JPWO2009130797A1 - Ａｂｏ式血液型を判定するためのプローブセット - Google Patents

Abstract

ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の多型を検出することによりＡＢＯ式血液型を判定するための簡便かつ効率的な手段を提供することを目的とする。本発明は、ＡＢＯ式血液型を判定するための、Ｏ型判定プローブペア及びＢ型判定プローブペアを含むプローブセットに関する。

Description

本発明は、ＡＢＯ式血液型を判定するためのプローブセット、及び該プローブセットを用いてＡＢＯ式血液型を判定する方法に関する。

ＡＢＯ式血液型分類は法医学者により実施される最も古い血清学である。Ｋａｒｌ Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒは、１９０１年にＡＢＯ式血液システムを発見し、血液分類方法を開発した。この方法の基礎は、赤血球及び他の組織に見出されるＡ、Ｂ及びＨ抗原との抗体反応性である。当該方法では、Ａ、Ｂ、Ｏ及びＡＢ表現型を区別するために、Ａ型−及びＢ型−抗原に対するポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体を利用した凝集アッセイが用いられる。この方法では、ＡＡ表現型はＡＯ表現型から区別されず、そしてＢＢ表現型はＢＯ表現型から区別されない。
抗原Ａ及びＢは、２種のグリコシルトランスフェラーゼの作用によりＨ抗原（Ｈオリゴ糖）から誘導される。血液型Ａを有する個人は、Ｎ−アセチルガラクトサミンをＨ抗原に輸送してＡ抗原を形成するトランスフェラーゼ活性を発現する。血液型Ｏを有する個人は、機能的グリコシルトランスフェラーゼを欠いており、その結果、細胞表面上に変性されていないＨ抗原のみを発現する。
ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の多型について、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４５（１７）：２２９−２３３では、既知のＡＢＯ型の個人から単離されたｃＤＮＡの配列分析が報告されている。Ａ及びＢトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡは、１０６２個の長さの塩基対であり、そして３５３個のアミノ酸のタンパク質をコードしている。Ａ及びＢ対立遺伝子配列は、７個のヌクレオチドで互いに異なっており、４個のアミノ酸において異なるタンパク質をコードしており、これはＡ及びＢトランスフェラーゼの異なった特異性を説明するものである。Ｏ対立遺伝子は塩基対欠失により、トランスフェラーゼの機能的ドメインを欠いた蛋白質をコードしている。
核酸を用いたＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子型の検出も行われており、例えば、一塩基多型を含む領域をＰＣＲで増幅し、制限酵素で切断後、ゲル電気泳動で一塩基多型を判定するＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法や、ゲノムＤＮＡにおけるＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の全塩基配列を決定して比較するシークエンス法などが報告されている。
しかし、従来の抗原抗体反応を利用して血球の凝集を目視で観察する判定方法や吸光度を測定する特殊な方法は、専門的な技術や経験が必要であり、また最近市販の抗体の性質上、微量な試料から判定する場合に誤判定を生じる可能性があるなど、多くの問題があった。また、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法やシークエンス法などを用いた判定方法は、コストや時間がかかる上、少量の試料での検査が困難であった。

本発明は、ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の多型を検出することによりＡＢＯ式血液型を判定するための簡便かつ効率的な手段を提供することを目的とする。
本発明者らは、ゲノム上のＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子におけるエキソン６及びエキソン７に存在する一塩基多型を効率的に識別できるプローブを設計することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）ＡＢＯ式血液型を判定するためのプローブセットであって、Ｏ型判定プローブペア及びＢ型判定プローブペアを含み、
Ｏ型判定プローブペアが、以下のプローブＯ−１及びプローブＯ−２のペア：
プローブＯ−１：配列番号１の２０１３６〜２０１５５番目の塩基を含む連続した２２塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
プローブＯ−２：配列番号１において２０１４６番目のＧが欠失した塩基配列における２０１３６〜２０１５６番目の塩基を含む連続した２２塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
、及び／又は以下のプローブＯ−１’及びプローブＯ−２’のペア：
プローブＯ−１’：配列番号１の２０１３６〜２０１５５番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
プローブＯ−２’：配列番号１において２０１４６番目のＧが欠失した塩基配列における２０１３６〜２０１５６番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
を含み、
Ｂ型判定プローブペアが、以下のプローブＢ−１及びプローブＢ−２のペア：
プローブＢ−１：配列番号１の２１８５７〜２１８７６番目の塩基を含む連続した２２塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
プローブＢ−２：配列番号１において２１８６７番目のＧがＡに置換された塩基配列における２１８５７〜２１８７６番目の塩基を含む連続した２２塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
、及び／又は以下のプローブＢ−１’及びプローブＢ−２’のペア：
プローブＢ−１’：配列番号１の２１８５７〜２１８７６番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
プローブＢ−２’：配列番号１において２１８６７番目のＧがＡに置換された塩基配列における２１８５７〜２１８７６番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
を含む、前記プローブセット。
（２）Ａ２型判定プローブペア、Ａ３型判定プローブペア及びＢ３型判定プローブペアからなる群から選択される少なくとも１のプローブペアをさらに含み、
Ａ２型判定プローブペアが、以下のプローブＡ２−１及びプローブＡ２−２のペア：
プローブＡ２−１：配列番号１の２１３９４〜２１４０９番目の塩基を含む連続した２２塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
プローブＡ２−２：配列番号１において２１４０４番目のＣがＴに置換された塩基配列における２１３９４〜２１４０９番目の塩基を含む連続した２２塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
、及び／又は以下のプローブＡ２−１’及びプローブＡ２−２’のペア：
プローブＡ２−１’：配列番号１の２１３９４〜２１４０９番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
プローブＡ２−２’：配列番号１において２１４０４番目のＣがＴに置換された塩基配列における２１３９４〜２１４０９番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
を含み、
Ａ３型判定プローブペアが、以下のプローブＡ３−１及びプローブＡ３−２のペア：
プローブＡ３−１：配列番号１の２１７９８〜２１８１７番目の塩基を含む連続した２２塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
プローブＡ３−２：配列番号１において２１８０８番目のＧがＡに置換された塩基配列における２１７９８〜２１８１７番目の塩基を含む連続した２２塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
、及び／又は以下のプローブＡ３−１’及びプローブＡ３−２’のペア：
プローブＡ３−１’：配列番号１の２１７９８〜２１８１７番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
プローブＡ３−２’：配列番号１において２１８０８番目のＧがＡに置換された塩基配列における２１７９８〜２１８１７番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
を含み、
Ｂ３型判定プローブペアが、以下のプローブＢ３−１及びプローブＢ３−２のペア：
プローブＢ３−１：配列番号１の２１９８１〜２２０００番目の塩基を含む連続した２２塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
プローブＢ３−２：配列番号１において２１９９１番目のＣがＴに置換された塩基配列における２１９８１〜２２０００番目の塩基を含む連続した２２塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
、及び／又は以下のプローブＢ３−１’及びプローブＢ３−２’のペア：
プローブＢ３−１’：配列番号１の２１９８１〜２２０００番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
プローブＢ３−２’：配列番号１において２１９９１番目のＣがＴに置換された塩基配列における２１９８１〜２２０００番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
含む、（１）記載のプローブセット。
（３）（１）又は（２）記載のプローブセットが担体上に固定化されてなる、ＡＢＯ式血液型を判定するためのマイクロアレイ。
（４）担体が、表面にカーボン層と化学修飾基とを有するものである、（３）記載のマイクロアレイ。
（５）被検者のＡＢＯ式血液型を判定する方法であって、
被検者由来の試料からゲノムＤＮＡを抽出する工程と、
抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子におけるエキソン６を含む領域及び／又はエキソン７を含む領域を増幅する工程と、
（１）又は（２）記載のプローブセットと増幅核酸を接触させる工程と、
各プローブペアにおいて、一方のプローブにハイブリダイズした核酸と他方のプローブにハイブリダイズした核酸の比を測定する工程と
を含む、前記方法。
（６）（１）若しくは（２）記載のプローブセット、又は（３）若しくは（４）記載のマイクロアレイを含む、ＡＢＯ式血液型を判定するためのキット。

