JP6028299B2 - 人獣判定するためのプライマーセット及びプローブ - Google Patents
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Description
(2)他方のプライマーが配列番号33の塩基配列からなることを特徴とする(1)記載のプライマーセット。
(3)上記(1)又は(2)記載のプライマーセットにより増幅した判定領域を検出する人獣判定プローブであって、配列番号37の塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むことを特徴とする人獣判定プローブ。
(4)配列番号37の塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列からなることを特徴とする(3)記載の人獣判定プローブ。
(5)上記(3)又は(4)記載の人獣判定プローブを担体上に固定化してなる、マイクロアレイ。
(6)配列番号10の塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む20塩基以上の塩基配列からなり、Tm値が65℃以上である、A型アレル又はO型アレル判定プローブを上記担体に固定化したことを特徴とする(5)記載のマイクロアレイ。
(7)上記A型アレル又はO型アレル判定プローブは配列番号11〜15のいずれかの塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列からなることを特徴とする(6)記載のマイクロアレイ。
(8)配列番号16の塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む18塩基以上の塩基配列からなり、Tm値が60℃以上である、B型アレル判定プローブを上記担体に固定化したことを特徴とする(5)記載のマイクロアレイ。
(9)上記B型アレル判定プローブは、配列番号17〜21のいずれかの塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列からなることを特徴とする(8)記載のマイクロアレイ。
(10)試料からゲノムDNAを抽出する工程と、抽出したゲノムDNAを鋳型とし、上記(1)又は(2)記載のプライマーセットにより判定領域を増幅する工程と、上記(3)又は(4)記載の人獣判定プローブと増幅核酸を接触させる工程と、人獣判定プローブと増幅核酸とのハイブリダイズを検出し、ハイブリダイズした場合に上記ゲノムDNAがヒト由来であると判断する工程とを含む、人獣判定方法。
(11)上記増幅する工程では、以下(I)〜(III)のいずれかに記載されたプライマーセットによりABO式血液型におけるB型を判定するためのB型判定領域を増幅するとともに、以下(IV)に記載されたプライマーセットによりABO式血液型におけるO型を判定するためのO型判定領域を増幅し、
(I)配列番号1の塩基配列からなるプライマーと配列番号2の塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、
(II)配列番号1の塩基配列からなるプライマーと配列番号3の塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、
(III)配列番号4の塩基配列からなるプライマーと配列番号5の塩基配列からなるプライマーと配列番号6の塩基配列からなるプライマーと配列番号7の塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、
(IV)配列番号8の塩基配列からなるプライマーと配列番号9の塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、
上記接触させる工程では、増幅核酸を、配列番号10の塩基配列を含む20塩基以上の塩基配列からなり、Tm値が65℃以上であるA型アレル又はO型アレル判定プローブまたは、その相補鎖及び配列番号16の塩基配列を含む18塩基以上の塩基配列からなり、Tm値が60℃以上であるB型アレル判定プローブまたは、その相補鎖に接触させることを特徴とする(10)記載の人獣判定方法。
(12)上記(1)又は(2)記載のプライマーセットと、上記(5)乃至(9)いずれか記載のマイクロアレイとを含む、人獣判定用キット。
本発明では、人獣判定に使用するヒト判定領域を特異的に増幅するプライマーセット、当該ヒト判定領域に対応する人獣判定プローブを設計している。また、本発明に係るプライマーセットやプローブを利用した人獣判定の結果、未知試料がヒト由来であることが判明したとき、その後、ABO式血液型の判定を行うこともできる。ABO式血液型の判定については、WO 2009/130797に詳細に開示されている。すなわち、ヒト由来と判定された試料について、WO 2009/130797に開示された手法を適用してABO式血液型の判定を行うことができる。なお、ABO式血液型判定の方法としては、WO 2009/130797に開示された手法に限定されず、従来公知の如何なる手法を適用しても良い。例えば、試薬の抗A血清と抗B血清とを用いて判定する方法を適用しても良い。さらに、詳細は後述するが、従来公知の手法とは異なるが、ABOグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子にに存在する一塩基多型を検出する方法を適用しても良い。
