JP7279633B2 - 核酸の検出方法 - Google Patents

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Description

核酸を検出する技術が開示される。
核酸を検出する方法として、ポリメラーゼ連鎖反応法（所謂、ＰＣＲ法：polymerase chain reaction）を用いて標的核酸を増幅した後、前記核酸を検出する方法が広く知られている。検出方法としては、アガロース電気泳動法や、蛍光法（所謂、リアルタイムＰＣＲ法）や、核酸クロマト法が広く知られている。例えば、特許文献１及び２には、リアルタイムＰＣＲ法を用いた遺伝子の検出方法が開示されている。また、特許文献３には、核酸クロマト法を用いた遺伝子の検出方法が開示されている。
特開平５－１８４３９７ 特表平１０－５１０９８２ ＷＯ２００９－０３４８４２
しかし、従来存在する核酸を検出する方法は種々の観点で改善の余地があった。例えば、アガロース電気泳動法は、定性評価（＋－判定）は可能なものの、定量評価は困難であった。リアルタイムＰＣＲ法は、測定感度は十分であるものの、専用の大型装置が必要であり、操作性、及び／又は測定時間等の観点で改善の余地があった。また、核酸クロマト法は、操作性、測定時間は十分であるものの、測定感度に改善の余地があった。そこで、効率的に核酸を検出するための新たな技術を提供することが１つの課題である。
上記課題を解決する代表的な手段は下記のとおりである。
項１．
標的核酸の検出方法であって、
（１）標的核酸にハイブリダイズする標識された捕捉核酸プローブ、及び標的核酸にハイブリダイズする標識された検出核酸プローブを準備する工程、
（２）標的核酸を含む試料と捕捉核酸プローブを混合し、標的核酸に捕捉核酸プローブをハイブリダイズさせる工程、
（３）標的核酸を含む試料と検出核酸プローブを混合し、標的核酸に検出核酸プローブをハイブリダイズさせる工程、
（４）捕捉核酸プローブの標識を特異的に認識する捕捉抗体が固定化された反応器に、捕捉核酸プローブがハイブリダイズした標的核酸を添加し、標的核酸を捕捉抗体に結合させる工程、
（５）反応器を洗浄し、標的核酸にハイブリダイズしていない検出核酸プローブを除去する工程、及び
（６）検出核酸プローブの標識を検出する工程
を含む、方法。
項２．
工程（２）～工程（４）をｐＨ７．６～９．０の緩衝液中で行う、項１に記載の方法。
項３．
捕捉核酸プローブは、標的核酸に相補的な領域（相補的領域）、及び相補的領域の末端に標的核酸と非相補的な核酸領域（リンカー領域）を有し、リンカー領域の相補的領域と隣接していない側の末端が標識されている、項１又は２に記載の方法。
項４。
検出核酸プローブは、標的核酸に相補的な領域（相補的領域）、及び相補的領域の末端に標的核酸と非相補的な核酸領域（リンカー領域）を有し、リンカー領域の相補的領域と隣接していない側の末端が標識されている、項１～３のいずれかに記載の方法。
項５．
捕捉核酸プローブのリンカー領域が３～１５ヌクレオチド残基からなる、項１～４のいずれかに記載の方法。
項６．
検出核酸プローブのリンカー領域が３～１５ヌクレオチド残基から成る、項１～５のいずれかに記載の方法。
項７．
捕捉核酸プローブの相補的領域のＴｍ値が４５～７５℃である、項１～６のいずれかに記載の方法。
項８．
検出核酸プローブの相補的領域の Ｔｍ値が４５～７５℃である、項１～７のいずれかに記載の方法。
項９．
捕捉核酸プローブの標識がビオチン、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、蛍光物質から成る群より選択され、且つ、検出核酸プローブの標識とは異なる、項１～８のいずれかに記載の方法。
項１０．
検出核酸プローブの標識がビオチン、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、蛍光物質から成る群より選択され、且つ、捕捉核酸プローブの標識とは異なる、項１～９のいずれかに記載の方法。
項１１．
蛍光物質がフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、シアニン及びその誘導体から成る群より選択される、項９または１０に記載の方法。
項１２．
工程（６）が、検出核酸プローブの標識を特異的に認識し、且つ、標識された検出抗体を、検出核酸プローブに結合させる工程を含む、項１～１１のいずれかに記載の方法。
項１３．
検出抗体の標識がアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）から成る群より選択される、項１～１２のいずれかに記載の方法。
項１４．
検出抗体が、ウサギ抗体、マウス抗体、及びラット抗体から成る群より選択される、項１２又は１３に記載の方法。
項１５．
捕捉抗体が固定化された反応器がカゼイン、及びＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＢＰＦ）から成る群より選択されるブロッキング剤でブロッキングされている、項１～１４のいずれかに記載の方法。
項１６．
ブロッキング剤が、さらにｄＮＴＰｓを含有する、項１５に記載の方法。
項１７．
標的核酸を検出するためのシステムであって、
標的核酸 にハイブリダイズする標識された捕捉核酸プローブ、及び標的核酸にハイブリダイズする標識された検出核酸プローブを含み、
項１～１５のいずれかに記載の方法を用いるシステム。
標的とする核酸を効率的に検出する手段が提供される。効率的とは、簡便、短時間、及び／又は検出感度が優れることを意味する。一実施形態において、標的核酸を含む試料の準備から標的核酸の検出までを２０分以内（好ましくは、１５分以内、又は１０分以内）で行うことが好ましい。
標的核酸及び各試薬を収容するためのカートリッジの例を示す。
標的核酸を検出する方法は、下記の工程（１）～（６）を含むことが好ましい。
（１）標的核酸にハイブリダイズする標識された捕捉核酸プローブ、及び標的核酸にハイブリダイズする標識された検出核酸プローブを準備する工程
（２）標的核酸を含む試料と捕捉核酸プローブを混合し、標的核酸に捕捉核酸プローブをハイブリダイズさせる工程
（３）標的核酸を含む試料と検出核酸プローブを混合し、標的核酸に検出核酸プローブをハイブリダイズさせる工程
（４）捕捉核酸プローブの標識を特異的に認識する捕捉抗体が固定化された反応器に、捕捉核酸プローブがハイブリダイズした標的核酸を添加し、標的核酸を捕捉抗体に結合させる工程
（５）反応器を洗浄し、標的核酸にハイブリダイズしていない検出核酸プローブを除去する工程
（６）検出核酸プローブの標識を検出する工程
