JP7456739B2 - 骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異評価用キット - Google Patents
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Description
さらにまた、特許文献4には、CALRにおける変異を同定するための技術が開示されている。
(1)JAK2における骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異に対応するJAK2変異型プローブと、当該遺伝子変異を含む領域を増幅するプライマーセットとを含む、骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異評価用キットであって、
上記JAK2変異型プローブは、V617F変異に対応するV617F変異型プローブと、JAK2遺伝子のエクソン12に存在する遺伝子変異に対応するエクソン12変異型プローブとを含み、
上記プライマーセットは、V617F変異を含む領域を増幅するV617F変異用プライマーセットと、JAK2遺伝子のエクソン12に存在する遺伝子変異を含む領域を増幅するエクソン12用プライマーセットとを含む、
ことを特徴とする遺伝子変異評価用キット。
(2)上記エクソン12変異型プローブは、JAK2におけるN542-E543の欠損変異に対応するN542_E543del変異型プローブ、JAK2におけるE543-D544の欠損変異に対応するE543_D544del変異型プローブ、JAK2におけるR541-E543がリシンとなる変異に対応するR541_E543>K変異型プローブ、JAK2におけるF537-K539がロイシンとなる変異に対応するF537_K539>L変異型プローブ、JAK2におけるK539L(TT)変異に対応するK539L(TT)変異型プローブ及びJAK2におけるK539L(CT)変異に対応するK539L(CT)変異型プローブからなる群から選ばれる少なくとも1以上の変異型プローブであることを特徴とする(1)記載の遺伝子変異評価用キット。
(3)V617F変異用プライマーセットに含まれる一方のプライマーの濃度が1.0μM以上であることを特徴とする(1)記載の遺伝子変異評価用キット。
(4)エクソン12用プライマーセットに含まれる一方のプライマーの濃度が2.5μM以上であることを特徴とする(1)記載の遺伝子変異評価用キット。
(5)V617F変異用プライマーセットにおける標識されたプライマーとエクソン12用プライマーセットにおける標識されたプライマーとの濃度比[エクソン12用プライマーの濃度]/[V617F変異用プライマーの濃度]が1.0~5.5であることを特徴とする(1)記載の遺伝子変異評価用キット。
(6)上記エクソン12用プライマーセットは、配列番号1に示す塩基配列から選ばれる連続する10塩基以上の長さを有するエクソン12用フォワードプライマーと、配列番号2に示す塩基配列から選ばれる連続する10塩基以上の長さを有するエクソン12用リバースプライマーとからなることを特徴とする(1)記載の遺伝子変異評価用キット。
(7)上記エクソン12用フォワードプライマーは、配列番号3に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF1、配列番号4に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF3、配列番号5に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF4及び配列番号6に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF5からなる群から選ばれる1つのプライマーであることを特徴とする(6)記載の遺伝子変異評価用キット。
(8)上記エクソン12用リバースプライマーは、配列番号7に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプライマーR1、配列番号8に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプライマーR2及び配列番号9に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプライマーR3からなる群から選ばれる1つのプライマーであることを特徴とする(6)記載の遺伝子変異評価用キット。
(9)上記エクソン12用プライマーセットは、配列番号6に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF5と、配列番号8に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプライマーR2とからなることを特徴とする(6)記載の遺伝子変異評価用キット。
(10)CALRにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異に対応するCALR変異型プローブと、
CALRにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する当該遺伝子変異を含む領域を増幅するCALR用プライマーセットと、
MPLにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異に対応するMPL変異型プローブと、
MPLにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する当該遺伝子変異を含む領域を増幅するMPL用プライマーセットと、
を更に含むことを特徴とする(1)記載の遺伝子変異評価用キット。
(11)上記V617F変異型プローブと、上記エクソン12変異型プローブとが担体に固定されたマイクロアレイを備えることを特徴とする(1)記載の遺伝子変異評価用キット。
(12)上記(1)~(11)いずれか記載の遺伝子変異評価用キットを用い、診断対象者について、JAK2における骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異のうちV617F変異とエクソン12に存在する遺伝子変異とを同時に同定する、骨髄増殖性腫瘍の診断に関するデータ分析方法。
フォワードプライマーJAK2-F:5'-GAGCAAGCTTTCTCACAAGCATTTGG-3'(配列番号25)及びリバースプライマーJAK2-R:5'-CTGACACCTAGCTGTGATCCTGAAACTG-3'(配列番号26)からなるセットが挙げられる。
プライマーCALR-F:5'-CGTAACAAAGGTGAGGCCTGGT-3'(配列番号27)及びプライマーCALR-R:5'-GGCCTCTCTACAGCTCGTCCTTG-3'(配列番号28)からなるプライマーのセットが挙げられる。
プライマーMPL-F:5'-CTCCTAGCCTGGATCTCCTTGG-3'(配列番号29)及びプライマーMPL-R:5'-ACAGAGCGAACCAAGAATGCCTGTTTAC-3'(配列番号30)からなるプライマーのセットが挙げられる。
1.サンプル調製
本実施例では、野生型検体として健常人末梢血由来ゲノムDNA(Biochain社製)を用いた。
本実施例では、表1に示した遺伝子変異を検出するため、当該遺伝子変異を含む対象領域(4箇所)をそれぞれ増幅した。
本実施例では、JAK2遺伝子におけるV617F変異並びにエクソン12に含まれる6つの遺伝子変異、CALR遺伝子におけるタイプ1変異~タイプ2変異及びMPL遺伝子におけるW515L/K変異に対応する変異型プローブとこれに対応する野生型プローブを設計した。各プローブの塩基配列を表4にまとめて示した。
上記プローブを有するチップを用いて以下のようにハイブリダイズを行った。先ず、規定温度(52℃)に設定したチャンバー内に湿箱を載置し、チャンバー及び湿箱を十分予熱しておいた。PCR反応液4μLとハイブリダイズ緩衝液(2.25×SSC/0.23%SDS/0.2 nM IC5標識オリゴDNA(ライフテクノロジーズジャパン社製))2μLを混合し、この溶液を3μLとり、ハイブリカバーの中央凸部の上に滴下して、これをチップに被せ、52℃に設定したハイブリダイズチャンバー装置(東洋鋼鈑社製)で1時間反応させた。ハイブリダイズ反応終了後、ハイブリカバーをはずしたチップをホルダーにセットし、洗浄用ステンレスホルダーを0.1×SSC/0.1% SDS溶液に浸した。上下に数回振動させた後、チップの蛍光強度を検出するまでホルダーを1×SSC溶液(室温)に浸した。
判定値=[変異型プローブの蛍光強度]/([野生型プローブの蛍光強度]+[変異型プローブの蛍光強度])
本実験例では、JAK2のエクソン12に含まれる6つの遺伝子変異を含む領域を増幅するためのプライマーセットを複数設計し、評価した。設計したプライマーセットは、図1に示した通りである。本実施例では、下記表5に示すプライマーセットについて評価した。表6におけるF1~F5及びR1~R3は図1に対応している。図1に示すように、フォワードプライマーF1、F3~F5は、配列番号1に示した塩基配列の範囲に含まれ、フォワードプライマーF2は当該範囲から外れる位置に設計した(配列番号52)。なお、実験例1及び後述する実験例2では検体として野生型である健常人由来末梢血ゲノムDNAを使用し、野生型プローブの蛍光強度で評価した。
図3及び4にPCR反応液に混合したプライマーミックスにおけるプライマーの濃度、V617F変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットのうち標識したプライマー(フォワードプライマー)の濃度を横軸とし、増幅した4つの領域に由来する蛍光強度を縦軸とした特性図を示した。また、図5及び6にPCR反応液に混合したプライマーミックスにおけるプライマーの濃度、JAK2 エクソン12を増幅するプライマーセットのうち標識したプライマー(リバースプライマー)の濃度を横軸とし、増幅した4つの領域に由来する蛍光強度を縦軸とした特性図を示した。
本実施例では、変異モデル検体には、遺伝子解析対象領域の野生型又は変異型配列を搭載した人工遺伝子(プラスミド)を構築し、野生型人工遺伝子と変異型人工遺伝子を任意で混合したものを用い、表6に示した反応液組成で変異検出のためのPCRを行った。
図8に示したように、1%又は5%の遺伝子変異について全て識別できることが明らかとなった。
Claims (7)
- JAK2における骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異に対応するJAK2変異型プローブと、当該遺伝子変異を含む領域を増幅するプライマーセットとを含む、骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異評価用キットであって、