図１は、Ｏ型の血液型を有する検体由来のゲノムＤＮＡから増幅した核酸を１７塩基、２０塩基、２３塩基又は２５塩基の塩基配列からなるＯ型判定プローブペアにハイブリダイズさせたときの、各プローブペアにハイブリダイズした核酸に由来する蛍光強度及びその比を示す。
図２は、各種血液型を有する検体由来のゲノムＤＮＡから増幅した核酸をＯ型判定プローブペア及びＢ型判定プローブペアにハイブリダイズさせたときの、各プローブペアにハイブリダイズした核酸に由来する蛍光強度の比を示す。
図３は、各種血液型を有する４４検体由来のゲノムＤＮＡから増幅した核酸をＯ型判定プローブペア及びＢ型判定プローブペアにハイブリダイズさせ、Ｏ型判定プローブペアにおける蛍光強度比をＸ軸に、Ｂ型判定プローブペアプローブ蛍光強度比Ｙ軸にプロットした結果を示す。
図４は、Ａ２型、Ａ３型、Ｂ３型、ＡＯ型及びＢＯ型のＤＮＡから増幅した核酸をＡ２型判定プローブペア、Ａ３型判定プローブペア及びＢ３型判定プローブペアにハイブリダイズさせたときの、各プローブペアにハイブリダイズした核酸に由来する蛍光強度の比を示す。
図５は、Ａ２型、ＡＯ型及びＢＯ型のＤＮＡから増幅した核酸を２０塩基、１８塩基又は１６塩基の塩基配列からなるＡ２型判定プローブペアにハイブリダイズさせたときの、各プローブペアにハイブリダイズした核酸に由来する蛍光強度の比を示す。