検出対象である標的核酸の種類は特に制限されず任意の核酸であり得る。標的核酸には、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッド鎖、及び人工核酸等が含まれる。標的核酸は、一本鎖でも二本鎖でもよい。一実施形態において、核酸は一本鎖であることが好ましい。核酸が二本鎖である場合、一本鎖に解離させる熱処理を行うことが好ましい。ＤＮＡは、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又は合成ＤＮＡであり得る。ＲＮＡは、例えば、ｒＲＮＡ，ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ又は合成ＲＮＡであり得る。人工核酸には、例えば、ペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸、Ｓ－オリゴ核酸、及びＢＮＡ（ＬＮＡ）が含まれる。核酸の由来も任意であり、特に制限されない。核酸は、例えば、ウイルス、微生物、植物、又は動物に由来し得る。動物には、ヒト及び非ヒト動物が含まれる。標的核酸の大きさ（塩基長）は任意であり特に制限されない。
標的核酸は、任意の形態の試料中に存在し得る。試料は、例えば、実験生物、培養細胞、ヒトや動物などの臨床検査に供される検体（例えば、尿、糞便、全血、血漿、唾液、口腔内擦過物、鼻腔液、鼻腔ぬぐい液、膣ぬぐい液、及び尿道擦過物等）、衛生管理に供される検体（例えば、吐しゃ物、ふき取りサンプル、及び食品材料等）、並びに、環境測定に供される検体（例えば、河川水、海水、土壌、空気からの捕集物等）等であり得る。
試料中の核酸の濃度は、高濃度であるほど検出は容易であるが、低濃度であっても検出可能である。一実施形態において試料中の核酸濃度は、０．０１ｐＭ以上が好ましく、よりこの好ましくは０．１ｐＭ以上、さらに好ましくは１ｐＭ以上である。試料中の核酸の濃度の上限は任意であるが、例えば、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、又は１０ｎＭ以下とすることができる。
「標的核酸にハイブリダイズする標識された捕捉核酸プローブ」は、標的核酸にハイブリダイズ可能であるように標的核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有し、標識されていることが好ましい。捕捉核酸プローブの構造は、特に制限されず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの混合、ＰＮＡ、ＢＮＡ（ＬＮＡ）、及びこれらの任意の組み合わせ等のいずれでもよい。これらの核酸は、任意の手法で調製（合成）することができる。捕捉核酸プローブの大きさ（塩基長）は、標的核酸にハイブリダイズ出来る限り任意であり、例えば、１０塩基以上４０塩基以下の範囲で設計することができる。一実施形態において、捕捉核酸プローブの大きさは、１１塩基以上、１２塩基以上、１３塩基以上、１４塩基以上、１５塩基以上、１６塩基以上、１７塩基以上、１８塩基以上、１９塩基以上又は２０塩基以上であり、３９塩基以下、３８塩基以下、３７塩基以下、３６塩基以下、３５塩基以下、３４塩基以下、３３塩基以下、３２塩基以下、３１塩基以下、又は３０塩基以下である。捕捉核酸プローブの塩基配列は、標的核酸とハイブリダイズできる限り任意であり、標的核酸の塩基配列に対して完全に相補的である必要はない。一実施形態において、捕捉核酸プローブの塩基配列は標的核酸の塩基配列に完全に相補的であることが好ましい。捕捉核酸プローブの塩基配列と相補的な標的核酸における領域は、検出核酸プローブの塩基配列と相補的な標的核酸における領域と異なる（重複していない）ことが好ましい。各プローブが認識する領域の位置関係は、各プローブの標識同士の立体障害により、ハイブリダイズが阻害されることを回避するため、互いに１０塩基以上離れていること好ましく、２０塩基以上離れていることがより好ましく、３０塩基以上離れていることがさらに好ましい。
捕捉核酸プローブの標識の種類は任意であり、それを介して捕捉核酸プローブ及び標的核酸を反応器に固定化することを可能にする物質であることが好ましい。一実施形態において、捕捉核酸プローブ標識は、抗体が結合可能な物質（抗原）であることが好ましい。そのような物質としては、例えば、ビオチン、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、及び蛍光物質等を挙げることができる。蛍光物質の種類は特に制限されず、例えば、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにシアニン及びその誘導体等が含まれ、これらは当該技術分野において広く知られている。一実施形態において、標識は、ビオチンであることが好ましい。これらの物質を用いた核酸の標識は任意の手法で行うことができる。
捕捉核酸プローブにおいて標識されている部位は任意である。一実施形態において、捕捉核酸プローブは、それを構成する核酸鎖の３’末端残基又は５’末端残基において標識されていることが好ましい。一実施形態において、捕捉核酸プローブは、その５’末端残基が標識されていることが好ましい。
捕捉核酸プローブは、標的核酸に相補的な領域（相補的領域）、及び相補的領域の末端に、それと隣接して標的核酸と非相補的な核酸領域（リンカー領域）を有し、リンカー領域において標識されていることが好ましい。一実施形態において、捕捉核酸プローブは、リンカー領域の相補的領域と隣接していない側の末端残基が標識されていることが好ましい。リンカー領域は、標的核酸における対応する位置の塩基の種類と非相補的な塩基で構成され、標的核酸とハイブリダイズしないことが好ましい。リンカー領域の大きさ（ヌクレオチド残基長）は特に制限されず、例えば、３～１５塩基が好ましく、３～１０塩基がより好ましく、３～７塩基がさらに好ましい。リンカー領域の大きさが２塩基以下だと標識物質の立体障害によりハイブリダイズが阻害される恐れがある。一方、リンカー領域の大きさが１６塩基以上だとコストが上がるだけでなく、予期せぬ二次構造（立体構造）をとり、かえってハイブリダイゼイズが阻害される恐れがある。
捕捉核酸プローブは、そのＴｍ値が４５℃以上７５℃以下であることが好ましい。一実施形態において、捕捉核酸プローブのＴｍ値は５０℃以上、又は５５℃以上であることが好ましい。他の実施形態において、捕捉核酸プローブのＴｍ値は、検出核酸プローブのＴｍ値との差が±１５℃以下、１０℃以下、又は５℃以下であることが好ましい。ここで、Ｔｍ値は、捕捉核酸プローブと標的核酸とをハイブリダイズさせる緩衝液中でのＴｍ値を意味する。Ｔｍ値は、任意の手法で測定でき、例えば、捕捉核酸プローブと標的核酸を含む緩衝液の吸光度（例えば、２６０ｎｍにおける吸光度）を測定することによって求めることができる。
