JP2015517798A

JP2015517798A - 低頻度変異を検出するための高感度な方法

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Publication number: JP2015517798A
Application number: JP2014557741A
Authority: JP
Inventors: ワン・ハイイン; ジャン・ユチウ; ワン・イーシン
Original assignee: Janssen Diagnostics LLC
Current assignee: Janssen Diagnostics LLC
Priority date: 2012-02-15
Filing date: 2013-02-13
Publication date: 2015-06-25
Also published as: EP2814985A4; AU2013221642A1; US20160130641A1; IL234021A0; EP2814985A2; WO2013123031A3; WO2013123031A2

Abstract

本開示の末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ法は、対立遺伝子特異的ＤＮＡ（又はＲＮＡ）を増幅する一方で、野生型（ＷＴ）ＤＮＡ（又はＲＮＡ）の増幅を劇的に阻害する。ＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ設計は、変異配列に対し相補的な対立遺伝子特異的プライマーとともに末端ブロッカーオリゴヌクレオチドを導入し、対立遺伝子特異的増幅を達成することにより既存のＰＣＲ反応設定の容易な改変を可能にする。本方法は、アッセイの最適化手順を簡略化し、かつ０．１％程度で存在するシグナルを１００％近い特異性で検出するのに十分な感度を達成した。これはＳＮＰ又は遺伝的変異を検出するのに有用である。本方法を使用して、異なる３種の末端修飾（リン酸塩、ｉｎｖｅｒｔｅｄｄＴ及びアミノ−Ｃ７）をなされたブロッカーオリゴヌクレオチドを用い、がんにおけるＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ及びＥＧＦＲにおいて３種の異なる遺伝的変異を検出した。本方法は、不均質なサンプルの１０００コピーの正常ＤＮＡのバックグラウンドから、１コピーの変異体ＤＮＡを検出することができ、かつ他のブロッキング法よりもはるかに高感度であった。

Description

診断領域において、分子アッセイの使用が急増している。分子試験は、患者の疾患特性、並びに分子レベルでの疾患に対する耐性をより良好に理解するために、臨床科学者及び臨床専門医により使用されてきた。具体的には、処置又は疾患に対する応答の評価において、個人間の遺伝的な差異を有効な因子として考慮し、治療に対する応答を判断するのである。

多くの疾患の処置において、異常でかつ有害な特定の細胞種を標的とすることは難しい。多くの場合、このような異常細胞は、周囲の正常組織には存在していない変異を示す。このような変異の提示は、特にがんの場合に当てはまり、がん性細胞の実際のクローン数は、周囲の正常組織中の正常細胞数と比べてはるかに少ない。存在が検出可能である場合には、場合により（成功率は増加してきている）、このような異常細胞は、該細胞が増殖する前の治療により標的とすることができる。したがって、臨床パラメータと分子特性とを組み合わせて使用することで、患者のための治療法の選択、特定の治療法に対する患者の応答の予測、又は患者の無疾患及び全生存の予測を補助することができる。

がんなどの疾患条件の評価において、患者は、有害に機能する単一の点置換、挿入、又は欠失変異を１つ又は２つ以上有する細胞を保有し得る。同種のがんを有する場合でさえ、異なる患者は異なる変異を有する場合がある。各変異又は変異群は、異なる治療レジメンにより最良に治療され得る。しかし、変異部位に隣接し、サンプル中の周囲の正常組織から得られる遺伝物質を有する、実質的にすべての核酸配列が同定されることに起因して、このような点変異は、強いシグナルを生成する正常組織により覆い隠されてしまうため、多くの場合、大規模な挿入又は欠失又は生殖系変異と比較してはるかに検出が困難である。換言すれば、何らかのがん性組織だけでなく多量の正常組織も含む組織サンプルでは、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）法を使用した場合に、概して変異配列よりも正常組織に対応するシグナルを生成することになる。

ハイスループットでかつ再現性の高いＰＣＲアッセイにより単一のＤＮＡ分子の増幅がなされ得ることから、通常、ＰＣＲのような高感度の手法であっても、偽陽性の増幅を避けるため、特別な研究所での実施を採用することが推奨されている。シグナルが、ほとんど同一の核酸分子由来の多量のシグナルに埋没してしまう場合、バックグラウンドシグナルは数的有利を有する分子に由来することから、所望の標的核酸分子の代わりにバックグラウンドのほとんど同一の核酸分子が増幅されることは回避するよう対処する必要があるという更なる技術的な問題がある。結果として、比較的非侵襲性の手法によりがんの早期検出あるいは検出及び監視を試みた場合、ＰＣＲに基づく増幅は、低頻度で存在する核酸変異体（変異は、通常、腫瘍細胞において存在することから、多くの場合、サンプル中では正常組織と比較してはるかに少量（多くの場合、ほんの僅かの割合）で存在している）を単に増幅することはできない。

このようなアッセイの有用性は、多くの場合、その大部分は、遺伝型解析を実施する前に、あるいはほとんどが同一な大量のバックグラウンド分子ではなく標的核酸分子を非常に望ましく増幅する手順を採用する前に、正常組織からがん性組織を良好に分離し、標的核酸変異体を富化することに依存する。このような技術の例は、例えば、Ｎｅｗｔｏｎｅｔａｌ．により、「ＤＮＡ中の任意の点変異の解析：アレル特異的ＰＣＲ法（ＡＲＭＳ）（Analysis of any point mutationin DNA: The amplificationre fractory mutation system（ARMS））」ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７：２５０３〜２５１６（１９８９）により記載される。このような手法の感度は、手法の感度の観点から説明することができる。１％の感度とは、ほとんどが同一である多量の正常なバックグラウンドコピーの中で１：１００で存在する標的変異分子種に相当するシグナルを、増幅及び生成し得ることを意味する。

がんに関して有用な有望な手法は、アレル特異的増幅を用いたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法（「ＡＳ−ＲＴ−ＰＣＲ」）であリ、この手法では、野生型配列に優先的に結合して、野生型配列の変異体と比較して野生型配列の増幅を抑制する、ブロッカーオリゴヌクレオチドが使用され、野生型配列の増幅が抑制される。この手法は、患者の腫瘍細胞において、又はキメラにおいて低頻度で存在する遺伝的変異の評価に役立つ。この手法は、本明細書において後述するとおり、遺伝的変異体、一塩基多型（ＳＮＰ）及び低頻度で存在している遺伝子変異を検出するのに役立ち得る。