ゲノム上のＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は多型を有し、Ａ、Ｂ及びＯ対立遺伝子配列を有する。Ａ及びＢ対立遺伝子は、異なる特異性を有するＡ及びＢトランスフェラーゼをそれぞれコードする。Ａ対立遺伝子は、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードし、Ｂ対立遺伝子は、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする。Ｏ対立遺伝子は塩基対欠失により、トランスフェラーゼの機能的ドメインを欠いている蛋白質をコードする。これらの対立遺伝子の組み合わせにより、ＡＢＯ式血液型には、ＡＡ型、ＢＢ型、ＡＯ型、ＢＯ型、ＡＢ型及びＯＯ型が存在する。さらに、ＡＡ型及びＢＢ型には亜型も存在し、ＡＡ型の亜型としては、Ａ２型、Ａ３型が存在し、ＢＢ型の亜型としてはＢ３型が存在する。
Ａ２型、Ａ３型および、Ｂ３型はそもそも抗原抗体反応において識別される血液型の亜型であるが、現在では遺伝子配列における点変異の部位が報告されているものである（ＩＭＭＵＮＯＨＥＭＡＴＯＬＯＧＹ，２０（１）（２００４）３−２２．）。
ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の配列は公知であり、公開されたデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されている。例えば、Ａ対立遺伝子の配列は、Ａ１０１（ＡＦ１３４４１２）として登録されており、Ｂ対立遺伝子の配列は、Ｂ１０１（ＡＦ０１６６２２，ＡＪ５３６１３５）として登録されており、Ｏ対立遺伝子の配列は、Ｏ０１（ＡＦ１３４４１５，ＡＦ１３４４３５，ＡＦ１３４４３６）として登録されている。また、Ａ２遺伝子の配列は、Ａ２０１（ＡＦ１３４４２１，ＡＦ１３４４２２）として登録されており、Ａ３遺伝子の配列は、Ａ３０１（ＡＦ１３４４２３，ＡＦ１３４４２４）として登録されており、Ｂ３遺伝子の配列は、Ｂ３０１（ＡＦ１３４４３１，ＡＦ１３４４３２）として登録されている。各配列は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／から入手できる。
本発明のＡＢＯ式血液型を判定するためのプローブセットは、Ｏ型判定プローブペア、及びＢ型判定プローブペアを含む。
本発明のプローブセットは、Ｏ型判定プローブペアとして、プローブＯ−１及びプローブＯ−２のペア、及び／又はプローブＯ−１’及びプローブＯ−２’のペアを含む。
プローブＯ−１は、配列番号１の２０１３６〜２０１５５番目の塩基（配列番号２）を含む連続した２２塩基以下の塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブであり、好ましくは配列番号２の塩基配列からなるプローブである。プローブＯ−２は、配列番号１において２０１４６番目のＧが欠失した塩基配列における２０１３６〜２０１５６番目の塩基（配列番号３）を含む連続した２２塩基以下の塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブである。好ましくは配列番号３の塩基配列からなるプローブである。
プローブＯ−１’は、配列番号１の２０１３６〜２０１５５番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブであり、プローブＯ−２’は、配列番号１において２０１４６番目のＧが欠失した塩基配列における２０１３６〜２０１５６番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブである。プローブＯ−１’とプローブＯ−２’のペアにおいては、５’末端及び３’末端において同じ欠失を有するペアを用いるのが好ましい。例えば、プローブＯ−１’が５’末端においてのみ１塩基の欠失を有する場合、プローブＯ−２’も５’末端においてのみ１塩基の欠失を有することが好ましい。
Ｏ型判定プローブペアとして、配列番号２の塩基配列からなるプローブと配列番号３の塩基配列からなるプローブを含むことが好ましい。
本発明のプローブセットは、Ｂ型判定プローブペアとして、プローブＢ−１及びプローブＢ−２のペア、及び／又はプローブＢ−１’及びプローブＢ−２’のペアを含む。
プローブＢ−１は、配列番号１の２１８５７〜２１８７６番目の塩基（配列番号４）を含む連続した２２塩基以下の塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブであり、好ましくは配列番号４の塩基配列からなるプローブである。プローブＢ−２は、配列番号１において２１８６７番目のＧがＡに置換された塩基配列における２１８５７〜２１８７６番目の塩基（配列番号５）を含む連続した２２塩基以下の塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブである。好ましくは配列番号５の塩基配列からなるプローブである。
プローブＢ−１’は、配列番号１の２１８５７〜２１８７６番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブであり、プローブＢ−２’は、配列番号１において２１８６７番目のＧがＡに置換された塩基配列における２１８５７〜２１８７６番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブである。プローブＢ−１’とプローブＢ−２’のペアにおいては、５’末端及び３’末端において同じ欠失を有するペアを用いるのが好ましい。例えば、プローブＢ−１’が５’末端においてのみ１塩基の欠失を有する場合、プローブＢ−２’も５’末端においてのみ１塩基の欠失を有することが好ましい。
Ｂ型判定プローブペアとして、配列番号４の塩基配列からなるプローブと配列番号５の塩基配列からなるプローブを含むことが好ましい。
本発明のＡＢＯ式血液型を判定するためのプローブセットは、Ａ２型判定プローブペア、Ａ３型判定プローブペア、及びＢ３型判定プローブペアからなる群から選択される少なくとも１のプローブペアをさらに含んでいてもよい。
本発明のプローブセットは、Ａ２型判定プローブペアとして、プローブＡ２−１及びプローブＡ２−２のペア、及び／又はプローブＡ２−１’及びプローブＡ２−２’のペアを含む。
プローブＡ２−１は、配列番号１の２１３９４〜２１４０９番目の塩基（配列番号６に相補的な配列）を含む連続した２２塩基以下、好ましくは１７塩基以下の塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブであり、好ましくは配列番号６の塩基配列からなるプローブである。プローブＡ２−２は、配列番号１において２１４０４番目のＣがＴに置換された塩基配列における２１３９４〜２１４０９番目の塩基（配列番号７に相補的な配列）を含む連続した２２塩基以下、好ましくは１７塩基以下の塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブである。好ましくは配列番号７の塩基配列からなるプローブである。
プローブＡ２−１’は、配列番号１の２１３９４〜２１４０９番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブであり、プローブＡ２−２’は、配列番号１において２１４０４番目のＣがＴに置換された塩基配列における２１３９４〜２１４０９番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブである。プローブＡ２−１’とプローブＡ２−２’のペアにおいては、５’末端及び３’末端において同じ欠失を有するペアを用いるのが好ましい。例えば、プローブＡ２−１’が５’末端においてのみ１塩基の欠失を有する場合、プローブＡ２−２’も５’末端においてのみ１塩基の欠失を有することが好ましい。
Ａ２型判定プローブペアとして、配列番号６の塩基配列からなるプローブと配列番号７の塩基配列からなるプローブを含むことが好ましい。
本発明のプローブセットは、Ａ３型判定プローブペアとして、プローブＡ３−１及びプローブＡ３−２のペア、及び／又はプローブＡ３−１’及びプローブＡ３−２’のペアを含む。
プローブＡ３−１は、配列番号１の２１７９８〜２１８１７番目の塩基（配列番号８）を含む連続した２２塩基以下の塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブであり、好ましくは配列番号８の塩基配列からなるプローブである。プローブＡ３−２は、配列番号１において２１８０８番目のＧがＡに置換された塩基配列における２１７９８〜２１８１７番目の塩基（配列番号９）を含む連続した２２塩基以下の塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブである。好ましくは配列番号９の塩基配列からなるプローブである。
プローブＡ３−１’は、配列番号１の２１７９８〜２１８１７番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブであり、プローブＡ３−２’は、配列番号１において２１８０８番目のＧがＡに置換された塩基配列における２１７９８〜２１８１７番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブである。プローブＡ３−１’とプローブＡ３−２’のペアにおいては、５’末端及び３’末端において同じ欠失を有するペアを用いるのが好ましい。例えば、プローブＡ３−１’が５’末端においてのみ１塩基の欠失を有する場合、プローブＡ３−２’も５’末端においてのみ１塩基の欠失を有することが好ましい。
Ａ３型判定プローブペアとして、配列番号８の塩基配列からなるプローブと配列番号９の塩基配列からなるプローブを含むことが好ましい。
本発明のプローブセットは、Ｂ３型判定プローブペアとして、プローブＢ３−１及びプローブＢ３−２のペア、及び／又はプローブＢ３−１’及びプローブＢ３−２’のペアを含む。
プローブＢ３−１は、配列番号１の２１９８１〜２２０００番目の塩基（配列番号１０）を含む連続した２２塩基以下の塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブであり、好ましくは配列番号１０の塩基配列からなるプローブである。プローブＢ３−２は、配列番号１において２１９９１番目のＣがＴに置換された塩基配列における２１９８１〜２２０００番目の塩基（配列番号１１）を含む連続した２２塩基以下の塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブである。好ましくは配列番号１１の塩基配列からなるプローブである。
プローブＢ３−１’は、配列番号１の２１９８１〜２２０００番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブであり、プローブＢ３−２’は、配列番号１において２１９９１番目のＣがＴに置換された塩基配列における２１９８１〜２２０００番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブである。プローブＢ３−１’とプローブＢ３−２’のペアにおいては、５’末端及び３’末端において同じ欠失を有するペアを用いるのが好ましい。例えば、プローブＢ３−１’が５’末端においてのみ１塩基の欠失を有する場合、プローブＢ３−２’も５’末端においてのみ１塩基の欠失を有することが好ましい。
Ｂ３型判定プローブペアとして、配列番号１０の塩基配列からなるプローブと配列番号１１の塩基配列からなるプローブを含むことが好ましい。
本発明はまた、上記プローブセットを用いて被検者のＡＢＯ式血液型を判定する方法に関する。本発明の方法では、被検者（通常、ヒト被検者をさす）の生体試料由来のゲノムＤＮＡを鋳型とする増幅反応によって得られた増幅核酸と上記プローブセットを接触させるハイブリダイゼーション法において、各プローブペアにおいて一方のプローブにハイブリダイズした核酸と他方のプローブにハイブリダイズした核酸の比（核酸の量の比）を測定することを特徴とする。
本発明において核酸には、ＤＮＡおよびＲＮＡが包含され、ＤＮＡには一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡが包含される。プローブは通常核酸をさし、好ましくはＤＮＡである。増幅核酸は、好ましくはＤＮＡである。
被検者の生体試料由来のゲノムＤＮＡを鋳型とする増幅反応によって得られた増幅核酸とは、通常、被検者の生体試料由来のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子におけるエキソン６を含む領域及び／又はエキソン７を含む領域を増幅することによって得られる増幅核酸をさす。Ｏ型判定プローブペア及びＢ型判定プローブペアの双方についてハイブリダイズした核酸の比を測定する場合は、エキソン６を含む領域及びエキソン７を含む領域の双方を増幅する。Ａ２型判定プローブペア、Ａ３型判定プローブペア又はＢ３型判定プローブペアについてのみハイブリダイズした核酸の比を測定する場合は、エキソン７を含む領域のみを増幅すれば足りるが、双方の領域を増幅してもよい。
エキソン６を含む領域を増幅するためのプライマー及びエキソン７を含む領域を増幅するためのプライマーは、当業者であれば適宜設計できる。例えば、エキソン６を含む領域を増幅するためのプライマーセットとしては、配列番号１８の塩基配列からなるプライマーと配列番号１９の塩基配列からなるプライマーのセットが挙げられる。エキソン７を含む領域を増幅するためのプライマーセットとしては、配列番号２０の塩基配列からなるプライマーと配列番号２１の塩基配列からなるプライマーのセットが挙げられる。
従って、より具体的には、本発明のＡＢＯ式血液型を判定する方法は、
被検者由来の試料からゲノムＤＮＡを抽出する工程と、
抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子におけるエキソン６を含む領域及び／又はエキソン７を含む領域を増幅する工程と、
本発明のプローブセットと増幅核酸を接触させる工程と、
各プローブペアにおいて、一方のプローブにハイブリダイズした核酸と他方のプローブにハイブリダイズした核酸の比を測定する工程と
を含む。
各プローブペアにおいてハイブリダイズした核酸の比を測定する２つのプローブは同じ塩基長のものを用いるのが好ましい。
プローブは、例えば、核酸合成装置によって化学的に合成することで取得することができる。核酸合成装置としては、ＤＮＡシンセサイザー、全自動核酸合成装置、核酸自動合成装置等と呼ばれる装置を使用することができる。
各プローブペアにおいて、一方のプローブにハイブリダイズした核酸と他方のプローブにハイブリダイズした核酸の比から、被検者の遺伝子型、すなわちＡＢＯ式血液型（ＡＡ型、ＡＯ型、ＢＯ型、ＡＢ型及びＯＯ型、並びにＡ２型、Ａ３型及びＢ３型）を判定することができる。
より具体的には、以下のように判定することができる。
Ｏ型判定プローブペアにおいて、プローブＯ−２にハイブリダイズした核酸／プローブＯ−１にハイブリダイズした核酸の値（Ｏ−２／Ｏ−１）に基づき、被検者の血液型がＯＯ型、？Ｏ型又は？？型（？＝Ａ又はＢ）であるかを判定できる。？Ｏ型は、ＡＯ型又はＢＯ型を意味し、？？型はＡＡ型、ＡＢ型又はＢＢ型を意味する。Ｏ−２／Ｏ−１の値は、ＯＯ型＞？Ｏ型＞？？型となる。従って、Ｏ−２／Ｏ−１の値に閾値を設定することにより、ＯＯ型、？Ｏ型又は？？型のいずれであるかを判定できる。例えば、Ｏ−２／Ｏ−１の値が３．０以上であればＯＯ型と判定し、Ｏ−２／Ｏ−１の値が１．０以上３．０未満であれば？Ｏ型と判定し、Ｏ−２／Ｏ−１の値が１．０未満であれば？？型と判定できる。プローブＯ−２’にハイブリダイズした核酸／プローブＯ−１’にハイブリダイズした核酸の値（Ｏ−２’／Ｏ−１’）についても同様である。
Ｂ型判定プローブペアにおいて、プローブＢ−２にハイブリダイズした核酸／プローブＢ−１にハイブリダイズした核酸の値（Ｂ−２／Ｂ−１）に基づき、被検者の血液型がＢＢ型、Ｂ？型又は？？型（？＝Ａ又はＯ）であるかを判定できる。Ｂ？型は、ＡＢ型又はＢＯ型を意味し、？？型はＡＡ型、ＡＯ型又はＯＯ型を意味する。Ｂ−２／Ｂ−１の値は、ＢＢ型＞Ｂ？型＞？？型となる。従って、Ｂ−２／Ｂ−１の値に閾値を設定することにより、ＢＢ型、Ｂ？型又は？？型のいずれであるかを判定できる。例えば、Ｂ−２／Ｂ−１の値が３．０以上であればＢＢ型と判定し、Ｂ−２／Ｂ−１の値が１．０以上３．０未満であればＢ？型と判定し、Ｂ−２／Ｂ−１の値が１．０未満であれば？？型と判定できる。プローブＢ−２’にハイブリダイズした核酸／プローブＢ−１’にハイブリダイズした核酸の値（Ｂ−２’／Ｂ−１’）についても同様である。
上記Ｏ−２／Ｏ−１の値及びＢ−２／Ｂ−１の値から得られる判定結果を組み合わせることにより、ＡＡ型、ＢＢ型、ＡＯ型、ＢＯ型、ＡＢ型又はＯＯ型のいずれであるかを判定することができる。