本発明における人獣判定領域は、Watanabe et al., J. Forensic Sci. January 2011, Vol. 56, No. S1, p. S182-S187(非特許文献2)等に記載されるように、霊長類における特異的なアルファサテライトDNAを利用している。当該文献等において記載されるように、人獣判定できるプローブとしては、当該アルファサテライトDNAに特異的にハイブリダイズできるプローブ(D17Z1と呼称される場合がある)を利用している。このD17Z1プローブの塩基配列を配列番号37に示している。
具体的に、本発明に係る、人獣判定領域を特異的に増幅できるプライマーセットを表1に示す。
本発明におけるB型判定領域は、いわゆる796C/A及び803G/Cにて特定される一対の多型を含む領域を意味する。B型の場合、796C/A及び803G/CがそれぞれA及びCであり、A型及びO型の場合、796C/A及び803G/CがそれぞれC及びGである。
本発明におけるO型判定領域は、いわゆる261G/Δにて特定される多型を含む領域を意味する。O型の場合、261G/Δが欠損しており、O型以外の場合、261G/ΔがGである。
上述した「B型判定領域を特異的に増幅するプライマーセット」を用いて増幅したB型判定領域は、本発明に係る「B型判定領域を検出するプローブ」にて高精度に検出することができる。ここで、B型判定領域は、上述したように、796C/A及び803G/Cを含む領域である。B型の遺伝子において796C/A及び803G/CはそれぞれA及びCであり、A型及びO型の遺伝子において796C/A及び803G/CはそれぞれC及びGである。言い換えると、増幅したB型判定領域に含まれる796C/A及び803G/CがそれぞれC及びGである場合、A型アレル及びO型アレルのいずれかであると判断される。また、B型判定領域に含まれる796C/A及び803G/CがそれぞれA及びCである場合、B型アレルであると判断される。
ここで、表6に示したA型アレル又はO型アレル判定プローブの中でも、特に配列番号14の塩基配列又は配列番号15の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用することが好ましい。これら配列番号14の塩基配列又は配列番号15の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドと比較して、上述したプライマーセット(I)〜(III)のいずれを使用した場合であっても、増幅したB型判定領域に基づく蛍光を優れた蛍光強度で検出することができる。
ここで、表7に示したB型アレル判定プローブの中でも、特に配列番号19の塩基配列、配列番号20の塩基配列又は配列番号21の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用することが好ましい。これら配列番号19の塩基配列、配列番号20の塩基配列又は配列番号21の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドと比較して、上述したプライマーセット(I)〜(III)のいずれを使用した場合であっても、増幅したB型判定領域に基づく蛍光を優れた蛍光強度で検出することができる。
上述した「O型判定領域を特異的に増幅するプライマーセット」を用いて増幅したO型判定領域は、上述したB型判定領域を検出するプローブと同様に、所定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて検出することができる。ここで、O型判定領域は、上述したように、261G/Δを含む領域である。O型の遺伝子において261G/ΔはGが欠失しており、O型以外の遺伝子において261G/ΔはGが存在している。言い換えると、増幅したO型判定領域に含まれる261G/Δが欠失してい場合、O型アレルであると判断される。また、O型判定領域に含まれる261G/ΔがGである場合、O型以外のアレルであると判断される。
本発明はまた、未知試料がヒト由来であるかヒト以外の生物由来であるかを判定する方法に関する。ここで、未知試料とは、ゲノムDNAを含む生体試料であって、当該生体試料がヒトに由来するものか不明な試料を意味する。生体試料としては、特に制限されず、例えば、血液およびこれに由来する血液関連試料(血液、血清および血漿など)、リンパ液、汗、涙、唾液、尿、糞便、腹水および髄液等の体液、ならびに細胞、組織または臓器の破砕物および抽出液などが挙げられる。本発明においては、好ましくは、血液関連試料を用いる。
先ず、上述したA型アレル又はO型アレル判定プローブ及びB型判定プローブに対するB型判定領域のハイブリダイズを検出する。血液型がAA型、AO型及びOO型のいずれかである場合、A型アレル又はO型アレル判定プローブへのハイブリダイズが検出され、B型アレル判定プローブへのハイブリダイズは実質的に検出されない(検出限界以下又はバックグラウンド以下)。一方、血液型がBB型の場合には、A型アレル又はO型アレル判定プローブへのハイブリダイズは実質的に検出されず、B型アレル判定プローブへのハイブリダイズが検出される。さらに、被験者の血液型がAB型及びBO型のいずれかである場合には、A型アレル又はO型アレル判定プローブ及びB型アレル判定プローブへのハイブリダイズがともに検出される。
<チップの作製>
