JP2002526123A - 核酸多形現象の検出 - Google Patents
核酸多形現象の検出Info
- Publication number
- JP2002526123A JP2002526123A JP2000574725A JP2000574725A JP2002526123A JP 2002526123 A JP2002526123 A JP 2002526123A JP 2000574725 A JP2000574725 A JP 2000574725A JP 2000574725 A JP2000574725 A JP 2000574725A JP 2002526123 A JP2002526123 A JP 2002526123A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- probe
- dna
- complex
- allele
- single strand
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明は、（ａ）変異の遺伝子座を含むＤＮＡ塩基配列の一本鎖と；（ｂ）上記一本鎖（ａ）とハイブリッド形成して二本鎖を形成可能で、かつ変異の１つの対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ類似体のアナログのプローブと；（ｃ）前記二本鎖で複合体を形成する一本鎖（ａ）とプローブ（ｂ）との二本鎖構造に特異で、当該二本鎖と複合体を形成し、かつ、二本鎖内で相互作用した場合に独自に反応するマーカーとから構成される複合体の形成または解離を監視することでＤＮＡ変異を検出する方法であって、その方法は前記の二本鎖とマーカーとの相互反応を示す出力信号を連続的に測定し、反応の出力信号に変化が生起した条件を記録することを包含する。出力信号の変化は、前記複合体の形成または解離に原因し、従って、一本鎖（ａ）にプローブ（ｂ）がハイブリッド形成している強さと相関する。動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（Dynamic Allele Specific Hybridization: DASH）と呼ばれるこの方法は、ＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの相違を評価する。複合体の変性あるいはハイブリッド形成から生じる蛍光の変化に追従する蛍光マーカーが、上記のマーカー（ｃ）として好適である。
Description
【０００１】 本発明は、核酸配列順序の変異、より詳しくは、天然ＤＮＡ塩基配列に発生す
る変異体（同質多型および突然変異）の評価に関する。
る変異体（同質多型および突然変異）の評価に関する。
【０００２】 例えばヒトなどの種のゲノムにおいて、任意の２つの等価染色体間におけるヌ
クレオチドの変異は、平均すると１０３につき１の割合であると推定される。そ
うした変異の大部分は機能的に中立であるが、ほんの少量は、疾病のリスクを含
むヒトの表現型的相違（phenotypic differences）を引き起こす。変異の遺伝子
座を含むＤＮＡ分節の染色体部分に対する対立遺伝子の特異プローブにおけるハ
イブリダイゼーションの程度を測定することにより、ＤＮＡの変異が調べられる
。この手法では、調査時に個体から採取したＤＮＡサンプルについて、“適合（
プローブと同一のＤＮＡの存在）”および“不適合（プローブと同一でないＤＮ
Ａの存在）”を記録することができる。しかし、こうした従来の手法には、適切
な差別的ハイブリダイゼーションを厳格に測定するのが困難であるという問題が
残る。従って、こうした問題点を改善して、信頼性が高く、より簡易な手法を確
立することが求められている。
クレオチドの変異は、平均すると１０３につき１の割合であると推定される。そ
うした変異の大部分は機能的に中立であるが、ほんの少量は、疾病のリスクを含
むヒトの表現型的相違（phenotypic differences）を引き起こす。変異の遺伝子
座を含むＤＮＡ分節の染色体部分に対する対立遺伝子の特異プローブにおけるハ
イブリダイゼーションの程度を測定することにより、ＤＮＡの変異が調べられる
。この手法では、調査時に個体から採取したＤＮＡサンプルについて、“適合（
プローブと同一のＤＮＡの存在）”および“不適合（プローブと同一でないＤＮ
Ａの存在）”を記録することができる。しかし、こうした従来の手法には、適切
な差別的ハイブリダイゼーションを厳格に測定するのが困難であるという問題が
残る。従って、こうした問題点を改善して、信頼性が高く、より簡易な手法を確
立することが求められている。
【０００３】 本発明は、 （ａ）変異の遺伝子座を含むＤＮＡ塩基配列の一本鎖と、 （ｂ）上記（ａ）の一本鎖を交雑して二本鎖を形成し、変異の１つの対立遺伝
子に対して特異的なオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ類似体のプローブと、 （ｃ）上記の（ａ）および（ｂ）の二本鎖構造に対して特異的であって、二本
鎖内で相互作用した際に独特に反応するマーカー から成る複合体を形成し、 （ｄ）該複合体を含む変性環境を定常的に高めるながら、マーカーと二本鎖と
の反応程度の出力信号を連続的に測定し、複合体の解離と考えられ、従って、上
記プローブ（ｂ）が上記一本鎖（ａ）と交雑している強さと相関関係にあるとこ
ろの、反応の出力信号に変化が起こる条件（以下、変性ポイントと称する）を記
録することならＤＮＡ変異の検出方法を提供する。
子に対して特異的なオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ類似体のプローブと、 （ｃ）上記の（ａ）および（ｂ）の二本鎖構造に対して特異的であって、二本
鎖内で相互作用した際に独特に反応するマーカー から成る複合体を形成し、 （ｄ）該複合体を含む変性環境を定常的に高めるながら、マーカーと二本鎖と
の反応程度の出力信号を連続的に測定し、複合体の解離と考えられ、従って、上
記プローブ（ｂ）が上記一本鎖（ａ）と交雑している強さと相関関係にあるとこ
ろの、反応の出力信号に変化が起こる条件（以下、変性ポイントと称する）を記
録することならＤＮＡ変異の検出方法を提供する。
【０００４】 上述したアッセイでは、複合体が最初に形成され、次に変性条件を適用して二
本鎖が解離するポイントを測定する。二本鎖の変性方法として加熱を採用する場
合、反応は以下の手順で実行される。初めに供試試料を冷却し、標的ＤＮＡにオ
リゴヌクレオチドまたはプローブを交雑させ、次に、制御および監視された状態
で定常的に加熱して変性温度を検出する。しかし、二本鎖ＤＮＡの形成は平衡反
応であり、両方向反応であると認められるので、上記の手順を逆にすることも可
能である。反応の全ての成分をまとめて上昇させ、次いで上と同様、制御および