Ａ２型判定プローブペアにおいて、プローブＡ２−２にハイブリダイズした核酸／プローブＡ２−１にハイブリダイズした核酸の値（Ａ２−２／Ａ２−１）に基づき、被検者の血液型がＡ２型であるかどうかを判定できる。Ａ２−２／Ａ２−１の値に閾値を設定することにより、Ａ２型であるかどうかを判定できる。例えば、Ａ２−２／Ａ２−１の値が１．５以上であればＡ２型と判定できる。プローブＡ２−２’にハイブリダイズした核酸／プローブＡ２−１’にハイブリダイズした核酸の値（Ａ２−２’／Ａ２−１’）についても同様である。
Ａ３型判定プローブペアにおいて、プローブＡ３−２にハイブリダイズした核酸／プローブＡ３−１にハイブリダイズした核酸の値（Ａ３−２／Ａ３−１）に基づき、被検者の血液型がＡ３型であるかどうかを判定できる。Ａ３−２／Ａ３−１の値に閾値を設定することにより、Ａ３型であるかどうかを判定できる。例えば、Ａ３−２／Ａ３−１の値が２．０以上であればＡ３型と判定できる。プローブＡ３−２’にハイブリダイズした核酸／プローブＡ３−１’にハイブリダイズした核酸の値（Ａ３−２’／Ａ３−１’）についても同様である。
Ｂ３型判定プローブペアにおいて、プローブＢ３−２にハイブリダイズした核酸／プローブＢ３−１にハイブリダイズした核酸の値（Ｂ３−２／Ｂ３−１）に基づき、被検者の血液型がＢ３型であるかどうかを判定できる。Ｂ３−２／Ｂ３−１の値に閾値を設定することにより、Ｂ３型であるかどうかを判定できる。例えば、Ｂ３−２／Ｂ３−１の値が２．０以上であればＢ３型と判定できる。プローブＢ３−２’にハイブリダイズした核酸／プローブＢ３−１’にハイブリダイズした核酸の値（Ｂ３−２’／Ｂ３−１’）についても同様である。
閾値は、実験条件により異なり当業者であれば適宜設定できる。より詳しくは、その遺伝子型が既知である被検者ついて、プローブペアごとに核酸ハイブリダイゼーションを実施し、統計的処理を行ってそれぞれの遺伝子型について上記比の標準値を算出し、遺伝子型が未知の被検者における比と当該標準値とを比較することにより、被検者の遺伝子型を判定することができる。
生体試料は、ゲノムＤＮＡを含むものであれば特に制限されない。例えば、血液およびこれに由来する血液関連試料（血液、血清および血漿など）、リンパ液、汗、涙、唾液、尿、糞便、腹水および髄液等の体液、ならびに細胞、組織または臓器の破砕物および抽出液などが挙げられる。本発明においては、好ましくは、血液関連試料を用いる。
ゲノムＤＮＡを鋳型とした増幅反応により得られる増幅核酸とプローブとのハイブリダイゼーション反応、並びに各プローブペアにおいて一方のプローブにハイブリダイズした核酸と他方のプローブにハイブリダイズした核酸の比の測定は、当技術分野で慣用の方法により実施することができる。具体的には、以下のように実施することができる。
まず、被検者から採取した生体試料からゲノムＤＮＡを抽出する。抽出手段としては、特に限定されないが、前記生体試料から直接的にＤＮＡ成分を分離し、精製して回収できる手段であることが好ましい。抽出手段の具体例としては、例えばフェノール／クロロホルム、エタノール、水酸化ナトリウム、ＣＴＡＢなどを用いたＤＮＡ抽出法が挙げられる。
次に、得られたゲノムＤＮＡを鋳型として用いて核酸増幅反応を行い、検出対象領域を増幅させる。核酸増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等を適用することができる。ここで、検出対象領域とは、被検者のゲノムＤＮＡ上のＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子に含まれるエキソン６及び／又はエキソン７における遺伝子多型を判定できる程度に特異性を有する領域である。本発明においては、好ましくはエキソン６を含む領域及び／又はエキソン７を含む領域に対し核酸増幅反応を実施する。
また、検出対象領域を増幅させる際には、増幅後の領域を識別できるように標識を付加することが望ましい。このとき、増幅された核酸を標識する方法としては、特に限定されないが、例えば核酸増幅反応に使用するプライマーをあらかじめ標識しておく方法を使用してもよいし、核酸増幅反応に標識ヌクレオチドを基質として使用する方法を使用してもよい。標識物質としては、特に限定されないが、放射性同位元素や蛍光色素、あるいはジゴキシゲニン（ＤＩＧ）やビオチンなどの有機化合物などを使用することができる。
またこの反応系は、核酸増幅・標識に必要な緩衝剤、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、検出対象領域特異的プライマー、標識ヌクレオチド三燐酸（具体的には蛍光標識等を付加したヌクレオチド三燐酸）、ヌクレオチド三燐酸および塩化マグネシウム等を含む反応系である。
上記のようにして得られた増幅核酸と本発明のプローブとのハイブリダイゼーション反応を行い、各プローブにハイブリダイズした核酸の量を、例えば標識を検出することにより測定できる。プローブにハイブリダイズした増幅核酸は、例えば、既知量のＤＮＡを含む試料を用いて検量線を作成することにより、定量することができる。
上記ハイブリダイゼーション反応においては、本発明のプローブが担体上に固定化されたマイクロアレイを用い、該マイクロアレイに増幅核酸を適用することが好ましい。その場合、本発明のプローブは、同一の担体に固定化されていてもよいし、異なる担体に固定化されていてもよい。少なくともプローブペア同士は同一の担体に固定化されていることが好ましく、Ｏ型判定プローブペアとＢ型判定プローブペアも同一の担体に固定化されていることが好ましい。各プローブとしては、それぞれの条件を満たす限り、複数種のものが担体上に固定化されていてもよい。
マイクロアレイにおける担体の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されない。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンおよびそれらの化合物などの貴金属、およびグラファイト、カーボンファイバーに代表される炭素などの導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表されるシリコン材料、ＳＯＩ（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表されるこれらシリコン材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、環状ポリオレフィン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。担体の形状も特に制限されないが、好ましくは平板状である。
本発明においては、担体として、好ましくは表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体を用いる。表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体には、基板の表面にカーボン層と化学修飾基とを有するもの、およびカーボン層からなる基板の表面に化学修飾基を有するものが包含される。基板の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されず、上述の担体材料と同様のものを使用できる。
本発明は、微細な平板状の構造を有する担体に対し好適に用いられる。形状は、長方形、正方形および円形など限定されないが、通常、１〜７５ｍｍ四方のもの、好ましくは１〜１０ｍｍ四方のもの、より好ましくは３〜５ｍｍ四方のものを用いる。微細な平板状の構造の担体を製造しやすいことから、シリコン材料や樹脂材料からなる基板を用いるのが好ましく、特に単結晶シリコンからなる基板の表面にカーボン層および化学修飾基を有する担体がより好ましい。単結晶シリコンには、部分部分でごくわずかに結晶軸の向きが変わっているものや（モザイク結晶と称される場合もある）、原子的尺度での乱れ（格子欠陥）が含まれているものも包含される。
本発明において基板上に形成させるカーボン層としては、特に制限されないが、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、またはそれらを積層させたものを用いることが好ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を用いてもよい。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ：Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｋｅ Ｃａｒｂｏｎ）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。カーボン層は、化学的安定性に優れておりその後の化学修飾基の導入や分析対象物質との結合における反応に耐えることができる点、分析対象物質と静電結合によって結合するためその結合が柔軟性を持っている点、ＵＶ吸収がないため検出系ＵＶに対して透明性である点、およびエレクトロブロッティングの際に通電可能な点において有利である。また、分析対象物質との結合反応において、非特異的吸着が少ない点においても有利である。前記のとおり基板自体がカーボン層からなる担体を用いてもよい。
本発明においてカーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。
高周波プラズマＣＶＤ法では、高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス（メタン）を分解し、基板上にＤＬＣ（ダイヤモンドライクカーボン）層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼン）を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基板上にカーボン層を形成する。水素ガス１〜９９体積％と残りメタンガス９９〜１体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりＤＬＣ層を形成してもよい。
アーク式蒸着法では、固体のグラファイト材料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。
レーザ蒸着法では、例えばＮｄ：ＹＡＧレーザ（パルス発振）光をグラファイトのターゲット板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形成することができる。
基板の表面にカーボン層を形成する場合、カーボン層の厚さは、通常、単分子層〜１００μｍ程度であり、薄すぎると下地基板の表面が局部的に露出する可能性があり、逆に厚くなると生産性が悪くなるので、好ましくは２ｎｍ〜１μｍ、より好ましくは５ｎｍ〜５００ｎｍである。
カーボン層が形成された基板の表面に化学修飾基を導入することにより、プローブを担体に強固に固定化できる。導入する化学修飾基は、当業者であれば適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基および活性エステル基が挙げられる。
アミノ基の導入は、例えば、カーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射することによりまたはプラズマ処理することにより実施できる。または、カーボン層を塩素ガス中で紫外線を照射して塩素化し、さらにアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。または、メチレンジアミン、エチレンジアミンで等の多価アミン類ガス中を、塩素化したカーボン層と反応させることによって実施することもできる。
カルボキシル基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に適当な化合物を反応させることにより実施できる。カルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−Ｒ_１−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ_１は炭素数１０〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸、３−クロロアクリル酸、４−クロロ安息香酸；式：ＨＯＯＣ−Ｒ_２−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ_２は単結合または炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：Ｒ_３−ＣＯ−Ｒ_４−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ_３は水素原子または炭素数１〜１２の２価の炭化水素基、Ｒ_４は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるケト酸またはアルデヒド酸；式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ_５−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ_５は単結合または炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。
エポキシ基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価エポキシ化合物を反応させることによって実施できる。あるいは、カーボン層が含有する炭素＝炭素２重結合に有機過酸を反応させることにより得ることができる。有機過酸としては、過酢酸、過安息香酸、ジペルオキシフタル酸、過ギ酸、トリフルオロ過酢酸などが挙げられる。
ホルミル基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に、グルタルアルデヒドを反応させることにより実施できる。
ヒドロキシル基の導入は、例えば、前記のように塩素化したカーボン層に、水を反応させることにより実施できる。
活性エステル基は、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味する。エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。より具体的には、活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド基等が挙げられ、特に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基が好ましく用いられる。
活性エステル基の導入は、例えば、前記のように導入したカルボキシル基を、シアナミドやカルボジイミド（例えば、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド）などの脱水縮合剤とＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステル化することにより実施できる。この処理により、アミド結合を介して炭化水素基の末端に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基が結合した基を形成することができる（特開２００１−１３９５３２）。
本発明のプローブを、スポッティング用バッファーに溶解してスポッティング用溶液を調製し、これを９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した溶液をスポッター装置等によって担体上にスポッティングすることにより、プローブが担体に固定化されたマイクロアレイを製造することができる。または、スポッティング溶液をマイクロピペッターにて手動でスポッティングしてもよい。
スポッティング後、プローブが担体に結合する反応を進行させるため、インキュベーションを行うことが好ましい。インキュベーションは、通常−２０〜１００℃、好ましくは０〜９０℃の温度で、通常０．５〜１６時間、好ましくは１〜２時間にわたって行う。インキュベーションは、高湿度の雰囲気下、例えば、湿度５０〜９０％の条件で行うのが望ましい。インキュベーションに続き、担体に結合していない核酸を除去するため、洗浄液（例えば、５０ｍＭ ＴＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて洗浄を行うことが好ましい。
本発明はまた、本発明のプローブセットを含む、ＡＢＯ式血液型を判定するためのキットに関する。本発明のキットにおいてプローブは、担体上に固定化されたマイクロアレイの形態で提供されてもよい。本発明のキットは、さらに、核酸増幅・標識に必要な緩衝剤、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、検出対象領域特異的プライマー、標識ヌクレオチド三燐酸（具体的には蛍光標識等を付加したヌクレオチド三燐酸）、ヌクレオチド三燐酸および塩化マグネシウム等を含んでいてもよい。検出対象領域特異的プライマーは、好ましくはＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のエキソン６を含む領域を増幅するためのプライマー及びエキソン７を含む領域を増幅するためのプライマーである。

