

ii)第二扩增步骤，其包括在第二退火/延伸温度进行第二数目的循环，

其中第一数目的循环少于第二数目的循环，并且第一退火/延伸温度低于第二退火/延伸温度；

c)检测通过步骤b)产生的靶序列的扩增产物中的检测探针的可检测性质的变化，从而检测所述核酸样品中的靶基因的第一等位基因变体。

48.项目47的方法，其中第一步中的循环数比第二步中的循环数少大约90%。

49.项目14的方法，其中第一步中的循环数是3-7个循环；并且第二步中的循环数是42-48个循环。

50.项目14的方法，其中所述两步循环程序的第一步中使用的退火/延伸温度比第二步中使用的退火/延伸温度低1-3℃。

51.项目14的方法，其中所述两步循环程序的第一步中使用的退火/延伸温度是56-59℃；并且第二步中使用的退火/延伸温度是60-62℃。

52.用于检测核酸样品中的靶序列中的等位基因变体的方法，包括：

a)在单一管中形成包含下列的第一反应混合物：

i)核酸样品；和

ii)至少两组引物，其中每组包含(a)第一等位基因特异性引物和第二等位基因特异性引物，其中所述第一和第二等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分分别互补于靶序列中的给定SNP的第一等位基因和第二等位基因；和(b)基因座特异性引物，其互补于在第一和第二等位基因的3’并且在相对链上的所述靶序列的区域；其中至少两组引物各自特异于不同的靶序列；

b)使用适合于将反应保持在线性期内的循环数扩增所述不同的靶序列；

c)将步骤b)的扩增产物分入至少两个单独的管；

d)向步骤c)的分开的产物中各加入：

i)步骤a)中使用的引物的至少一组，

ii)等位基因特异性封闭探针，其互补于包含第二等位基因变体的靶序列的区域，其中所述区域包含对应于所述第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置的位置，并且其中所述第一等位基因特异性封闭探针包含小沟结合剂；和

iv)检测探针，

以在至少两个单独的管中形成第二和第三反应混合物；

e)扩增所述第二和第三反应混合物中的所述靶序列；和

f)检测通过步骤e)产生的所述靶序列的每个扩增产物中的检测探针的可检测性质的变化，从而检测所述核酸样品中的靶基因的等位基因变体。

53.项目52的方法，其中所述第一反应混合物是多重反应，并且所述第二和第三反应混合物是单重反应。

Claims (59)

1.用于检测怀疑包含至少靶序列的第二等位基因变体的核酸样品中的靶序列的第一等位基因变体的方法，包括：

a)通过组合：

i)核酸样品；

ii)第一等位基因特异性引物，其中所述第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于靶序列的第一等位基因变体，并且其中所述第一等位基因特异性引物的熔解温度Tm是50℃-67℃；

iii)第一等位基因特异性封闭探针，其互补于包含第二等位基因变体的靶序列的区域，其中所述区域包含对应于所述第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置的位置，并且其中所述第一等位基因特异性封闭探针包含不可延伸的封闭部分，其中所述不可延伸的封闭部分包括位于3’末端的、抑制引物延伸反应的MGB部分；

iv)第一基因座特异性引物，其互补于在第一等位基因变体的3’并且在相对链上的靶序列的区域；和

v)具有两个标记物的第一基因座特异性检测探针；

形成第一反应混合物；

b)使用第一基因座特异性引物和第一等位基因特异性引物在第一反应混合物中进行扩增反应，以形成第一扩增子；和

c)通过检测第一检测探针的可检测性质的变化来检测第一扩增子，从而检测核酸样品中的靶基因的第一等位基因变体，其中第一等位基因变体是稀少或突变体等位基因并且第二等位基因变体是野生型等位基因，并且其中所述方法提供的选择性为检测100,000至1,000,000个或其中任意部分范围的野生型等位基因的背景中的1个第一等位基因变体分子。

2.权利要求1的方法，还包括使用第一检测探针的可检测性质的变化来定量第一等位基因变体。

3.权利要求1的方法，还包括：

d)通过组合：

i)核酸样品；

ii)第二等位基因特异性引物，其中第二等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于靶序列的第二等位基因变体，并且其中所述第二等位基因特异性引物的熔解温度Tm是50℃-67℃；

iii)第二等位基因特异性封闭探针，其互补于包含第一等位基因变体的靶序列的区域，其中所述区域包含对应于第二等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置的位置，并且其中所述第二等位基因特异性封闭探针包含不可延伸的封闭部分，其中所述不可延伸的封闭部分包括位于3’末端的、抑制引物延伸反应的MGB部分；