監視された状況でこれらを冷却して、二本鎖（および複合体）が形成される温度
を検出する。この温度は“アニーリング”温度と称される。このアニーリング温
度は、“変性”温度に等しいと考えられるが、複合体が伴う化学作用に原因して
実際は別の値をとる。この等価原理は、本発明の目的のために、加熱以外の変性
／アニーリング条件が採用される場合にも、勿論適用可能である。
本鎖が解離するポイントを測定する。二本鎖の変性方法として加熱を採用する場
合、反応は以下の手順で実行される。初めに供試試料を冷却し、標的ＤＮＡにオ
リゴヌクレオチドまたはプローブを交雑させ、次に、制御および監視された状態
で定常的に加熱して変性温度を検出する。しかし、二本鎖ＤＮＡの形成は平衡反
応であり、両方向反応であると認められるので、上記の手順を逆にすることも可
能である。反応の全ての成分をまとめて上昇させ、次いで上と同様、制御および
監視された状況でこれらを冷却して、二本鎖（および複合体）が形成される温度
を検出する。この温度は“アニーリング”温度と称される。このアニーリング温
度は、“変性”温度に等しいと考えられるが、複合体が伴う化学作用に原因して
実際は別の値をとる。この等価原理は、本発明の目的のために、加熱以外の変性
／アニーリング条件が採用される場合にも、勿論適用可能である。
【０００５】 上記した方法は、所定の複合体が形成される以前に、且つ成分（ａ）（ｂ）が
交雑しない条件の下で、成分（ａ）〜（ｃ）を結合させ、その後、二本鎖及び複
合体が形成されるように、成分の環境条件を定常的に調節し、次いで、成分（ａ
）と（ｂ）のハイブリッド形成が生起したこと（以下、アニーリングポイントと
称す）を示す反応の出力信号を得る方法である。
交雑しない条件の下で、成分（ａ）〜（ｃ）を結合させ、その後、二本鎖及び複
合体が形成されるように、成分の環境条件を定常的に調節し、次いで、成分（ａ
）と（ｂ）のハイブリッド形成が生起したこと（以下、アニーリングポイントと
称す）を示す反応の出力信号を得る方法である。
【０００６】 従って、より具体的には、本発明に係るＤＮ変異の検出方法の一つは、 （ａ）変異の遺伝子座を含むＤＮＡ塩基配列の一本鎖と、 （ｂ）変異の一つの対立遺伝子に対して特異的で、かつ、上記の一本鎖（ａ）
と交雑して二本鎖を形成することができるオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ類似体
のプローブと、 （ｃ）前記（ａ）プラス（ｂ）の二本鎖構造に対して特異的であり、その二本
鎖と共に複合体を形成し、且つ、二本鎖内での相互作用に際して独特に反応する
マーカー からなる複合体の形成または解離を監視し、一本鎖（ａ）とプローブ（ｂ）から
形成される二本鎖に、マーカーが相互作用したことを示す出力信号を連続的に測
定し、複合体の形成または解離の原因と考えられ、従って、上記プローブ（ｂ）
が一本鎖（ａ）に交雑している強さと相関する反応の出力信号に変化が起きた条
件を記録することからなる。
と交雑して二本鎖を形成することができるオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ類似体
のプローブと、 （ｃ）前記（ａ）プラス（ｂ）の二本鎖構造に対して特異的であり、その二本
鎖と共に複合体を形成し、且つ、二本鎖内での相互作用に際して独特に反応する
マーカー からなる複合体の形成または解離を監視し、一本鎖（ａ）とプローブ（ｂ）から
形成される二本鎖に、マーカーが相互作用したことを示す出力信号を連続的に測
定し、複合体の形成または解離の原因と考えられ、従って、上記プローブ（ｂ）
が一本鎖（ａ）に交雑している強さと相関する反応の出力信号に変化が起きた条
件を記録することからなる。
【０００７】 また、本発明に係るＤＮＡの変異検出方法の他の一つは、 （ａ）変異の遺伝子座を含むＤＮＡ塩基配列の一本鎖と、 （ｂ）変異の一つの対立遺伝子に対して特異的で、かつ、上記の一本鎖（ａ）
を交二本鎖とするために一本鎖（ａ）と交雑することができるオリゴヌクレオチ
ド又はＤＮＡ類似体のプローブと、 （ｃ）前記の成分（ａ）プラス（ｂ）の二本鎖構造に対して特異的であり、そ
の二本鎖と共に複合体を形成し、且つ、二本鎖内での相互作用に際して独特に反
応するマーカー とを、 （ｉ）成分（ａ）が成分（ｂ）と交雑し、成分（ｃ）と共に複合体が形成され
る条件、または、 （ｉｉ）成分（ａ）と成分（ｂ）とが交雑せず、成分（ｃ）との複合体も形成
されない条件 の下で結合させ、しかる後、 （ｉ）形成された二本鎖が変性されて複合体が解離するか、あるいは、 （ｉｉ）二本鎖が形成されて複合体が形成される ように環境条件を徐々に且つ定常的に調節し、 さらに成分（ａ）と成分（ｂ）のハイブリダイゼーションの程度および成分（ｃ
）との複合体形成の程度を示す出力信号を継続的に測定し、 そして、（ｉ）複合体の解離または（ｉｉ）複合体の形成をそれぞれ示す出力信
号の変化が起こる条件を記録することかなる。
を交二本鎖とするために一本鎖（ａ）と交雑することができるオリゴヌクレオチ
ド又はＤＮＡ類似体のプローブと、 （ｃ）前記の成分（ａ）プラス（ｂ）の二本鎖構造に対して特異的であり、そ
の二本鎖と共に複合体を形成し、且つ、二本鎖内での相互作用に際して独特に反
応するマーカー とを、 （ｉ）成分（ａ）が成分（ｂ）と交雑し、成分（ｃ）と共に複合体が形成され
る条件、または、 （ｉｉ）成分（ａ）と成分（ｂ）とが交雑せず、成分（ｃ）との複合体も形成
されない条件 の下で結合させ、しかる後、 （ｉ）形成された二本鎖が変性されて複合体が解離するか、あるいは、 （ｉｉ）二本鎖が形成されて複合体が形成される ように環境条件を徐々に且つ定常的に調節し、 さらに成分（ａ）と成分（ｂ）のハイブリダイゼーションの程度および成分（ｃ
）との複合体形成の程度を示す出力信号を継続的に測定し、 そして、（ｉ）複合体の解離または（ｉｉ）複合体の形成をそれぞれ示す出力信
号の変化が起こる条件を記録することかなる。
【０００８】 ＤＮＡの二本鎖は多くの手法で変性可能である。採用される最も一般的な方法
は、ｐＨを上げるか、温度を上昇させることである。従って、定常的に制御され
た温度上昇が、変性“圧力”を二本鎖に付与するのに使用され、適合した二本鎖
および不適合の二本鎖が変性するポイントが調べられる。別法として、定常的に
制御されたｐＨ上昇を用いることもできる。さらに、本発明の原理は、ＤＮＡの
“マイクロチップ”フォーマット（平面上にサブｍｍスケールのアッセイ領域を
有し、電気チップへの取付け用ポテンシャル付き）の使用を許す。この場合、Ｄ
ＮＡの鎖（負の電荷も）を表面から押し出すのに、増大する負の電荷（電荷反発
）が利用できる可能性を開く。二本鎖の一方が面結合（surface bound）である
場合、このことはｐＨおよび温度に関してＤＮＡを変性させる傾向にある。
は、ｐＨを上げるか、温度を上昇させることである。従って、定常的に制御され