実施例１ 担体の作製
３ｍｍ角のシリコン基板にイオン化蒸着法を用いて、下記の条件で２層のＤＬＣ層の製膜を行った。
１層目 ２層目
原料ガス ＣＨ_４ ４．７５ ４７．５ （ｓｓｃｍ）
Ｈ_２ ０．２５ ２．５ （ｓｓｃｍ）
作動圧力 ３．０ ８．０ （Ｐａ）
基板バイアス 直流電圧 ５００ ５００ （Ｖ）
高周波出力 １００ − （Ｗ）
アノード電圧 ５０ ５０ （Ｖ）
フィラメント 電圧 ７ ７ （Ｖ）
電流 ２２ ２２ （Ａ）
得られた表面にＤＬＣ層を有するシリコン基板上に、下記の条件でアンモニアプラズマを用いて、アミノ基を導入した。
原料ガス ＮＨ_３ ３０ （ｓｓｃｍ）
作動圧力 ８．０ （ｓｓｃｍ）
基板バイアス 直流電圧 ５００ （Ｐａ）
高周波出力 − （Ｗ）
アノード電圧 ５０ （Ｖ）
フィラメント 電圧 ７ （Ｖ）
電流 ２２ （Ａ）
１４０ｍＭ無水コハク酸及び０．１Ｍホウ酸ナトリウムを含む１−メチル−２−ピロリドン溶液に３０分間浸漬し、カルボキシル基を導入した。０．１Ｍリン酸カリウムバッファー、０．１Ｍ １−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド、２０ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスクシイミドを含む溶液に３０分間浸漬し、活性化を行い、シリコン基板表面にＤＬＣ層及び化学修飾基としてのＮ−ヒドロキシスクシイミド基を有する担体を得た。
実施例２ プローブ長の比較
ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノム配列（配列番号１）におけるエキソン６の塩基配列に基づき、１７塩基、２０塩基、２３塩基又は２５塩基の塩基配列からなり５’末端をアミノ基で修飾した８種のプローブを合成した。各プローブの塩基配列を下記表１に示す。プローブＯ−１−１７とＯ−２−１７、プローブＯ−１−２０とＯ−２−２０、プローブＯ−１−２３とＯ−２−２３、及びプローブＯ−１−２５とＯ−２−２５がそれぞれＯ型判定プローブペアに相当する。

