WO2020067388A1 - 甲状腺乳頭癌の予後予測に関連する遺伝子変異評価用キット - Google Patents

甲状腺乳頭癌の予後予測に関連する遺伝子変異評価用キット Download PDF

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WO2020067388A1
WO2020067388A1 PCT/JP2019/038065 JP2019038065W WO2020067388A1 WO 2020067388 A1 WO2020067388 A1 WO 2020067388A1 JP 2019038065 W JP2019038065 W JP 2019038065W WO 2020067388 A1 WO2020067388 A1 WO 2020067388A1
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WO
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gene mutation
nucleic acid
tert
braf
mutation
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PCT/JP2019/038065
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拓哉 寺垣
幸一 平山
山野　博文
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東洋鋼鈑株式会社
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    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology

Definitions

  • the present invention relates to a gene mutation evaluation kit capable of evaluating a gene mutation associated with prognosis of papillary thyroid cancer, and a data analysis method for predicting the prognosis of papillary thyroid cancer using the gene mutation evaluation kit.
  • V600E gene mutation in the BRAF protein, 228C> T gene mutation in the TERT promoter region and a thyroid papillary carcinoma patient having a 250C> T gene mutation are evaluated as having a relatively high possibility of recurrence, and based on the evaluation, Appropriate treatment strategies can be determined.
  • the present invention has been made in view of the above-described circumstances, and a gene mutation evaluation kit capable of simultaneously examining the V600E gene mutation in these BRAF proteins, the 228C> T gene mutation and the 250C> T gene mutation in the TERT promoter region, and
  • An object of the present invention is to provide a data analysis method for prognosis prediction of papillary thyroid cancer used.
  • the present invention includes the following.
  • a BRAF V600E mutant probe that specifically hybridizes to a V600E gene mutation (1799T> A) in BRAF (v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1);
  • a TERT 228C> T mutant probe that specifically hybridizes to a 228C> T gene mutation in the TERT (telomerase reverse transcriptase) promoter region,
  • a TERT 250C> T mutant probe that specifically hybridizes to a 250C> T gene mutation in the TERT promoter region,
  • a primer set for BRAF that amplifies a region containing a V600E gene mutation in the BRAF gene A primer set for TERT that amplifies a region containing a 228C> T gene mutation and a 250C> T gene mutation in the TERT gene, comprising: a kit for evaluating gene mutations related to prognosis prediction of papillary thyroid cancer.
  • the BRAF primer set comprises a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the primer set for TERT comprises a forward primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the primer set for BRAF comprises a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • the TERT primer set comprises a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4,
  • the gene mutation evaluation kit according to (1) wherein the concentration of the TERT primer set is 0.2 ⁇ M or more and 0.6 ⁇ M or less.
  • the gene mutation other than V600E is characterized in that it is at least one kind of gene mutation selected from the group consisting of V600D gene mutation, V600K gene mutation, V600R gene mutation, V600G gene mutation and V600M gene mutation ( The kit for evaluating a gene mutation according to 6).
  • TERT (10) Common for TERT that hybridizes to any of the wild-type TERT fragment amplified by the above-mentioned primer set for TERT and the mutant TERT fragment having a mutation at a position corresponding to cytosine at position 228 and / or cytosine at position 250.
  • a hybridization buffer composition comprising a target nucleic acid having a predetermined gene mutation and a mutation detection probe specifically hybridizing to the target nucleic acid, A hybridization buffer composition comprising a blocking nucleic acid fragment that hybridizes preferentially to a non-target nucleic acid having a gene mutation other than a predetermined gene mutation in a target nucleic acid as compared to a target nucleic acid.
  • the target nucleic acid is a nucleic acid fragment containing a V600E gene mutation (1799T> A) in BRAF (v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1)
  • the mutation detection probe is a BRAF V600E mutant probe that specifically hybridizes to the nucleic acid fragment
  • the non-target nucleic acid is a nucleic acid fragment containing a V600D gene mutation or a V600K gene mutation
  • the hybridization buffer composition according to (12) wherein the blocking nucleic acid fragment hybridizes preferentially to a nucleic acid fragment containing a V600D gene mutation or a nucleic acid fragment containing a V600K gene mutation.
  • the above-mentioned gene mutation evaluation kit is a microarray comprising a mutation type probe relating to each of the above gene mutations, and a common probe which hybridizes to a mutant type having the gene mutation and a wild type having no mutation.
  • the signal derived from the mutant probe and the common probe is measured using the formula: [Signal intensity of the mutant probe] / [Signal intensity of the common probe] to calculate the judgment value for each gene mutation, and the judgment value is defined in advance.
  • the gene mutation evaluation kit of the present invention three gene mutations related to the prognosis prediction of papillary thyroid cancer can be simultaneously tested. Therefore, the prognosis of papillary thyroid cancer can be quickly predicted at low cost by using the gene mutation evaluation kit according to the present invention.
  • the data analysis method relating to the prognosis prediction of papillary thyroid cancer uses a gene mutation evaluation kit that can simultaneously test three gene mutations related to prognosis prediction of papillary thyroid cancer, the prognosis prediction of papillary thyroid cancer Can be performed quickly and at low cost.
  • FIG. 5 It is a characteristic view showing a part (SEQ ID NO: 5) of a BRAF gene containing a V600E gene mutation.
  • FIG. 4 is a characteristic diagram showing a part of the TERT promoter region (SEQ ID NO: 6) containing 228C> T gene mutation and 250C> T gene mutation.
  • FIG. 4 is an electrophoretogram showing the results of performing a nucleic acid amplification reaction using primer sets A to E and primer sets F to I alone.
  • FIG. 9 is a characteristic diagram showing the results of performing a nucleic acid amplification reaction using each of primer sets A to E, H, and I alone and detecting amplified nucleic acid fragments with a BRAF common probe and a TERT common probe.
  • FIG. 5 It is a characteristic view showing a part (SEQ ID NO: 5) of a BRAF gene containing a V600E gene mutation.
  • FIG. 4 is a characteristic diagram showing a part of the TERT promoter region (SEQ ID
  • FIG. 9 is a characteristic diagram showing the results of simultaneous nucleic acid amplification reactions performed with primer set B and primer set H at different concentrations and ratios, and amplified nucleic acid fragments detected with a BRAF common probe and a TERT common probe.
  • FIG. 9 is a characteristic diagram showing the results of detecting a wild-type sample and a 5% mutant sample using primer set B and primer set H.
  • FIG. 10 is a characteristic diagram showing the results of calculating determination values when only a blocking nucleic acid fragment corresponding to a wild type is added to a reaction solution after a nucleic acid amplification reaction for a wild type sample and various V600 mutant samples.
  • FIG. 10 is a characteristic diagram showing a result of calculating a determination value when “” is added.
  • the kit for evaluating gene mutations relating to the prognosis of papillary thyroid cancer relates to mutations of the V600E gene in the BRAF protein, 228C> T gene mutation and 250C> T gene mutation in the TERT promoter region.
  • These genetic mutations in BRAF and TERT are genetic mutations that are considered to be related to the prognosis (recurrence) of papillary thyroid cancer in Scientific ⁇ Reports ⁇
  • the gene mutation evaluation kit according to the present invention is a BRAF V600E mutant probe for identifying the V600E gene mutation in these BRAF proteins, and a TERT 228C> T mutant for identifying a 228C> T gene mutation in the TERT promoter region.
  • the gene mutation evaluation kit according to the present invention includes a BRAF primer set for amplifying a predetermined region containing a V600E gene mutation, and a TERT for amplifying a predetermined region containing a 228C> T gene mutation and a 250C> T gene mutation. Primer set.
  • the V600E gene mutation contained in the nucleic acid fragment amplified using the BRAF primer set can be identified with a BRAF ⁇ V600E mutant probe.
  • FIG. 1 shows a part of the BRAF gene containing the mutation of the V600E gene (SEQ ID NO: 5).
  • the V600E gene mutation is counted from the N-terminus of the BRAF protein by setting the A of the initiation codon (ATG) to 1st (not shown in FIG. 1) and the 1799th T to A.
  • the valine at position 600 will be mutated to glutamic acid. Therefore, the primer set for BRAF is designed as a forward primer and a reverse primer so as to amplify the region containing the 1799th base.
  • the BRAF primer set include a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the BRAF primer set is not limited to a set consisting of a forward primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2, but may be a part of the BRAF gene shown in FIG. It can be appropriately designed based on the above.
  • a forward primer in a part of the BRAF gene shown in FIG. 1, several bases, for example, 20 bases, preferably 10 bases, more preferably 10 bases in the 5 ′ side (upstream) direction from the base sequence of SEQ ID NO: 1
  • a forward primer may be designed at a position shifted by 5 bases.
  • a reverse primer in a part of the BRAF gene shown in FIG. 1, several bases, for example, 20 bases in the 5 ′ (upstream) or 3 ′ (downstream) direction from the base sequence of SEQ ID NO: 2,
  • the reverse primer may be designed at a position shifted by preferably 10 bases, more preferably 5 bases.
  • FIG. 2 shows a part of the TERT promoter region containing the 228C> T gene mutation and the 250C> T gene mutation (SEQ ID NO: 6).
  • the primer set for TERT is designed as a forward primer and a reverse primer so as to amplify the region including the 228th and 250th positions.
  • the TERT primer set include a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the primer set for TERT is not limited to a set consisting of a forward primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4, and is a part of the TERT promoter region shown in FIG. Can be appropriately designed based on the For example, as the forward primer, in a part of the TERT promoter region shown in FIG. 2, several bases, for example, 10 bases in the 5 ′ (upstream) or 3 ′ (downstream) direction from the base sequence of SEQ ID NO: 3; Preferably, a forward primer may be designed at a position shifted by 5 bases. Similarly, as the reverse primer, in a part of the TERT promoter region shown in FIG. 2, several bases, for example, 10 bases in the 5 ′ (upstream) or 3 ′ (downstream) direction from the base sequence of SEQ ID NO: 4 The reverse primer may be designed at a position preferably shifted by 5 bases.
  • the BRAF primer set and the TERT primer set according to the present invention designed as described above can simultaneously amplify target nucleic acid fragments by a nucleic acid amplification reaction using genomic DNA of a subject as a template.
  • nucleic acid fragment amplified by the primer set for BRAF and the primer set for TERT according to the present invention designed as described above is a probe designed to hybridize regardless of the presence or absence of the gene mutation to be detected ( Common probe). More specifically, the nucleic acid fragment amplified by the BRAF primer set and the TERT primer set is based on the fluorescence intensity of the common probe by attaching a fluorescent labeling compound to either the forward primer or the reverse primer. Can be detected.
  • the BRAF common probe for detecting the nucleic acid fragment amplified by the BRAF primer set is designed to hybridize to a region not containing a codon encoding valine at position 600 in the BRAF protein.
  • GGTCCCATCAGTTTGAAC SEQ ID NO: 1 is extracted from a region sandwiched between a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • 7) can be designed as a common probe for BRAF.
  • a common probe for TERT for detecting a nucleic acid fragment amplified by the primer set for TERT is designed to hybridize to a region not containing the 228th and 250th bases in the TERT promoter region.
  • ACGGGGCGGGGTCCG sequence between the forward primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 3 and the reverse primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4) No. 8 can be designed as a common probe for TERT.
  • the concentration of the primer set for TERT is preferably 0.2 ⁇ M to 0.6 ⁇ M, more preferably 0.4 ⁇ M.
  • the concentration of the primer set for TERT within the above range, and the concentration ratio of the primer set for BRAF and the primer set for TERT within this range, the amplified fragment obtained by the nucleic acid amplification reaction can be used as the common probe for BRAF described above. Further, the variation of the fluorescence intensity can be further suppressed by the common probe for TERT, and the detection can be performed with higher accuracy.
  • the BRAF V600E mutant probe that specifically hybridizes to the V600E gene mutation (1799T> A) has a base sequence for detecting the base A at position 1799 described above. Can be designed as a probe.