ＡＳ−ＲＴ−ＰＣＲプロトコルの例、並びにそれらの限界は、例えば、Ｍｏｒｌａｎｅｔａｌ．「リアルタイムＰＣＲによる変異検出：簡単でロバストでありかつ好感度な手法（Mutation Detection by Real-Time PCR: ASimple ,Robustand Highly Selective Method）」、ＰＬｏＳＯＮＥ４（２）：ｅ４５８４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００４５８４（２００９）に記載されている。Ｍｏｒｌａｎの参照文献は、点変異の検出を増強させるためのセンターブロッカー（center-blocker）オリゴヌクレオチドの使用を記載している−この手法は、Ｗｕｅｔａｌ．の「鎌状赤血球貧血を診断するための、アレル特異的な酵素によるｆ８−グロブリンゲノムＤＮＡの増幅（Ｘ）」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：２７５７〜６０（１９８９）により報告されている対立遺伝子特異的な増幅法を改良したものである。Ｍｏｒｌａｎ法では、センターブロッカーオリゴヌクレオチドとともに、変異特異的なプライマーが使用される。センターブロッカーオリゴヌクレオチドは、いずれの末端からもほぼ等距離にミスマッチを有するオリゴヌクレオチドを意味する。変異特異的なプライマーは、変異配列に対して完全に相補的である。Ｍｏｒｌａｎの変異特異的なプライマーは、ＰＣＲに使用されるアニール／伸長温度よりも溶解温度が約１０℃下回るよう更に５’末端がトリミングされている。センターブロッカーオリゴヌクレオチドは、野生型配列と相補性であり、点変異がおよそ等しい距離になるよう点変異部位は配置される。更には、センターブロッカーオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応中の伸長を予防するため、３’末端がリン酸化されている。

その他の取り組み例としては、Ｄａｍｅｓｅｔａｌ．「非標識プローブアッセイにおける異常な融解ピークの特性評価（Characterization of Aberrant Melting Peaksin Un labeled Probe Assays）」、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．３，Ｊｕｌｙ２００７；並びにＷｉｌｌｅｍＭａａｔ及びＰｉｅｔｅｒＡ．ＶａｎｄｅｒＶｅｌｄｅｎ、「ピロリン酸分解による原発性ぶどう膜黒色腫におけるＢ−ＲＡＦ変異の検出（Pyrophosphorolysis Detects B-RAF Mutations in Primary Uveal Melanoma）」，ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＯｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆ＶｉｓｕａｌＳｃｉｅｎｃｅ，Ｊａｎ２００８，Ｖｏｌ．４９，Ｎｏ．１．が挙げられる。

センターブロッカーオリゴヌクレオチド法に関し、選択された点変異の検出により良好な結果が得られ、かつこれまでの試みには著しい改良が見られているものの、稀な変異を最大限に検出するための手法を実際に利用するにあたって、常に１％超の感度を得るという課題は残っている。更に、この手法は、点変異の検出に限定される。稀な対立遺伝子を単に点変異により特定するものではない、高感度な検出法が引き続き更なる課題となっている。

変異アッセイ方法論をもとにした非伸張性プライマーブロッカー対立遺伝子特異的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Non-Extendable Primer Blocker Allele Specific-Real Time Polymerase Chain Reaction；ＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ）に基づく、新規末端ブロッカーオリゴヌクレオチドを開示し、これは、従来技術法の制限を克服して、１％未満の頻度で存在する核酸変異体の増幅及び検出を可能にし、１％未満のレベルで存在する標的に対する感度を達成するものである。本開示の方法は、ＳＮＰ又は遺伝的変異を検出するための任意のＡＳ−ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて使用することができる対立遺伝子特異的プライマー及びプライマーブロッカーの普遍的な設計を可能にする。この方法はアッセイの最適化手順を単純化し、かつおよそ１００％の特異性で０．１％の検出感度を達成している。

本開示の末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ法は、対立遺伝子特異的ＤＮＡ（又はＲＮＡ）を増幅する一方で、野生型（ＷＴ）ＤＮＡ（又はＲＮＡ）の増幅を劇的に阻害する。本開示のＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ設計は、変異配列に対し相補的な対立遺伝子特異的プライマーとともに末端ブロッカーオリゴヌクレオチドを導入し、対立遺伝子特異的増幅を達成することにより既存のＰＣＲ反応設定の容易な改変を可能にする。好ましい実施形態では、末端ブロッカーオリゴヌクレオチド及び対立遺伝子特異的プライマーは同一の長さを有し、かつ３’末端のみが異なっていてよく、末端ブロッカーオリゴヌクレオチドが変異配列に対し非相補的な塩基及びブロック化３’末端を有するのに対し、対立遺伝子特異的プライマーは好ましくは対象とする変異配列に対し完全に相補的であり、かつ３’末端に、ＰＣＲ反応中の伸長を可能にするヒドロキシル基を有する。この方法は、装置よりも簡単であるばかりでなく、野生型配列の増幅を常に抑制して、変異配列が野生型配列の約０．１％の頻度で存在する場合でさえも野生型配列をほとんど非検出にすることにも成功する。更には、末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ法は、点変異を検出することのみに制限されるものではなく、特定の挿入又は欠失を検出することもできる。

末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ法は、がんにおいて異なる３つの遺伝的変異を検出するために使用されていた。ここで標的とされた遺伝的変異はＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、及びＥＧＦＲ遺伝子におけるものであり、３種の異なる種類の末端修飾されたブロッカーオリゴヌクレオチド（リン酸、ｉｎｖｅｒｔｅｄｄＴ及びアミノ−Ｃ７）を使用することにより検出されていた。得られるデータは、参照として、既知の一般的なブロッキング法のうちの１つと比較された。本明細書において開示される新規方法は、不均質なサンプルの１０００コピーの正常ＤＮＡのバックグラウンドから、１コピーの変異体ＤＮＡを検出することができ、かつ参照のブロッキング法よりもはるかに高感度であった。

置換、欠失又は挿入の少なくとも１つ又は２つ以上に起因する１つ又は２つ以上の変異により定義される変異核酸配列を検出し、かつ野生型配列に起因するシグナルを抑制するための好ましい方法は、複数の工程を包含する。好ましくは、少なくとも１つの変異が生じている核酸部位と３’末端が一致するよう、変異核酸配列に相補的なプライマーが選択される。第２のプライマー、すなわち末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドも使用される。末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドは、末端ブロッカー野生型プライマーの３’末端が、変異核酸配列に対する３’末端に又は３’末端付近に少なくとも１つのミスマッチを有するものの、野生型配列に対するミスマッチは有さないように野生型配列に対応する。更に、末端ブロッカー野生型プライマーの末端の３’ヒドロキシル基を阻害することにより、プライマーにはポリメラーゼ連鎖反応における非伸張性がもたらされる。好ましい実施形態では、逆方向プライマーは通常通りに選択されるものの、欠損又は挿入の検出を試みる場合には、ブロックされた３’末端を有する野生型配列と一致するものと類似する逆方向プライマーを使用することが有利な場合があることは注目すべきである。ＰＣＲ反応の増幅産物は、ポリメラーゼ連鎖反応における増幅産物に特異的な少なくとも１つのプローブにより検出される。好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応はリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応である。

変法においては、ポリメラーゼ連鎖反応の開始後に１つ又は２つ以上のプローブを加える事もできる。更に、開始時出発材料は、対象とする点変異又はその他の変異に関係する転写産物を調査するために逆転写酵素により生成することができる。

この方法により手軽に操作される対象とする状況は、対象とする２つの点変異が隣接するなどして互いに接近している状況である。このような状況下で、この方法は、変異核酸配列に対する３’末端にあるいは３’末端付近に少なくとも１つのミスマッチを有する末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの３’末端を使用することができ、更には２つのミスマッチにいずれもの点変異を網羅させて、野生型配列の増幅を更により効果的に抑制することができる。いずれもの変異部位を網羅する対立遺伝子特異的プライマーが好ましい。このような適用範囲に関し、対立遺伝子特異的プライマーの結合に基づく伸長でさえも、増幅産物は野生型配列以外の標的変異に一致し得る。