た温度上昇が、変性“圧力”を二本鎖に付与するのに使用され、適合した二本鎖
および不適合の二本鎖が変性するポイントが調べられる。別法として、定常的に
制御されたｐＨ上昇を用いることもできる。さらに、本発明の原理は、ＤＮＡの
“マイクロチップ”フォーマット（平面上にサブｍｍスケールのアッセイ領域を
有し、電気チップへの取付け用ポテンシャル付き）の使用を許す。この場合、Ｄ
ＮＡの鎖（負の電荷も）を表面から押し出すのに、増大する負の電荷（電荷反発
）が利用できる可能性を開く。二本鎖の一方が面結合（surface bound）である
場合、このことはｐＨおよび温度に関してＤＮＡを変性させる傾向にある。
【０００９】 どちらかの信号検出方法を選択するために、プローブと標的ＤＮＡの二本鎖の
変性（またはハイブリダイゼーション）を検出するための根拠として、二本鎖Ｄ
ＮＡおよび一本鎖ＤＮＡに対して異なった信号を与える任意のシステムを利用す
ることができる。二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡとの最もよく知られている物理化
学的相違は、これらの分子種によって生じる紫外線吸収スペクトルである。この
パラメータを利用するために装置が考案できる。
変性（またはハイブリダイゼーション）を検出するための根拠として、二本鎖Ｄ
ＮＡおよび一本鎖ＤＮＡに対して異なった信号を与える任意のシステムを利用す
ることができる。二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡとの最もよく知られている物理化
学的相違は、これらの分子種によって生じる紫外線吸収スペクトルである。この
パラメータを利用するために装置が考案できる。
【００１０】 上述した方法で用いられる好ましいマーカーは、蛍光性に基づくものである。
蛍光マーカーを使用する場合、本発明のＤＮＡ変異検出方法は、 （ａ）変異の遺伝子座を含むＤＮＡ塩基配列の一本鎖 （ｂ）変異の１つの対立遺伝子に対して特異的であり、上記一本鎖（ａ）と交
雑して二本鎖を形成するオリゴヌクレオチドのプローブ （ｃ）上記の一本鎖（ａ）とプローブ（ｂ）と形成される二本鎖に対して特異
的であり、二本鎖ＤＮＡに結びつくか、二本鎖ＤＮＡ内での相互作用した際に蛍
光を発するマーカー から成る複合体を形成させ、 複合体を含有する環境の温度を定常的に上昇させながら、発生する蛍光を連続的
に測定し、複合体の解離によって生起し、従って、プローブ（ｂ）が一本鎖（ａ
）に交雑した強さと相関関係を持つところの、蛍光の減少が起きた温度（以下、
融解温度と称す）を記録することからなる。
蛍光マーカーを使用する場合、本発明のＤＮＡ変異検出方法は、 （ａ）変異の遺伝子座を含むＤＮＡ塩基配列の一本鎖 （ｂ）変異の１つの対立遺伝子に対して特異的であり、上記一本鎖（ａ）と交
雑して二本鎖を形成するオリゴヌクレオチドのプローブ （ｃ）上記の一本鎖（ａ）とプローブ（ｂ）と形成される二本鎖に対して特異
的であり、二本鎖ＤＮＡに結びつくか、二本鎖ＤＮＡ内での相互作用した際に蛍
光を発するマーカー から成る複合体を形成させ、 複合体を含有する環境の温度を定常的に上昇させながら、発生する蛍光を連続的
に測定し、複合体の解離によって生起し、従って、プローブ（ｂ）が一本鎖（ａ
）に交雑した強さと相関関係を持つところの、蛍光の減少が起きた温度（以下、
融解温度と称す）を記録することからなる。
【００１１】 この方法を実行する場合、変異の異なる対立遺伝子に対して特異的なプローブ
をそれぞれ有する２つ又はそれ以上の一連の複合体を形成し、変異の対立遺伝子
がそれぞれ区別でき、好適にはホモ接合状態かヘテロ接合状態かが識別できるよ
うに、それぞれの複合体の転移点を観察するのが通例である。蛍光発光を利用す
る場合、出力信号曲線（蛍光測定）の負又正の第１又は第２微分係数（微分）を
参照して、融解温度は通常決定される。
をそれぞれ有する２つ又はそれ以上の一連の複合体を形成し、変異の対立遺伝子
がそれぞれ区別でき、好適にはホモ接合状態かヘテロ接合状態かが識別できるよ
うに、それぞれの複合体の転移点を観察するのが通例である。蛍光発光を利用す
る場合、出力信号曲線（蛍光測定）の負又正の第１又は第２微分係数（微分）を
参照して、融解温度は通常決定される。
【００１２】 本発明の方法は、支持材に取り付けられた一本鎖ＤＮＡにて実施されるのが有
利であって、さらに好ましくは、ビオチン／ストレプタビジン型（biotin/strep
tavidin type）相互作用にて実施される。一本鎖は、標的塩基配列をＰＣＲ増幅
した二本鎖ＤＮＡ生成物から導かれる。培養ウイルス性ゲノム、精製したクロー
ンＤＮＡなどのような複雑性の低い配列は、トレプタビジンなどで末端標識する
ことができ、特別な増幅なしで利用できる。長さで１００塩基対以上の、好まし
くは４０〜１００塩基対のＰＣＲ産物を検出の対象とすることが望ましい。複合
体は適当な緩衝液中において、一本鎖にプローブとマーカーを添加することで形
成することができる。
利であって、さらに好ましくは、ビオチン／ストレプタビジン型（biotin/strep
tavidin type）相互作用にて実施される。一本鎖は、標的塩基配列をＰＣＲ増幅
した二本鎖ＤＮＡ生成物から導かれる。培養ウイルス性ゲノム、精製したクロー
ンＤＮＡなどのような複雑性の低い配列は、トレプタビジンなどで末端標識する
ことができ、特別な増幅なしで利用できる。長さで１００塩基対以上の、好まし
くは４０〜１００塩基対のＰＣＲ産物を検出の対象とすることが望ましい。複合
体は適当な緩衝液中において、一本鎖にプローブとマーカーを添加することで形
成することができる。
【００１３】 上述したように、表面に拘束された標的ＤＮＡにてアッセイが実行される。し
かし、本発明は如何なる一形式に限定されるものではない。標的（ターゲット）
とプローブの両方が遊離液中にあっても差し支えない。また、上記の両者をある
割り当て領域に局在させることもできる。本発明の方法は、２つの種の間に二本
鎖を形成することを含むので、両方が局在しない場合、あるいは、いずれか一方
が局在する場合には、分子を結合させる拡散に頼るしかない。しかし、種を相互
に極めて近接して局在させた場合（たとえば、両者を表面に、または、両方を末
端部に接合させる）には、二本鎖の形成効率を向上させることができる。このこ
とはアッセイの基礎に変性を使用せずに、ハイブリダイゼーションを使用する場
合に特に重要である。また、これは変性に基づくフォーマットについて、初期の
ハイブリダイゼーション速度を高める。我々は、これを直接的に連鎖した標的配
列とプローブ配列ついて、すなわち、一方が他方の末端に連結した連鎖について
、両者間の無関係なＤＮＡの“スタッファー”配列と共に、適用して“ヒンジ”
を構成させた。
かし、本発明は如何なる一形式に限定されるものではない。標的（ターゲット）