iv)第二基因座特异性引物，其互补于在第二等位基因变体的3’并且在相对链上的靶序列的区域；和

v)具有两个标记物的第二基因座特异性检测探针，

形成第二反应混合物；

e)使用第二等位基因特异性引物和基因座特异性引物在第二反应混合物中进行扩增反应，以形成第二扩增子；和

f)通过测定检测探针的可检测性质的变化来检测第二扩增子，从而检测核酸样品中的靶基因的第二等位基因变体。

4.权利要求3的方法，还包括将第一反应混合物中的第一检测探针的可检测性质的变化与第二反应混合物中的第二检测探针的可检测性质的变化进行比较。

5.权利要求3的方法，其中所述第一、第二、或第一和第二等位基因特异性引物和/或所述第一、第二、或第一和第二等位基因特异性封闭探针包含至少一个修饰的碱基。

6.权利要求5的方法，其中所述修饰的碱基是8-氮杂-7-脱氮杂-dN(ppN)碱基类似物，其中N是腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)。

7.权利要求5的方法，其中所述修饰的碱基是锁核酸(LNA)碱基。

8.权利要求5的方法，其中所述修饰的碱基是fdU或isodC碱基。

9.权利要求5的方法，其中所述修饰的碱基是增大匹配的与错配的靶序列或核苷酸之间的Tm的任意修饰的碱基。

10.权利要求5的方法，其中所述修饰的碱基位于所述等位基因特异性引物和/或等位基因特异性封闭探针的

(a)：3’末端；

(b)：5’末端；

(c)：内部位置；或

(d)：(a)、(b)或(c)的任意组合。

11.权利要求3的方法，其中所述第一、第二或者第一和第二等位基因特异性引物在等位基因特异性引物的5’末端包含尾巴。

12.权利要求11的方法，其中所述第一、第二或者第一和第二等位基因特异性引物的尾巴是富含GC的。

13.权利要求1或3的方法，其中所述等位基因特异性封闭探针在PCR扩增过程中不被切割。

14.权利要求1或3的方法，其中所述等位基因特异性封闭探针的Tm是58℃至66℃。

15.权利要求3的方法，其中所述第一、第二或者第一和第二等位基因特异性引物的浓度是50-400nM。

16.权利要求3的方法，其中所述第一、第二或者第一和第二等位基因特异性引物的浓度是100-300nM。

17.权利要求1或3的方法，其中所述等位基因特异性引物的Tm比扩增过程中使用的PCR循环条件的退火/延伸温度高3℃至6℃。

18.权利要求1或3的方法，其中所述进行扩增反应包括两步循环程序，所述两步循环程序包括：在较低的退火/延伸温度进行的使用初始循环数目的第一步扩增，然后在较高的退火/延伸温度进行的使用多个循环数目的第二步扩增。

19.权利要求1或3的方法，其中第一步中的循环数比第二步中的循环数少90％。

20.权利要求1或3的方法，其中第一步中的循环数是3-7个循环；第二步中的循环数是42-48个循环。

21.权利要求1或3的方法，其中两步循环程序的第一步中使用的退火/延伸温度比第二步中使用的退火/延伸温度低1-3℃。

22.权利要求1或3的方法，其中两步循环程序的第一步中使用的退火/延伸温度是56-59℃；第二步中使用的退火/延伸温度是60-62℃。

23.权利要求1或3的方法，其中检测探针是5’核酸酶探针。

24.权利要求1或3的方法，其中检测探针包含MGB部分、报告子部分、猝灭剂部分和/或被动参照。

25.权利要求1或2的方法，其中选择性的水平是：可以检出1,000,000个拷贝的另一种等位基因中的单一拷贝的给定的等位基因。

26.组合物，其包含：

a)第一等位基因特异性引物，其中所述第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于靶序列的第一等位基因变体，并且其中所述第一等位基因特异性引物的熔解温度Tm是50℃-67℃；

b)第一等位基因特异性封闭探针，其互补于包含第二等位基因变体的靶序列的区域，其中所述区域包含对应于所述第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置的位置，并且其中所述第一等位基因特异性封闭探针包含不可延伸的封闭部分，其中所述不可延伸的封闭部分包括位于3’末端的、抑制引物延伸反应的MGB部分；和

c)具有两个标记物的基因座特异性检测探针。

27.权利要求26的组合物，还包含基因座特异性引物，其互补于在第一等位基因变体的3’并且在相对链上的靶序列的区域。

28.权利要求26的组合物，其中所述第一等位基因特异性引物和/或所述第一等位基因特异性封闭探针包含至少一个修饰的碱基。

29.权利要求28的组合物，其中所述修饰的碱基是8-氮杂-7-脱氮杂-dN(ppN)碱基类似物，其中N是腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)。