上記JAK2変異型プローブは、V617F変異に対応するV617F変異型プローブと、JAK2遺伝子のエクソン12に存在する遺伝子変異に対応するエクソン12変異型プローブとを含み、
上記プライマーセットは、V617F変異を含む領域を増幅するV617F変異用プライマーセットと、JAK2遺伝子のエクソン12に存在する遺伝子変異を含む領域を増幅するエクソン12用プライマーセットとを含み、
上記エクソン12変異型プローブは、JAK2におけるN542-E543の欠損変異に対応するN542_E543del変異型プローブ、JAK2におけるE543-D544の欠損変異に対応するE543_D544del変異型プローブ、JAK2におけるR541-E543がリシンとなる変異に対応するR541_E543>K変異型プローブ、JAK2におけるF537-K539がロイシンとなる変異に対応するF537_K539>L変異型プローブ、JAK2におけるK539L(TT)変異に対応するK539L(TT)変異型プローブ及びJAK2におけるK539L(CT)変異に対応するK539L(CT)変異型プローブからなる群から選ばれる少なくとも1以上の変異型プローブであり、
上記V617F変異用プライマーセットに含まれる一方のプライマーの濃度が1.0μM以上であり、
上記エクソン12用プライマーセットに含まれる一方のプライマーの濃度が2.5μM以上であり、
上記エクソン12用プライマーセットは、配列番号3に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF1と配列番号7に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプライマーR1との組み合わせ;配列番号5に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF4と配列番号9に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプライマーR3との組み合わせ;又は配列番号6に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF5と配列番号8に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプライマーR2との組み合わせからなる
ことを特徴とする遺伝子変異評価用キット。 - V617F変異用プライマーセットにおける標識されたプライマーとエクソン12用プライマーセットにおける標識されたプライマーとの濃度比[エクソン12用プライマーの濃度]/[V617F変異用プライマーの濃度]が1.0~5.5であることを特徴とする請求項1記載の遺伝子変異評価用キット。
- 上記エクソン12用プライマーセットは、配列番号3に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF1と配列番号7に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプライマーR1との組み合わせ;又は配列番号6に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF5と配列番号8に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプライマーR2との組み合わせからなることを特徴とする請求項1記載の遺伝子変異評価用キット。
- 上記エクソン12用プライマーセットは、配列番号6に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF5と、配列番号8に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプライマーR2とからなることを特徴とする請求項1記載の遺伝子変異評価用キット。
- CALRにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異に対応するCALR変異型プローブと、
CALRにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する当該遺伝子変異を含む領域を増幅するCALR用プライマーセットと、
MPLにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異に対応するMPL変異型プローブと、
MPLにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する当該遺伝子変異を含む領域を増幅するMPL用プライマーセットと、
を更に含むことを特徴とする請求項1記載の遺伝子変異評価用キット。 - 上記V617F変異型プローブと、上記エクソン12変異型プローブとが担体に固定されたマイクロアレイを備えることを特徴とする請求項1記載の遺伝子変異評価用キット。
- 請求項1~6いずれか一項記載の遺伝子変異評価用キットを用い、診断対象者について、JAK2における骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異のうちV617F変異とエクソン12に存在する遺伝子変異とを同時に同定する、骨髄増殖性腫瘍の診断に関するデータ分析方法。
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