  • the BRAF ⁇ V600E mutant probe is designed to hybridize to the amplified nucleic acid when the base to be detected (the 1799th base) in the amplified fragment amplified by the above-mentioned BRAF primer set is A.
  • the TERT> 228C> T mutant probe that specifically hybridizes to the 228C> T gene mutation, a probe having a base sequence for detecting the 228th base T described above.
  • the TERT 228C> T mutant probe is designed to hybridize with the amplified nucleic acid when the base to be detected (the 228th base) in the amplified fragment amplified by the above-mentioned primer set for TERT is T.
  • the TERT 250C> T mutant probe that specifically hybridizes to the 250C> T gene mutation, a probe having a base sequence for detecting the 250th base T described above.
  • the TERT 250C> T mutant probe is designed to hybridize with the amplified nucleic acid when the base to be detected (250th base) in the amplified fragment amplified by the above-mentioned primer set for TERT is T.
  • the base length of these probes is not particularly limited, but may be, for example, 10 to 40 bases, and preferably 15 to 35 bases.
  • the probe is composed of a base sequence designed based on a region containing a gene mutation to be detected and a base sequence added to one or both ends of the base sequence, for example, 10 to 10
  • the length can be 40 bases, preferably 20 to 35 bases.
  • the probe designed as described above is preferably a nucleic acid, and more preferably a DNA.
  • the DNA may be double-stranded or single-stranded, but is preferably single-stranded DNA.
  • the probe can be obtained by, for example, chemically synthesizing with a nucleic acid synthesizer.
  • a nucleic acid synthesizer a device called a DNA synthesizer, a fully automatic nucleic acid synthesizer, an automatic nucleic acid synthesizer, or the like can be used.
  • the gene mutation evaluation kit according to the present invention further includes a blocking nucleic acid fragment that hybridizes to a gene mutation other than V600E corresponding to the 600th valine (V600) in BRAF.
  • the blocking nucleic acid has a base sequence complementary to the base sequence of a nucleic acid fragment having a gene mutation other than V600E among nucleic acid fragments amplified by the BRAF primer set.
  • the gene mutation other than V600E include a V600D gene mutation, a V600K gene mutation, a V600R gene mutation, a V600G gene mutation, and a V600M gene mutation.
  • the blocking nucleic acid fragment a plurality of types may be prepared so as to correspond to all of these gene mutations other than V600E, but it is necessary to prepare to correspond to some of the gene mutations selected from the gene mutations other than V600E. Is also good.
  • the blocking nucleic acid fragment it is preferable to use a blocking nucleic acid fragment corresponding to the V600D gene mutation and / or a blocking nucleic acid fragment corresponding to the V600K gene mutation.
  • the gene mutation evaluation kit according to the present invention contains a blocking nucleic acid corresponding to a gene mutation other than V600E, when an amplified nucleic acid having a gene mutation other than V600E is obtained by the BRAF primer set, Even, it is possible to suppress non-specific hybridization between the amplified nucleic acid having a gene mutation other than V600E and the BRAF V600E mutant probe, and the amplified nucleic acid having the V600E gene mutation and the BRAF V600E mutant probe. Inhibition of specific hybridization can be prevented. Therefore, by using a blocking nucleic acid corresponding to a gene mutation other than V600E, the presence or absence of the V600E gene mutation can be detected with high accuracy.
  • the BRAF V600E mutant probe, the TERT 228C> T mutant probe and the TERT 250C> T mutant probe designed as described above have their 5 ′ end immobilized on a carrier. Therefore, it is preferable to use in the form of a microarray (for example, a DNA chip).
  • the microarray has a mutant probe and the above-mentioned common probe for each of the above-mentioned gene mutations.
  • a mutant probe and a common probe for each gene mutation not only the presence or absence of the mutation but also the ratio of the mutation can be accurately determined.
  • the material of the carrier those known in the art can be used and are not particularly limited.
  • noble metals such as platinum, platinum black, gold, palladium, rhodium, silver, mercury, tungsten and their compounds, and conductive materials such as graphite and carbon represented by carbon fiber
  • conductive materials such as graphite and carbon represented by carbon fiber
  • single-crystal silicon amorphous Silicon materials such as silicon, silicon carbide, silicon oxide, silicon nitride, etc., and composite materials of these silicon materials such as SOI (silicon-on-insulator); glass, quartz glass, alumina, sapphire, ceramics, phos Inorganic materials such as stellite and photosensitive glass; polyethylene, ethylene, polypropylene, cyclic polyolefin, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol , Polyvin
  • a carrier having a carbon layer and a chemically modifying group on the surface is preferably used as the carrier.
  • the carrier having a carbon layer and a chemically modified group on the surface thereof includes those having a carbon layer and a chemically modified group on the surface of a substrate and those having a chemically modified group on the surface of a substrate made of a carbon layer.
  • the material for the substrate those known in the art can be used, and there is no particular limitation, and the same materials as those described above as the carrier material can be used.
  • a carrier having a fine plate-like structure is preferably used.
  • the shape is not limited to a rectangle, square, round or the like, but usually a shape of 1 to 75 mm square, preferably 1 to 10 mm square, more preferably 3 to 5 mm square is used.
  • a carrier having a carbon layer and a chemically modifying group on the surface of a substrate made of single crystal silicon is more preferable.
  • Single-crystal silicon has crystal orientation that is slightly changed in some parts (sometimes referred to as mosaic crystal), or contains disorder on the atomic scale (lattice defect) Are also included.
  • the carbon layer formed on the substrate is not particularly limited, but is synthetic diamond, high-pressure synthetic diamond, natural diamond, soft diamond (for example, diamond-like carbon), amorphous carbon, carbon-based substance (for example, graphite, fullerene). , Carbon nanotubes), a mixture thereof, or a laminate thereof.
  • carbides such as hafnium carbide, niobium carbide, silicon carbide, tantalum carbide, thorium carbide, titanium carbide, uranium carbide, tungsten carbide, zirconium carbide, molybdenum carbide, chromium carbide, and vanadium carbide may be used.
  • soft diamond is a general term for imperfect diamond structures that are a mixture of diamond and carbon, such as so-called diamond-like carbon (DLC), and the mixing ratio is not particularly limited.
  • the carbon layer is excellent in chemical stability and can withstand the subsequent reaction in the introduction of a chemical modifying group and the binding with the analyte, and the bond is flexible due to the electrostatic binding with the analyte. It is advantageous in that it has a property, is transparent to the detection system UV due to no UV absorption, and can be energized during electroblotting. It is also advantageous in that non-specific adsorption is small in the binding reaction with the analyte. As described above, a carrier in which the substrate itself is made of a carbon layer may be used.
  • the formation of the carbon layer can be performed by a known method.
  • microwave plasma CVD Chemical vapor deposition
  • ECRCVD Electro cyclotron resonance chemical vapor deposition
  • ICP Inductive coupled plasma
  • DC sputtering ECR (Electric cyclotron resonance) sputtering
  • ionization vapor deposition arc Examples thereof include a vacuum evaporation method, a laser evaporation method, an EB (Electron beam) evaporation method, and a resistance heating evaporation method.
  • a raw material gas (methane) is decomposed by glow discharge generated between electrodes by high frequency, and a carbon layer is synthesized on a substrate.
  • a raw material gas (benzene) is decomposed and ionized using thermoelectrons generated by a tungsten filament, and a carbon layer is formed on a substrate by a bias voltage.
  • the carbon layer may be formed by ionization vapor deposition in a mixed gas consisting of 1 to 99% by volume of hydrogen gas and 99 to 1% by volume of methane gas remaining.
  • a direct current voltage is applied between a solid graphite material (cathode evaporation source) and a vacuum vessel (anode) to cause an arc discharge in a vacuum to generate a plasma of carbon atoms from a cathode, thereby generating an evaporation source.
  • a further negative bias voltage is applied to the substrate, carbon ions in the plasma can be accelerated toward the substrate to form a carbon layer.
  • a carbon layer can be formed by irradiating a graphite target plate with Nd: YAG laser (pulse oscillation) light to melt it, and depositing carbon atoms on a glass substrate.
  • Nd: YAG laser pulse oscillation
  • the thickness of the carbon layer is usually about a monomolecular layer to about 100 ⁇ m. If the carbon layer is too thin, the surface of the base substrate may be locally exposed. If this is the case, the productivity becomes worse. Therefore, the thickness is preferably 2 nm to 1 ⁇ m, more preferably 5 nm to 500 nm.
  • the oligonucleotide probe can be firmly immobilized on the carrier.
  • the chemical modification group to be introduced can be appropriately selected by those skilled in the art, and is not particularly limited. Examples thereof include an amino group, a carboxyl group, an epoxy group, a formyl group, a hydroxyl group, and an active ester group.
  • the introduction of the amino group can be carried out, for example, by irradiating the carbon layer with ultraviolet rays in ammonia gas or by performing a plasma treatment.
  • the method can be carried out by irradiating the carbon layer with ultraviolet rays in chlorine gas to chlorinate and further irradiating the carbon layer with ultraviolet rays in ammonia gas.
  • the reaction can be carried out by reacting a polyamine gas such as methylene diamine or ethylene diamine with a chlorinated carbon layer.
  • the introduction of a carboxyl group can be carried out, for example, by reacting an appropriate compound with the carbon layer aminated as described above.
  • the compound used for introducing a carboxyl group is represented, for example, by the formula: X-R1-COOH (where X represents a halogen atom, and R1 represents a divalent hydrocarbon group having 10 to 12 carbon atoms).
  • Halocarboxylic acids such as chloroacetic acid, fluoroacetic acid, bromoacetic acid, iodoacetic acid, 2-chloropropionic acid, 3-chloropropionic acid, 3-chloroacrylic acid, 4-chlorobenzoic acid; formula: HOOC-R2-COOH (formula Wherein R2 represents a single bond or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms), for example, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, phthalic acid; polyacrylic acid , Polyvalent carboxylic acids such as polymethacrylic acid, trimellitic acid and butanetetracarboxylic acid; formula: R3-CO-R4-COOH (wherein R3 is a hydrogen atom or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms) , R4 represents a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms) Dicarboxylic acid represented by the formula
  • the introduction of the epoxy group can be carried out, for example, by reacting the carbon layer aminated as described above with a suitable polyvalent epoxy compound. Alternatively, it can be obtained by reacting an organic peracid with a carbon-carbon double bond contained in the carbon layer.
  • the organic peracid include peracetic acid, perbenzoic acid, diperoxyphthalic acid, formic acid, and trifluoroperacetic acid.
  • Formyl group can be introduced, for example, by reacting the aminated carbon layer with glutaraldehyde.
  • the introduction of the hydroxyl group can be carried out, for example, by reacting the chlorinated carbon layer with water.
  • the active ester group means an ester group having a highly acidic electron withdrawing group on the alcohol side of the ester group to activate the nucleophilic reaction, that is, an ester group having a high reaction activity.
  • the active ester group has reactivity to groups such as an amino group, a thiol group, and a hydroxyl group. More specifically, phenol esters, thiophenol esters, N-hydroxyamine esters, cyanomethyl esters, esters of heterocyclic hydroxy compounds, etc., are active ester groups having a much higher activity than alkyl esters and the like.
  • examples of the active ester group include a p-nitrophenyl group, an N-hydroxysuccinimide group, a succinimide group, a phthalimide group, and a 5-norbornene-2,3-dicarboximide group.
  • an N-hydroxysuccinimide group is preferably used.
  • the introduction of the active ester group can be performed, for example, by combining the carboxyl group introduced as described above with a dehydrating condensing agent such as cyanamide or carbodiimide (for example, 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide). It can be carried out by active esterification with a compound such as hydroxysuccinimide. By this treatment, a group in which an active ester group such as an N-hydroxysuccinimide group is bonded to the terminal of the hydrocarbon group via an amide bond can be formed (JP-A-2001-139532).
  • a dehydrating condensing agent such as cyanamide or carbodiimide (for example, 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide).
  • the probe is dissolved in a spotting buffer to prepare a spotting solution, dispensed into a 96-well or 384-well plastic plate, and the dispensed solution is spotted on a carrier by a spotter or the like to obtain a probe.