30.权利要求28的组合物，其中所述修饰的碱基是锁核酸(LNA)碱基。

31.权利要求28的组合物，其中所述修饰的碱基是fdU或isodC碱基。

32.权利要求28的组合物，其中所述修饰的碱基是增大匹配的与错配的靶序列或核苷酸之间的Tm的任意修饰的碱基。

33.权利要求28的组合物，其中所述修饰的碱基位于所述等位基因特异性引物和/或等位基因特异性封闭探针的

(a)：3’末端；

(b)：5’末端；

(c)：内部位置；或

(d)：(a)、(b)或(c)的任意组合。

34.权利要求26的组合物，其中所述第一等位基因特异性引物在等位基因特异性引物的5’末端包含尾巴。

35.权利要求34的组合物，其中所述第一等位基因特异性引物的尾巴是富含GC的。

36.权利要求26的组合物，其中所述等位基因特异性封闭探针的不可延伸的封闭部分包含MGB部分并且其中所述MGB部分位于所述等位基因特异性封闭探针的3’末端、5’末端和/或内部位置。

37.权利要求26的组合物，其中所述等位基因特异性封闭探针在PCR扩增过程中不被切割。

38.权利要求26的组合物，其中所述等位基因特异性封闭探针的Tm是58℃至66℃。

39.权利要求26的组合物，其中所述第一等位基因特异性引物的浓度是50-400nM。

40.权利要求26的组合物，其中所述第一等位基因特异性引物的浓度是100-300nM。

41.权利要求26的组合物，其中所述等位基因特异性引物的Tm比扩增过程中使用的PCR循环条件的退火/延伸温度高3℃至6℃。

42.包括两个或更多个容器的试剂盒，所述容器包含独立分配于两个或更多个容器中的之一中的下列成分：

a)第一等位基因特异性引物，其中所述第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于靶序列的第一等位基因变体，并且其中所述第一等位基因特异性引物的熔解温度Tm是50℃-67℃；

b)第一等位基因特异性封闭探针，其互补于包含第二等位基因变体的靶序列的区域，其中所述区域包含对应于所述第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置的位置，并且其中所述第一等位基因特异性封闭探针包含不可延伸的封闭部分，其中所述不可延伸的封闭部分包括位于3’末端的、抑制引物延伸反应的MGB部分；和

c)具有两个标记物的基因座特异性检测探针。

43.权利要求42的试剂盒，还包含基因座特异性引物，其互补于在第一等位基因变体的3’并且在相对链上的靶序列的区域。

44.权利要求42的试剂盒，其中所述第一等位基因特异性引物和/或所述第一等位基因特异性封闭探针包含至少一个修饰的碱基。

45.权利要求44的试剂盒，其中所述修饰的碱基是8-氮杂-7-脱氮杂-dN(ppN)碱基类似物，其中N是腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)。

46.权利要求44的试剂盒，其中所述修饰的碱基是锁核酸(LNA)碱基。

47.权利要求44的试剂盒，其中所述修饰的碱基是fdU或isodC碱基。

48.权利要求44的试剂盒，其中所述修饰的碱基是增大匹配的与错配的靶序列和/或核苷酸之间的Tm的任意修饰的碱基。

49.权利要求44的试剂盒，其中所述修饰的碱基位于所述等位基因特异性引物和/或等位基因特异性封闭探针的

(a)：3’末端；

(b)：5’末端；

(c)：内部位置；或

(d)：(a)、(b)或(c)的任意组合。

50.权利要求42的试剂盒，其中所述第一等位基因特异性引物在等位基因特异性引物的5’末端包含尾巴。

51.权利要求50的试剂盒，其中所述第一等位基因特异性引物的尾巴是富含GC的。

52.权利要求42的试剂盒，其中所述等位基因特异性封闭探针的不可延伸的封闭部分包含MGB部分并且其中所述MGB部分位于所述等位基因特异性封闭探针的：

(a)：3’末端；

(b)：5’末端；和/或

(c)：内部位置。

53.权利要求42的试剂盒，其中所述等位基因特异性封闭探针在PCR扩增过程中不被切割。

54.权利要求42的试剂盒，其中所述等位基因特异性封闭探针的Tm是58℃至66℃。

55.权利要求42的试剂盒，其中所述第一等位基因特异性引物的浓度是50-400nM。

56.权利要求42的试剂盒，其中所述第一等位基因特异性引物的浓度是100-300nM。

57.权利要求42的试剂盒，其中所述等位基因特异性引物的Tm比扩增过程中使用的PCR循环条件的退火/延伸温度高3℃至6℃。

58.权利要求26的组合物或权利要求42的试剂盒，其中所述基因座特异性检测探针的两个标记物包括荧光团和猝灭剂。

59.权利要求26的组合物或权利要求42的试剂盒，其中所述基因座特异性检测探针包括MGB。