一実施形態では、末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドのブロック化された３’末端に直接隣接する３つの塩基対のうち２つの塩基対はミスマッチを有するものの、末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの長さを増加させることによりこれが相殺され、対立遺伝子特異的プライマーにより野生型配列の増幅が抑制され得る。

好ましい実施形態では、末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドは、変異型又は野生型配列の類似する部位を網羅する３’末端を両方有する対立遺伝子特異的プライマーと長さが等しい。本方法は、存在する頻度がほんの１／１０００ほどの場合、あるいはこれよりも更に稀である場合でさえも変異配列を検出し得る。

しかしながら、記載の通りの末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドは、対立遺伝子特異的プライマーによる野生型配列の偶発的な伸長を予防するよう、対立遺伝子特異的プライマーの排除を促進する目的で、対立遺伝子特異的プライマーより５’末端が長くてもよい。

末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドによる効果的な競争を確実にするため、対立遺伝子特異的プライマーの融解温度は野生型配列に対する末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの溶解温度よりも低い。好ましくは、対立遺伝子特異的プライマーの融解温度は、例えば、末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの溶解温度よりも約１０℃低い。

野生型配列の末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドによる効果的な競争は、野生型配列を抑制しつつ変異配列の増幅を可能にするのに好適な濃度で確実に末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドを存在させることにより促進される。好ましくは、この濃度は野生型配列の濃度レベルと同等であり、少なくとも等しい。その一方で、ＰＣＲ産物に組み込まれることから対立遺伝子特異的プライマーの濃度は野生型配列の濃度よりも過剰であり、かつ末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドは野生型配列の増幅の抑制をもたらすことから、対立遺伝子特異的プライマー濃度が標的ＰＣＲ産物の増幅を低下させ、これにより野生型配列の増幅が減少する可能性がある。したがって、好ましくは、末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチド及び対立遺伝子特異的プライマーの濃度は同等である。

好ましくは、例えば、較正曲線を使用する、本開示の希少変異核酸配列の検出方法は、野生型配列に対する変異核酸配列の濃度を推定するための定量化を包含する。このような較正曲線は、ポリメラーゼ連鎖反応によりサンプルをスパイクすることにより生成することができる。

より良好な治療介入をもたらすためのがんの早期検出は、本開示の方法を使用して、組織、ＣＴＣ、又は患者から採取されたその他のサンプルにおける腫瘍細胞型に一致する変異核酸配列により腫瘍細胞を検出した場合になすことができる。希少標的対立遺伝子が転移性の細胞疾患と一致する場合、腫瘍細胞が顕著になるより前の治療介入がより現実的に可能なものとなる。

したがって、本開示の方法は、患者由来のサンプル中の、変異核酸配列を保有しかつこの細胞の存在により悪性度又は再発の可能性が導かれる１つ又は２つ以上の標的細胞の存在を検出するという手法による、がんの早期発見に好適な診断方法である。方法は、対立遺伝子特異的プライマーの３’末端が、ミスマッチを有さず、かつ標的において少なくとも１つ変異が生じている核酸部位と整列されるよう、変異核酸配列の一部に一致する対立遺伝子特異的プライマーを選択することを含む。末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの３’末端が３’末端に又は３’末端付近に少なくとも１つのミスマッチを有するよう、かつ更には末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの３’末端をブロックして該オリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応における非伸長性の競合阻害剤とするよう、野生型配列に一致させた、末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドも使用する。所望の増幅産物を検出するための他の成分及び１つ又は２つ以上のプローブと一緒に、ポリメラーゼ連鎖反応、好ましくはリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を実施する。この方法は、有効に早期にがんを検出するだけでなく、患者の処置に最適な治療法を案内することもできる。

偽性シグナルの確認として、変異核酸配列は、予め設定された増幅サイクル数に満たない反応産物を検出することにより検出される。

偽性シグナルに対する更なる予防措置として、同じサンプルにおいて、増幅産物が変異核酸配列と一致する場合には変異核酸配列の存在が検出されるが、変異型と同様に扱った参照配列は検出されない。野生型様配列と一致する配列を用い又は用いずに標的配列を使用して、サンプルをスパイクすることができる。対象とする感度及び他のパラメータを決定することができる。

末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドは、リン酸、ｉｎｖｅｒｔｅｄｄＴ及びアミノ−Ｃ７からなる群から選択される１つ又は２つ以上のものにより３’ヒドロキシル基を誘導体化する又は置き換えることによりブロック化される。

本開示の新規ＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ法及びこれらの変法のこれらの利点及びその他の利点を、添付の図面の補助として以降に記載する。