とプローブの両方が遊離液中にあっても差し支えない。また、上記の両者をある
割り当て領域に局在させることもできる。本発明の方法は、２つの種の間に二本
鎖を形成することを含むので、両方が局在しない場合、あるいは、いずれか一方
が局在する場合には、分子を結合させる拡散に頼るしかない。しかし、種を相互
に極めて近接して局在させた場合（たとえば、両者を表面に、または、両方を末
端部に接合させる）には、二本鎖の形成効率を向上させることができる。このこ
とはアッセイの基礎に変性を使用せずに、ハイブリダイゼーションを使用する場
合に特に重要である。また、これは変性に基づくフォーマットについて、初期の
ハイブリダイゼーション速度を高める。我々は、これを直接的に連鎖した標的配
列とプローブ配列ついて、すなわち、一方が他方の末端に連結した連鎖について
、両者間の無関係なＤＮＡの“スタッファー”配列と共に、適用して“ヒンジ”
を構成させた。
【００１４】 本発明の方法は、単一のオリゴヌクレオチドプローブの使用に限定されるもの
ではない。標的ＤＮＡ配列に沿って順次アニール化される付加的なプローブを使
用することができる。これらの付加的なプローブは、直接連続して、換言すれば
、隙間なく配置される場合もあるし、そうでない場合もある。連続して配置され
たプローブは、十分確立された現象である“塩基積み上げ（base stacking）”
の化学作用で、相互に安定化する。また、隣接するプローブ間に直接物理結合を
構成することもできる。これらの余剰プローブから生じた余剰の二本鎖ＤＮＡは
、アッセイの信号レベルを高める。
ではない。標的ＤＮＡ配列に沿って順次アニール化される付加的なプローブを使
用することができる。これらの付加的なプローブは、直接連続して、換言すれば
、隙間なく配置される場合もあるし、そうでない場合もある。連続して配置され
たプローブは、十分確立された現象である“塩基積み上げ（base stacking）”
の化学作用で、相互に安定化する。また、隣接するプローブ間に直接物理結合を
構成することもできる。これらの余剰プローブから生じた余剰の二本鎖ＤＮＡは
、アッセイの信号レベルを高める。
【００１５】１. 方法の原理 動的対立遺伝子特殊ハイブリダイゼーション（Dynamic Allele Specific Hybr
idization: DASH）と名付けられるた本発明の方法は、ＤＮＡ塩基配列における
単一ヌクレオチドの相違を検出して評価する技術である。このアッセイでは、二
本鎖ＤＮＡ（例えば、ＰＣＲ生成物）の一方の鎖が、固体表面に拘束され、他方
の鎖は除去される。変異の１つのバージョン（対立遺伝子）に対して特異的なオ
リゴヌクレオチドプローブが、拘束された一本鎖に交雑せしめられる。次に、二
本鎖ＤＮＡ（すなわち、ＤＮＡサンプルに交雑せしめられたオリゴヌクレオチド
プローブ）の存在下で特に蛍光を発する挿入染色（intercalating dye）を添加
する。反応物をある温度範囲内において一定速度で加熱し、蛍光を連続的に測定
する。温度が上昇するにつれ、オリゴヌクレオチドプローブが標的ＤＮＡから解
離する温度に達するまで、蛍光は徐々に減少する。この温度は融解温度、すなわ
ち、Ｔｍとして知られている。この温度において、蛍光発行が急激に減少する。
idization: DASH）と名付けられるた本発明の方法は、ＤＮＡ塩基配列における
単一ヌクレオチドの相違を検出して評価する技術である。このアッセイでは、二
本鎖ＤＮＡ（例えば、ＰＣＲ生成物）の一方の鎖が、固体表面に拘束され、他方
の鎖は除去される。変異の１つのバージョン（対立遺伝子）に対して特異的なオ
リゴヌクレオチドプローブが、拘束された一本鎖に交雑せしめられる。次に、二
本鎖ＤＮＡ（すなわち、ＤＮＡサンプルに交雑せしめられたオリゴヌクレオチド
プローブ）の存在下で特に蛍光を発する挿入染色（intercalating dye）を添加
する。反応物をある温度範囲内において一定速度で加熱し、蛍光を連続的に測定
する。温度が上昇するにつれ、オリゴヌクレオチドプローブが標的ＤＮＡから解
離する温度に達するまで、蛍光は徐々に減少する。この温度は融解温度、すなわ
ち、Ｔｍとして知られている。この温度において、蛍光発行が急激に減少する。
【００１６】 ＤＮＡ変異は、２つ又はそれ以上の対立遺伝子を有する。所与のＤＮＡサンプ
ルにどの対立遺伝子が存在するかを決定するために、変異の各バージョン用に対
して特異的なプローブが、ＤＮＡサンプルに対して検定（アッセイ）される。２
つのプロービングから得られた蛍光データの第１微分係数を比較することにより
、ＤＮＡサンプル中に、一方の又は両方の対立遺伝子が存在するかどうかを決定
することができる。
ルにどの対立遺伝子が存在するかを決定するために、変異の各バージョン用に対
して特異的なプローブが、ＤＮＡサンプルに対して検定（アッセイ）される。２
つのプロービングから得られた蛍光データの第１微分係数を比較することにより
、ＤＮＡサンプル中に、一方の又は両方の対立遺伝子が存在するかどうかを決定
することができる。
【００１７】２. 方法論 概要として、本方法は以下の工程からなる： １． テストＤＮＡ塩基配列のＰＣＲ増幅 ２． ＰＣＲ生成物の一本鎖の面への結合 ３． 未結合（unbound）ＤＮＡおよびＰＣＲ成分の溶出 ４． ｐＨの中和 ５． 対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成 ６． 過剰な対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの除去 ７． 加熱状態での蛍光の検出 (７ａ. 別の対立遺伝子プローブについての工程４〜７の反復) ８． 蛍光出力の分析
【００１８】２.１. ＰＣＲ増幅 ゲノムＤＮＡを試験するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて既
知の変異を含むＤＮＡセグメントを増幅させる。理想的な条件には、１８〜３０
ヌクレオチドの長いプライマーで短いＰＣＲセグメント（４０〜１００ｂｐ）を
増幅させることが含まれる。１個のプライマーは、後の工程で固体表面に拘束で
きるように、５’末端でビオチニル化（biotinylated）されている。タックゴー
ルド（Taq Gold）またはその他の“ホットスタート”型のＰＣＲ条件は、可能な
かぎりプライマー２量体のアーチファクトを制限するために使用される。有効な
ＰＣＲ緩衝条件は次のとおりであって、特定なＤＮＡ断片に適したサイクル時間
およびサイクル個数で採用される。 プライマー１（非ビオチニル化） １００ｎｇ プライマー２（ビオチニル化） ５０ｎｇ ＤＭＳＯ ５％ ヌクレオチド ｄＮＴＰにつき５．０ナノモル ＰＣＲ緩衝 ｌｘまで 酵素（タックゴールドなど） ０．７５ユニット 総水量 ２５μｌ
知の変異を含むＤＮＡセグメントを増幅させる。理想的な条件には、１８〜３０