  • a spotting solution may be manually spotted using a micropipettor.
  • Incubation is usually performed at a temperature of -20 to 100 ° C, preferably 0 to 90 ° C, for usually 0.5 to 16 hours, preferably 1 to 2 hours. Incubation is desirably performed in a high humidity atmosphere, for example, at a humidity of 50 to 90%. Following the incubation, it is preferable to perform washing using a washing solution (for example, 50 mM TBS / 0.05% Tween 20, 2 ⁇ SSC / 0.2% SDS solution, ultrapure water, etc.) to remove DNA not bound to the carrier. .
  • a washing solution for example, 50 mM TBS / 0.05% Tween 20, 2 ⁇ SSC / 0.2% SDS solution, ultrapure water, etc.
  • the presence or absence of each gene mutation in BRAF and TERT in the diagnosis subject can be determined simultaneously.
  • the subject to be diagnosed is usually a human, and is not particularly limited to race, etc., but is particularly preferably a yellow race, preferably an East Asian race, and particularly preferably a Japanese race.
  • the subject to be diagnosed can be a patient suspected of having papillary thyroid cancer.
  • Thyroid tissue is used as the measurement sample derived from the diagnostic subject.
  • DNA is extracted from the sample collected from the subject.
  • the extraction means is not particularly limited.
  • a DNA extraction method using phenol / chloroform, ethanol, sodium hydroxide, CTAB, or the like can be used.
  • an amplification reaction is performed using the obtained DNA as a template to amplify a 228C> T gene mutation and a 250C> T gene mutation in the region containing the V600E gene mutation and the TERT promoter region.
  • amplification reaction polymerase chain reaction (PCR), LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification), ICAN (Isothermal Chimeric primer-initiateditiAmplificationmplof Nucleic acids), or the like can be applied.
  • PCR polymerase chain reaction
  • LAMP Loop-Mediated Isothermal Amplification
  • ICAN Isothermal Chimeric primer-initiateditiAmplificationmplof Nucleic acids
  • the method for labeling the amplified nucleic acid is not particularly limited, and for example, a method in which a primer used for the amplification reaction is labeled in advance may be used, or a labeled nucleotide is used as a substrate in the amplification reaction. May be used.
  • the labeling substance is not particularly limited, but a radioisotope, a fluorescent dye, or an organic compound such as digoxigenin (DIG) or biotin can be used.
  • this reaction system includes a buffer necessary for nucleic acid amplification and labeling, a heat-resistant DNA polymerase, the above-mentioned primer set for BRAF and primer set for TERT, a primer specific to an amplification region, a labeled nucleotide triphosphate (specifically, Is a reaction system containing nucleotide triphosphate to which a fluorescent label or the like is added), nucleotide triphosphate, magnesium chloride, and the like.
  • a buffer necessary for nucleic acid amplification and labeling includes a heat-resistant DNA polymerase, the above-mentioned primer set for BRAF and primer set for TERT, a primer specific to an amplification region, a labeled nucleotide triphosphate (specifically, Is a reaction system containing nucleotide triphosphate to which a fluorescent label or the like is added), nucleotide triphosphate, magnesium chloride, and the like.
  • the hybridization reaction is preferably performed under stringent conditions.
  • Stringent conditions refer to conditions under which a specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed.For example, after a hybridization reaction at 50 ° C. for 16 hours, 2 ⁇ SSC / 0.2% SDS, 25 Washing conditions are as follows: 10 ° C., 10 minutes and 2 ⁇ SSC, 25 ° C., 5 minutes.
  • the hybridization temperature can be 45 to 60 ° C.
  • the presence or absence of the gene mutation can be evaluated using the signal intensity from the mutant probe and the common probe.
  • the signal intensity of the common probe and the signal intensity of the mutant probe are measured, and a determination value for evaluating the signal intensity derived from the mutant probe is calculated. Examples of the calculation of the determination value include a method using the formula: [signal intensity derived from mutant probe] / [signal intensity derived from common probe].
  • the determination value calculated by the above equation is compared with a predetermined threshold value (cutoff value). If the determination value exceeds the threshold value, it is determined that the amplified nucleic acid contains the gene mutation, and the determination value is determined. Is smaller than the threshold, it is determined that the amplified nucleic acid does not contain the gene mutation.
  • the threshold is not particularly limited, for example, calculated by the above equation using a sample that has been determined to be a wild type having no V600E gene mutation and 228C> T gene mutation and 250C> T gene mutation It can be defined based on the determined determination value. More specifically, a plurality of determination values are calculated using a plurality of samples that have been determined to be wild-type having no V600E gene mutation and 228C> T gene mutation and 250C> T gene mutation, and the average thereof is calculated.
  • the value + 6 ⁇ ( ⁇ : standard deviation) can be used as the threshold.
  • the value of the average value + 3 ⁇ , the average value + 2 ⁇ , or the average value + ⁇ can be used as the threshold value.
  • a blocking nucleic acid fragment corresponding to a mutation other than the specific mutation may be used. It is preferable. Therefore, in a target nucleic acid having a predetermined gene mutation, and a hybridization buffer composition of a mutation detection probe that specifically hybridizes to the target nucleic acid, other than the predetermined gene mutation in the target nucleic acid other than the predetermined gene mutation It is preferable to include a blocking nucleic acid fragment that hybridizes preferentially to a non-target nucleic acid having a gene mutation as compared to a target nucleic acid.
  • Such a blocking nucleic acid fragment is designed to have a base sequence complementary to a non-target nucleic acid.
  • the probe can be designed based on the same concept as when designing a probe.
  • the base length can be 10 to 40 bases, preferably 15 to 35 bases.
  • gene mutations other than the predetermined gene mutation to be detected may be present in the nucleic acid fragment amplified for detecting the predetermined gene mutation, and a probe for detecting the predetermined gene mutation may be used.
  • a blocking nucleic acid fragment when other gene mutations can exist within a range where the probe hybridizes.
  • the utility is high when the base sequence of a given gene mutation partially overlaps the base sequence of another gene mutation.
  • the wild-type corresponding to the gene mutation is positioned as a non-target nucleic acid so that high detection sensitivity can be obtained even if the mutation ratio is small, and it is used for blocking against the wild-type. It preferably contains nucleic acid fragments.
  • the hybridization buffer composition containing the blocking nucleic acid fragment As described above, by using the hybridization buffer composition containing the blocking nucleic acid fragment, non-specific hybridization between the non-target nucleic acid and the mutation detection probe is prevented, and the target nucleic acid and the mutation detection probe are prevented.
  • the target nucleic acid can be detected with high accuracy based on the specific hybridization with the target nucleic acid.
  • the concentration of the blocking nucleic acid is not particularly limited, but is at least 1 times the nucleic acid concentration of the nucleic acid mixture comprising the amplified target nucleic acid and the non-target nucleic acid. Is preferable.
  • the concentration is at least one-fold the concentration of a nucleic acid mixture comprising an amplified target nucleic acid and a non-target nucleic acid. It is preferable to adjust the amount of the blocking nucleic acid as described above.
  • the upper limit of the concentration range of the blocking nucleic acid is not particularly limited, but is preferably, for example, not more than the concentration of the added primer set.
  • the nucleic acid concentration of the nucleic acid mixture can be measured according to a standard method. For example, after purifying the reaction solution after the nucleic acid amplification reaction, absorbance at a wavelength of 260 nm is measured using a spectrophotometer, and the measured value is converted into a nucleic acid concentration. Thereby, the nucleic acid concentration of the nucleic acid mixture obtained by the nucleic acid amplification reaction can be measured.
  • the nucleic acid concentration of the nucleic acid mixture can be measured by intercalating the amplification product with a fluorescent dye such as SYBR Gold, Pico Green, etc., and measuring the absorbance at around 600 nm.
  • the nucleic acid concentration of the nucleic acid mixture can be measured by detecting the electrophoretic band of the amplification product by electrophoresis and comparing the detected electrophoretic band with the electrophoretic band of a known concentration of nucleic acid.
  • the hybridization buffer composition according to the present invention contains a blocking nucleic acid corresponding to a gene mutation different from the gene mutation to be detected
  • the hybridization buffer composition contains a gene mutation different from the gene mutation to be detected.
  • Non-specific hybridization between the target nucleic acid and the nucleic acid probe can be suppressed, and specific hybridization between the target nucleic acid containing the gene mutation to be detected and the nucleic acid probe can be prevented from being inhibited.
  • the hybridization buffer composition according to the present invention for example, even when a plurality of types of mutations are present at a predetermined position, a target nucleic acid having a mutation for the purpose of detection can be highly accurately detected by a nucleic acid probe. Can be detected.
  • the gene mutation having a plurality of types of mutations at predetermined positions is not limited to the above-described substitution mutation for valine at position 600 in BRAF, and includes, for example, KRAS (v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog And G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V and the like.
  • KRAS v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog And G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V and the like.
  • primers were designed that can simultaneously amplify a region having a V600E gene mutation in BRAF and a region having a 228C> T gene mutation and a 250C> T gene mutation in the TERT promoter region.
  • the nucleic acid amplification reaction for amplifying each of these regions and the method for detecting a nucleic acid fragment obtained by the nucleic acid amplification reaction with a DNA chip are as described in the [Experiment] section described later.
  • the following primer sets A to E were designed to amplify a region having a V600E gene mutation in BRAF, and as shown in Table 2, the TERT promoter region
  • the following primer sets F to I were designed.
  • FIG. Indicated the results of detection of the amplified nucleic acid fragments with the BRAF common probe and the TERT common probe are shown in FIG. Indicated.
  • the primer set B when the primer set B was used for BRAF and the primer set H was used for the TERT promoter region, the best fluorescence intensity could be observed.
  • a region having a V600E gene mutation in BRAF was amplified by a nucleic acid amplification reaction using primer set B, and a 228C> T gene mutation and 250C> T gene in the TERT promoter region were amplified by a nucleic acid amplification reaction using primer set H. It has been found that it is preferable to amplify a region having a mutation.
  • FIG. 5 shows the respective concentrations of the primer set B and the primer set H in the nucleic acid amplification reaction.
  • the concentration of the primer set H was 0.4 ⁇ M or more and 0.6 ⁇ M or less
  • Example 2 In this example, using the primer set B and the primer set H designed in Example 1, a sample containing only wild type (wild type sample) and a sample containing 5% of gene mutation (5% mutant sample) We examined whether it could be detected with high accuracy. Also in this example, the nucleic acid amplification reaction and the method of detecting a nucleic acid fragment obtained by the nucleic acid amplification reaction with a DNA chip are as described in the [Experiment] section described later.
  • a wild-type specimen and a 5% mutant specimen were prepared as follows.
  • the wild-type specimen was obtained by purchasing wild-type genomic DNA derived from a cell line, measuring the concentration with a fluorometer, and adjusting the concentration to 2 ng / ⁇ L with a TE buffer (pH 8.0, Tris-EDTA).
  • a 50% V600E mutant genomic DNA derived from a cell line was purchased, prepared to 2 ng / ⁇ L in the same manner as described above, and further mixed with a wild-type BRAF specimen (2 ng / ⁇ L) and 9: It was prepared by mixing at a ratio of 1 (wild-type genomic DNA: 50% V600E mutant genomic DNA).
  • 5% mutant samples for TERT are artificial gene (plasmid DNA) with BRAF wild type sequence, plasmid DNA with TERT wild type sequence, plasmid DNA with TERT mutant sequence (228C> T gene mutation, 250C> T gene mutation are separately purchased, and after measuring the concentration with a fluorometer, prepare with TE buffer (pH 8.0, Tris-EDTA) to 1320 copies / ⁇ L (corresponding to genomic DNA 4 ng / ⁇ L). A solution obtained by mixing a plasmid DNA having the TERT wild-type sequence and a plasmid DNA having the TERT mutant sequence in a ratio of 95: 5 is mixed with an equal amount of the plasmid DNA having the BRAF wild-type sequence (1320 copies / ⁇ L). It was prepared (660 genes / ⁇ L of each target gene (equivalent to genomic DNA 2 ng / ⁇ L)).