末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲの設計に関する概略図：３’末端に修飾（リン酸又はｉｎｖｅｒｔｅｄｄＴ）を有するプライマーは、ポリメラーゼによる野生型配列の伸長を予防するためのブロッキング基として機能する。−ＰＣＲは、ＡＳプライムした変異のみを増幅するのに対し、野生株は修飾された非伸張性プライマー（末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ）によりブロックされる。Ｖ６００Ｅの末端ブロッカーオリゴヌクレオチド設計のマッピングを示す図。ＡＳプライマー１及び２は、それぞれ配列番号１及び配列番号２に相当するＢＲＡＦ−ＡＳ−順方向プライマー１及び２を示す（ＡＳプライマー１はＡＳプライマー２よりも５’が６塩基長い）。末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ：野生型１及び２は、末端ブロッカーオリゴヌクレオチド１及び末端ブロッカーオリゴヌクレオチド２を表し、かつこれらはそれぞれ配列番号５及び配列番号６に相当する。プローブ−染料（染料標識プローブ−配列番号４）及び逆方向プライマー（配列番号３）はいずれのアッセイについても共通のものである。ＡＳプライマー１、すなわち配列番号１は末端ブロッカーオリゴヌクレオチド−野生型−１（ＮＥＰＢ−野生型−１）、すなわち配列番号５とともに用い、ＡＳプライマー２、すなわち配列番号２は末端ブロッカーオリゴヌクレオチド−野生型−２（ＮＥＰＢ−野生型−２）、すなわち配列番号６とともに用い実施した。説明文及び図中の太字はＡＳプライマー１及び２における「Ａ−ＢＲＡＦ変異（Ｖ６００Ｅ；Ｔ＞Ａ）」などのミスマッチを表し、「^＊」は本明細書及び図中の３’修飾を表す。２つのＫ−ｒａｓ遺伝子変異のための末端ブロッカーオリゴヌクレオチドの設計をマッピングする図。ＡＳプライマーＫｒａｓＰ４（配列番号１７）及びＫｒａｓＰ７（配列番号２１）はＧ１２Ｖ−ＡＳ−順方向プライマー及びＧ１３Ｄ−ＡＳ−順方向プライマーを示す。ＮＥＰＢ−野生型−ＫｒａｓＰ４Ｂ（配列番号１８）及びＰ７Ｂ（配列番号２２）は、Ｇ１２Ｖ−ＮＥ末端ブロッカーオリゴヌクレオチド及びＧ１３Ｄ−ＮＥ末端ブロッカーオリゴヌクレオチドを表す。ＫＰｒｏｂｅ１（配列番号２０）及びＫＰｒｏｂｅ２（配列番号２４）は染料標識したプローブであり、いずれのアッセイについてもプライマーは共通のものである。ＡＳプライマーＫｒａｓＰ４（配列番号１７）を末端ブロッカーオリゴヌクレオチド−野生型−ＫｒａｓＰ４Ｂ（配列番号１８）及びＫＰｒｏｂｅ１（配列番号２０）とともに用い実施した。ＡＳプライマー−ＫｒａｓＰ７（配列番号２１）をセンターブロッカーオリゴヌクレオチド−野生型−ＫｒａｓＰ７Ｂ（配列番号２２）及びＫＰｒｏｂｅ２（配列番号２４）とともに用い実施した。赤色の「ｔ」はＫ−ｒａｓｐ．Ｇ１２Ｖを示し、変異（ｃ．Ｇ＞Ｔ）及び赤い色の「ａ」はＫ−ｒａｓｐ．Ｇ１３Ｄを示し、ＡＳプライマー−ＫｒａｓＰ４及びＰ７における変異（ｃ．Ｇ＞Ａ）並びに恒例により「^＊」は３’の修飾を表す。ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異型の検出：２０ｎｇＤＮＡ反応物由来の２０μＬＰＣＲ産物のうち８種類をゲルに装填した。５％〜０．１％変異型の反応物からは単一の鮮明なバンドが観察され、かつＳＫＢＲ３野生型ＡＳ−ＮＥＰＢ２−ＰＣＲ−２反応物からはアクチンのＰＣＲ産物を除きＰＣＲ産物は観察されなかった。ＳＷ４８０細胞株ＤＮＡに対するＫｒａｓＰ４（Ｇ１２Ｖ；Ｇ＞Ｔ）ＮＥＰＢ又はＣＢＯブロッカーＰＣＲ：２０ｎｇＤＮＡ反応物からの２０μＬＰＣＲ産物のうち８種をゲルに装填した。４％アガロースゲルでは、０．１％変異型反応物由来の清浄なＰＣＲ産物が可視化され、野生型反応物からはアクチンのＰＣＲ産物を除きＰＣＲ産物は観察されなかった。ブロッカーを添加していない野生型の増幅産物由来のＰＣＲ産物も可視化された。テンプレート非添加対照（ＮＴＣ）はいずれも未検出であった。ＨＣＴ１１６細胞株ＤＮＡに対するＫｒａｓＰ７（Ｇ１３Ｄ；１３Ｇ＞Ａ）ＮＥＰＢ又はＣＢＯブロッカーＰＣＲ：８μＬＰＣＲ産物をゲルに装填した。０．１％変異型反応物由来の清浄なＰＣＲ産物が可視化され、野生型反応物からはＰＣＲ産物は観察されなかった。ブロッカーを添加していない野生型の増幅産物由来のＰＣＲ産物も同様に可視化された。ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株ＤＮＡに対するＥＧＦＲＥｘｏｎ２１Ｌ８５８Ｒ（２５７３Ｔ＞Ｇ）ＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ：８μＬＰＣＲ産物をゲルに装填した。０．１％変異型反応物由来の清浄なＰＣＲ産物が可視化され、野生型反応物からはＰＣＲ産物は観察されなかった。ブロッカーを添加していない野生型の増幅産物由来のＰＣＲ産物も同様に可視化された。

本明細書においては、実施例及び考察例による補助を用い、変異アッセイ方法論をもとにした非伸張性プライマーブロッカー対立遺伝子特異的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Non-Extendable Primer Blocker Allele Specific-Real Time Polymerase Chain Reaction；ＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ）に基づく、新規末端ブロッカーオリゴヌクレオチドを開示し、これは、従来技術法の制限を克服して、１％未満の頻度で存在する核酸変異体の増幅及び検出を可能にし、１％未満の濃度で存在する標的に対する感度を達成するものである。本開示の方法は、ＳＮＰ又は遺伝的変異を検出するための任意のＡＳ−ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて使用することができる対立遺伝子特異的プライマー及びプライマーブロッカーの普遍的な設計を可能にする。この方法はアッセイの最適化手順を単純化し、かつおよそ１００％の特異性で０．１％の検出感度を達成している。本説明は、本手法の有効性を例示する実験の概略を詳述することにより開始する。

材料及び方法
細胞株及びＦＦＰＥ組織サンプル
がん細胞株をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ．ＵＳ）により取り寄せ、ＡＴＣＣプロトコルに従って培養した。本試験には、特異的な対立遺伝子配列を含有する次の細胞株を使用した：ｐ．Ｖ６００Ｅ（ｃ．１７９９Ｔ＞Ａ）の予想される変異硬化を有するＢＲＡＦ変異において、ＨＴ２９細胞株（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−３８Ｄ）はヘテロ接合性であり、ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−５９０８）はホモ接合性である。ＢＲＡＦ変異の評価は、発がん性変異のようであるとして記載された（１１）。ＨＣＴ１１６細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２４７）はＫ−ｒａｓがん原遺伝子のコドン１３に変異を有し（ｐ．Ｇ１３Ｄ；ｃ．Ｇ＞Ａ）、ＳＷ４８０細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２２８）はコドン１２に変異を有する（ｐ．Ｇ１２Ｖ；ｃ．Ｇ＞Ｔ）。ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−５９０８）は、Ｌ８５８Ｒ−２５７３Ｔ＞Ｇ（１２）のＥＧＦＲエクソン２１の頻発型（recurrent）ヘテロ接合性ミスセンス変異を保有する。ＳＫＢＲ３細胞株（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−３０）はＢＲＡＦ用の野生型対照として使用し、Ｋ−ｒａｓ及びＮＣＩ−Ｈ３５８細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−５８０７）はＥＧＦＲ変異検出アッセイ用の野生型対照として使用した。

黒色腫及び大腸組織サンプルは、生物サンプル供給元の１つＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ（ＣｕｌｖｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ．ＵＳ）から購入した。

患者サンプル
肝臓転移がん切除前及び腫瘍の処置（manipulation）に先立ち、末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の算出及び評価のため、４２名の転移性結腸直腸がん患者から、静脈穿刺法により２×３０ｍＬの血液サンプルを採取した。ＣＴＣの濃縮及び算出は、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈｓｙｓｔｅｍ（ＶｅｒｉｄｅｘＬＬＣ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）により処理した。すべての患者は、記入済みのインフォームド・コンセント同意書を得てからＥｒａｓｍｕｓＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ（Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に収容した。

ＤＮＡ抽出
製造元の説明書に従って、ＡｌｌＰｒｅｐ（商標）ＤＮＡ／ＲＮＡＭｉｃｒｏキットを使用して細胞株のＤＮＡを抽出し、Ｑｉａｇｅｎ（ＶａｌｅｎｃｉａＣＡ．ＵＳカタログ番号８０２８４及び７４４０４）のＲＮｅａｓｙＦＦＰＥキットを使用してＦＦＰＥ組織ＤＮＡを抽出した。次に、抽出したＤＮＡを使用者マニュアルに従ってＮａｎｏｄｒｏｐ−２０００分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ．ＵＳ）で定量した後、後に使用するまで−２０℃で保管した。