ヌクレオチドの長いプライマーで短いＰＣＲセグメント（４０〜１００ｂｐ）を
増幅させることが含まれる。１個のプライマーは、後の工程で固体表面に拘束で
きるように、５’末端でビオチニル化（biotinylated）されている。タックゴー
ルド（Taq Gold）またはその他の“ホットスタート”型のＰＣＲ条件は、可能な
かぎりプライマー２量体のアーチファクトを制限するために使用される。有効な
ＰＣＲ緩衝条件は次のとおりであって、特定なＤＮＡ断片に適したサイクル時間
およびサイクル個数で採用される。 プライマー１（非ビオチニル化） １００ｎｇ プライマー２（ビオチニル化） ５０ｎｇ ＤＭＳＯ ５％ ヌクレオチド ｄＮＴＰにつき５．０ナノモル ＰＣＲ緩衝 ｌｘまで 酵素（タックゴールドなど） ０．７５ユニット 総水量 ２５μｌ
【００１９】 （固体表面上の結合サイトを競う）組み込まれていないビオチニル化プライマ
ーの量を制限するためには、２０ｎｇのビオチニル化プライマーで十分であると
定めた。１００ｎｇの非ビオチニル化プライマーにつき２０ｎｇのビオチニル化
プライマーの割合で、ＰＣＲ生成物の形成はなお有効であり、ビオチニル化プラ
イマーの濃度が低下すると、固体表面に結合する時のストレプタビジンサイトに
対する競合が減少する。
ーの量を制限するためには、２０ｎｇのビオチニル化プライマーで十分であると
定めた。１００ｎｇの非ビオチニル化プライマーにつき２０ｎｇのビオチニル化
プライマーの割合で、ＰＣＲ生成物の形成はなお有効であり、ビオチニル化プラ
イマーの濃度が低下すると、固体表面に結合する時のストレプタビジンサイトに
対する競合が減少する。
【００２０】 より長さの長いＰＣＲ生成物（１００塩基対以上）でも構わないが、斟酌すべ
き事柄がある。長いＰＣＲ生成物の場合、末端で運動が低下するので、変異はビ
オチニル化プライマーの方に位置させるべきである。二次構造はプローブの結合
を効果的に阻害するので、これは避けるべきである。さらに、長いＰＣＲ生成物
のプレート（plate）への結合効率が減じるが、これはおそらく分子拡散の運動
速度が遅いことだけでなく、二次構造の複雑性と関係しているものと推測される
。
き事柄がある。長いＰＣＲ生成物の場合、末端で運動が低下するので、変異はビ
オチニル化プライマーの方に位置させるべきである。二次構造はプローブの結合
を効果的に阻害するので、これは避けるべきである。さらに、長いＰＣＲ生成物
のプレート（plate）への結合効率が減じるが、これはおそらく分子拡散の運動
速度が遅いことだけでなく、二次構造の複雑性と関係しているものと推測される
。
【００２１】 長さの短いＰＣＲ生成物（４０〜１００塩基対）が、いくつかの理由から好ま
しい。プライマー２量体のアーチフェクトは、短いＰＣＲ生成物で少なくなる。
加えて、短い生成物を増幅した場合に、ＰＣＲの全体効率がしばしば優れたもの
になる。固体表面への結合能力が十分に増加した場合、ＤＡＳＨ検定（アッセイ
）への複合ＰＣＲの利用が検討できる。短いＰＣＲは、複合ＰＣＲの効率だけで
なく、表面への結合にも寄与する。
しい。プライマー２量体のアーチフェクトは、短いＰＣＲ生成物で少なくなる。
加えて、短い生成物を増幅した場合に、ＰＣＲの全体効率がしばしば優れたもの
になる。固体表面への結合能力が十分に増加した場合、ＤＡＳＨ検定（アッセイ
）への複合ＰＣＲの利用が検討できる。短いＰＣＲは、複合ＰＣＲの効率だけで
なく、表面への結合にも寄与する。
【００２２】２.２. ＰＣＲ生成物の一本鎖の固体表面への結合 ここで使用した結合面フォーマットは、ストレプタビジン(さまざまな製造業
者から入手可能)でコートされた９６ウェルマイクロタイタプレート（96 well m
icrotitre plate）である。室温において、１個のＰＣＲからの全量（２５μｌ
）を、２５μｌの緩衝液Ｉ（緩衝液に関する２.２.１〜２.２.３の項参照）と共
に、ストレプタビジン被膜したプレートのウェル(くぼみ)内に収める。ＰＣＲ生
成物は、プレートに塗布したストレプタビジンに結合するＰＣＲ生成物上のビオ
チン標識を介してプレートに物理的に結合する。これを任意の場所で５分〜２４
時間放置して結合を進行させる。結合は、１時間以内に９０％完了するので、通
常、３０分〜２時間で最大効率に達する。典型的には、最大効率においてＰＣＲ
生成物の２０％未満がプレートと結合する。結合溶液を取り除いて第２のウェル
に移すことにより、第２のウェルを満たすことができる。
者から入手可能)でコートされた９６ウェルマイクロタイタプレート（96 well m
icrotitre plate）である。室温において、１個のＰＣＲからの全量（２５μｌ
）を、２５μｌの緩衝液Ｉ（緩衝液に関する２.２.１〜２.２.３の項参照）と共
に、ストレプタビジン被膜したプレートのウェル(くぼみ)内に収める。ＰＣＲ生
成物は、プレートに塗布したストレプタビジンに結合するＰＣＲ生成物上のビオ
チン標識を介してプレートに物理的に結合する。これを任意の場所で５分〜２４
時間放置して結合を進行させる。結合は、１時間以内に９０％完了するので、通
常、３０分〜２時間で最大効率に達する。典型的には、最大効率においてＰＣＲ
生成物の２０％未満がプレートと結合する。結合溶液を取り除いて第２のウェル
に移すことにより、第２のウェルを満たすことができる。
【００２３】 この工程においても、またこれに続く工程においても大切なことは、反応チュ
ーブ（マイクロタイタプレートのウェル）内に気泡が存在しないことである。気
泡はマイクロタイタプレート表面と溶液間の反応を阻害するので、各インキュベ
ーションの前に除去すべきである。気泡の除去は、ピペットチップまたはウェル
を指で軽くたたいて行うことができる。さらに、工程と工程の間で、反応チュー
ブからなるべく溶液を除去することも必要である。次の工程に入る前に、ウェル
の底に溶液が視認できなくなることで、反応チューブは“空”の状態になったと
認められる。
ーブ（マイクロタイタプレートのウェル）内に気泡が存在しないことである。気
泡はマイクロタイタプレート表面と溶液間の反応を阻害するので、各インキュベ
ーションの前に除去すべきである。気泡の除去は、ピペットチップまたはウェル
を指で軽くたたいて行うことができる。さらに、工程と工程の間で、反応チュー
ブからなるべく溶液を除去することも必要である。次の工程に入る前に、ウェル
の底に溶液が視認できなくなることで、反応チューブは“空”の状態になったと
認められる。
【００２４】２.２.１ ヘペス緩衝液（緩衝液Ｉ） 緩衝液Ｉは、ヘペス １００ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、ＥＤＴＡ １０ｍＭか
らなり、ｐＨは７である。この緩衝液を選択したことには重大な理由がある。当
該緩衝液は、Ｇ＋Ｃの含有量に関係なく、オリゴヌクレオチドの長さに基づいて
Ｔｍｓ（融解温度）を劇的に標定化させ、標準化させるからである。例えば、図