  • Example 3 In this example, a specimen containing a gene mutation other than the V600E gene mutation in BRAF was prepared, and the effectiveness of the blocking nucleic acid fragment corresponding to the other gene mutation was evaluated. Also in this example, the nucleic acid amplification reaction and the method of detecting a nucleic acid fragment obtained by the nucleic acid amplification reaction with a DNA chip are as described in the [Experiment] section described later.
  • a wild-type specimen and a mutant specimen were prepared as follows.
  • a sample containing 5% of the V600E gene mutation (5% V600E), a sample containing 50% of the V600R gene mutation (50% V600R), and a sample containing 50% of the V600K gene mutation (50% V600K)
  • a sample containing 50% of the V600G gene mutation (50% V600G), a sample containing 50% of the V600M gene mutation (50% V600M), and a sample containing 50% of the V600D gene mutation (50% V600D) were prepared.
  • the wild-type specimen and the 5% V600E mutant specimen used were those prepared in Example 2.
  • 50% V600R mutant sample, 50% V600K mutant sample, 50% V600G mutant sample and 50% V600M mutant sample separately purchased each 50% mutated genomic DNA from the cell line, and after measuring the concentration with a fluorometer, Those prepared at 2 ng / ⁇ L with a TE buffer (pH 8.0, Tris-EDTA) were used.
  • the 50% V600D mutant specimen is obtained by separately purchasing a plasmid DNA having the BRAF wild-type sequence, a plasmid DNA having the V600D mutant sequence, and a plasmid DNA having the TERT wild-type sequence, measuring the concentration with a fluorometer, and then using a TE buffer. (pH 8.0, Tris-EDTA) to make 1320 copies / ⁇ L (corresponding to genomic DNA 4 ng / ⁇ L).
  • the plasmid DNA having the BRAF wild-type sequence and the plasmid DNA having the V600D mutant type The mixed solution was prepared by mixing equal amounts of the plasmid DNA having the TERT wild-type sequence (1320 copies / ⁇ L) (each target gene 660 copies / ⁇ L (corresponding to genomic DNA 2 ng / ⁇ L)).
  • FIG. 7 shows the calculation results of the determination values when only the blocking nucleic acid fragment corresponding to the wild type was added to the reaction solution after the nucleic acid amplification reaction.
  • a sample containing the V600D gene mutation and the V600K genetic mutation was determined as positive. This was considered to be the result of nonspecific hybridization of the amplified nucleic acid containing the V600D gene mutation or the V600K hereditary mutation with the BRAF ⁇ V600E mutant probe.
  • the blocking nucleic acid fragment corresponding to the V600D gene mutation and the blocking nucleic acid fragment corresponding to the V600K genetic mutation are used in the reaction solution after the nucleic acid amplification reaction.
  • the judgment value was calculated.
  • the result is shown in FIG.
  • the amplified nucleic acid containing the V600D gene mutation or the V600K genetic mutation and the BRAF V600E mutant probe were non-specifically hybridized with the blocking nucleic acid fragment, and as a result, the specimen containing the V600E gene mutation was detected. Has been found to be able to be detected with high accuracy.
  • primer set B shown in Table 1 and primer set H shown in Table 2 were used, respectively.
  • the amplification product obtained by the nucleic acid amplification reaction and the hybridization buffer were mixed at a volume ratio of 2: 1.
  • As the hybridization buffer a solution prepared to have a concentration of 2.25 ⁇ SSC / 0.225% 25SDS was used.
  • 228C> T mutant probe 1 corresponds to a sequence having only 228C> T gene mutation
  • 250C> T mutant probe 1 corresponds to a sequence having only 250C> T gene mutation.
  • 228C> T gene mutations and 250C> T gene mutations there is a non-detection target mutation in the vicinity, and both the detection target mutation and the non-detection target mutation (unlike BRAF) There is.
  • the base sequences of the 228C> T mutant probe 2 and the 250C> T mutant probe 2 are adjusted so that the target mutation can be detected even if there is a non-detection target mutation in the same amplification product.
  • the DNA chip was placed in a preheated bat, transferred to a hybridization oven, and subjected to a hybridization reaction at 58 ° C for 60 minutes. After completion of the reaction, the hybrid cover was immediately removed, and the DNA chip was washed with a washing solution (1 ⁇ SSC / 0.1% SDS solution, liquid temperature: 20 to 30 ° C.) for 5 minutes. Then, it was rinsed with 1 ⁇ SSC solution.
  • the fluorescence intensity on the DNA chip was measured using a fluorescence detector, and a judgment value was calculated based on the obtained fluorescence intensity.
  • Judgment value fluorescence intensity of mutant probe DNA / fluorescence intensity of common probe DNA
  • TERT when at least one of the probes 1 or 2 was larger than the cutoff value, it was determined to be mutation positive.
  • the BRAF wild-type blocker, the V600D blocker and the V600K blocker are 225 ⁇ M
  • the TERT wild-type blocker (C228T) and the TERT wild-type blocker (C250T) are 300 ⁇ M.
  • Table 7 shows the blocking nucleic acid fragments used.

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Abstract

BRAF V600E遺伝子変異、TERT 228C>T遺伝子変異及びTERT 250C>T遺伝子変異を同時に検査する。　BRAF V600E変異型プローブと、TERT 228C>T変異型プローブと、TERT 250C>T変異型プローブと、BRAF用プライマーセットと、TERT用プライマーセットとを含むキット。

Description

甲状腺乳頭癌の予後予測に関連する遺伝子変異評価用キット
　本発明は、甲状腺乳頭癌の予後に関連する遺伝子変異を評価できる遺伝子変異評価用キット、当該遺伝子変異評価用キットを用いた甲状腺乳頭癌の予後予測に関するデータ分析方法に関する。
　甲状腺癌の年間罹患数は年々増加傾向にある。甲状腺癌のなかでも甲状腺乳頭癌（papillary thyroid cancer）は甲状腺癌の約9割を占め、その再発率は5～20%程度である。近年、甲状腺乳頭癌の予後予測の指標として、BRAF（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1）タンパク質における特定の変異、すなわち600番目のバリンがグルタミン酸となる変異（V600E遺伝子変異）と、TERT（telomerase reverse transcriptase）遺伝子のプロモータ領域における228番目のシトシンがチミンとなる変異（228C>T遺伝子変異）及び250番目のシトシンがチミンとなる変異（250C>T遺伝子変異）が注目されている（非特許文献１）。
　すなわち、BRAFタンパク質におけるV600E遺伝子変異、TERTプロモータ領域における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を有する甲状腺乳頭癌患者については、再発の可能性が比較的高いと評価され、当該評価に基づいて適切な治療方針を決定することができる。
Michiko Matsuse, Tomonori Yabuta, Vladimir Saenko, Mitsuyoshi Hirokawa Eijun Nishihara, Keiji Suzuki, Shunichi Yamashita, Akira Miyauchi & Norisato Mitsutake, Scientific Reports | 7:41752 | DOI: 10.1038/srep41752(2017)
　しかしながら、これらBRAFタンパク質におけるV600E遺伝子変異、TERTプロモータ領域における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を同定するには、それぞれ独立して検査を実施しなければならず、検査に要する費用や迅速な判断ができないといった問題があった。
　そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、これらBRAFタンパク質におけるV600E遺伝子変異、TERTプロモータ領域における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を同時に検査することができる遺伝子変異評価用キット及びこれを用いた甲状腺乳頭癌の予後予測に関するデータ分析方法を提供することを目的とする。
　本発明は以下を包含する。
　（１）BRAF（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1）におけるV600E遺伝子変異（1799T>A）に特異的にハイブリダイズするBRAF V600E変異型プローブと、
　TERT（telomerase reverse transcriptase）プロモータ領域における228C>T遺伝子変異に特異的にハイブリダイズするTERT 228C>T変異型プローブと、
　TERTプロモータ領域における250C>T遺伝子変異に特異的にハイブリダイズするTERT 250C>T変異型プローブと、
　BRAF遺伝子におけるV600E遺伝子変異を含む領域を増幅するBRAF用プライマーセットと、
　TERT遺伝子における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を含む領域を増幅するTERT用プライマーセットと
　を含む、甲状腺乳頭癌の予後予測に関連する遺伝子変異評価用キット。