オリゴ設計
ＮＥＰＢの概略図を図１に例示する。解析した対立遺伝子に関し、ＤＮＡ（又はＲＮＡ）のポジティブ鎖又はネガティブ鎖のいずれかに対して対立遺伝子特異的プライマー（ＡＳＰ）を設計することができる。順方向又は逆方向プライマーのいずれかに関し、３’末端は変異体の塩基に係留させる。ＡＳＰの融解温度（Ｔｍ）は、ＰＣＲ伸長温度に近づけて設定すべきである。

順方向又は逆方向プライマーの３’末端が野生型塩基に係留されていること、及び３’末端の修飾（リン酸又はｉｎｖｅｒｔｅｄｄＴ又はアミノ−Ｃ７）によりポリメラーゼによる伸長が可能でないことを除き、対立遺伝子特異的プライマーと同一鎖及び同一の長さとなるよう、末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ法を設計した。センターブロッカーオリゴヌクレオチド設計は、論文（７）に掲載される基準に基づくものであり、末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ法との比較のために使用した。設計した配列は、ＳｅｑＭａｎＩＩエキスパート配列解析ソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲＩｎｃ，ＷＩ，ＵＳ）により構築した；図２はＢＲＡＦ遺伝子の設計に関するものであり、かつ図３は２つのＫ−ｒａｓ遺伝子に関するものである。

非ＡＳ順方向又は逆方向プライマー及びプローブを含む全ての設計には、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＩｎｓｉｇｈｔｓ（Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＯ．ＵＳ）のオリゴプライマー解析ソフトウェアを使用した。Ｔｍは、０．２ｕＭプライマー、１００ｍＭ［一価のカチオン］及び３ｍＭフリーＭｇ［２＋］のＰＣＲ条件をもとにオリゴソフトウェアにより算出した。

ＭＧＢプローブを除き、プライマー、プローブ及びブロッカーを含むすべてのオリゴヌクレオチドは、ＢｉｏｓｅａｒｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ．ＵＳ）から購入した。製造元の使用説明書に従って、５’末端にはフルオロフォア染料（ＦＡＭ及びＣＡＬＦｌｕｏｒオレンジ）及び３’末端にはＢＨＱ又はリン酸塩（表１ａ、ｂ及びＣ）を含む修飾オリゴヌクレオチドを合成した。Ｋ−ｒａｓアッセイ用の２つのＭＧＢプローブはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）から購入した。

ＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ増幅
Ｂ−Ｒａｆ、Ｋ−ｒａｓ及びＥＧＦＲの対立遺伝子解析用のＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲアッセイでは、ポジティブストランド上にＡＳＰを１つ、ネガティブストランド上にＮＥＰＢ１つ、３’末端にＢＨＱ又はＭＧＢを有する蛍光標識した配列特異的ＴａｑＭａｎプローブを１つ、及び非ＡＳ逆方向プライマー（ＲＰ）を１つ含んだ。ＢＲＡＦ遺伝子、Ｋｒａｓ遺伝子及びＥＧＦＲ遺伝子のそれぞれのプライマー、プローブ及びオリゴヌクレオチドブロッカーの配列は、以下の表１ａ、表１ｂ及び表１ｃに掲載する。すべての表は、以降の「参照」節後の表題「表」において提供される。

ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００（又は７９００）リアルタイムＰＣＲシステム（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）での２つの独立した反応又は１つの反応において、１波長又は２波長フォーマットのＡＳ−ＲＴ−ＰＣＲ、ＡＳ内部標準遺伝子を有する遺伝子としてアッセイを実施した。

ＢＲＡＦｐ．Ｖ６００Ｅ（ｃ．１７９９Ｔ＞Ａ）検出に関し、ＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲアッセイの各プライマー、ブロッカー及びプローブ最終濃度を表２ａに掲載する。アッセイは次のとおりに構成した：１０ｎｇ〜５０ｎｇの不均質なＤＮＡ混合物を使用し、反応時最終容量２０μＬで実施した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現マスターキット（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販，製品番号４３６８８１４）を使用し、ＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲを実施した。各反応物は１０．０μＬの２×ＰＣＲマスターミックス、１μＬの２０ｘプライマー／ブロッカー／プローブミックス、及び１〜５μＬの１０ｎｇ／μＬ総ＤＮＡサンプルから構成した。ＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲアッセイは次のとおりに実施した：標準モード下で、９５℃で１０分間の変性を１サイクル、９５℃で２０秒間の変性及び状況により６４℃でＢＲＡＦ−ＮＥＰＢ１−ＰＣＲ−１若しくは５８℃でＢＲＡＦ−ＮＥＰＢ２−ＰＣＲ−２により４５秒間のアニーリング及び伸長を４０サイクル実施。

センターブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ法と比較するため、刊行物（７）において掲載の基準をもとに設計した２つのＢＲＡＦセンターブロッカーオリゴヌクレオチド（表１ａ）を試験した。１ｘ、２ｘのＡＳプライマー濃度によりセンターブロッカーオリゴヌクレオチドの最終濃度を試験した。ＡＳプライマー濃度は０．９ｕｍであり、０．９ｕｍ逆方向プライマーと、０．２ｕｍプローブとを最終的な２０μＬ反応液中に有する。ＰＣＲの試薬及び条件はＢＲＡＦ−ＮＥＰＢ１−ＰＣＲ−１アッセイと同様である。各プライマー、ブロッカー、及びプローブの濃度は表２ａに掲載する。

２つのＫ−ｒａｓ変異体に関する、ＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲアッセイの各プライマー、ブロッカーオリゴヌクレオチド及びプローブの最終濃度は表１ｂ及び２ｂに掲載する。アッセイは次のとおりに構成した：２０ｎｇの不均質なＤＮＡ混合物を使用し、反応時最終容量２０μＬで実施した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現マスターキットを使用し、ＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲを実施した。各反応物は１０．０μＬの２×ＰＣＲマスターミックス、２μＬの１０ｘプライマー／ブロッカー／プローブミックス、及び２μＬの１０ｎｇ／μＬ総ＤＮＡサンプルから構成した。ＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲアッセイは次のとおりに実施した：標準モード下で、９５℃で１０分間の変性を１サイクル、９５℃で２０秒間の変性及び状況により６０℃で４５秒間のアニーリング及び伸長を４０サイクル実施。

刊行物（７）において提案されているＡＳＰ濃度と一致するものとして、４ｘセンターブロッカーオリゴヌクレオチド濃度を用いたことを除き、末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ方法と同様のＰＣＲ条件でＫ−ｒａｓのセンターブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＰＣＲ方法を実施した。

ＥＧＦＲ変異に関する、ＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲアッセイの各プライマー、ブロッカーオリゴヌクレオチドおよびプローブの最終濃度は表１ｃ及び２ｃに掲載する。アッセイの構成は、ＤＮＡテンプレートを除きＫ−ｒａｓ変異アッセイのものと同様であった。ＤＮＡサンプルはＮＣＩ−Ｈ１９７５及びＮＣＩ−Ｈ３５８の不均質な混合物であった。ＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲアッセイは次のとおりに実施した：標準モード下で、９５℃で１０分間の変性を１サイクル、９５℃で２０秒間の変性及び状況により６３℃で４５秒間のアニーリング及び伸長を４０サイクル実施。