人獣判定領域に特異的にハイブリダイズすることが公知のD17Z1プローブ(Watanabe et al., J. Forensic Sci. January 2011, Vol. 56, No. S1, p. S182-S187)をジーンシリコンの所定の位置にスポットし、固定化を行い、チップを作製した。なお、具体的なチップの担体基板材料、固定化に使用した試薬、固定化方法等についてはWO 2009/130797の実施例に記載した方法に準じた。
本実施例では、人獣判定領域を特異的に増幅する従来のプライマーセット(表8)と、本発明に係るプライマーセット(表9)を使用した。
以上のように調製した従来のプライマーセット、本発明のプライマーセットをそれぞれ用いてPCRを行いて、人獣判定領域を増幅した。このとき、本実施例では、鋳型としてヒトゲノムDNAを使用して、下記の反応液組成とした。
上述の反応液組成及び反応条件でPCRを実施した後、反応液とハイブリダイズ緩衝液(3×SSC/0.3%SDS/0.4 nM Cy5標識オリゴDNA(シグマジェノシス))を2:1で混合し、この溶液を3μLとり、ハイブリカバーの中央凸部の上に滴下して、これをチップに被せ、54℃に設定したハイブリダイズチャンバー装置(東洋鋼鈑)で1時間反応させた。
ハイブリダイズ反応終了後、洗浄用ステンレスホルダーを2×SSC/0.2% SDS溶液に浸し、ハイブリカバーをはずしたチップをホルダーにセットした。上下に数回振動させた後、チップの蛍光強度を検出するまでホルダーを2×SSC溶液(室温)に浸した。
従来のプライマーセットを用いた場合、本発明に係るプライマーセットを用いた場合、それぞれにおいて蛍光強度を測定した結果を図2に示す。図2に示すように、本発明に係るプライマーセットを使用した場合には、従来のプライマーセットを使用した場合と比較して、増幅した人獣判定領域とプローブとのハイブリダイズに基づく蛍光強度が非常に高い値を示した。この結果から、本発明に係るプライマーセットを使用することで、未知試料の人獣判定をより高精度に行えることが明らかとなった。
本実施例では、ヒト以外のほ乳類由来のゲノムDNAを用いて、実施例1と同様に本発明に係るプライマーセットを使用して核酸増幅反応を行い、ヒトのゲノムDNAを用いた場合と比較した。なお、本実施例では、ヒト以外のほ乳類としてチンパンジー、オランウータン、ミドリザル、ニホンザル及びネコのDNAを使用した。
本実施例では、本発明に係る人獣判定領域を特異的に増幅するプライマーセットを用いた人獣判定と、ABO式血液型判定とを同時に行った。
以上のように調製したプライマーミックスを用いてPCRを行い、人獣判定領域、B型判定領域及びO型判定領域を同時に増幅した。PCRのプレミックスの組成を表15に示した。
<チップの作製>
表17に示すA型アレル又はO型アレル判定プローブ、表18に示すB型アレル判定プローブ、表19に示すO型アレル判定用プローブ(WO 2009/130797)及び表20に示す位置プローブをそれぞれジーンシリコンの所定の位置にスポットし、固定化を行い、チップを作製した。なお、具体的なチップの担体基板材料、固定化に使用した試薬、固定化方法等についてはWO 2009/130797の実施例に記載した方法に準じた。
本実施例では、B型判定領域を増幅するためのプライマーセット、O型判定領域を増幅するためのプライマーセット及び人獣判定領域を増幅するためのプライマーセットを含む、表21〜23に示す3種類のプライマーミックスを作製した。なお、表21に示したプライマーミックスは、B型判定領域を特異的に増幅するプライマーセット(I)を含んでいる。表22に示したプライマーミックスは、B型判定領域を特異的に増幅するプライマーセット(II)を含んでいる。表23に示したプライマーミックスは、B型判定領域を特異的に増幅するプライマーセット(III)を含んでいる。
以上のように調製した3種類のプライマーミックスを用いてPCRを行い、B型判定領域及びO型判定領域を同時に増幅した。PCRのプレミックスの組成を表26に示した(各プライマーセット分計183本)。
上述の反応液組成及び反応条件でPCRを実施した後、反応液とハイブリダイズ緩衝液(3×SSC/0.3%SDS/0.4 nM Cy5標識オリゴDNA(シグマジェノシス))を2:1で混合し、この溶液を3μLとり、ハイブリカバーの中央凸部の上に滴下して、これをチップに被せ、54℃に設定したハイブリダイズチャンバー装置(東洋鋼鈑)で1時間反応させた。
ハイブリダイズ反応終了後、洗浄用ステンレスホルダーを2×SSC/0.2% SDS溶液に浸し、ハイブリカバーをはずしたチップをホルダーにセットした。上下に数回振動させた後、チップの蛍光強度を検出するまでホルダーを2×SSC溶液(室温)に浸した。
先ず、チップに固定したプローブから検出された蛍光強度を指標としてプローブの評価を行った。表17に示したA型アレル又はO型アレル判定プローブ1〜13については、B型アレルがない検体(AA、AO及びOO型)を用いたときの蛍光強度の平均を算出し、蛍光強度平均値が1000以上のプローブを検出可能として、評価「○」とした。結果を表28に示した。
上述した3種類のプライマーセットを用いて増幅したB型判定領域について、B型判定値は(B型アレル判定プローブの蛍光強度)/(A,O型アレル判定プローブとB型判定プローブの蛍光強度の平均値)から算出した値を判定値とした。この時、各種プローブを使用した場合の判定値の平均値、標準偏差及び3σを算出した。これらの算出結果を表30〜32に示した。表30〜32は、それぞれB型判定領域を特異的に増幅するプライマーセット(I)〜(III)を使用したとき(すなわち表21〜23のプライマーミックス)の結果を示している。また、表30〜32において「プローブA,O」とした欄は、A型アレル又はO型アレル判定プローブの種類(表17に示した13種類)を示している。表30〜32において「プローブB」とした欄は、B型アレル判定プローブの種類(表18に示した6種類)を示している。