　（２）上記BRAF用プライマーセットは、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーからなることを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（３）上記TERT用プライマーセットは、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーからなることを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（４）上記BRAF用プライマーセットは、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーからなり、
　上記TERT用プライマーセットは、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーからなり、
　上記TERT用プライマーセットの濃度を0.2μＭ以上、0.6μＭ以下とすることを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（５）上記BRAF用プライマーセット及び上記TERT用プライマーセットの濃度比を、（BRAF用プライマーセット濃度）：（TERT用プライマーセット濃度）＝４：１～２：１とすることを特徴とする（４）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（６）BRAFにおける600番目のバリン（V600）に対するV600E以外の遺伝子変異にハイブリダイズするブロッキング用核酸断片を更に含むことを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（７）上記V600E以外の遺伝子変異は、V600D遺伝子変異、V600K遺伝子変異、V600R遺伝子変異、V600G遺伝子変異及びV600M遺伝子変異からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子変異であることを特徴とする（６）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（８）上記ブロッキング用核酸断片はV600D遺伝子変異又はV600K遺伝子変異に特異的にハイブリダイズするものであることを特徴とする（６）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（９）上記BRAF用プライマーセットにより増幅される野生型BRAF断片及び600番目のバリンに相当する位置に変異を有する変異型BRAF断片の何れにもハイブリダイズするBRAF用共通プローブを更に備えることを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（１０）上記TERT用プライマーセットにより増幅される野生型TERT断片及び228番目のシトシン及び/又は250番目のシトシンに相当する位置に変異を有する変異型TERT断片の何れにもハイブリダイズするTERT用共通プローブを更に備えることを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（１１）上記BRAF V600E変異型プローブ、上記TERT 228C>T変異型プローブ及び上記TERT 250C>T変異型プローブが担体に固定されたマイクロアレイを備えることを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（１２）所定の遺伝子変異を有するターゲット核酸と、当該ターゲット核酸に対して特異的にハイブリダイズする変異用検出プローブとのハイブリダイゼーション用バッファー組成物であって、
　ターゲット核酸における所定の遺伝子変異以外の他の遺伝子変異を有する非ターゲット核酸に対して、ターゲット核酸と比して優先的にハイブリダイズするブロッキング用核酸断片を含むハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
　（１３）上記ブロッキング用核酸断片は、非ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を有することを特徴とする（１２）記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
　（１４）上記ターゲット核酸は、BRAF（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1）におけるV600E遺伝子変異（1799T>A）を含む核酸断片であり、
　上記変異検出用プローブは、当該核酸断片に特異的にハイブリダイズするBRAF V600E変異型プローブであり、
　上記非ターゲット核酸は、V600D遺伝子変異又はV600K遺伝子変異を含む核酸断片であり、
　上記ブロッキング用核酸断片は、V600D遺伝子変異を含む核酸断片又はV600K遺伝子変異を含む核酸断片に優先的にハイブリダイズすることを特徴とする（１２）記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
　（１５）上記（１）～（１１）いずれか記載の遺伝子変異評価用キットを用い、診断対象者について、BRAF（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1）におけるV600E遺伝子変異、TERT（telomerase reverse transcriptase）プロモータ領域における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を同時に同定する、甲状腺乳頭癌の予後予測に関するデータ分析方法。
　（１６）上記遺伝子変異評価用キットは、上記各遺伝子変異に関する変異型プローブと、遺伝子変異を有する変異型及び変異を有しない野生型にハイブリダイズする共通プローブを備えるマイクロアレイであり、当該マイクロアレイを用いて変異型プローブ及び共通プローブに由来するシグナルを測定し、式：[変異型プローブのシグナル強度]/[共通型プローブのシグナル強度]により各遺伝子変異ついて判定値を算出し、判定値が予め規定したカットオフ値を上回る場合に上記遺伝子変異を有すると判定する、（１５）記載のデータ分析方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-181141号の開示内容を包含する。
　本発明に係る遺伝子変異評価用キットによれば、甲状腺乳頭癌の予後予測に関連する3つの遺伝子変異を同時に検査することができる。したがって、本発明に係る遺伝子変異評価用キットを用いることで、甲状腺乳頭癌の予後予測を低コスト且つ迅速に行うことができる。
　また、本発明に係る甲状腺乳頭癌の予後予測に関するデータ分析方法は、甲状腺乳頭癌の予後予測に関連する3つの遺伝子変異を同時に検査できる遺伝子変異評価用キットを用いるため、甲状腺乳頭癌の予後予測を低コスト且つ迅速に行うことができる。
V600E遺伝子変異を含むBRAF遺伝子の一部（配列番号５）を示す特性図である。 228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を含むTERTプロモータ領域の一部（配列番号６）を示す特性図である。 プライマーセットA～E及びプライマーセットF～Iをそれぞれ単独で用いて核酸増幅反応を行った結果を示す電気泳動図である。 プライマーセットA～E、H及びIをそれぞれ単独で用いて核酸増幅反応を行い、増幅した核酸断片をBRAF用共通プローブ及びTERT用共通プローブで検出した結果を示す特性図である。 プライマーセットB及びプライマーセットHを濃度及び比率を変えて同時核酸増幅反応を行い、増幅した核酸断片をBRAF用共通プローブ及びTERT用共通プローブで検出した結果を示す特性図である。 プライマーセットB及びプライマーセットHを使用し、野生型検体と5%変異検体とを検出した結果を示す特性図である。 野生型検体及び様々なV600変異検体について核酸増幅反応後の反応液に野生型に対応するブロッキング用核酸断片のみを加えた場合の判定値を計算した結果を示す特性図である。 野生型検体及び様々なV600変異検体について核酸増幅反応後の反応液に野生型に対応するブロッキング用核酸断片、V600D遺伝子変異に対応するブロッキング用核酸断片及びV600K遺伝性変異に対応するブロッキング用核酸断片を加えた場合の判定値を計算した結果を示す特性図である。
　本発明に係る甲状腺乳頭癌の予後予測に関する遺伝子変異評価用キットは、BRAFタンパク質におけるV600E遺伝子変異、TERTプロモータ領域における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異に関するものである。これらBRAF及びTERTにおける遺伝子変異は、Scientific Reports | 7:41752 | DOI: 10.1038/srep41752(2017)において甲状腺乳頭癌の予後（再発）に関連するとされている遺伝子変異である。
　本発明に係る遺伝子変異評価用キットは、これらBRAFタンパク質におけるV600E遺伝子変異を同定するためのBRAF V600E変異型プローブと、TERTプロモータ領域における228C>T遺伝子変異を同定するためのTERT 228C>T変異型プローブと、TERTプロモータ領域における250C>T遺伝子変異を同定するためのTERT 250C>T変異型プローブとを含んでいる。また、本発明に係る遺伝子変異評価用キットは、V600E遺伝子変異を含む所定の領域を増幅するBRAF用プライマーセットと、228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を含む所定の領域を増幅するTERT用プライマーセットとを含んでいる。すなわち、本発明に係る遺伝子変異評価用キットを利用する場合、BRAF用プライマーセットを用いて増幅した核酸断片に含まれるV600E遺伝子変異を、BRAF V600E変異型プローブにて同定することができる。また、本発明に係る遺伝子変異評価用キットを利用する場合、TERT用プライマーセットを用いて増幅した核酸断片に含まれる228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を、それぞれTERT 228C>T変異型プローブ及びTERT 250C>T変異型プローブにて同定することができる。
　図１にV600E遺伝子変異を含むBRAF遺伝子の一部（配列番号５）を示す。図１に示すようにV600E遺伝子変異は、開始コドン（ATG）のうちAを1番目（図１には示さず）として1799番目のTがAとなることで、BRAFタンパク質のN末端から数えて600番目のバリンがグルタミン酸に変異することとなる。したがって、BRAF用プライマーセットは、この1799番目の塩基を含む領域を増幅するようにフォワードプライマー及びリバースプライマーとして設計される。BRAF用プライマーセットの一例としては、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーを挙げることができる。
　但し、BRAF用プライマーセットとしては、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーからなるセットに限定されず、図１に示したBRAF遺伝子の一部に基づいて適宜設計することができる。例えば、フォワードプライマーとしては、図１に示したBRAF遺伝子の一部において、配列番号１の塩基配列よりも５’側（上流）方向に数塩基、例えば２０塩基、好ましくは１０塩基、より好ましくは５塩基ずれた位置にフォワードプライマーを設計しても良い。同様に、リバースプライマーとしては、図１に示したBRAF遺伝子の一部において、配列番号２の塩基配列よりも５’側（上流）又は３’側（下流）方向に数塩基、例えば２０塩基、好ましくは１０塩基、より好ましくは５塩基ずれた位置にリバースプライマーを設計しても良い。
　また、図２に228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を含むTERTプロモータ領域の一部（配列番号６）を示す。図２に示すように228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異は、TERT遺伝子の転写開始点から５’末端側の上流に向かって数えて228番目のCがT、250番目のCがTとなる変異である。したがって、TERT用プライマーセットは、これら228番目及び250番目を含む領域を増幅するようにフォワードプライマー及びリバースプライマーとして設計される。TERT用プライマーセットの一例としては、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーを挙げることができる。
　但し、TERT用プライマーセットとしては、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーからなるセットに限定されず、図２に示したTERTプロモータ領域の一部に基づいて適宜設計することができる。例えば、フォワードプライマーとしては、図２に示したTERTプロモータ領域の一部において、配列番号３の塩基配列よりも５’側（上流）又は３’側（下流）方向に数塩基、例えば１０塩基、好ましくは５塩基ずれた位置にフォワードプライマーを設計しても良い。同様に、リバースプライマーとしては、図２に示したTERTプロモータ領域の一部において、配列番号４の塩基配列よりも５’側（上流）又は３’側（下流）方向に数塩基、例えば１０塩基、好ましくは５塩基ずれた位置にリバースプライマーを設計しても良い。
　以上のように設計された、本発明に係るBRAF用プライマーセット及びTERT用プライマーセットは、被験者のゲノムDNAを鋳型とした核酸増幅反応により、それぞれ目的とする核酸断片を同時に増幅することができる。
　また、以上のように設計された、本発明に係るBRAF用プライマーセット及びTERT用プライマーセットにより増幅された核酸断片は、検出対象の遺伝子変異の有無に拘わらずハイブリダイズするように設計したプローブ（共通プローブ）により検出することができる。より具体的に、BRAF用プライマーセット及びTERT用プライマーセットにより増幅された核酸断片は、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に蛍光標識化合物を結合させておくことにより、共通プローブにおける蛍光強度に基づいて検出することができる。
　ここで、BRAF用プライマーセットにより増幅した核酸断片を検出するためのBRAF用共通プローブとしては、BRAFタンパク質における600番目のバリンをコードするコドンを含まない領域にハイブリダイズするように設計する。一例としては、図１に示したBRAF遺伝子の一部において、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとに挟み込まれる領域のなかからGGTCCCATCAGTTTGAAC（配列番号７）をBRAF用共通プローブとして設計することができる。
　TERT用プライマーセットにより増幅した核酸断片を検出するためのTERT用共通プローブとしては、TERTプロモータ領域における228番目及び250番目の塩基を含まない領域にハイブリダイズするように設計する。一例としては、図２に示したTERTプロモータ領域の一部において、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーとに挟み込まれる領域のなかからACGGGGCGGGGTCCG（配列番号８）をTERT用共通プローブとして設計することができる。
　特に、本発明に係る遺伝子変異評価用キットにおいては、TERT用プライマーセットの濃度を0.2μＭ～0.6μＭとすることが好ましく、0.4μＭとすることがより好ましい。TERT用プライマーセットをこの範囲の濃度としてBRAF用プライマーセットとともに核酸増幅反応を行うことで、得られた核酸断片を、上述したBRAF用共通プローブ及びTERT用共通プローブにより蛍光強度のバラツキがなく高精度に検出することができる。
　特に、TERT用プライマーセットを上記範囲の濃度とし、且つ、BRAF用プライマーセット及びTERT用プライマーセットの濃度比を、（BRAF用プライマーセット濃度）：（TERT用プライマーセット濃度）＝４：１～２：１とすることが好ましい。TERT用プライマーセットを上記範囲の濃度とし、且つ、BRAF用プライマーセット及びTERT用プライマーセットの濃度比をこの範囲とすることによって、核酸増幅反応で得られた増幅断片を、上述したBRAF用共通プローブ及びTERT用共通プローブにより蛍光強度のバラツキを更に抑えることができ、更に高精度に検出することができる。