データ分析
末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ検出のＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）及びＫ−ｒａｓ（Ｇ１２Ｖ又はＧ１３Ｄ）感受性／特異性は、関連する変異細胞株ＤＮＡ（上記細胞株サンプルの節に記載）を細胞株ＳＫＢＲ３の野生型ＤＮＡに希釈して用いることにより評価した。変異体ＤＮＡの希釈は５％、１％、０．５％及び０．１％で行い、データは、ＡＢＩ７５００ｆａｓｔＳｙｓｔｅｍＳＤＳソフトウェア（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により回収及び解析した。センターブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ法及び末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ法の両方で同様の解析方法を使用した。マニュアル閾値（manual threshold）を０．１及びベースライン５〜１５によりデータを解析し、ＦＡＭ及びＶＩＣチャネルの両方に関しＣ_Ｔ値を得た。アクチンのＣ_Ｔ値が２７以下であり、特異的変異遺伝子のＣ_Ｔが３７（最大３コピー）以下であり、すべてのテンプレート非添加対照（ＮＴＣ）のＣ_Ｔが未検出である場合、アッセイは妥当であるものとみなされる。

ＰＣＲのアリコートは、１００塩基の分子マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いアガロースゲル電気泳動でも解析した。増幅後には、対応する陽性サンプル由来の特異的ＰＣＲ産物が１種存在すべきである。

配列解析
ＢＲＡＦＶ６００ＥにおいてＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲにより検出された変異を、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅｄｙｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｃｙｃｌｅ配列決定キット（ＢｉｇＤｙｅ；ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する直接配列決定法により確認した。細胞株（２０ｎｇ）及びＦＦＰＥ（５０ｎｇ）。変異を含有するＤＮＡサンプルを、ＡＳ−ＮＥＰＢ２−ＰＣＲ−２と同様のＰＣＲ条件下で、配列プライマー（表１ａ）を使用する非−ＡＳ−ＰＣＲにより増幅させた。配列を確認するため、ＰＣＲ増幅産物をＧＥＮＥＷＩＺ（ＳｏｕｔｈＰｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ，ＵＳ）に送付した。製造元の指示に従って、ＡＢＩ３７３０ｘｌＤＮＡＡｎａｌｙｚｅｒで配列決定を行い、ＡＢＩＰＲＩＳＭＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ解析ソフトウェア（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して解析した。

結果及び考察
ＢＲＡＦＶ６００Ｅ遺伝子変異の検出の際、最初に、Ｋ−ｒａｓ変異検出に関する刊行物（７）からのセンターブロッカーオリゴ（ＣＢＯ）法を適用した。ＡＳＰ及びブロッカーの設計は論文に掲載される基準に従った。ＢＲＡＦ変異遺伝子の検出感度を０．１％に到達させる目的で、複数のアッセイ条件を試験した。我々は、各種アニーリング温度（５８、６０、６２、６４及び６５℃）及びＡＳＰ：ＰＢ比（１：４、１：２及び１：１）を滴定することによりアッセイ条件の最適化を試みた。しかしながら、野生型テンプレートに対する非特異的増幅以外に、変異検出感度を０．１％に到達させることができた条件はなかった。各ＣＢＯに関し、１つの条件下で結果を観察した。ＣＢＯ−１由来の非特異的増幅は除き検出感度０．５％を得た（６４℃及び１：１比）ものの、０．５％時のＣ_Ｔが３６を超過していた。検出感度０．１％を有する場合、ＣＢＯ−２は一貫して非特異的増幅（６４℃及び１：２比）を得た（表３）。

他の条件下では、ブロッカーの濃度を増加させるか、又はアニーリング温度を増加させることによりＡＳ−ＰＣＲ反応をブロックされた；ブロッカー濃度又はアニーリング温度を減少させた場合にはより非特異的増幅が生じた（データ不掲載）。更に、ＣＢＯ法は、プライマー、ブロッカー及びプローブの配列が一部重なりあうこと、ブロッカーがオリゴヌクレオチドの中央の塩基を判別すること、Ｔｍ（長さ）が異なることを必要とするため、ＢＲＡＦ遺伝子オリゴの選択及びアッセイ条件の最適化には困難さが伴ったものの、この方法はＫ−ｒａｓ変異アッセイでは成功した。

ＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ法に基づき末端ブロッカーオリゴヌクレオチド（ＥＢＯ）を開発して検出感度を改良し、ＢＲＡＦ遺伝子変異検出アッセイに関する非特異的増幅を除去した。対応する順方向ＡＳプライマー、ＢＲＡＦ−ＡＳ−順方向プライマー１及び２を用い、ＥＢＯ、ＥＢＯ−１及びＥＢＯ−２を２組設計し、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ対立遺伝子変異体に関し評価した。多型部位の下流に共通の逆転写プライマー及びプローブを設計し、ＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲにおいて使用した。ＡＳＰ及びＮＥＰＢのの両方のＴｍ；ＮＥプライマーブロッカー１のアニーリング温度（６４及び６５℃）及びＡＳＰ：ＥＢＯ比（１：１又は１：２）並びにＮＥプライマーブロッカー２のアニーリング温度（５６、５８及び６０℃）及びＡＳＰ：ＥＢＯ（７：１又は３：１）比が同様であることに起因し、一部のアッセイ条件を試験する必要があった。アニーリング温度のスクリーニングは、ＡＳＰのＴｍと近くなるように選択した（表１ａ）。ＡＳＰ：ＥＢＯスクリーニング比は、末端ブロッカーオリゴヌクレオチドは集計せずにＡＳ−ＰＣＲから生成されたデータをもとに決定した（表３）。末端ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在しないＢＲＡＦ−ＡＳ−順方向プライマー２は、野生型ＤＮＡの使用量が５０ｎｇを超える場合に非特異的増幅をもたらしたことから（データ不掲載）、必要とされたＥＢＯはより少なかった。

この結果から、末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲを組み込むことにより、野生型ＤＮＡを非特異的増幅せずにＡＳ−ＰＣＲの感度が増強されることが実証された。ＣＢＯ法よりも良好に実施された（表３）。末端ブロッカーオリゴヌクレオチドをもとにしたＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ法は、強力な対立遺伝子特異的増幅も示し、ＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲアッセイの両方において、不均質な混合物の１０００コピーの正常ＤＮＡバックグラウンド中１コピーの変異体ＤＮＡを検出した（変異頻度０．１％及び変異体コピー２〜３）。ＥＢＯ−２を有するＢＲＡＦ−ＡＳ−順方向プライマー−２（ＡＳ−ＮＥＰＢ２−ＰＣＲ−２）は、野生型及び変異型対立遺伝子を区別するのに最良の結果をもたらした。ここで、ΔＣ_Ｔは、ＳＫＢＲ３野生型細胞株Ｃ_Ｔと、ＨＴ２９変異型／ＳＫＢＲ３野生型株混合細胞株Ｃ_Ｔとの間の差として算出される。ＡＳ−ＮＥＰＢ２−ＰＣＲ−２の使用により、０．１％変異体の検出感度が再現可能であったこと（変異体３〜５コピーまで減少）及び野生型特異性が非検出であったこと（最大で野生型細胞株ＤＮＡ５０ｎｇ）が得られた（表４）。１７５ｎｇの野生型組織ＤＮＡについては野生型特異性が非検出であったことも観察された（データ不掲載）。ゲル画像において、５％〜０．１％変異体反応物からは単一の鮮明なバンドが得られ、ＳＫＢＲ３ＷＴＡＳ−ＮＥＰＢ２−ＰＣＲ−２の反応物からは、アクチンのＰＣＲ産物を除きＰＣＲ産物は観察されなかった（図４）。