７.１.４.に示すデータを参照されたい。多くのその他の緩衝液も、対立遺伝子
の十分な識別を可能にしているが、観察された絶対的Ｔｍは、Ｇ＋Ｃの含有量に
応じて大きく変化する。
らなり、ｐＨは７である。この緩衝液を選択したことには重大な理由がある。当
該緩衝液は、Ｇ＋Ｃの含有量に関係なく、オリゴヌクレオチドの長さに基づいて
Ｔｍｓ（融解温度）を劇的に標定化させ、標準化させるからである。例えば、図
７.１.４.に示すデータを参照されたい。多くのその他の緩衝液も、対立遺伝子
の十分な識別を可能にしているが、観察された絶対的Ｔｍは、Ｇ＋Ｃの含有量に
応じて大きく変化する。
【００２５】２.２.２. その他の緩衝液およびｐＨ ＳＳＰＥ、ＳＳＣ、ＴＥＮ、ＴＥＳ、ＭＥＳおよびリン酸緩衝液が試され、全
ての実験の完全性を維持した。緩衝液を変えると、オリゴヌクレオチド／標的Ｄ
ＮＡの二本鎖で観察されるＴｍｓが変化した。ＤＮＡ標的に適合したオリゴプロ
ーブのＴｍと、標的に交雑して不適合のオリゴ体のＴｍとの関係は、８〜１０℃
で一定してほとんど変化がなかった。上記の緩衝液のｐＨは６.０〜９.８の範囲
に維持した。この範囲のｐＨによる顕著な影響は見られなかった。ｐＨが６.０
以下では、分析されたＤＮＡは退化の傾向にあり、ｐＨが１０およびそれ以上で
は、Ｔｍが室温近くまで低下し、効率的な蛍光測定が妨げられた。
ての実験の完全性を維持した。緩衝液を変えると、オリゴヌクレオチド／標的Ｄ
ＮＡの二本鎖で観察されるＴｍｓが変化した。ＤＮＡ標的に適合したオリゴプロ
ーブのＴｍと、標的に交雑して不適合のオリゴ体のＴｍとの関係は、８〜１０℃
で一定してほとんど変化がなかった。上記の緩衝液のｐＨは６.０〜９.８の範囲
に維持した。この範囲のｐＨによる顕著な影響は見られなかった。ｐＨが６.０
以下では、分析されたＤＮＡは退化の傾向にあり、ｐＨが１０およびそれ以上で
は、Ｔｍが室温近くまで低下し、効率的な蛍光測定が妨げられた。
【００２６】 ２.２.３. 緩衝液／塩化ナトリウム濃度 上記の緩衝液に関し、緩衝液とＮａＣｌの濃度（１ｍＭ〜４００ｍＭ）の範囲
を試験した。塩化ナトリウムの濃度が低いと、緩衝液の濃度が増加するにつれ、
観察されたＴｍは低下した。例えば、ＮａＣｌが０.０Ｍで、濃度が１、１０、
４０、１００ｍＭのヘペス緩衝液では、Ｔｍ値が１回の実験中それぞれ８８℃、
８４℃、７８℃、７２℃と低下した。
を試験した。塩化ナトリウムの濃度が低いと、緩衝液の濃度が増加するにつれ、
観察されたＴｍは低下した。例えば、ＮａＣｌが０.０Ｍで、濃度が１、１０、
４０、１００ｍＭのヘペス緩衝液では、Ｔｍ値が１回の実験中それぞれ８８℃、
８４℃、７８℃、７２℃と低下した。
【００２７】 ＮａＣｌ濃度が１０ｍＭを超えると、緩衝液の濃度よりも、塩化ナトリウムの
濃度が、Ｔｍ値に影響を及ぼす主な要因となる。緩衝液の濃度同様、ＮａＣｌ濃
度が上昇すると、Ｔｍ値が低下する傾向がある。ＮａＣｌ濃度を１ｍＭ〜８００
ｍＭの範囲で試験した。濃度が２００ｍＭを超えると、データの評価が困難にな
る（曲線がランダムな変動を示す）。
濃度が、Ｔｍ値に影響を及ぼす主な要因となる。緩衝液の濃度同様、ＮａＣｌ濃
度が上昇すると、Ｔｍ値が低下する傾向がある。ＮａＣｌ濃度を１ｍＭ〜８００
ｍＭの範囲で試験した。濃度が２００ｍＭを超えると、データの評価が困難にな
る（曲線がランダムな変動を示す）。
【００２８】２.２.４. プラスチック製品 採用したマイクロタイタプレートおよびチューブは、蛍光発光しないプラスチ
ック製であることが必要で、これにより検定から付加的なバックグラウンドを排
除することができる。マイクロタイタプレートおよびチューブは、チューブの外
から検出されるいかなる蛍光も排除するために、艶消し加工（frosted）される
。従って、プレートもカップも実質的に実験のバックグラウンド対象ではない。
殆どすべてのバックグラウンド蛍光は、物理的装置（励起／検出装置）によって
斟酌される。
ック製であることが必要で、これにより検定から付加的なバックグラウンドを排
除することができる。マイクロタイタプレートおよびチューブは、チューブの外
から検出されるいかなる蛍光も排除するために、艶消し加工（frosted）される
。従って、プレートもカップも実質的に実験のバックグラウンド対象ではない。
殆どすべてのバックグラウンド蛍光は、物理的装置（励起／検出装置）によって
斟酌される。
【００２９】２.３. ＰＣＲ生成物の第２の鎖の溶出 ひとたびＰＣＲ生成物がプレートに結合すると、非結合ＰＣＲ試薬は吸引除去
され、５０μｌのＮａＯＨ溶液が添加される。こうしてＰＣＲ生成物を変性させ
、ビオチン／ストレプタビジンの相互作用によりプレートに結合された一本鎖Ｄ
ＮＡが残る。二本鎖ＰＣＲ生成物を確かに変性させるのに必要なＮａＯＨの最小
濃度は、０．０５Ｍであるが、０．１Ｍは濃度の不正確さに対するゆとりであっ
て、爾後の反応を邪魔することはない。０．１ＭのＮａＯＨ中でＰＣＲ生成物を
完全変性するには、０．５〜５．０分を要した。これ以上の長時間は有害ではな
いが、不必要である。残余の全てのＰＣＲ成分（組み込まれていないプライマー
、ヌクレオチド、酵素など）を、非ビオチニル生成物の鎖と共に除去するために
、溶出液を吸引した。
され、５０μｌのＮａＯＨ溶液が添加される。こうしてＰＣＲ生成物を変性させ
、ビオチン／ストレプタビジンの相互作用によりプレートに結合された一本鎖Ｄ
ＮＡが残る。二本鎖ＰＣＲ生成物を確かに変性させるのに必要なＮａＯＨの最小
濃度は、０．０５Ｍであるが、０．１Ｍは濃度の不正確さに対するゆとりであっ
て、爾後の反応を邪魔することはない。０．１ＭのＮａＯＨ中でＰＣＲ生成物を
完全変性するには、０．５〜５．０分を要した。これ以上の長時間は有害ではな
いが、不必要である。残余の全てのＰＣＲ成分（組み込まれていないプライマー
、ヌクレオチド、酵素など）を、非ビオチニル生成物の鎖と共に除去するために
、溶出液を吸引した。
【００３０】２.４. ｐＨの中和 二本鎖ＤＮＡに特異な蛍光色素を含む緩衝液Ｉの溶液を調製する。ここでは“
ＳＹＢＲ グリーンＩ”色素を用いる。ＤＡＳＨアッセイにおける当該色素の最
適濃度は、１：１０，０００である。色素濃度の微細な変動は結果に影響しない
。しかし、ＳＹＢＲグリーンＩ色素の特性に関し、注意すべきことがある（２.
７.２.、３.１.、３.２.参照）。５０μｌの緩衝液Ｉ／色素溶液を反応チューブ
に添加する。この緩衝液は、残存ＮａＯＨを中和すると共に、次の工程でのハイ
ブリッド形成の緩衝に寄与する。供試ＤＮＡ分子での二次構造の形成を最小限に
するために、次工程に進むまでの時間遅延は最小にすべきである。
ＳＹＢＲ グリーンＩ”色素を用いる。ＤＡＳＨアッセイにおける当該色素の最
適濃度は、１：１０，０００である。色素濃度の微細な変動は結果に影響しない
。しかし、ＳＹＢＲグリーンＩ色素の特性に関し、注意すべきことがある（２.