　一方、本発明に係る遺伝子変異評価用キットにおいて、V600E遺伝子変異（1799T>A）に特異的にハイブリダイズするBRAF V600E変異型プローブとしては、上述した1799番目の塩基Aを検出する塩基配列を有するプローブとして設計することができる。言い換えると、BRAF V600E変異型プローブは、上述したBRAF用プライマーセットにより増幅した増幅断片における検出対象塩基（1799番目の塩基）がAの場合、増幅核酸とハイブリダイズするように設計する。
　また、本発明に係る遺伝子変異評価用キットにおいて、228C>T遺伝子変異に特異的にハイブリダイズするTERT 228C>T変異型プローブとしては、上述した228番目の塩基Tを検出する塩基配列を有するプローブとして設計することができる。言い換えると、TERT 228C>T変異型プローブは、上述したTERT用プライマーセットにより増幅した増幅断片における検出対象塩基（228番目の塩基）がTの場合、増幅核酸とハイブリダイズするように設計する。
　さらに、本発明に係る遺伝子変異評価用キットにおいて、250C>T遺伝子変異に特異的にハイブリダイズするTERT 250C>T変異型プローブとしては、上述した250番目の塩基Tを検出する塩基配列を有するプローブとして設計することができる。言い換えると、TERT 250C>T変異型プローブは、上述したTERT用プライマーセットにより増幅した増幅断片における検出対象塩基（250番目の塩基）がTの場合、増幅核酸とハイブリダイズするように設計する。
　これらプローブの塩基長としては、特に限定しないが、例えば１０～４０塩基長とすることができ、１５～３５塩基長とすることが好ましい。なお、プローブは、上述のように、検出目的の遺伝子変異を含む領域に基づいて設計した塩基配列と、当該塩基配列における一方又は両方の末端に付加した塩基配列とを合計して、例えば１０～４０塩基長とすることができ、２０～３５塩基長とすることが好ましい。
　また、上述のように設計したプローブは、好ましくは核酸であり、より好ましくはDNAである。DNAには二本鎖も一本鎖も含まれるが、好ましくは一本鎖DNAである。プローブは、例えば、核酸合成装置によって化学的に合成することで取得することができる。核酸合成装置としては、DNAシンセサイザー、全自動核酸合成装置、核酸自動合成装置等と呼ばれる装置を使用することができる。
　ところで、本発明に係る遺伝子変異評価用キットは、BRAFにおける600番目のバリン（V600）に対するV600E以外の遺伝子変異にハイブリダイズするブロッキング用核酸断片を更に含むことが好ましい。当該ブロッキング用核酸は、BRAF用プライマーセットにより増幅された核酸断片のうちV600E以外の遺伝子変異を有する核酸断片の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する。V600E以外の遺伝子変異としては、例えば、V600D遺伝子変異、V600K遺伝子変異、V600R遺伝子変異、V600G遺伝子変異及びV600M遺伝子変異を挙げることができる。
　ブロッキング用核酸断片としては、これらV600E以外の遺伝子変異の全てに対応するよう複数種類を準備しても良いが、これらV600E以外の遺伝子変異から選ばれる一部の遺伝子変異に対応するよう準備しても良い。特に、ブロッキング用核酸断片としては、V600D遺伝子変異に対応するブロッキング用核酸断片及び/又はV600K遺伝子変異に対応するブロッキング用核酸断片を使用することが好ましい。
　以上のように、本発明に係る遺伝子変異評価用キットは、V600E以外の遺伝子変異に対応するブロッキング用核酸を含むため、BRAF用プライマーセットによりV600E以外の遺伝子変異を有する増幅核酸が得られた場合であっても、V600E以外の遺伝子変異を有する増幅核酸とBRAF V600E変異型プローブとの非特異的なハイブリダイズを抑制することができ、V600E遺伝子変異を有する増幅核酸とBRAF V600E変異型プローブとの特異的なハイブリダイズが阻害されることを防止できる。このため、V600E以外の遺伝子変異に対応するブロッキング用核酸を使用することによって、V600E遺伝子変異の有無を高精度に検出することができる。
　本発明に係る遺伝子変異評価用キットにおいて、上述したように設計したBRAF V600E変異型プローブ、TERT 228C>T変異型プローブ及びTERT 250C>T変異型プローブは、その５’末端を担体上に固定化することにより、マイクロアレイ（一例としてDNAチップ）の形態で用いるのが好ましい。
　このとき、マイクロアレイは、上述した各遺伝子変異について、変異型プローブ及び上述した共通プローブを有することが好ましい。各遺伝子変異について、変異型プローブと共通プローブとを利用することによって、変異の有無のみならず変異の割合を正確に判定することができる。
　担体の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されない。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンおよびそれらの化合物などの貴金属、およびグラファイト、カ－ボンファイバ－に代表される炭素などの導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表されるシリコン材料、SOI（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表されるこれらシリコン材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、環状ポリオレフィン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。担体の形状も特に制限されないが、好ましくは平板状である。
　本発明においては、担体として、好ましくは表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体を用いる。表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体には、基板の表面にカーボン層と化学修飾基とを有するもの、およびカーボン層からなる基板の表面に化学修飾基を有するものが包含される。基板の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されず、上述の担体材料として挙げたものと同様のものを使用できる。
　本発明に係るマイクロアレイにおいては、微細な平板状の構造を有する担体が好適に用いられる。形状は、長方形、正方形および丸形など限定されないが、通常、1～75mm四方のもの、好ましくは1～10mm四方のもの、より好ましくは3～5mm四方のものを用いる。微細な平板状の構造の担体を製造しやすいことから、シリコン材料や樹脂材料からなる基板を用いるのが好ましく、特に単結晶シリコンからなる基板の表面にカーボン層および化学修飾基を有する担体がより好ましい。単結晶シリコンには、部分部分でごくわずかに結晶軸の向きが変わっているものや（モザイク結晶と称される場合もある）、原子的尺度での乱れ(格子欠陥)が含まれているものも包含される。
　本発明において基板上に形成させるカーボン層としては、特に制限されないが、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、またはそれらを積層させたものを用いることが好ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を用いてもよい。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（DLC：Diamond Like Carbon）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。カーボン層は、化学的安定性に優れておりその後の化学修飾基の導入や分析対象物質との結合における反応に耐えることができる点、分析対象物質と静電結合によって結合するためその結合が柔軟性を持っている点、UV吸収がないため検出系UVに対して透明性である点、およびエレクトロブロッティングの際に通電可能な点において有利である。また、分析対象物質との結合反応において、非特異的吸着が少ない点においても有利である。前記のとおり基板自体がカーボン層からなる担体を用いてもよい。
　本発明においてカーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマCVD(Chemical vapor deposit）法、ECRCVD(Electric cyclotron resonance chemical vapor deposit）法、ICP(Inductive coupled plasma）法、直流スパッタリング法、ECR(Electric cyclotron resonance)スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法、EB(Electron beam)蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。
　高周波プラズマCVD法では、高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス（メタン）を分解し、基板上にカーボン層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼン）を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基板上にカーボン層を形成する。水素ガス1～99体積％と残りメタンガス99～1体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりカーボン層を形成してもよい。
　アーク式蒸着法では、固体のグラファイト材料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。
　レーザ蒸着法では、例えばNd:YAGレーザ（パルス発振）光をグラファイトのターゲット板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形成することができる。
　基板の表面にカーボン層を形成する場合、カーボン層の厚さは、通常、単分子層～100μm程度であり、薄すぎると下地基板の表面が局部的に露出する可能性があり、逆に厚くなると生産性が悪くなるので、好ましくは2nm～1μm、より好ましくは5nm～500nmである。
　カーボン層が形成された基板の表面に化学修飾基を導入することにより、オリゴヌクレオチドプローブを担体に強固に固定化できる。導入する化学修飾基は、当業者であれば適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基および活性エステル基が挙げられる。
　アミノ基の導入は、例えば、カーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射することによりまたはプラズマ処理することにより実施できる。または、カーボン層を塩素ガス中で紫外線を照射して塩素化し、さらにアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。または、メチレンジアミン、エチレンジアミンで等の多価アミン類ガス中を、塩素化したカーボン層と反応させることによって実施することもできる。
　カルボキシル基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に適当な化合物を反応させることにより実施できる。カルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：X-R1-COOH（式中、Xはハロゲン原子、R1は炭素数10～12の2価の炭化水素基を表す）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、2-クロロプロピオン酸、3-クロロプロピオン酸、3-クロロアクリル酸、4-クロロ安息香酸；式：HOOC-R2-COOH（式中、R2は単結合または炭素数1～12の2価の炭化水素基を表す）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：R3-CO-R4-COOH（式中、R3は水素原子または炭素数1～12の2価の炭化水素基、R4は炭素数1～12の2価の炭化水素基を表す）で示されるケト酸またはアルデヒド酸；式：X-OC-R5-COOH（式中、Xはハロゲン原子、R5は単結合または炭素数1～12の2価の炭化水素基を表す）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。
　エポキシ基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価エポキシ化合物を反応させることによって実施できる。あるいは、カーボン層が含有する炭素＝炭素２重結合に有機過酸を反応させることにより得ることができる。有機過酸としては、過酢酸、過安息香酸、ジペルオキシフタル酸、過ギ酸、トリフルオロ過酢酸などが挙げられる。
　ホルミル基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に、グルタルアルデヒドを反応させることにより実施できる。
　ヒドロキシル基の導入は、例えば、前記のように塩素化したカーボン層に、水を反応させることにより実施できる。
　活性エステル基は、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味する。エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、N-ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。より具体的には、活性エステル基としては、たとえばp-ニトロフェニル基、N-ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基等が挙げられ、特に、N-ヒドロキシスクシンイミド基が好ましく用いられる。
　活性エステル基の導入は、例えば、前記のように導入したカルボキシル基を、シアナミドやカルボジイミド（例えば、1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミド)などの脱水縮合剤とN-ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステル化することにより実施できる。この処理により、アミド結合を介して炭化水素基の末端に、N-ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基が結合した基を形成することができる（特開2001-139532）。
　プローブを、スポッティング用バッファーに溶解してスポッティング用溶液を調製し、これを96穴もしくは384穴プラスチックプレートに分注し、分注した溶液をスポッター装置等によって担体上にスポッティングすることにより、プローブが担体に固定化されたマイクロアレイを製造することができる。または、スポッティング溶液をマイクロピペッターにて手動でスポッティングしてもよい。
　スポッティング後、プローブが担体に結合する反応を進行させるため、インキュベーションを行うことが好ましい。インキュベーションは、通常－20～100℃、好ましくは0～90℃の温度で、通常0.5～16時間、好ましくは1～2時間にわたって行う。インキュベーションは、高湿度の雰囲気下、例えば、湿度50～90％の条件で行うのが望ましい。インキュベーションに続き、担体に結合していないDNAを除去するため、洗浄液（例えば、50mM TBS/0.05% Tween20、2×SSC/0.2%SDS溶液、超純水など）を用いて洗浄を行うことが好ましい。
　以上のように構成されたマイクロアレイを用いることで、診断対象者における、BRAF及びTERTに存在する上記遺伝子変異について、それぞれの遺伝子変異の有無を同時に判定することができる。
　具体的に、BRAF及びTERTに存在する上記遺伝子変異の有無を判定する際には、診断対象者由来の試料からDNAを抽出する工程と、抽出したDNAを鋳型とし、BRAF用プライマーセット及びTERT用プライマーセットを用いて上記遺伝子変異を含むBRAFの部分領域及びTERTプロモータ部分領域をそれぞれ増幅する工程と、上述したマイクロアレイを用いて、増幅された核酸に含まれるBRAF及びTERTに存在する上記遺伝子変異の有無をそれぞれ検出する工程とを含む。