「標的核酸にハイブリダイズする標識された検出核酸プローブ」は、標的核酸にハイブリダイズ可能であるように標的核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有し、その存在を検出可能な物質で標識されていることが好ましい。検出核酸プローブの構造は、特に制限されず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの混合、ＰＮＡ、ＢＮＡ（ＬＮＡ）、及びこれらの任意の組み合わせ等のいずれでもよい。これらの核酸は、任意の手法で調製（合成）することができる。検出核酸プローブの大きさ（塩基長）は、標的核酸にハイブリダイズ出来る限り任意であり、例えば、１０塩基以上４０塩基以下の範囲で設計することができる。一実施形態において、検出核酸プローブの大きさは、１１塩基以上、１２塩基以以上、１３塩基以上、１４塩基以上、１５塩基以上、１６塩基以上、１７塩基以上、１８塩基以上、１９塩基以上又は２０塩基以上であり、３９塩基以下、３８塩基以下、３７塩基以下、３６塩基以下、３５塩基以下、３４塩基以下、３３塩基以下、３２塩基以下、３１塩基以下、又は３０塩基以下である。検出核酸プローブの塩基配列は、標的核酸とハイブリダイズできる限り任意であり、標的核酸の塩基配列に対して完全に相補的である必要はない。一実施形態において、検出核酸プローブの塩基配列は標的核酸の塩基配列に完全に相補的であることが好ましい。捕捉核酸プローブの塩基配列と相補的な標的核酸における領域は、検出核酸プローブの塩基配列と相補的な標的核酸における領域と異なる（重複していない）ことが好ましい。
検出核酸プローブの標識の種類は、それを介して検出核酸プローブ及び標的核酸を検出することを可能にする物質である限り任意である。一実施形態において、検出核酸プローブの標識は、抗体が結合可能な物質（抗原）であることが好ましい。そのような物質としては、例えば、ビオチン、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、及び蛍光物質等を挙げることができる。蛍光物質の種類は特に制限されず、例えば、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにシアニン及びその誘導体等が含まれ、これらは当該技術分野において広く知られている。一実施形態において、標識は蛍光色素であることが好ましい。これらの物質を用いた核酸の標識は任意の手法で行うことができる。
検出核酸プローブにおいて標識されている部位は任意である。一実施形態において、検出核酸プローブは、それを構成する核酸鎖の３’末端残基又は５’末端残基が標識されていることが好ましい。一実施形態において、検出核酸プローブは、その５’末端残基が標識されていることが好ましい。
検出核酸プローブは、標的核酸に相補的な領域（相補的領域）、及び相補的領域の末端に、それと隣接して標的核酸と非相補的な核酸領域（リンカー領域）を有し、リンカー領域において標識されていることが好ましい。一実施形態において、検出核酸プローブは、リンカー領域の相補的領域と隣接していない側の末端残基が標識されていることが好ましい。リンカー領域は、標的核酸における対応する位置の塩基の種類と非相補的な塩基で構成され、標的核酸とハイブリダイズしないことが好ましい。リンカー領域の大きさ（ヌクレオチド残基長）は特に制限されず、例えば、３～１５塩基が好ましく、３～１０塩基がより好ましく、３～７塩基がさらに好ましい。リンカー領域の大きさが２塩基以下だと標識物質の立体障害によりハイブリダイズが阻害される恐れがある。一方、リンカー領域の大きさが１６塩基以上だとコストが上がるだけでなく、予期せぬ二次構造（立体構造）をとり、かえってハイブリダイゼイズが阻害される恐れがある。
検出核酸プローブは、そのＴｍ値が４５℃以上７５℃以下であることが好ましい。一実施形態において、検出核酸プローブのＴｍ値は５０℃以上、又は５５℃以上であることが好ましい。他の実施形態において、検出核酸プローブのＴｍ値は、捕捉核酸プローブのＴｍ値との差が±１５℃以下、１０℃以下、又は５℃以下であることが好ましい。ここで、Ｔｍ値は、検出核酸プローブと標的核酸とをハイブリダイズさせる緩衝液中でのＴｍ値を意味する。Ｔｍ値は、任意の手法で測定でき、例えば、検出核酸プローブと標的核酸を含む緩衝液の吸光度（例えば、２６０ｎｍにおける吸光度）を測定することによって求めることができる。
「標的核酸を含む試料と捕捉核酸プローブを混合し、標的核酸に捕捉核酸プローブをハイブリダイズさせる工程」は、標的核酸及び捕捉核酸プローブを混合し、これらをハイブリダイゼーションに適した条件に供することよって行うことができる。具体的には、ハイブリダイゼーションに適した緩衝液中で標的核酸及び捕捉核酸プローブを混合し、その温度を約３０℃～５０℃、好ましくは３５℃～４５℃で一定時間（例えば、１分以上、２分以上、又は３分以上、且つ１０分以下、９分以下、８分以下、７分以下、又は６分以下）保持することで行うことができる。緩衝液は、標的核酸と捕捉核酸プローブとがハイブリダイズするのに適したｐＨを有することが好ましい。例えば、緩衝液のｐＨは、７．６以上９．０以下が好ましい。そのような緩衝液としては、例えば、ＰＣＲ用の緩衝液を使用することができ、例えば、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ Ｍｇ２＋ ｆｒｅｅ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝８．３），５００ｍＭ ＫＣｌ）（タカラバイオ社製）、１０×Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｔａｑ Ｍｇ－ｆｒｅｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝８．３），５００ｍＭ ＫＣｌ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ社製）が挙げられる。緩衝液は、目的とするｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、及びグッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、及びビシン）等が挙げられる。これらの中でも、ｐＨ７．６以上９．０以下において充分な緩衝能力を有する等の理由から、トリス、リン酸、ＰＩＰＥＳが好ましく、トリスがより好ましい。前記緩衝剤の濃度は、１００ｍＭ～１Ｍ程度の１０×ストック液を１０倍希釈して使用するのがハイブリダイズの観点からも一般的である。添加するプローブの量（モル換算）は、標的核酸量よりも多ければ特に限定されないが、１ｐＭ～１０μＭが好ましく、１ｎＭ～１０μＭがより好ましく、１μＭ～１０μＭがさらに好ましい。一実施形態において、標的酢酸と捕捉プローブの比率は、モル換算で、標的核酸：プローブ＝１：１０～１０００、１：２５～５００、又は１：５０～２００であることが好ましい。捕捉核酸プローブとハイブリダイズさせる標的核酸は、既に検出核酸プローブとハイブリダイズした標的核酸であっても、検出核酸プローブと未だハイブリダイズしていない標的核酸であってもよい。