７.２.、３.１.、３.２.参照）。５０μｌの緩衝液Ｉ／色素溶液を反応チューブ
に添加する。この緩衝液は、残存ＮａＯＨを中和すると共に、次の工程でのハイ
ブリッド形成の緩衝に寄与する。供試ＤＮＡ分子での二次構造の形成を最小限に
するために、次工程に進むまでの時間遅延は最小にすべきである。
【００３１】２.５. 対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブのハイブリッド形成 ＳＹＢＲグリーンＩ色素は、オリゴヌクレオチドプローブと供試ＤＮＡとの相
互作用を安定させるので、最終工程のハイブリッド形成溶液に含有させる。３０
ｐｍｏｌｓ（１μｌ容積中）のオリゴヌクレオチドプローブが、反応チューブに
添加される。、プローブは、中和緩衝液としても加えることができる。当該量の
プローブによりハイブリッド形成が数秒以内に完了し、従って、この工程では実
際上インキュベーション時間を必要としない。加熱工程および冷却工程を実施（
５０℃より高温に加熱し、１５分以上をかけて室温まで徐々に冷却する）し、非
結合のプローブをウェルから洗い流し、５０μｌの緩衝液Ｉ／色素の溶液を再充
填することにより、最適結果が得られる。プローブの量を少なくすると、インキ
ュベーション期間を長くする必要があるが、高濃度にしてもアニーリングに要す
る時間は短くはならない。プローブの詳細については、２.５.１.を参照された
い。
互作用を安定させるので、最終工程のハイブリッド形成溶液に含有させる。３０
ｐｍｏｌｓ（１μｌ容積中）のオリゴヌクレオチドプローブが、反応チューブに
添加される。、プローブは、中和緩衝液としても加えることができる。当該量の
プローブによりハイブリッド形成が数秒以内に完了し、従って、この工程では実
際上インキュベーション時間を必要としない。加熱工程および冷却工程を実施（
５０℃より高温に加熱し、１５分以上をかけて室温まで徐々に冷却する）し、非
結合のプローブをウェルから洗い流し、５０μｌの緩衝液Ｉ／色素の溶液を再充
填することにより、最適結果が得られる。プローブの量を少なくすると、インキ
ュベーション期間を長くする必要があるが、高濃度にしてもアニーリングに要す
る時間は短くはならない。プローブの詳細については、２.５.１.を参照された
い。
【００３２】２.５.１. プローブの設計と利用 ３つの異なる変異座について、１３〜２５塩基対長さのプローブを試験した。
これらの全ての長さで対立遺伝子の識別が可能であるが、最適なプローブ長さは
、１５塩基対である。１３ｍｅｒのプローブは室温付近の温度で変性したが、本
技術では理想的でないと判断した。２５ｍｅｒのプローブは高輝度の蛍光（蛍光
性は二本鎖ＤＮＡ長さの関数）を発したが、対立遺伝子の識別は最小であった。
１５ｍｅｒのプローブは十分な蛍光輝度を有し、対立遺伝子の間で高い識別性を
示した。
これらの全ての長さで対立遺伝子の識別が可能であるが、最適なプローブ長さは
、１５塩基対である。１３ｍｅｒのプローブは室温付近の温度で変性したが、本
技術では理想的でないと判断した。２５ｍｅｒのプローブは高輝度の蛍光（蛍光
性は二本鎖ＤＮＡ長さの関数）を発したが、対立遺伝子の識別は最小であった。
１５ｍｅｒのプローブは十分な蛍光輝度を有し、対立遺伝子の間で高い識別性を
示した。
【００３３】 ハイブリッド形成したプローブにおける変異の位置も調査された。１５ｍｅｒ
のプローブでは、変異位置がプローブの中心から３番目（in the central third
）に位置した時に最良の識別が得られることが分かった。単一の塩基変異におい
ては、変異位置は中央にあるのが最良である。変異位置が中心から２塩基分移動
すると、検定の識別性が低下する。
のプローブでは、変異位置がプローブの中心から３番目（in the central third
）に位置した時に最良の識別が得られることが分かった。単一の塩基変異におい
ては、変異位置は中央にあるのが最良である。変異位置が中心から２塩基分移動
すると、検定の識別性が低下する。
【００３４】 固体サポート上でプローブをＤＮＡ標的に素早くハイブリッド形成させるため
には、３０ｐｍｏｌｓが有効であるが判明した。この場合、蛍光の検出前にプロ
ーブを削除することが必要である。ハイブリッド形成にごく少量のプローブ（１
〜５ｐｍｏｌ）を使用し、余剰プローブを除去せずにその後の工程を実施する別
法も試験した。対立遺伝子の識別は可能であったが、蛍光値が低く、結果も大き
くばらついた。プレートへの結合能力がより高い場合、検定に要する工程数を減
らす上でこの方向は有効かもしれない。
には、３０ｐｍｏｌｓが有効であるが判明した。この場合、蛍光の検出前にプロ
ーブを削除することが必要である。ハイブリッド形成にごく少量のプローブ（１
〜５ｐｍｏｌ）を使用し、余剰プローブを除去せずにその後の工程を実施する別
法も試験した。対立遺伝子の識別は可能であったが、蛍光値が低く、結果も大き
くばらついた。プレートへの結合能力がより高い場合、検定に要する工程数を減
らす上でこの方向は有効かもしれない。
【００３５】２.６. 余剰プローブの削除 ハイブリッド形成していないプローブ分子を除去するために、バイブリッド形
成溶液は吸引され、５０μｌの緩衝液Ｉ／色素が加えられる。そして、実験は加
熱および蛍光検出段階へと進む。
成溶液は吸引され、５０μｌの緩衝液Ｉ／色素が加えられる。そして、実験は加
熱および蛍光検出段階へと進む。
【００３６】２.７. 蛍光検出および加熱方式 マイクロタイタプレートを加熱／検出装置内に設置する。融解温度プロフィー
ルを作成するのに必要とされるような、温度変調と蛍光検出を同時に行える装置
は、幾つか存在する。これらの装置には、対立遺伝子の自動評価を行うために特
に作成されたハイベイド（Hybaid）からの“ＤＡＳＨマシン”と、本明細書に掲
載したデータの作成に使用されたパーキンエルマー７７００（タックマン：Taqm
an）装置が含まれる。蛍光を継続的に監視しながら、サンプルプレートを〜２５
℃から〜９０℃に加熱する。大部分のサンプルは６５℃±１０℃で変性する。加
熱速度（昇温速度）が少なくとも０．０１〜１．０℃／１秒の範囲で変化しても
、対立遺伝子の識別を殆ど損なわない。通常、０．１℃／１秒で検定を行った。
タックマン装置のハードウエアに関する詳細は、２.７.１.を参照されたい。
ルを作成するのに必要とされるような、温度変調と蛍光検出を同時に行える装置
は、幾つか存在する。これらの装置には、対立遺伝子の自動評価を行うために特
に作成されたハイベイド（Hybaid）からの“ＤＡＳＨマシン”と、本明細書に掲
載したデータの作成に使用されたパーキンエルマー７７００（タックマン：Taqm
an）装置が含まれる。蛍光を継続的に監視しながら、サンプルプレートを〜２５
℃から〜９０℃に加熱する。大部分のサンプルは６５℃±１０℃で変性する。加
熱速度（昇温速度）が少なくとも０．０１〜１．０℃／１秒の範囲で変化しても
、対立遺伝子の識別を殆ど損なわない。通常、０．１℃／１秒で検定を行った。
タックマン装置のハードウエアに関する詳細は、２.７.１.を参照されたい。
【００３７】２.７.１. パーキンエルマー７７００（タックマン）配列検出器 検出装置は、二本鎖ＤＮＡ特異的蛍光色素が発する発光分光を検出し、かつ、
蛍光のデータポイントが導き出された温度トラックを保持しなければならない。
励起光源周波数は、ＤＡＳＨ検定で使用された色素の要求と一致しなければなら