　診断対象者は通常ヒトであり、人種等には特に限定されないが、特に、黄色人種、好適には東アジア人種、特に好適には日本人とする。また、診断対象者としては、甲状腺乳頭癌が疑われる患者とすることができる。
　診断対象者由来の測定試料は、甲状腺組織を用いる。
　まず、診断対象者から採取した試料からDNAを抽出する。抽出手段としては、特に限定されない。例えばフェノール／クロロホルム、エタノール、水酸化ナトリウム、CTABなどを用いたDNA抽出法を用いることができる。
　次に、得られたDNAを鋳型として用いて増幅反応を行い、V600E遺伝子変異を含む領域、TERTプロモータ領域における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を増幅する。増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）、ICAN（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法等を適用することができる。増幅反応においては、増幅後の領域を識別できるように標識を付加することが望ましい。このとき、増幅された核酸を標識する方法としては、特に限定されないが、例えば増幅反応に使用するプライマーをあらかじめ標識しておく方法を使用してもよいし、増幅反応に標識ヌクレオチドを基質として使用する方法を使用してもよい。標識物質としては、特に限定されないが、放射性同位元素や蛍光色素、あるいはジゴキシゲニン（DIG）やビオチンなどの有機化合物などを使用することができる。
　またこの反応系は、核酸増幅・標識に必要な緩衝剤、耐熱性DNAポリメラーゼ、上述したBRAF用プライマーセット並びにTERT用プライマーセット、増幅領域に特異的なプライマー、標識ヌクレオチド三リン酸（具体的には蛍光標識等を付加したヌクレオチド三リン酸）、ヌクレオチド三リン酸及び塩化マグネシウム等を含む反応系である。
　上記のようにして得られた増幅核酸と、担体に固定されたBRAF V600E変異型プローブ、TERT 228C>T変異型プローブ及びTERT 250C>T変異型プローブとのハイブリダイゼーション反応を行い、変異型プローブに対する増幅核酸のハイブリダイズを検出することで診断対象者における上記遺伝子変異の有無を評価することができる。すなわち、変異型プローブに対して増幅核酸がハイブリダイズしたことを例えば標識を検出することにより測定できる。
　標識からのシグナルは、例えば、蛍光標識を用いた場合は、蛍光スキャナを用いて蛍光シグナル検出し、これを画像解析ソフトによって解析することによりシグナル強度を数値化することができる。ハイブリダイゼーション反応は、好ましくはストリンジェントな条件下で実施する。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、50℃で16時間ハイブリダイズ反応させた後、2×SSC/0.2% SDS、25℃、10分および2×SSC、25℃、5分の条件で洗浄する条件をさす。或いは、ハイブリダイズする温度としては、塩濃度が0.75×SSCのとき、45～60℃とすることができ、プローブの鎖長が短い場合にはハイブリダイズ温度をこれより低くすることがより好ましく、鎖長が長い場合にはハイブリダイズ温度をこれより高くとすることがより好ましい。塩濃度が高くなると特異性を有するハイブリダイズ温度は高くなり、逆に塩濃度が低くなると特異性を有するハイブリダイズ温度は低くなることはいうまでもない。
　また、上述した各遺伝子変異について変異型プローブと共通プローブとを備えるマイクロアレイを使用した場合、これら変異型プローブ及び共通プローブからのシグナル強度を用いて上記遺伝子変異の有無を評価することができる。具体的には、共通プローブにおけるシグナル強度及び変異型プローブにおけるシグナル強度をそれぞれ測定し、変異型プローブに由来するシグナル強度を評価するための判定値を算出する。判定値の算出例としては、例えば、式：[変異型プローブ由来のシグナル強度]/[共通プローブ由来のシグナル強度]を使用する方法が挙げられる。
　そして、上記式にて算出される判定値と予め定めた閾値（カットオフ値）とを比較し、判定値が閾値を上回る場合には増幅核酸に上記遺伝子変異が含まれると判断し、判定値が閾値を下回る場合には増幅核酸に上記遺伝子変異が含まれないと判断する。このように判定値を利用することで、上述したBRAF及びTERTプロモータ領域における各遺伝子変異の有無を判定することができる。
　ここで、閾値としては、特に限定されないが、例えば、V600E遺伝子変異及び228C>T遺伝子変異並びに250C>T遺伝子変異を有しない野生型であることが確定している検体を用いて上記式により算出された判定値に基づいて規定することができる。より具体的には、V600E遺伝子変異及び228C>T遺伝子変異並びに250C>T遺伝子変異を有しない野生型であることが確定している複数の検体を用いて複数の判定値を算出し、その平均値+６σ（σ：標準偏差）の値を閾値とすることができる。なお、平均値+３σ、平均値+２σや平均値+σの値を閾値とすることもできる。
　以上のように、BRAFにおけるV600E遺伝子変異、TERTプロモータ領域における228C>T遺伝子変異並びに250C>T遺伝子変異を同時に検出することで、甲状腺乳頭癌の予後予測に利用できるデータを取得することができる。すなわち、これらBRAFにおけるV600E遺伝子変異、TERTプロモータ領域における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を全て有する場合、甲状腺乳頭癌の再発可能性が比較的高いと決定することができる。
　ところで、上述したように、BRAFにおけるV600E遺伝子変異を同定する際には、ブロッキング用核酸を使用することで当該遺伝子変異を高精度に検出できることを説明した。これは、V600E遺伝子変異とは異なるV600D遺伝子変異やV600K遺伝子変異といった、塩基配列において非常に類似する他の遺伝子変異を有する核酸断片とBRAF V600E変異型プローブとの非特異的なハイブリダイズを抑制したためである。
　すなわち、例えば、タンパク質における所定の位置に複数種類の変異が存在する場合であって、特定の変異を検出する場合は、当該特定の変異以外の変異に対応するブロッキング用核酸断片を使用することが好ましいと言える。したがって、所定の遺伝子変異を有するターゲット核酸と、当該ターゲット核酸に対して特異的にハイブリダイズする変異用検出プローブとのハイブリダイゼーション用バッファー組成物においては、ターゲット核酸における所定の遺伝子変異以外の他の遺伝子変異を有する非ターゲット核酸に対して、ターゲット核酸と比して優先的にハイブリダイズするブロッキング用核酸断片を含むことが好ましい。
　このようなブロッキング用核酸断片は、非ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を有するように設計する。そのほかプローブを設計する場合と同様の考え方に基づいて設計することができ、たとえば塩基長は１０～４０塩基長、好ましくは１５～３５塩基長とすることができる。
　なお、検出対象となる所定の遺伝子変異以外の他の遺伝子変異は、所定の遺伝子変異を検出するために増幅された核酸断片内に存在しうるものであり、所定の遺伝子変異を検出するプローブを設計する際、プローブがハイブリダイズする範囲内に他の遺伝子変異が存在しうる場合にブロッキング用核酸断片を用いるのが有用である。特に、所定の遺伝子変異と他の遺伝子変異の塩基配列が一部重なる場合に有用性が高い。また、病変部位における遺伝子変異の有無を検出する際には変異割合が小さくても高い検出感度を得られるように、遺伝子変異に対応する野生型を非ターゲット核酸と位置付けて、野生型に対するブロッキング用核酸断片を含むのが好ましい。
　このように、ブロッキング用核酸断片を含むハイブリダイゼーション用バッファー組成物を利用することによって、非ターゲット核酸と変異検出用プローブとの非特異的なハイブリダイズを防止して、ターゲット核酸と変異検出用プローブとの特異的なハイブリダイズに基づいてターゲット核酸を高精度に検出することができる。
　ここで、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物において、ブロッキング用核酸の濃度は、特に限定されないが、増幅されたターゲット核酸と非ターゲット核酸とからなる核酸混合物の核酸濃度に対して１倍以上の濃度とすることが好ましい。例えば、検出対象塩基を含むターゲット核酸をポリメラーゼ連鎖反応等の核酸増幅反応により取得する場合、増幅されたターゲット核酸と非ターゲット核酸とからなる核酸混合物の濃度に対して、１倍以上の濃度となるようにブロッキング用核酸の量を調整することが好ましい。
　ブロッキング用核酸の濃度を上記範囲とすることで、非ターゲット核酸と変異検出用プローブとの非特異的なハイブリダイズをより効果的に抑制することができ、ターゲット核酸と変異検出用プローブとの特異的ハイブリダイズを高感度に検出することができる。
　一方、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物において、ブロッキング用核酸の濃度範囲の上限は、特に限定されないが、例えば、添加したプライマーセットの濃度以下とすることが好ましい。
　なお、核酸混合物の核酸濃度については、定法に従って測定することができる。例えば、核酸増幅反応後の反応液を精製した後、分光光度計を用いて波長２６０ｎｍの吸光度を測定し、測定値を核酸濃度に換算する。これにより核酸増幅反応により得られた核酸混合物の核酸濃度を測定することができる。また、SYBR Gold , Pico Green等の蛍光色素で増幅産物をインターカレーションし、６００ｎｍ付近の吸光を測定することで核酸混合物の核酸濃度を測定することができる。あるいは、電気泳動によって増幅産物の電気泳動バンドを検出し、既知濃度の核酸に関する電気泳動バンドと比較することで、核酸混合物の核酸濃度を測定することができる。
　以上のように、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物は、検出対象の遺伝子変異とは異なる遺伝子変異に対応するブロッキング用核酸を含むため、検出対象の遺伝子変異とは異なる遺伝子変異を含む非ターゲット核酸と核酸プローブとの非特異的なハイブリダイズを抑制することができ、検出対象の遺伝子変異を含むターゲット核酸と核酸プローブとの特異的なハイブリダイズが阻害されることを防止できる。このため、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物を使用することによって、例えば所定の位置に複数種類の変異を有する場合であっても、検出目的の変異を有するターゲット核酸を核酸プローブにより高精度に検出することができる。
　具体的に、所定の位置に複数種類の変異を有する遺伝子変異としては、上述したBRAFにおける600番目のバリンに対する置換変異に限定されず、例えば、KRAS（v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog）における12番目のグリシンに対する置換変異、G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V等を挙げることができる。
　以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。
　［実施例１］
　本実施例では、BRAFにおけるV600E遺伝子変異を有する領域と、TERTプロモータ領域における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を有する領域とを同時増幅できるプライマーを設計した。なお、これら各領域を増幅する核酸増幅反応、核酸増幅反応で得られた核酸断片をDNAチップで検出する方法については、後述の[実験]欄に記載した通りである。
　特に、本実施例では、表１に示すように、BRAFにおけるV600E遺伝子変異を有する領域を増幅するため以下のA～Eのプライマーセットを設計し、また、表２に示すように、TERTプロモータ領域における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を有する領域を増幅するため以下のF～Iのプライマーセットを設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　まず、A～Eのプライマーセット及びF～Iのプライマーセットをそれぞれ単独で用いて核酸増幅反応を行った結果を図３に示した。図３に示したように、A～Eのプライマーセットについては全て目的とする核酸断片を増幅でき、F～IのプライマーセットについてはプライマーセットH及びIについてのみ目的とする核酸断片を増幅できた。
　次に、A～Eのプライマーセット及びH並びにIのプライマーセットをそれぞれ単独で用いて核酸増幅反応を行い、増幅した核酸断片をBRAF用共通プローブ及びTERT用共通プローブで検出した結果を図４に示した。図４に示したように、BRAFについてはプライマーセットB、TERTプロモータ領域についてはプライマーセットHを使用したときに、最も優れた蛍光強度を観察することができた。この結果より、プライマーセットBを使用した核酸増幅反応によりBRAFにおけるV600E遺伝子変異を有する領域を増幅し、プライマーセットHを使用した核酸増幅反応によりTERTプロモータ領域における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を有する領域を増幅することが好ましいことが明らかになった。
　次に、本実施例では、これらプライマーセットB及びプライマーセットHを用いた同時核酸増幅反応により、目的とする２つの領域を高精度に検出するための、プライマーセットの濃度を検討した。その結果を図５に示した。図５には、核酸増幅反応におけるプライマーセットB及びプライマーセットHの各濃度を記載した。図５に示したように、プライマーセットHの濃度を0.4μＭ以上、0.6μＭ以下とし、且つ、プライマーセットB及びプライマーセットHの濃度比を、（プライマーセットB）：（プライマーセットH）＝４：１～２：１とすることで、２つの領域をほぼ同程度にバランス良く同時増幅できることが明らかとなった。
　［実施例２］
　本実施例では、実施例１で設計したプライマーセットB及びプライマーセットHを使用し、野生型のみを含む検体（野生型検体）と遺伝子変異を5%含む検体（5%変異検体）とを、高精度に検出できるか検討した。なお、本実施例においても、核酸増幅反応、核酸増幅反応で得られた核酸断片をDNAチップで検出する方法については、後述の[実験]欄に記載した通りである。
　本実施例では、以下のようにして野生型検体及び5%変異検体を調製した。野生型検体は、細胞株由来の野生型ゲノムDNAを購入し、フルオロメーターにて濃度測定後、TE緩衝液(pH 8.0、Tris-EDTA)にて2ng/μLに調製したものを用いた。BRAF用5%変異検体は、細胞株由来の50%V600E変異ゲノムDNAを購入し、前述と同様の方法にて2ng/μLに調製し、更にBRAF用野生型検体（2ng/μL）と9：1（野生型ゲノムDNA：50％V600E変異ゲノムDNA）の割合で混合することにより調製した。
　TERT用5%変異検体は、BRAF野生型配列を持つ人工遺伝子（プラスミドDNA）、TERT野生型配列を持つプラスミドDNA、TERT変異型配列を持つプラスミドDNA（228C>T遺伝子変異、250C>T遺伝子変異をともに含む）をそれぞれ個別に購入し、フルオロメーターにて濃度測定後、TE緩衝液(pH 8.0、Tris-EDTA)にて1320copies/μL（ゲノムDNA 4ng/μLに相当）に調製し、更に、TERT野生型配列を持つプラスミドDNAとTERT変異型配列を持つプラスミドDNAを95：5の割合で混合した溶液を、BRAF野生型配列を持つプラスミドDNA（1320copies/μL）と等量ずつ混合することにより調製した（各対象遺伝子660copies/μL（ゲノムDNA 2ng/μLに相当））。
　結果を図６に示した。図６に示すように、実施例１で設計したプライマーセットB及びプライマーセットHを使用することで、野生型検体と5%変異検体とを明確に区別して高精度に検出できることが明らかとなった。
　［実施例３］
　本実施例では、BRAFにおけるV600E遺伝子変異以外の他の遺伝子変異を含む検体を作製し、当該他の遺伝子変異に対応するブロッキング用核酸断片の有効性を評価した。なお、本実施例においても、核酸増幅反応、核酸増幅反応で得られた核酸断片をDNAチップで検出する方法については、後述の[実験]欄に記載した通りである。