代表的な直接配列決定法を使用して、細胞株及びＦＦＰＥ組織ＤＮＡサンプルの両方においてＡＳ−ＮＥＰＢ２−ＰＣＲ−２方法を確認した。配列データをもとにＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ法を使用することにより１００％の感度及び特異性が得られた（表５）。

２つのＫＲＡＳ遺伝子変異体（ｐ．Ｇ１２Ｖ；Ｇ＞Ｔ及びｐ．Ｇ１３Ｄ；１３Ｇ＞Ａ）に対しても末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ方法を検証し、センターブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＰＣＲ法と比較した。少数のＡＳＰ対末端ブロッカーオリゴヌクレオチド比を試験して、末端ブロッカーオリゴヌクレオチドの最良濃度を得た。刊行物（７）により提供されるアニーリング温度６０℃下で、論文に記載のものと同様のＡＳプライマーを使用した。ＫｒａｓＧ１２Ｖ及びＧ１３Ｄ変異型遺伝子検出アッセイのいずれもで、ＡＳＰ対末端ブロッカーオリゴヌクレオチドが１：１比である場合に最良の結果、すなわち野生型ＤＮＡの非特異的増幅はせずに検出感度０．１％（最大５コピー）が観察された（表６ａ、６ｂ、及び６ｃ）。我々は、同一の反応条件下で、末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ法及びセンターブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＰＣＲ法を試験した。等価のアッセイ性能が得られた（表７及び図５ａ及び５ｂ）。末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ方法から、２つのＫ−ｒａｓ０．１％（最大５コピー）変異型に関する３つの独立試行において＜３％ＣＶの良好なアッセイ精度が得られた。

ｉｎｖｅｒｔｅｄｄＴ又はアミノ−Ｃ７により修飾した末端ブロッカーオリゴヌクレオチドも評価した。リン酸塩による３’末端の修飾と等価のアッセイ性能が得られた（表８）。

我々は、４２の臨床サンプル、すなわち循環性結腸直腸腫瘍細胞に対し、末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ法を試験した。２つの組織サンプル及び１つのＣＴＣサンプルにおいてＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）を検出した。これは配列決定データと一致した。組織及びＣＴＣサンプルの両方で非特異的増幅は観察されなかった。これは配列決定データと一致した（表９）。

ＥＧＦＲ遺伝子（ｅｘｏｎ２１＿Ｌ８５８Ｒ）変異検出で、末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ法も試験した。この結果により、末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに対するＡＳＰ比１：１及びアニーリング温度６３℃にて非特異的増幅せずに０．１％の変異（最大５コピー）が検出されたことが示された（表１０及び図６）。独立した３つの試行により、５％、１％及び０．１％から、良好なアッセイ精度、＜２％ＣＶが得られた。

３つの異なる遺伝子（Ｂ−Ｒａｆ、Ｋ−Ｒａｓ及びＥＧＦＲ）及び４つの変異型の（Ｖ６００Ｅ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ及びＬ８５８Ｒ）検出には、末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ方法が効果的に採用された。ＡＳＰとほとんど同様の融解温度（Ｔｍ）をもたらす対立遺伝子特異的プライマーと同様のストランド及び長さを有する末端ブロッカーオリゴヌクレオチドの設計の利点に起因し、アッセイのそれぞれに関し、最適なアッセイ条件を容易に決定した。我々は、（１）通常、２つのアニーリング温度はＴｍ近傍、すなわちＡＳＰのＴｍの１℃下及び１℃上であることのみが必要とされること、並びに（２）ＡＳＰ：ブロッカー比が１：１であることが、最適なアッセイ条件を得るために最も好適であることを見出した。

結論として、非常に不均質なサンプルにおける変異検出に関し、末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ法は高感度でありかつ特異的方法である。これに加え、末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ法は、アッセイ設計及びアッセイ最適化の単純化において他のブロッキング法を上回る重大な利点を提供する。末端ブロッカーオリゴヌクレオチドに基づくＡＳ−ＮＥＰＢ−ＰＣＲ法は、数多くの異なる変異体のアッセイを開発する必要がある場合に有効なワークフローとなる。

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〔実施の態様〕
（１）野生型配列の存在下で、ある位置における置換、欠失又は挿入のうちの少なくとも１つ又は２つ以上に起因する１つ又は２つ以上の変異により定義される変異核酸配列を検出し、かつ前記野生型配列に起因するシグナルを抑制するための方法であって、
対立遺伝子特異的プライマーの３’末端が、ミスマッチを有さずに少なくとも１つの変異が生じている核酸部位と整列されるよう、前記変異核酸配列の一部に一致する前記対立遺伝子特異的プライマーを選択する工程、
末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチド（edge-blocker wild type oligonucleotide）の３’末端が、３’末端に又は３’末端付近に少なくとも１つのミスマッチを有するよう、前記野生型配列に一致する前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドを選択する工程であって、更には、おそらくはＣＢＯ法と類似して、前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの３’末端をブロックして該オリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応において非伸長性とする、工程、
１つ又は２つ以上の逆方向プライマーを選択する工程、
１つ又は２つ以上のプローブを選択して、前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物を検出する工程、並びに
前記対立遺伝子特異的プライマー、前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチド、前記１つ又は２つ以上の逆方向プライマー、及び前記１つ又は２つ以上のプローブを含む成分により前記ポリメラーゼ連鎖反応を実施する工程、を含む、方法。
（２）前記１つ又は２つ以上のプローブの少なくとも１つが、前記ポリメラーゼ連鎖反応の開始後に添加される、実施態様１に記載の方法。
（３）前記変異核酸配列及び前記野生型配列が、逆転写酵素により生成される、実施態様１に記載の方法。
（４）前記１つ又は２つ以上の変異が、２つの隣接する点変異を含む、実施態様１に記載の方法。
（５）前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドの、ブロックされた３’末端に直接隣接する前記３塩基対のうちの少なくとも１つにミスマッチを有する、実施態様１に記載の方法。

（６）前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの長さが、前記対立遺伝子特異的プライマーの長さと等しい、実施態様１に記載の方法。
（７）前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの長さが、該オリゴヌクレオチドの５’末端において前記対立遺伝子特異的プライマーの長さよりも長い、実施態様１に記載の方法。
（８）前記対立遺伝子特異的プライマーの溶融温度が、前記野生型配列に対する前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの溶融温度以上である、実施態様１に記載の方法。
（９）前記対立遺伝子特異的プライマーの溶融温度が、前記野生型配列に対する前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの溶融温度よりも低い、実施態様１に記載の方法。
（１０）前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドが、前記対立遺伝子特異的プライマーと同濃度以下で存在することにより、前記ポリメラーゼ連鎖反応中の前記野生型配列の増幅がブロッキングされる、実施態様１に記載の方法。