「標的核酸を含む試料と検出核酸プローブを混合し、標的核酸に検出核酸プローブをハイブリダイズさせる工程」は、標的核酸及び検出核酸プローブを混合し、これらをハイブリダイゼーションに適した条件に供することよって行うことができる。具体的には、ハイブリダイゼーションに適した緩衝液中で標的核酸及び検出核酸プローブを混合し、その温度を約３０℃～５０℃、好ましくは約３５℃～４５℃で一定時間（例えば、１分以上、２分以上、又は３分以上、且つ１０分以下、９分以下、８分以下、７分以下、又は６分以下）保持することで行うことができる。緩衝液は、標的核酸と検出核酸プローブとがハイブリダイズするのに適したｐＨを有することが好ましい。例えば、緩衝液のｐＨは、７．６以上９．０以下が好ましい。そのような緩衝液としては、例えば、ＰＣＲ用の緩衝液を使用することができ、例えば、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ Ｍｇ２＋ ｆｒｅｅ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝８．３），５００ｍＭ ＫＣｌ）（タカラバイオ社製）、１０×Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｔａｑ Ｍｇ－ｆｒｅｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝８．３），５００ｍＭ ＫＣｌ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ社製）が挙げられる。緩衝液は、目的とするｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、及びグッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、及びビシン）等が挙げられる。これらの中でも、ｐＨ７．６以上９．０以下において充分な緩衝能力を有する等の理由から、トリス、リン酸、ＰＩＰＥＳが好ましく、トリスがより好ましい。前記緩衝剤の濃度は、１００ｍＭ～１Ｍ程度の１０×ストック液を１０倍希釈して使用するのがハイブリダイズの観点からも一般的である。添加するプローブの量は、標的核酸量よりも多ければ特に限定されないが、１ｐＭ～１０μＭが好ましく、１ｎＭ～１０μＭがより好ましく、１μＭ～１０μＭがさらに好ましい。一実施形態において、標的酢酸と検出核酸プローブの比率は、モル換算で、標的核酸：プローブ＝１：１０～１０００、１：２５～５００、又は１：５０～２００であることが好ましい。検出核酸プローブとハイブリダイズさせる標的核酸は、既に捕捉核酸プローブとハイブリダイズした標的核酸であっても、捕捉核酸プローブと未だハイブリダイズしていない標的核酸であってもよい。
一実施形態において、作業効率の観点から、標的核酸を含む試料と捕捉核酸プローブを混合し、標的核酸に捕捉核酸プローブをハイブリダイズさせる工程と標的核酸を含む試料と検出核酸プローブを混合し、標的核酸に検出核酸プローブをハイブリダイズさせる工程は単一の緩衝液中で同時に行うことが好ましい。これは、例えば、標的核酸と捕捉核酸プローブ及び検出核酸プローブとのハイブリダイゼーションに適した緩衝液に標的核酸、捕捉核酸プローブ、及び検出核酸プローブを添加し、ハイブリダイゼーションに適した条件の一定時間（例えば、１分以上、２分以上、又は３分以上、且つ１０分以下、９分以下、８分以下、７分以下、又は６分以下）保持して行うことができる。
「捕捉核酸プローブの標識を特異的に認識する捕捉抗体が固定化された反応器に、捕捉核酸プローブがハイブリダイズした標的核酸を添加し、標的核酸を捕捉抗体に結合させる工程」における捕捉抗体、その固定化方法、及び反応器の種類は、標的核酸の検出が可能である限り任意であり、当該技術分野において知られるものから適宜選択することができる。代表的な捕捉抗体及び反応器は特開２００１－２３５４７１号公報に開示されている。例えば、反応器は、捕捉核酸プローブを含む溶液を受容する多孔質フィルタを備え、捕捉抗体は捕捉核酸プローブを捕捉可能な態様で多孔質フィルタに固定化されていることが好ましい。一実施形態において、多孔質フィルタは、通液性に優れ、抗体の固定化に適したグラスファイバーで構成されていることが好ましい。また、反応器は、多孔質フィルタの下部に液体の多孔質フィルタの通液を促進させるための吸収層を備えていることが好ましい。
反応器は、捕捉核酸プローブ（捕捉核酸プローブがハイブリダイズした標的核酸を含む）以外の物質による非特異的な結合を防止するため、反応器の内側表面が適当なブロッキング剤でブロッキングされていることが好ましい。ブロッキングは、当該技術分野で知られている任意の手法で行うことができる。一実施形態においてブロッキングは、ブロッキング液を用いて行うことが好ましい。ブロッキング液は、ブロッキング効果と他の反応（例えば、抗原抗体反応、酵素発色反応等）に影響しないという観点から、緩衝剤とブロッキング剤を含む水溶液であることが好ましい。検出を酵素発色反応で行う場合は、当該水溶液は、酵素発色反応に適するｐＨ＝７．０付近であることがより好ましい。前記緩衝液としては、目的とするｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、及びグッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、及びビシン）等が挙げられる。これらの中でも、ｐＨ７．０付近において充分な緩衝能力を有する等の理由から、トリス、リン酸、ＰＩＰＥＳが好ましく、トリスがより好ましい。前記緩衝材の濃度は、１０ｍＭ程度が一般的である。ブロッキング剤は、反応器の種類、多孔質フィルタの有無及び種類、捕捉抗体の種類、及び固定化方法の種類等に応じて適宜選択することができるが、カゼイン、及びＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＢＰＦ）から成る群より選択されることが好ましい。一実施形態においてブロッキング剤はＢＳＡでないことが好ましい。また、ブロッキング剤にはｄＮＴＰｓを添加するのがさらに好ましい。前記カゼイン、及びＢＰＦはタンパク質用のブロッキング剤として作用し、前記ｄＮＴＰｓは核酸用のブロッキング剤として作用する。前記ｄＮＴＰｓの濃度は、１～１００μＭが好ましい。ｄＮＴＰｓ濃度が１μＭより低いと、十分なブロッキング効果が得られない恐れがある。一方、ｄＮＴＰｓ濃度が１００μＭより高いと、コストが上がるだけでなく、ブロッキング効果が高すぎて、ブランクのシグナルのみならず、標的核酸由来のシグナルまで下がる恐れがある。
標的核酸を捕捉抗体に結合させることは、捕捉核酸プローブがハイブリダイズした標的核酸を反応器に添加し、捕捉核酸プローブの標識と捕捉抗体との結合に適した条件に一定時間維持することで行うことができる。捕捉核酸プローブの標識と捕捉抗体との結合に適した条件とは、例えば、約３０℃～５０℃、好ましくは約３５℃～４５℃の温度を挙げることができる。一定時間とは、例えば、３分以下、好ましくは約１～２分を挙げることができる。一実施形態において、捕捉核酸プローブと捕捉抗体との結合は、捕捉核酸プローブ（又は検出核酸プローブ）と標的核酸とのハイブリダイゼーションに使用する緩衝液中で行うことができる。
他の実施形態において、標的核酸と捕捉核酸プローブとをハイブリダイズさせる前に、捕捉核酸プローブに捕捉抗体を結合させることもできる。その後、捕捉抗体を介して反応器に固定された捕捉核酸プローブに標的核酸をハイブリダイズさせることができる。ここで標的核酸は、検出核酸プローブがハイブリダイズしたものであっても、検出核酸プローブがハイブリダイズしていないものであってもよい。標的核酸が、検出核酸プローブがハイブリダイズしていないものである場合は、更に検出核酸プローブをハイブリダイズさせることができる。