表１に示した８種のプローブを１０μＭとなるようにスポットソリューション（Ｓｏｌ．６）に溶解し、スポッターＳＰＢＩＯ（日立ソフト社製）を用いて実施例１で作製した担体上にスポットした。８０℃で１時間ベーキング後、２×ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳ溶液（室温）で１５分間洗浄し、８種のプローブが担体上に固定化されたマイクロアレイ１を得た。
血液型がＯ型であることがわかっている被検者の頬内側の口腔内細胞を綿棒でかきとり、１ｍＬのＰＢＳに懸濁した。５０００ｒｐｍで１分遠心し、細胞を回収した。ＰＢＳを１８０μＬ加えた。フジフイルム社製Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ ＤＮＡ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ Ｓを用いてライセートを作成し、さらにフジフイルム社製Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ−８００を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
このＤＮＡを鋳型ＤＮＡとし、ゲノムにおけるＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のエキソン６を含む領域（配列番号１の１９８８０〜２０４１０番目の塩基、５２８ｂｐ）及びエキソン７を含む領域（配列番号１の２１２９９〜２２０８４番目の塩基、７８６ｂｐ）を増幅するよう表２に示した組成でＰＣＲ反応液を作製した。プライマー１〜４の配列を表３に示す。

調製したＰＣＲ反応液に対し、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＡＢＩ）を用い、下記温度サイクルでＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応中にＣｙ５−ｄＣＴＰが取り込まれ、増幅ＤＮＡが蛍光標識される。

２μＬ ＰＣＲ産物と１μＬ ３×ＳＳＣ／０．３％ ＳＤＳを混合し、マイクロアレイ１に滴下し、カバーを被せた。水を張ったタッパーに入れ、４５℃で１時間インキュベートした。室温で２×ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳで２回、２×ＳＳＣで２回、洗浄を行った。
マイクロアレイ１の周りの余分な洗浄液を拭き取り、カバーガラスを被せた。続いてＦＬＡ８０００（フジフイルム社製）でスキャンを行い、蛍光画像からＡｒｒａｙ Ｇａｕｇｅ（フジフイルム社製）を用いて各プローブのスポットの蛍光強度を数値化した。この蛍光強度がプローブにハイブリダイズした核酸の量を表す。各プローブペアについて、蛍光強度から蛍光強度比を算出した。この蛍光強度比がプローブにハイブリダイズした核酸の量の比を表す。蛍光強度実測値と蛍光強度比（プローブＯ−２−＊における蛍光強度／プローブＯ−１−＊における蛍光強度）の結果を図１に示す。プローブの塩基数が増えるに従って、蛍光強度実測値は増加した。蛍光強度比は２０塩基のプローブを用いた場合が最も高かった。このことからプローブの塩基長は２０塩基が最適であることがわかった。
実施例３ ＡＡ型、ＡＯ型、ＢＯ型、ＡＢ型及びＯＯ型の判定
実施例２と同様に試験を行った。ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノム配列（配列番号１）におけるエキソン６及びエキソン７の塩基配列に基づき、２０塩基の塩基配列からなり５’末端をアミノ基で修飾した４種のプローブ、すなわち、Ｏ型判定プローブペア（プローブＯ−１及びプローブＯ−２）及びＢ型判定プローブペア（プローブＢ−１及びプローブＢ−２）を合成した。各プローブの配列を下記表４に示す。