本実施例では、WO 2009/130797で開示されたプライマーセットと、実施例1で設計したABO_261_O_Fw(配列番号8)及びABO_261_O_Rv(配列番号9)のプライマーセットとの性能を評価した。具体的に、各プライマーセットで増幅したO型判定領域を、WO 2009/130797で開示されたO型アレル判定用プローブ(実施例1の表9)で検出する際の精度を指標にして評価した。
Claims (2)
- 試料からゲノムDNAを抽出する工程と、
抽出したゲノムDNAを鋳型とし、一方のプライマーが配列番号34の塩基配列からなるプライマーセットにより人獣判定領域を増幅するとともに、ABO式血液型におけるB型を判定するためのB型判定領域を特異的に増幅するプライマーセットであって、以下(A)及び/又は(B)のプライマーセットによりB型判定領域を増幅し、
(A)配列番号1の塩基配列からなるプライマーと配列番号3の塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット
(B)配列番号4の塩基配列からなるプライマーと配列番号5の塩基配列からなるプライマーと配列番号6の塩基配列からなるプライマーと配列番号7の塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット
ABO式血液型におけるO型を判定するためのO型判定領域を特異的に増幅するプライマーセットであって、配列番号8の塩基配列からなるプライマーと配列番号9の塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットによりO型判定領域を増幅する工程と、
配列番号37の塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む人獣判定プローブ、配列番号14又は15の塩基配列若しくは当該塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるA型アレル又はO型アレル判定プローブ、配列番号19〜21のいずれかの塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるB型アレル判定プローブ、及び配列番号30の塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるプローブと配列番号31の塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるプローブとからなる一対のO型アレル判定プローブと増幅核酸を接触させる工程と、
人獣判定プローブと増幅核酸とのハイブリダイズを検出し、ハイブリダイズした場合に上記ゲノムDNAがヒト由来であると判断する工程と、
上記ゲノムDNAがヒト由来であると判断した場合、上記A型アレル又はO型アレル判定プローブ、上記B型アレル判定プローブ及び上記一対のO型アレル判定プローブと増幅核酸とのハイブリダイズを検出し、ハイブリダイズした核酸の比に基づいてABO式血液型を判定する工程と
を含む、人獣判定及びABO式血液型判定方法。 - 人獣判定領域を増幅する、一方のプライマーが配列番号34の塩基配列からなるプライマーセットと、
ABO式血液型におけるB型を判定するためのB型判定領域を特異的に増幅する、以下(A)及び/又は(B)のプライマーセットと、
(A)配列番号1の塩基配列からなるプライマーと配列番号3の塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット
(B)配列番号4の塩基配列からなるプライマーと配列番号5の塩基配列からなるプライマーと配列番号6の塩基配列からなるプライマーと配列番号7の塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット
ABO式血液型におけるO型を判定するためのO型判定領域を特異的に増幅する、配列番号8の塩基配列からなるプライマーと配列番号9の塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットと、
配列番号37の塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む人獣判定プローブ、配列番号14又は15の塩基配列若しくは当該塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるA型アレル又はO型アレル判定プローブ、配列番号19〜21のいずれかの塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるB型アレル判定プローブ、及び配列番号30の塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるプローブと配列番号31の塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるプローブとからなる一対のO型アレル判定プローブが担体上に固定化されてなるマイクロアレイとを含む、人獣判定及びABO式血液型判定用キット。
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