　本実施例では、以下のようにして野生型検体及び変異検体を調製した。本実施例において変異型検体として、V600E遺伝子変異を5%含む検体（5% V600E）、V600R遺伝子変異を50%含む検体（50% V600R）、V600K遺伝子変異を50%含む検体（50% V600K）、V600G遺伝子変異を50%含む検体（50% V600G）、V600M遺伝子変異を50%含む検体（50% V600M）及びV600D遺伝子変異を50%含む検体（50% V600D）を作製した。
　野生型検体及び5% V600E変異検体は、実施例２で調製したものを用いた。50% V600R変異検体、50% V600K変異検体、50% V600G変異検体及び50% V600M変異検体は、細胞株由来の各50%変異ゲノムDNAをそれぞれ個別に購入し、フルオロメーターにて濃度測定後、TE緩衝液(pH 8.0、Tris-EDTA)にて2ng/μLに調製したものをそれぞれ用いた。
　50% V600D変異検体は、BRAF野生型配列を持つプラスミドDNA、V600D変異配列を持つプラスミドDNA、TERT野生型配列を持つプラスミドDNAをそれぞれ個別に購入し、フルオロメーターにて濃度測定後、TE緩衝液(pH 8.0、Tris-EDTA)にて1320copies/μL（ゲノムDNA 4ng/μLに相当）に調製し、更に、BRAF野生型配列を持つプラスミドDNAとV600D変異型配列を持つプラスミドDNAを1：1の割合で混合した溶液を、TERT野生型配列を持つプラスミドDNA（1320copies/μL）と等量ずつ混合することにより調製した（各対象遺伝子660copies/μL（ゲノムDNA 2ng/μLに相当））。
　先ず、核酸増幅反応後の反応液に野生型に対応するブロッキング用核酸断片のみを加えた場合の判定値計算結果を図７に示した。図７に示したように、V600E遺伝子変異と同位置において異なる遺伝子変異のうち、V600D遺伝子変異及びV600K遺伝性変異を含む検体を陽性として判定していた。これは、V600D遺伝子変異又はV600K遺伝性変異を含む増幅核酸がBRAF V600E変異型プローブと非特異的にハイブリダイズした結果と考えられた。
　そこで、核酸増幅反応後の反応液に野生型に対応するブロッキング用核酸断片に加えて、V600D遺伝子変異に対応するブロッキング用核酸断片及びV600K遺伝性変異に対応するブロッキング用核酸断片を使用して同様に判定値を計算した。その結果を図８に示した。図８に示すように、V600D遺伝子変異又はV600K遺伝性変異を含む増幅核酸とBRAF V600E変異型プローブと非特異的にハイブリダイズをブロッキング用核酸断片によって防止し、その結果、V600E遺伝子変異を含む検体を高精度に検出できることが明らかとなった。
　［実験］
　核酸増幅反応の反応液組成を表３に示し、核酸増幅反応の条件を表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　本実験では表１に示したプライマーセットB及び表２に示したプライマーセットHをそれぞれ使用した。
　核酸増幅反応で得られた増幅産物と、ハイブリダイズ緩衝液をそれぞれ2：1の容量比で混合した。ハイブリダイズ緩衝液は、2.25×SSC/0.225% SDSの濃度になるように調製した溶液を用いた。
　得られた混合液約4μLをハイブリカバーに滴下し、DNAチップに被せた。ここで、DNAチップに固定したプローブを表５及び６にまとめた。
　ここで、TERT用プローブに関して、228C>T変異型プローブ1は228C>T遺伝子変異のみを有する配列に対応し、250C>T変異型プローブ1は250C>T遺伝子変異のみを有する配列に対応する。228C>T遺伝子変異、250C>T遺伝子変異の各検出対象変異にはともに、近傍に非検出対象の変異があり、（BRAFとは異なって）検出対象変異と非検出対象変異とを両方有する場合がある。検出対象変異と非検出対象変異が併存した場合、上記のプローブとはハイブリダイズが起こりにくく、正確に検出されない。そこで、228C>T変異型プローブ2、250C>T変異型プローブ2では、同一増幅産物内に非検出対象変異が存在しても検出対象変異を検出できるように塩基配列を調整している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　その後、DNAチップを予熱しておいたバット内にいれ、ハイブリダイズオーブン内に移し、58℃にてハイブリダイズ反応を60分間行った。反応終了後、速やかにハイブリカバーを外し、DNAチップを洗浄液（1×SSC/0.1%SDS溶液、液温：20～30℃）で5分間洗浄した。その後、1×SSC溶液でリンスした。
　蛍光検出器を用いてDNAチップ上の蛍光強度を測定し、得られた蛍光強度をもとに判定値を算出した。
判定値=変異型プローブDNAの蛍光強度/共通プローブDNAの蛍光強度
蛍光強度=（各スポットの蛍光強度-バックグラウンド値）の平均値（n=2）
　得られた判定値がカットオフ値より大きい場合、変異陽性と判定した。
カットオフ値=野生型検体の判定値の平均値+係数×標準偏差（n=20以上）
　なおTERTについては、プローブ１または２の少なくとも一方がカットオフ値よりも大きい場合に変異陽性と判定した。
　また、ブロッキング用核酸断片を使用する場合、ハイブリダイズ緩衝液において、BRAF野生型用ブロッカー、V600D用ブロッカー及びV600K用ブロッカーは225μM、TERT野生型ブロッカー（C228T）及びTERT野生型ブロッカー（C250T）は300μMとなるように添加した。使用したブロッキング用核酸断片を表７にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (16)

  1. 　BRAF（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1）におけるV600E遺伝子変異（1799T>A）に特異的にハイブリダイズするBRAF V600E変異型プローブと、
    　TERT（telomerase reverse transcriptase）プロモータ領域における228C>T遺伝子変異に特異的にハイブリダイズするTERT 228C>T変異型プローブと、
    　TERTプロモータ領域における250C>T遺伝子変異に特異的にハイブリダイズするTERT 250C>T変異型プローブと、
    　BRAF遺伝子におけるV600E遺伝子変異を含む領域を増幅するBRAF用プライマーセットと、
    　TERT遺伝子における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を含む領域を増幅するTERT用プライマーセットと
    　を含む、甲状腺乳頭癌の予後予測に関連する遺伝子変異評価用キット。
  2. 　上記BRAF用プライマーセットは、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーからなることを特徴とする請求項１記載の遺伝子変異評価用キット。
  3. 　上記TERT用プライマーセットは、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーからなることを特徴とする請求項１記載の遺伝子変異評価用キット。
  4. 　上記BRAF用プライマーセットは、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーからなり、
    　上記TERT用プライマーセットは、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーからなり、
    　上記TERT用プライマーセットの濃度を0.2μＭ以上、0.6μＭ以下とすることを特徴とする請求項１記載の遺伝子変異評価用キット。
  5. 　上記BRAF用プライマーセット及び上記TERT用プライマーセットの濃度比を、（BRAF用プライマーセット濃度）：（TERT用プライマーセット濃度）＝４：１～２：１とすることを特徴とする請求項４記載の遺伝子変異評価用キット。
  6. 　BRAFにおける600番目のバリン（V600）に対するV600E以外の遺伝子変異にハイブリダイズするブロッキング用核酸断片を更に含むことを特徴とする請求項１記載の遺伝子変異評価用キット。
  7. 　上記V600E以外の遺伝子変異は、V600D遺伝子変異、V600K遺伝子変異、V600R遺伝子変異、V600G遺伝子変異及びV600M遺伝子変異からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子変異であることを特徴とする請求項６記載の遺伝子変異評価用キット。
  8. 　上記ブロッキング用核酸断片はV600D遺伝子変異又はV600K遺伝子変異に特異的にハイブリダイズするものであることを特徴とする請求項６記載の遺伝子変異評価用キット。
  9. 　上記BRAF用プライマーセットにより増幅される野生型BRAF断片及び600番目のバリンに相当する位置に変異を有する変異型BRAF断片の何れにもハイブリダイズするBRAF用共通プローブを更に備えることを特徴とする請求項１記載の遺伝子変異評価用キット。
  10. 　上記TERT用プライマーセットにより増幅される野生型TERT断片及び228番目のシトシン及び/又は250番目のシトシンに相当する位置に変異を有する変異型TERT断片の何れにもハイブリダイズするTERT用共通プローブを更に備えることを特徴とする請求項１記載の遺伝子変異評価用キット。
  11. 　上記BRAF V600E変異型プローブ、上記TERT 228C>T変異型プローブ及び上記TERT 250C>T変異型プローブが担体に固定されたマイクロアレイを備えることを特徴とする請求項１記載の遺伝子変異評価用キット。
  12. 　所定の遺伝子変異を有するターゲット核酸と、当該ターゲット核酸に対して特異的にハイブリダイズする変異用検出プローブとのハイブリダイゼーション用バッファー組成物であって、
    　ターゲット核酸における所定の遺伝子変異以外の他の遺伝子変異を有する非ターゲット核酸に対して、ターゲット核酸と比して優先的にハイブリダイズするブロッキング用核酸断片を含むハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
  13. 　上記ブロッキング用核酸断片は、非ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を有することを特徴とする請求項１２記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
  14. 　上記ターゲット核酸は、BRAF（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1）におけるV600E遺伝子変異（1799T>A）を含む核酸断片であり、
    　上記変異検出用プローブは、当該核酸断片に特異的にハイブリダイズするBRAF V600E変異型プローブであり、
    　上記非ターゲット核酸は、V600D遺伝子変異又はV600K遺伝子変異を含む核酸断片であり、
    　上記ブロッキング用核酸断片は、V600D遺伝子変異を含む核酸断片又はV600K遺伝子変異を含む核酸断片に優先的にハイブリダイズすることを特徴とする請求項１２記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
  15. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載の遺伝子変異評価用キットを用い、診断対象者について、BRAF（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1）におけるV600E遺伝子変異、TERT（telomerase reverse transcriptase）プロモータ領域における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を同時に同定する、甲状腺乳頭癌の予後予測に関するデータ分析方法。
  16. 　上記遺伝子変異評価用キットは、上記各遺伝子変異に関する変異型プローブと、遺伝子変異を有する変異型及び変異を有しない野生型にハイブリダイズする共通プローブを備えるマイクロアレイであり、当該マイクロアレイを用いて変異型プローブ及び共通プローブに由来するシグナルを測定し、式：[変異型プローブのシグナル強度]/[共通型プローブのシグナル強度]により各遺伝子変異ついて判定値を算出し、判定値が予め規定したカットオフ値を上回る場合に上記遺伝子変異を有すると判定する、請求項１５記載のデータ分析方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023008385A (ja) * 2021-07-06 2023-01-19 東洋鋼鈑株式会社 マイクロアレイキット、マイクロアレイを用いたターゲット検出方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016167317A1 (ja) * 2015-04-14 2016-10-20 凸版印刷株式会社 遺伝子変異の検出方法
US20170022572A1 (en) * 2014-04-01 2017-01-26 The Johns Hopkins University Tert and braf mutations in human cancer
JP2018019640A (ja) * 2016-08-03 2018-02-08 東洋鋼鈑株式会社 ハイブリダイゼーション用バッファー組成物及びハイブリダイゼーション方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170022572A1 (en) * 2014-04-01 2017-01-26 The Johns Hopkins University Tert and braf mutations in human cancer
WO2016167317A1 (ja) * 2015-04-14 2016-10-20 凸版印刷株式会社 遺伝子変異の検出方法
JP2018019640A (ja) * 2016-08-03 2018-02-08 東洋鋼鈑株式会社 ハイブリダイゼーション用バッファー組成物及びハイブリダイゼーション方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ILIE, M. I. ET AL.: "Diagnostic value of immunohistochemistry for the detection of the BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinoma: Comparative analysis with three DNA-based assays", THYROID, vol. 24, 2014, pages 858 - 866, XP55702198 *
MATSUSE, M. ET AL.: "T ERI promoter mutations and Ki-67 labeling index as a prognostic marker of papillary thyroid carcinomas: combination of two independent factors", SCI. REP., vol. 7, no. 41752, 2 February 2017 (2017-02-02), pages 1 - 8, XP55702188 *
OHN, A. L. ET AL.: "BRAF(V600) mutations in solid tumors, other than metastatic melanoma and papillary thyroid cancer, or multiple myeloma: a screening study", ONCOTARGETS THER., vol. 10, 2017, pages 965 - 971, XP55702197 *
TAKAHASHI, YASUO ET AL.: "GeneChip system from a bioinformatical point of view", FOLIA PHARMACOLOGICA JAPONICA, vol. 120, 2002, pages 73 - 84 *

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