表４に示した４種のプローブを１０μＭとなるようにスポットソリューション（Ｓｏｌ．６）に溶解し、スポッターＳＰＢＩＯ（日立ソフト社製）を用いて実施例１で作製した担体上にスポットした。８０℃で１時間ベーキング後、２×ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳ溶液（室温）で１５分間洗浄し、４種のプローブが担体上に固定化されたマイクロアレイ２を得た。
検体として、血液型がそれぞれＡＡ型、ＡＯ型、ＢＯ型、ＡＢ型及びＯＯ型であることがわかっている６人の被検者の頬内側の口腔内細胞を用い、実施例２と同様にゲノムＤＮＡを抽出し、プライマー１〜４を用いてＰＣＲを実施した。
２μＬ ＰＣＲ産物と１μＬ ３×ＳＳＣ／０．３％ ＳＤＳを混合し、マイクロアレイ２に滴下し、カバーを被せた。水を張ったタッパーに入れ、４５℃で１時間インキュベートした。室温で２×ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳで２回、２×ＳＳＣで２回、洗浄を行った。マイクロアレイ２の周りの余分な洗浄液を拭き取り、カバーガラスを被せた。続いてＦＬＡ８０００（フジフイルム社製）でスキャンを行い、蛍光画像からＡｒｒａｙ Ｇａｕｇｅ（フジフイルム社製）を用いて各プローブのスポットの蛍光強度を数値化した。各プローブペアについて、蛍光強度から蛍光強度比を算出した。蛍光強度実測値と蛍光強度比（プローブＯ−２における蛍光強度／プローブＯ−１における蛍光強度、及びプローブＢ−２における蛍光強度／プローブＢ−１における蛍光強度）の結果を図２に示す。図２の結果から、本発明のＯ型判定プローブペア（プローブＯ−１及びプローブＯ−２）及びＢ型判定プローブペア（プローブＢ−１及びプローブＢ−２）を用いて、ＡＡ、ＡＯ型、ＢＯ型、ＡＢ型及びＯＯ型を判定できることが示された。
実施例４ 血液型未知の検体の判定
実施例３で作製したマイクロアレイ２を用いて、血液型が未知の４４検体を用いて試験を行った。検体として、血液（生体血、死体血、血痕）、大動脈、骨、腎臓、毛髪を用い、実施例２と同様にゲノムＤＮＡを抽出し、プライマー１〜４を用いてＰＣＲを実施した。
２μＬ ＰＣＲ産物と１μＬ ３×ＳＳＣ／０．３％ ＳＤＳを混合し、マイクロアレイ２に滴下し、カバーを被せた。水を張ったタッパーに入れ、４５℃で１時間インキュベートした。室温で２×ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳで２回、２×ＳＳＣで２回、洗浄を行った。マイクロアレイ２の周りの余分な洗浄液を拭き取り、カバーガラスを被せた。続いてＦＬＡ８０００（フジフイルム社製）でスキャンを行い、蛍光画像からＡｒｒａｙ Ｇａｕｇｅ（フジフイルム社製）を用いて各スポットの蛍光強度を数値化した。各プローブペアについて、蛍光強度から蛍光強度比を算出した。
４４検体について、プローブＯ−２における蛍光強度／プローブＯ−１における蛍光強度をＸ軸に、プローブＢ−２における蛍光強度／プローブＢ−１における蛍光強度をＹ軸にプロットした（図３）。グラフ上の５箇所に偏った分布を示し、これに血液型（遺伝型）を当てはめることができた。以上から、Ｏ型判定プローブペア（プローブＯ−１及びプローブＯ−２）及びＢ型判定プローブペア（プローブＢ−１及びプローブＢ−２）における蛍光強度比について、それぞれ閾値を設定することで未知の検体の血液型を判定できることが示された。
実施例５ 血液型亜型の判定
実施例２と同様に試験を行った。ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノム配列（配列番号１）におけるエキソン７の塩基配列に基づき、２０塩基の塩基配列からなり５’末端をアミノ基で修飾した４種のプローブ、すなわち、Ａ２型判定プローブペア（プローブＡ２−１及びプローブＡ２−２）、Ａ３型判定プローブペア（プローブＡ３−１及びプローブＡ３−２）、及びＢ３型判定プローブペア（プローブＢ３−１及びプローブＢ３−２）を合成した。各プローブの配列を下記表５に示す。

表５に示した６種のプローブを１０μＭとなるようにスポットソリューション（Ｓｏｌ．６）に溶解し、スポッターＳＰＢＩＯ（日立ソフト社製）を用いて実施例１で作製した担体上にスポットした。８０℃で１時間ベーキング後、２×ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳ溶液（室温）で１５分間洗浄し、４種のプローブが担体上に固定化されたマイクロアレイ３を得た。
検体として、ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のエキソン７を含む領域（配列番号１の２１２９９〜２２０８４番目の塩基に相当、７８６ｂｐ）について、Ａ２型、Ａ３型、Ｂ３型、ＡＯ型及びＢＯ型に相当する塩基配列からなるＤＮＡを合成しプラスミドｐＵＣに組み込んだプラスミドを鋳型ＤＮＡとして用い、実施例２と同様に、プライマー３及び４を用いてＰＣＲを実施した。
２μＬ ＰＣＲ産物と１μＬ ３×ＳＳＣ／０．３％ ＳＤＳを混合し、マイクロアレイ２に滴下し、カバーを被せた。水を張ったタッパーに入れ、４５℃で１時間インキュベートした。室温で２×ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳで２回、２×ＳＳＣで２回、洗浄を行った。マイクロアレイ２の周りの余分な洗浄液を拭き取り、カバーガラスを被せた。続いてＦＬＡ８０００（フジフイルム社製）でスキャンを行い、蛍光画像からＡｒｒａｙ Ｇａｕｇｅ（フジフイルム社製）を用いて各プローブのスポットの蛍光強度を数値化した。各プローブペアについて、蛍光強度から蛍光強度比（プローブＡ２−２における蛍光強度／プローブＡ２−１における蛍光強度、プローブＡ３−２における蛍光強度／プローブＡ３−１における蛍光強度、プローブＢ３−２における蛍光強度／プローブＢ３−１における蛍光強度）を算出した。結果を図４に示す。
Ａ２型の検体は、Ａ２型判定プローブペアにおいても蛍光強度比（Ａ２−１／Ａ２−２）はその他の検体と差が小さく、Ａ２型を明確に判定することはできなかった。Ａ３型判定プローブペアにおける蛍光強度比（Ａ３−１／Ａ３−２）は、Ａ３型の検体では約６．３であり、一方その他の検体では約１．０であり、判定可能であった。また検体Ｂ３型についても、Ｂ３型判定プローブペアにおける蛍光強度比（Ｂ３−１／Ｂ３−２）は、その他の検体の蛍光強度比が約１．０であるに対して、約２．７となり、判定可能であった。
実施例６ 亜型Ａ２判定プローブの塩基長の検討
実施例５で判定できなかった亜型Ａ２型を判定するために、２０塩基、１８塩基及び１６塩基の塩基配列からなり５’末端をアミノ基で修飾した３種のＡ２型判定プローブペアを合成した。各プローブの配列を下記表６に示す。