標的核酸を捕捉核酸プローブ及び捕捉抗体を介して反応器に結合させた後、反応器を洗浄し、標的核酸にハイブリダイズしていない検出核酸プローブを除去することが好ましい洗浄は、当該技術分野で知られている任意の手法で行うことができる。一実施形態において、洗浄は、洗浄液を用いて行うことが好ましい。洗浄液は、洗浄力と他の反応（例えば、抗原抗体反応、酵素発色反応等）に影響しないという観点から、緩衝剤とノニオン性界面活性剤を含む水溶液であることが好ましく、検出を酵素発色反応で行う場合は、酵素発色反応に適するｐＨ＝７．０付近であることがより好ましい。前記緩衝液としては、目的とするｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、及びグッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、及びビシン）等が挙げられる。これらの中でも、ｐＨ７．０付近において充分な緩衝能力を有する等の理由から、トリス、リン酸、ＰＩＰＥＳが好ましく、トリスがより好ましい。前記緩衝材の濃度は、１０ｍＭ程度が一般的である。前記ノニオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、及びショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。これらの中でも、洗浄力と他の反応（例えば、抗原抗体反応、酵素発色反応等）に影響しないという観点から、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤等）が好ましい。また、前記ノニオン性界面活性剤は単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。前記ノニオン性界面活性剤の濃度としては、好ましくは０．０１ｗｔ％～５．０ｗｔ％、より好ましくは０．０５ｗｔ％～４．５ｗｔ％、さらに好ましくは０．１ｗｔ％～４．０ｗｔ％である。標的核酸にハイブリダイズしていない検出核酸プローブが除去できる限り洗浄の解するは特に制限されない。例えば、洗浄は１～４回行うことができ、好ましくは２～３回である。
捕捉核酸プローブ及び捕捉抗体を介して反応器に結合された標的核酸にハイブリダイズしている検出核酸プローブの標識を検出することにより、当該標的核酸を検出することが好ましい。検出核酸プローブの検出は、その標識を検出できる限り任意であり、標識の種類に応じて適宜選択することができる。
一実施形態において、検出核酸プローブの検出は、検出核酸プローブの標識を特異的に認識する２次検出プローブを用いて検出することが好ましい。２次検出プローブの種類は、標的核酸にハイブリダイズしている検出核酸プローブに結合可能であり、且つ、その存在を検出できる限り特に制限されない。好適な一実施形態において、２次検出プローブは、検出核酸プローブの標識に特異的に結合する標識された抗体であり得る。例えば、検出核酸プローブの標識が蛍光物質である場合、２次検出プローブとして、当該蛍光物質を特異的に認識する抗体を検出核酸プローブの標識とは別の標識物質で標識した抗体を用いることができる。このような抗体は当該技術分野において知られており、使用する検出核酸プローブの種類に応じて適宜選択することができる。
一実施形態において２次検出プローブとして利用される抗体は、ウサギ抗体、マウス抗体、及びラット抗体から成る群より選択されることが好ましい。他の実施形態において、抗体は、ヒツジ抗体でないことが好ましい。
２次検出プローブの標識は任意であり、例えば、蛍光物質又は酵素であり得る。一実施形態において２次検出プローブの標識は酵素であることが好ましい。標識として使用される酵素の種類は、検出に利用できる限り任意であり、当該技術分野において知られるものから適宜選択して使用することができる。例えば、酵素としては、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼを利用することができる。これらの酵素を用いる場合、対応する基質を添加し、得られる酵素反応を検出することで標的核酸の存在（及び量）を検出することができる。
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
［実施例１］
測定操作は小型化学発光免疫自動分析装置ＰＯＣｕｂｅ（東洋紡社製）を用いて以下のように行った。なお、各試薬はＰＯＣｕｂｅ専用１３連容器（図１）の検体ウェルおよび試薬ウェル（１）～（１２）に別々に調製した。
検体ウェル：測定対象の１０ｎＭ ＴａｒｇｅｔＤＮＡ１（配列番号１）
試薬ウェル（１）：反応Ｂｕｆｆｅｒとして１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（ｐＨ＝８．８）試薬ウェル（２）：Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識抗ＦＩＴＣ抗体１（ａｂ４９３６８、Ｒａｂｂｉｔ、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、ａｂｃａｍ社製）を１％ＢＳＡ－ＴＢＳ溶液で１万倍希釈した抗体試薬
試薬ウェル（３）：１μＭ Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ１（配列番号２、Ｔｍ＝６１．９℃、ＳＩＧＭＡ ＧＥＮＯＳＹＳ社製）と、１μＭ ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ１（配列番号３、Ｔｍ＝５７．４℃、ＳＩＧＭＡ ＧＥＮＯＳＹＳ社製）との混合試薬
試薬ウェル（４）：ブロッキング液として１％カゼイン／１００μＭ ｄＮＴＰｓ－ＴＢＳ溶液
試薬ウェル（５）：洗浄液として１％Ｔｗｅｅｎ２０－ＴＢＳ溶液
試薬ウェル（６）：発光基質としてＡＰＳ－５（Ｌｕｍｉｇｅｎ社製）
試薬ウェル（７）：蒸留水
試薬ウェル（８）～（１２）：空の試薬ウェル
初めに、検体ウェルのＴａｒｇｅｔＤＮＡ１００μＬ、試薬ウェル（１）の反応Ｂｕｆｆｅｒ１２μＬ、試薬ウェル（３）の混合試薬３μＬ、試薬ウェル（７）の蒸留水３．２μＬを、空の試薬ウェル（８）で混合し、４０℃で１０分間静置することで、ハイブリダイゼーション反応によるＢｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ／ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ／ＴａｒｇｅｔＤＮＡの３者複合体を形成した。
次いで、前記試薬ウェル（８）の混合液を９８．５μＬと、試薬ウェル（２）の抗体試薬１．５μＬを、空の試薬ウェル（９）で混合し、４０℃で５分間静置することで、抗原－抗体反応によるＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識抗ＦＩＴＣ抗体／Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ／ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ／ＴａｒｇｅｔＤＮＡの４者複合体を形成した。