（１１）前記変異核酸配列の検出が、前記野生型配列に対し前記変異核酸配列の濃度（level）を評価するための定量を含む、実施態様１に記載の方法。
（１２）前記変異核酸配列が、腫瘍細胞型に相当する、実施態様１に記載の方法。
（１３）前記変異核酸配列が、転移性細胞疾患に相当する、実施態様１に記載の方法。
（１４）変異核酸配列を保有する患者由来のサンプルにおいて、野生型細胞の存在下で、１つ又は２つ以上の変異細胞の存在を検出するという手法による（by way to detecting）がんの早期発見のための診断法であって、
対立遺伝子特異的プライマーの３’末端が、ミスマッチを有さない一方で、少なくとも１つの変異が生じている核酸部位と整列されるよう、前記変異核酸配列の一部に一致する前記対立遺伝子特異的プライマーを選択する工程、
末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの３’末端が、３’末端に又は３’末端付近に少なくとも１つのミスマッチを有するよう、前記野生型配列に一致する前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドを選択する工程であって、更には、前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの３’末端をブロックして該オリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応において非伸長性とする、工程、
１つ又は２つ以上の逆方向プライマーを選択する工程、
１つ又は２つ以上のプローブを選択して前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物を検出する工程、
前記対立遺伝子特異的プライマー、前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチド、前記１つ又は２つ以上の逆方向プライマー、及び前記１つ又は２つ以上のプローブを含む成分により前記ポリメラーゼ連鎖反応を実施する工程、並びに
前記サンプル中に前記変異核酸配列が存在する場合に、がんの初期段階を検出する工程、を含む、方法。
（１５）前記変異核酸配列と一致する増幅産物が、事前に規定された増幅サイクル数未満で検出された場合、前記変異核酸配列の存在が検出される、実施態様１４に記載の方法。

（１６）前記変異核酸配列と一致する増幅産物が検出され、かつ同じサンプルにおいて参照変異配列が検出されない場合、前記変異核酸配列の存在が検出される、実施態様１４に記載の方法。
（１７）前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの３’末端が、ヒドロキシル基を有さないことから、該末端がＰＣＲ反応において伸長からブロックされる、実施態様１又は１４に記載の方法。
（１８）前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの３’末端が、前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシル基を、リン酸、ｉｎｖｅｒｔｅｄｄＴ及びアミノ−Ｃ７からなる群から選択される１つ又は２つ以上により誘導体化する又は置き換えることによりブロックされる、実施態様１４に記載の方法。

Claims

野生型配列の存在下で、ある位置における置換、欠失又は挿入のうちの少なくとも１つ又は２つ以上に起因する１つ又は２つ以上の変異により定義される変異核酸配列を検出し、かつ前記野生型配列に起因するシグナルを抑制するための方法であって、
対立遺伝子特異的プライマーの３’末端が、ミスマッチを有さずに少なくとも１つの変異が生じている核酸部位と整列されるよう、前記変異核酸配列の一部に一致する前記対立遺伝子特異的プライマーを選択する工程、
末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの３’末端が、３’末端に又は３’末端付近に少なくとも１つのミスマッチを有するよう、前記野生型配列に一致する前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドを選択する工程であって、更には、おそらくはＣＢＯ法と類似して、前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの３’末端をブロックして該オリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応において非伸長性とする、工程、
１つ又は２つ以上の逆方向プライマーを選択する工程、
１つ又は２つ以上のプローブを選択して、前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物を検出する工程、並びに
前記対立遺伝子特異的プライマー、前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチド、前記１つ又は２つ以上の逆方向プライマー、及び前記１つ又は２つ以上のプローブを含む成分により前記ポリメラーゼ連鎖反応を実施する工程、を含む、方法。
前記１つ又は２つ以上のプローブの少なくとも１つが、前記ポリメラーゼ連鎖反応の開始後に添加される、請求項１に記載の方法。
前記変異核酸配列及び前記野生型配列が、逆転写酵素により生成される、請求項１に記載の方法。
前記１つ又は２つ以上の変異が、２つの隣接する点変異を含む、請求項１に記載の方法。
前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドの、ブロックされた３’末端に直接隣接する前記３塩基対のうちの少なくとも１つにミスマッチを有する、請求項１に記載の方法。
前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの長さが、前記対立遺伝子特異的プライマーの長さと等しい、請求項１に記載の方法。
前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの長さが、該オリゴヌクレオチドの５’末端において前記対立遺伝子特異的プライマーの長さよりも長い、請求項１に記載の方法。
前記対立遺伝子特異的プライマーの溶融温度が、前記野生型配列に対する前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの溶融温度以上である、請求項１に記載の方法。
前記対立遺伝子特異的プライマーの溶融温度が、前記野生型配列に対する前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの溶融温度よりも低い、請求項１に記載の方法。
前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドが、前記対立遺伝子特異的プライマーと同濃度以下で存在することにより、前記ポリメラーゼ連鎖反応中の前記野生型配列の増幅がブロッキングされる、請求項１に記載の方法。
前記変異核酸配列の検出が、前記野生型配列に対し前記変異核酸配列の濃度を評価するための定量を含む、請求項１に記載の方法。
前記変異核酸配列が、腫瘍細胞型に相当する、請求項１に記載の方法。
前記変異核酸配列が、転移性細胞疾患に相当する、請求項１に記載の方法。
変異核酸配列を保有する患者由来のサンプルにおいて、野生型細胞の存在下で、１つ又は２つ以上の変異細胞の存在を検出するという手法によるがんの早期発見のための診断法であって、
対立遺伝子特異的プライマーの３’末端が、ミスマッチを有さない一方で、少なくとも１つの変異が生じている核酸部位と整列されるよう、前記変異核酸配列の一部に一致する前記対立遺伝子特異的プライマーを選択する工程、
末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの３’末端が、３’末端に又は３’末端付近に少なくとも１つのミスマッチを有するよう、前記野生型配列に一致する前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドを選択する工程であって、更には、前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの３’末端をブロックして該オリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応において非伸長性とする、工程、
１つ又は２つ以上の逆方向プライマーを選択する工程、
１つ又は２つ以上のプローブを選択して前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物を検出する工程、
前記対立遺伝子特異的プライマー、前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチド、前記１つ又は２つ以上の逆方向プライマー、及び前記１つ又は２つ以上のプローブを含む成分により前記ポリメラーゼ連鎖反応を実施する工程、並びに
前記サンプル中に前記変異核酸配列が存在する場合に、がんの初期段階を検出する工程、を含む、方法。
前記変異核酸配列と一致する増幅産物が、事前に規定された増幅サイクル数未満で検出された場合、前記変異核酸配列の存在が検出される、請求項１４に記載の方法。
前記変異核酸配列と一致する増幅産物が検出され、かつ同じサンプルにおいて参照変異配列が検出されない場合、前記変異核酸配列の存在が検出される、請求項１４に記載の方法。
前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの３’末端が、ヒドロキシル基を有さないことから、該末端がＰＣＲ反応において伸長からブロックされる、請求項１又は１４に記載の方法。
前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの３’末端が、前記末端ブロッカー野生型オリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシル基を、リン酸、ｉｎｖｅｒｔｅｄｄＴ及びアミノ−Ｃ７からなる群から選択される１つ又は２つ以上により誘導体化する又は置き換えることによりブロックされる、請求項１４に記載の方法。