検体として、ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のエキソン７を含む領域（配列番号１の２１２９９〜２２０８４番目の塩基に相当、７８６ｂｐ）について、Ａ２型、ＡＯ型及びＢＯ型に相当する塩基配列からなるＤＮＡを合成しプラスミドｐＵＣに組み込んだプラスミドを鋳型ＤＮＡとして用い、実施例２と同様に、プライマー３及び４を用いてＰＣＲを実施した。
２μＬＰＣＲ産物と１μＬ ３×ＳＳＣ／０．３％ ＳＤＳを混合し、マイクロアレイ２に滴下し、カバーを被せた。水を張ったタッパーに入れ、４５℃で１時間インキュベートした。室温で２×ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳで２回、２×ＳＳＣで２回、洗浄を行った。マイクロアレイ２の周りの余分な洗浄液を拭き取り、カバーガラスを被せた。続いてＦＬＡ８０００（フジフイルム社製）でスキャンを行い、蛍光画像からＡｒｒａｙ Ｇａｕｇｅ（フジフイルム社製）を用いて各プローブのスポットの蛍光強度を数値化した。各プローブペアについて、蛍光強度から蛍光強度比（プローブＡ２−２−＊における蛍光強度／プローブＡ２−１−＊における蛍光強度）を算出した。結果を図５に示す。
２０塩基及び１８塩基のプローブペアでは、Ａ２型の検体の蛍光強度比（Ａ２−２−＊／Ａ２−１−＊）は、ＡＯ型及びＢＯ型の検体と比べてわずかしか差がなかった。それに対し、１６塩基のプローブペアでは蛍光強度比（Ａ２−２−１６／Ａ２−１−１６）は、Ａ２型が約１．７、ＡＯ型が約０．３、ＢＯ型が約０．０と差が大きくなった。以上から、Ａ２型の判定には、１６塩基のプローブペアが好ましいことが示された。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
［配列表］

Claims (6)

1. ＡＢＯ式血液型を判定するためのプローブセットあって、Ｏ型判定プローブペア及びＢ型判定プローブペアを含み、
   Ｏ型判定プローブペアが、以下のプローブＯ−１及びプローブＯ−２のペア：
   プローブＯ−１：配列番号１の２０１３６〜２０１５５番目の塩基を含む連続した２２塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
   プローブＯ−２：配列番号１において２０１４６番目のＧが欠失した塩基配列における２０１３６〜２０１５６番目の塩基を含む連続した２２塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
   、及び／又は以下のプローブＯ−１’及びプローブＯ−２’のペア：
   プローブＯ−１’：配列番号１の２０１３６〜２０１５５番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
   プローブＯ−２’：配列番号１において２０１４６番目のＧが欠失した塩基配列における２０１３６〜２０１５６番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
   を含み、
   Ｂ型判定プローブペアが、以下のプローブＢ−１及びプローブＢ−２のペア：
   プローブＢ−１：配列番号１の２１８５７〜２１８７６番目の塩基を含む連続した２２塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
   プローブＢ−２：配列番号１において２１８６７番目のＧがＡに置換された塩基配列における２１８５７〜２１８７６番目の塩基を含む連続した２２塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
   、及び／又は以下のプローブＢ−１’及びプローブＢ−２’のペア：
   プローブＢ−１’：配列番号１の２１８５７〜２１８７６番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
   プローブＢ−２’：配列番号１において２１８６７番目のＧがＡに置換された塩基配列における２１８５７〜２１８７６番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
   を含む、前記プローブセット。
2. Ａ２型判定プローブペア、Ａ３型判定プローブペア及びＢ３型判定プローブペアからなる群から選択される少なくとも１のプローブペアをさらに含み、
   Ａ２型判定プローブペアが、以下のプローブＡ２−１及びプローブＡ２−２のペア：
   プローブＡ２−１：配列番号１の２１３９４〜２１４０９番目の塩基を含む連続した２２塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
   プローブＡ２−２：配列番号１において２１４０４番目のＣがＴに置換された塩基配列における２１３９４〜２１４０９番目の塩基を含む連続した２２塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
   、及び／又は以下のプローブＡ２−１’及びプローブＡ２−２’のペア：
   プローブＡ２−１’：配列番号１の２１３９４〜２１４０９番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
   プローブＡ２−２’：配列番号１において２１４０４番目のＣがＴに置換された塩基配列における２１３９４〜２１４０９番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
   を含み、
   Ａ３型判定プローブペアが、以下のプローブＡ３−１及びプローブＡ３−２のペア：
   プローブＡ３−１：配列番号１の２１７９８〜２１８１７番目の塩基を含む連続した２２塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
   プローブＡ３−２：配列番号１において２１８０８番目のＧがＡに置換された塩基配列における２１７９８〜２１８１７番目の塩基を含む連続した２２塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
   、及び／又は以下のプローブＡ３−１’及びプローブＡ３−２’のペア：
   プローブＡ３−１’：配列番号１の２１７９８〜２１８１７番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
   プローブＡ３−２’：配列番号１において２１８０８番目のＧがＡに置換された塩基配列における２１７９８〜２１８１７番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
   を含み、
   Ｂ３型判定プローブペアが、以下のプローブＢ３−１及びプローブＢ３−２のペア：
   プローブＢ３−１：配列番号１の２１９８１〜２２０００番目の塩基を含む連続した２２塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
   プローブＢ３−２：配列番号１において２１９９１番目のＣがＴに置換された塩基配列における２１９８１〜２２０００番目の塩基を含む連続した２２塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
   、及び／又は以下のプローブＢ３−１’及びプローブＢ３−２’のペア：
   プローブＢ３−１’：配列番号１の２１９８１〜２２０００番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
   プローブＢ３−２’：配列番号１において２１９９１番目のＣがＴに置換された塩基配列における２１９８１〜２２０００番目の塩基の５’末端及び／又は３’末端の１塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
   含む、請求の範囲第１項記載のプローブセット。
3. 請求の範囲第１項又は第２項記載のプローブセットが担体上に固定化されてなる、ＡＢＯ式血液型を判定するためのマイクロアレイ。
4. 担体が、表面にカーボン層と化学修飾基とを有するものである、請求の範囲第３項記載のマイクロアレイ。
5. 被検者のＡＢＯ式血液型を判定する方法であって、
   被検者由来の試料からゲノムＤＮＡを抽出する工程と、
   抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子におけるエキソン６を含む領域及び／又はエキソン７を含む領域を増幅する工程と、
   請求の範囲第１項又は第２項記載のプローブセットと増幅核酸を接触させる工程と、
   各プローブペアにおいて、一方のプローブにハイブリダイズした核酸と他方のプローブにハイブリダイズした核酸の比を測定する工程と
   を含む、前記方法。
6. 請求の範囲第１項若しくは第２項記載のプローブセット、又は請求の範囲第３項若しくは第４項記載のマイクロアレイを含む、ＡＢＯ式血液型を判定するためのキット。

Images