次いで、ＰＯＣｕｂｅ専用反応容器（抗Ｂｉｔｏｉｎ抗体を結合させたガラスフィルターを含む容器）に、試薬ウェル（４）のブロッキング液５０μＬを滴下し、４０℃で５分間静置した後、前記試薬ウェル（９）の混合液８０μＬを反応容器に滴下し、４０℃で２分間静置することで、前記４者複合体を反応容器に結合させた。
次いで、反応容器に試薬ウェル（５）の洗浄液８０μＬを２回滴下することでＢＦ分離を行った後、試薬ウェル（６）の発光基質３０μＬを滴下し、ＰＯＣｕｂｅにて発光強度を測定した。得られた発光強度をシグナルの発光強度とし、検体ウェルに測定対象のＴａｒｇｅｔＤＮＡの代わりに蒸留水を用いる以外は同様の操作を経て得られた発光強度をノイズの発光強度とし、下式（１）よりＳ／Ｎ比で算出した。得られたＳ／Ｎ比は１６０であった。Ｓ／Ｎ比は、２以上であれば検出可能と判断でき、より高い方が好ましい。２以上が好ましく、３０以上がより好ましく、７０以上が更に好ましく、１００以上がより特に好ましく、２００以上が最も好ましい。
Ｓ／Ｎ比＝シグナルの発光強度／ノイズの発光強度 式（１）
また、検体ウェルの測定対象の１０ｎＭ ＴａｒｇｅｔＤＮＡの濃度を１／１０ずつ段階的に希釈しながら上記と同様の操作を行い、Ｓ／Ｎ＝２．０以上を維持できる最小濃度を最小検出感度として求めた。実施例１の最小検出感度は、０．１ｐＭであった。最小濃度は低い程好ましく、１ｎＭ以下、好ましくは１００ｐＭ以下、より好ましくは１０ｐＭ以下、更に好ましくは１ｐＭ以下、特に好ましくは０．１ｐＭ以下、最も好ましくは０，０１ｐＭ以下である。
［実施例２～７］捕捉核酸プローブのバリエーション
Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ１（配列番号２、Ｔｍ＝６１．９℃、ＳＩＧＭＡ ＧＥＮＯＳＹＳ社製）の代わりに、Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ２（配列番号４、Ｔｍ＝６０．５℃、ＳＩＧＭＡ ＧＥＮＯＳＹＳ社製）、Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ３（配列番号５、Ｔｍ＝６２．４℃、ＳＩＧＭＡ ＧＥＮＯＳＹＳ社製）、Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ４（配列番号８、Ｔｍ＝６１．９℃、ＳＩＧＭＡ ＧＥＮＯＳＹＳ社製）、Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ５（配列番号９、Ｔｍ＝６１．９℃、ＳＩＧＭＡ ＧＥＮＯＳＹＳ社製）、Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ６（配列番号１０、Ｔｍ＝６１．９℃、ＳＩＧＭＡ ＧＥＮＯＳＹＳ社製）、又はＢｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ７（配列番号１１、Ｔｍ＝６１．９℃、ＳＩＧＭＡ ＧＥＮＯＳＹＳ社製）を用いる以外は、実施例１と同様にして、Ｓ／Ｎ比を測定した。得られたＳ／Ｎ比は、標識捕捉ＤＮＡプローブ２について１５０、標識捕捉ＤＮＡプローブ３について１００、標識捕捉ＤＮＡプローブ４について４０、標識捕捉ＤＮＡプローブ５について５０、標識捕捉ＤＮＡプローブ６について８０、標識捕捉ＤＮＡプローブ７について１８０であった。また、最小検出感度は、標識捕捉ＤＮＡプローブ２について０．１ｐＭ、標識捕捉ＤＮＡプローブ３について０．１ｐＭ、標識捕捉ＤＮＡプローブ４について１０ｐＭ、標識捕捉ＤＮＡプローブ５について１０ｐＭ、標識捕捉ＤＮＡプローブ６について１ｐＭ、標識捕捉ＤＮＡプローブ７について０．１ｐＭであった。
［実施例８～１４］検出核酸プローブのバリエーション
ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ１（配列番号３、Ｔｍ＝５７．４℃、ＳＩＧＭＡ ＧＥＮＯＳＹＳ社製）の代わりに、ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ２（配列番号６、Ｔｍ＝６１．８℃、ＳＩＧＭＡ ＧＥＮＯＳＹＳ社製）、ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ３（配列番号７、Ｔｍ＝６９．０℃、ＳＩＧＭＡ ＧＥＮＯＳＹＳ社製）、ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ４（配列番号１２、Ｔｍ＝３５．０℃、ＳＩＧＭＡ ＧＥＮＯＳＹＳ社製）、ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ５（配列番号１３、Ｔｍ＝５７．４℃、ＳＩＧＭＡ ＧＥＮＯＳＹＳ社製）、ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ６（配列番号１４、Ｔｍ＝５７．４℃、ＳＩＧＭＡ ＧＥＮＯＳＹＳ社製）、ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ７（配列番号１５、Ｔｍ＝５７．４℃、ＳＩＧＭＡ ＧＥＮＯＳＹＳ社製）、又はＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ８（配列番号１６、Ｔｍ＝５７．４℃、ＳＩＧＭＡ ＧＥＮＯＳＹＳ社製）を用いる以外は、実施例１と同様にして、Ｓ／Ｎ比を測定した。得られたＳ／Ｎ比は、標識検出ＤＮＡプローブ２について２００、標識検出ＤＮＡプローブ３について２４０、標識検出ＤＮＡプローブ４について４．０、標識検出ＤＮＡプローブ５について４０、標識検出ＤＮＡプローブ６について５０、標識検出ＤＮＡプローブ７について８０、標識検出ＤＮＡプローブ８について２００であった。また、最小検出感度は、標識検出ＤＮＡプローブ２について０．０１ｐＭ、標識検出ＤＮＡプローブ３について０．０１ｐＭ、標識検出ＤＮＡプローブ４について１００ｐＭ、標識検出ＤＮＡプローブ５について１０ｐＭ、標識検出ＤＮＡプローブ６について１０ｐＭ、標識検出ＤＮＡプローブ７について１ｐＭ、標識検出ＤＮＡプローブ８について０．０１ｐＭであった。
［実施例１５～１９］２次検出プローブのバリエーション
Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識抗ＦＩＴＣ抗体１（ａｂ４９３６８、Ｒａｂｂｉｔ、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、ａｂｃａｍ社製）の代わりに、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識抗ＦＩＴＣ抗体２（Ａ５７１９、Ｒａｂｂｉｔ、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、ＳＩＧＭＡ社製）、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識抗ＦＩＴＣ抗体３（２００－０５２－０３７、ｍｏｕｓｅ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ社製）、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識抗ＦＩＴＣ抗体４（Ａ１８１２、ｍｏｕｓｅ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ、ＳＩＧＭＡ社製）、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識抗ＦＩＴＣ抗体５（ＮＢ１００－６４６１８、Ｓｈｅｅｐ、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、ＮＯＶＵＳ社製）、又はＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識抗ＦＩＴＣ抗体６（６０４００／０４、Ｓｈｅｅｐ、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ社製）を用いる以外は、実施例１と同様にして、Ｓ／Ｎ比を測定した。得られたＳ／Ｎ比は、ＦＩＴＣ抗体２について１６０、ＦＩＴＣ抗体３について８０、ＦＩＴＣ抗体４について９０、ＦＩＴＣ抗体５について５．０、ＦＩＴＣ抗体６について５．０であった。また、最小検出感度は、ＦＩＴＣ抗体２について０．１ｐＭ、ＦＩＴＣ抗体３について１ｐＭ、ＦＩＴＣ抗体４について１ｐＭ、ＦＩＴＣ抗体５について１ｎＭ、ＦＩＴＣ抗体６について１ｎＭであった。
［実施例２０～２５］ブロッキング液のバリエーション
ブロッキング液として１％カゼイン／１００μＭ ｄＮＴＰｓ－ＴＢＳ溶液の代わりに、１％ＢＰＦ／１００μＭ ｄＮＴＰｓ－ＴＢＳ溶液、１％カゼイン－ＴＢＳ溶液、１％ＢＳＡ－ＴＢＳ、１％ＢＳＡ／１００μＭ ｄＮＴＰｓ－ＴＢＳ、１％ＢＳＡ－ＴＢＳ、又はＴＢＳを用いる以外は、実施例１と同様にして、Ｓ／Ｎ比を測定した。得られたＳ／Ｎ比は、１％ＢＰＦ／１００μＭ ｄＮＴＰｓ－ＴＢＳ溶液について１５０、１％カゼイン－ＴＢＳ溶液について９０、１％ＢＰＦ－ＴＢＳについて８０、１％ＢＳＡ／１００μＭ ｄＮＴＰｓ－ＴＢＳについて４０、１％ＢＳＡ－ＴＢＳについて２０、ＴＢＳについて５．０であった。また、最小検出感度は、１％ＢＰＦ／１００μＭ ｄＮＴＰｓ－ＴＢＳ溶液について０．１ｐＭ、１％カゼイン－ＴＢＳ溶液について１ｐＭ、１％ＢＳＡ－ＴＢＳについて１ｐＭ、１％ＢＳＡ／１００μＭ ｄＮＴＰｓ－ＴＢＳについて１０ｐＭ、１％ＢＳＡ－ＴＢＳについて１０ｐＭ、ＴＢＳについて１ｎＭであった。
［実施例２６～３３］反応バッファーのバリエーション
反応Ｂｕｆｆｅｒとして１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝８．８）の代わりに１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１０×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）、又は蒸留水を用いる以外は、実施例１と同様にして、Ｓ／Ｎ比を測定した。得られたＳ／Ｎ比は、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）について８０、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）について９０、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）について１３０、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）について１５、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）について４０、１０×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）について５．０、蒸留水について５．０であった。また、最小検出感度は、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）について１ｐＭ、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）について１ｐＭ、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）について０．１ｐＭ、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）について１ｎＭ、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）について１０ｐＭ、１０×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）について１ｎＭ、蒸留水について１ｎＭであった。
［実施例３４］洗浄液のバリエーション
洗浄液として１％Ｔｗｅｅｎ２０－ＴＢＳ溶液の代わりにＴＢＳを用いる以外は、実施例１と同様にして、Ｓ／Ｎ比を測定した。得られたＳ／Ｎ比は、２０であった。また、最小検出感度は、１０ｐＭであった。
［実施例３５］
ＴａｒｇｅｔＤＮＡとしてＴａｒｇｅｔＤＮＡ１の代わりに、ＴａｒｇｅｔＤＮＡ１とＴａｒｇｅｔＤＮＡ１の相補鎖をハイブリダイズさせた２本鎖ＤＮＡを用い、且つ検体ウェルのＴａｒｇｅｔＤＮＡ１００μＬ、試薬ウェル（１）の反応Ｂｕｆｆｅｒ１２μＬ、試薬ウェル（３）の混合試薬３μＬ、試薬ウェル（７）の蒸留水３．２μＬを、空の試薬ウェル（８）で混合した後、９４℃で５分間熱処理を行う以外は、実施例１と同様にして、Ｓ／Ｎ比を測定した。得られたＳ／Ｎ比は、８０であった。また、最小検出感度は、１ｐＭであった。
［実施例３６］
ＴａｒｇｅｔＤＮＡとしてＴａｒｇｅｔＤＮＡ１の代わりに、ＴａｒｇｅｔＤＮＡ１とＴａｒｇｅｔＤＮＡ１の相補鎖をハイブリダイズさせた２本鎖ＤＮＡを用いる以外は、実施例１と同様にして、Ｓ／Ｎ比を測定した。得られたＳ／Ｎ比は、２０であった。また、最小検出感度は、１０ｐＭであった。
以上の試験で使用した各ＤＮＡ分子の塩基配列は下記のとおりである。
ＴａｒｇｅｔＤＮＡ１
5’-CACCCGTTAGGCGCAACGGGACGGAAAGACCCCGTGAAGCTTTACTGTAGCTTAATATTGATCAGGACATTATCATGTAGAGAATAGGTAGGAGCAAT-3’（配列番号１）
Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ１
5’-Ｂｉｏｔｉｎ－TTTTA－TGCTCCTACCTATTCTCTACATGATAA-3’ （配列番号２）
ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ１
5’-ＦＩＴＣ－TTTTT－TCTTTCCGTCCCGTT-3’ （配列番号３）
Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ２
5’-Ｂｉｏｔｉｎ－TAATT－TCCTACCTATTCTCTACATGATAATGTC-3’ （配列番号４）
Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ３
5’-Ｂｉｏｔｉｎ－TTTAT－TTCTCTACATGATAATGTCCTGATCA-3’（配列番号５）
ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ２
5’-ＦＩＴＣ－TTTTT－GTCTTTCCGTCCCGTTG-3’ （配列番号６）
ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ３
5’-ＦＩＴＣ－TTTTT－GGTCTTTCCGTCCCGTTGC-3’ （配列番号７）
Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ４
5’-Ｂｉｏｔｉｎ－TGCTCCTACCTATTCTCTACATGATAA-3’ （配列番号８）
Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ５
5’-Ｂｉｏｔｉｎ－TA-TGCTCCTACCTATTCTCTACATGATAA-3’ （配列番号９）
Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ６
5’-Ｂｉｏｔｉｎ－TTA-TGCTCCTACCTATTCTCTACATGATAA-3’ （配列番号１０）
Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ７
5’-Ｂｉｏｔｉｎ－TTTTTTTTTA-TGCTCCTACCTATTCTCTACATGATAA-3’ （配列番号１１）
ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ４
5’-ＦＩＴＣ－TTTTA－CTTTCCGTCCCGT-3’ （配列番号１２）
ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ５
5’-ＦＩＴＣ－TCTTTCCGTCCCGTT-3’ （配列番号１３）
ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ６
5’-ＦＩＴＣ－TT－TCTTTCCGTCCCGTT-3’ （配列番号１４）
ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ７
5’-ＦＩＴＣ－TTTT－TCTTTCCGTCCCGTT-3’ （配列番号１５）
ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ８
5’-ＦＩＴＣ－TTTAATTTTT－TCTTTCCGTCCCGTT-3’ （配列番号１６）

Claims (8)

  1. 標的核酸の検出方法であって、
    （１）標的核酸にハイブリダイズする標識された捕捉核酸プローブ、及び標的核酸にハイブリダイズする標識された検出核酸プローブを準備する工程
    （２）標的核酸を含む試料と捕捉核酸プローブを混合し、標的核酸に捕捉核酸プローブをハイブリダイズさせる工程
    （３）標的核酸を含む試料と検出核酸プローブを混合し、標的核酸に検出核酸プローブをハイブリダイズさせる工程
    （４）捕捉核酸プローブの標識を特異的に認識する捕捉抗体が固定化された反応器に、捕捉核酸プローブがハイブリダイズした標的核酸を添加し、標的核酸を捕捉抗体に結合させる工程
    （５）反応器を洗浄し、標的核酸にハイブリダイズしていない検出核酸プローブを除去する工程、及び
    （６）検出核酸プローブの標識を検出する工程
    を含み、
    捕捉核酸プローブは、標的核酸に相補的な領域（相補的領域）、及び相補的領域の末端に標的核酸と非相補的な核酸領域（リンカー領域）を有し、リンカー領域の相補的領域と隣接していない側の末端が標識されており、
    捕捉核酸プローブのリンカー領域は３～１５ヌクレオチド残基からなり、
    捕捉核酸プローブのＴｍ値が６０．５～６２．４℃であり、
    検出核酸プローブは、標的核酸に相補的な領域（相補的領域）、及び相補的領域の末端に標的核酸と非相補的な核酸領域（リンカー領域）を有し、リンカー領域の相補的領域と隣接していない側の末端が標識されおり、
    検出核酸プローブのリンカー領域は３～１５ヌクレオチド残基からなり、
    検出核酸プローブのＴｍ値が５７．４～６９．０℃であり、
    工程（２）～工程（４）は、ｐＨ７．６～９．０の緩衝液中で行われ、
    捕捉抗体が固定化された反応器が、カゼイン、及びＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＢＰＦ）から成る群より選択されるブロッキング剤でブロッキングされており、
    工程（２）及び工程（３）は、３０～５０℃の緩衝液中で行われる、
    方法。
  2. 捕捉核酸プローブの標識がビオチン、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、蛍光物質から成る群より選択され、且つ、検出核酸プローブの標識とは異なる、請求項１に記載の方法。
  3. 検出核酸プローブの標識がビオチン、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、蛍光物質から成る群より選択され、且つ、捕捉核酸プローブの標識とは異なる、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 蛍光物質がフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにシアニン及びその誘導体から成る群より選択される、請求項２または３に記載の方法。
  5. 工程（６）が、検出核酸プローブの標識を特異的に認識し、且つ、標識された検出抗体を、検出核酸プローブに結合させる工程を含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 検出抗体の標識がアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、及びペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）から成る群より選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 検出抗体が、ウサギ抗体、マウス抗体、及びラット抗体から成る群より選択される、請求項５又は６に記載の方法。
  8. ブロッキング剤が、さらにｄＮＴＰｓを含有する、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
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