ない。例えば、４８８ｎｍ周波数近くで励起するＳＹＢＲグリーンＩ等の色素で
は、アルゴンレーザまたはハロゲンランプ（４８８ｎｍ周波数が濾波される）は
、色素分子を励起させるのに十分である。タックマン装置には、蛍光分子を励起
させるアルゴンレーザが装備される。フィルターを設けて、アルゴンレーザスペ
クトル中の波長４８８ｎｍ以外の他のずべての波長を除去する。
蛍光のデータポイントが導き出された温度トラックを保持しなければならない。
励起光源周波数は、ＤＡＳＨ検定で使用された色素の要求と一致しなければなら
ない。例えば、４８８ｎｍ周波数近くで励起するＳＹＢＲグリーンＩ等の色素で
は、アルゴンレーザまたはハロゲンランプ（４８８ｎｍ周波数が濾波される）は
、色素分子を励起させるのに十分である。タックマン装置には、蛍光分子を励起
させるアルゴンレーザが装備される。フィルターを設けて、アルゴンレーザスペ
クトル中の波長４８８ｎｍ以外の他のずべての波長を除去する。
【００３８】 タックマン装置のＣＣＤカメラは、５００〜６００ｎｍの周波数範囲を検出す
る。蛍光信号は５ｎｍの“ビン”に記録される。そして“ビン１”が５００〜５
０５ｎｍの蛍光データを収容する。目下の構成では、ＤＡＳＨ検定に利用した光
の周波数範囲はビン９（５４５〜５５０ｎｍ）であるが、このビンだけが有効と
いうわけではない。
る。蛍光信号は５ｎｍの“ビン”に記録される。そして“ビン１”が５００〜５
０５ｎｍの蛍光データを収容する。目下の構成では、ＤＡＳＨ検定に利用した光
の周波数範囲はビン９（５４５〜５５０ｎｍ）であるが、このビンだけが有効と
いうわけではない。
【００３９】２.７.２. 蛍光色素 採用する色素は、二本鎖ＤＮＡの存在下での蛍光が、これを含まない溶液中で
の蛍光に比較して、少なくとも１０倍以上であるという特異性を備えることが求
められる。ここでは、特異的な信号の増大が〜１０００倍である“ＳＹＢＲグリ
ーンＩ”色素が使用されている。
の蛍光に比較して、少なくとも１０倍以上であるという特異性を備えることが求
められる。ここでは、特異的な信号の増大が〜１０００倍である“ＳＹＢＲグリ
ーンＩ”色素が使用されている。
【００４０】 ＳＹＢＲグリーンＩ色素の最適濃度は、サンプル中に存在するＤＮＡの量に直
接依存する。これを“ＳＹＢＲグリーン効果”と名付ける。使用される色素の量
が、所与のＤＮＡ量に対する最適濃度より低い場合又は高い場合は、検定で観察
される全体としての蛍光が減少する。この検定における色素の最適希釈率は１：
１０，０００である。
接依存する。これを“ＳＹＢＲグリーン効果”と名付ける。使用される色素の量
が、所与のＤＮＡ量に対する最適濃度より低い場合又は高い場合は、検定で観察
される全体としての蛍光が減少する。この検定における色素の最適希釈率は１：
１０，０００である。
【００４１】 別の色素についても試験した結果、ビスタグリーン（アマーシャム：Amersham
）は、ＳＹＢＲグリーンＩとほぼ同一の特性を備え、ＤＡＳＨ検定に代替色素と
して利用可能である。アクリジニウムオレンジや臭化エチジウムなどのその他の
色素は、多くの蛍光バックグラウンドを与えるので、ＤＡＳＨ検定には適当でな
い。Ｙｏ−ＰｒｏＩやＴｏ−ＰｒｏＩなどのその他の色素は、タックマン装置で
の光源とフィルターとの組合せに適当なものがないため、検定していない。
）は、ＳＹＢＲグリーンＩとほぼ同一の特性を備え、ＤＡＳＨ検定に代替色素と
して利用可能である。アクリジニウムオレンジや臭化エチジウムなどのその他の
色素は、多くの蛍光バックグラウンドを与えるので、ＤＡＳＨ検定には適当でな
い。Ｙｏ−ＰｒｏＩやＴｏ−ＰｒｏＩなどのその他の色素は、タックマン装置で
の光源とフィルターとの組合せに適当なものがないため、検定していない。
【００４２】２.７.３. 検定溶液添加物 様々な添加物の検定への影響を見極めるため、いろいろな添加剤を検査した。
ホルムアミドのような一般的な不安定剤をスクリーニングしたところ、検定には
無益であると認められた。さらに、テトラメチル塩化アンモニウム（ＴＭＡＣ）
、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびデキストラン硫酸塩のようなハイブリッ
ド形成試薬を検査したところ、これらも検定に不規則性を生じさせることが判明
した。極微量のイオン性界面活性剤でさえ、蛍光信号を完全に破壊する。非イオ
ン性界面活性剤は、反応チューブに気泡を生成させる傾向があることを除いて、
否定的な影響を示さなかった。非イオン性界面活性剤を用いる場合には、ＤＡＳ
Ｈ検定におけるさまざまな工程で、反応チューブに気泡が残らないように細心の
注意を払う必要があった。ジメチルスルホキシドが、唯一の有益な添加剤である
ことが見出され、観察されたＴｍ値を低下させるために、このものは５０％また
はそれ以下の割合で添加することができる。
ホルムアミドのような一般的な不安定剤をスクリーニングしたところ、検定には
無益であると認められた。さらに、テトラメチル塩化アンモニウム（ＴＭＡＣ）
、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびデキストラン硫酸塩のようなハイブリッ
ド形成試薬を検査したところ、これらも検定に不規則性を生じさせることが判明
した。極微量のイオン性界面活性剤でさえ、蛍光信号を完全に破壊する。非イオ
ン性界面活性剤は、反応チューブに気泡を生成させる傾向があることを除いて、
否定的な影響を示さなかった。非イオン性界面活性剤を用いる場合には、ＤＡＳ
Ｈ検定におけるさまざまな工程で、反応チューブに気泡が残らないように細心の
注意を払う必要があった。ジメチルスルホキシドが、唯一の有益な添加剤である
ことが見出され、観察されたＴｍ値を低下させるために、このものは５０％また
はそれ以下の割合で添加することができる。
【００４３】２.８. 蛍光出力の分析 温度グラフに対する出力蛍光の解釈は、以下のように行うのが便宜的である。
一次データのグラフは、検定がどの程度うまく実行されたか、すなわち、蛍光の
レベルがどの程度であり、どのサンプルが失敗したかに関する一般的情報を得る
のに利用する。対立遺伝子の評価には、一連のサンプル（同一の対立遺伝子特異
的プローブでハイブリッド形成された異なるＤＮＡ）の結果を、蛍光値の第１微
分係数の負数に沿ってプロットする。好適には、既知の遺伝子型ＤＮＡを一連の
サンプルに含ませる。２個の対立遺伝子について、２つの異なるピークがグラフ
に観察される。これらのピークは、一次データにおける蛍光減少（変性したプロ
ーブおよび標的の二本鎖）の最大比率に対応する。従って、この２つのピークは
、プローブおよび標的の“適合”二本鎖と“不適合”二本鎖のＴｍに相当する。
一次データのグラフは、検定がどの程度うまく実行されたか、すなわち、蛍光の
レベルがどの程度であり、どのサンプルが失敗したかに関する一般的情報を得る
のに利用する。対立遺伝子の評価には、一連のサンプル（同一の対立遺伝子特異
的プローブでハイブリッド形成された異なるＤＮＡ）の結果を、蛍光値の第１微
分係数の負数に沿ってプロットする。好適には、既知の遺伝子型ＤＮＡを一連の
サンプルに含ませる。２個の対立遺伝子について、２つの異なるピークがグラフ
に観察される。これらのピークは、一次データにおける蛍光減少（変性したプロ
ーブおよび標的の二本鎖）の最大比率に対応する。従って、この２つのピークは
、プローブおよび標的の“適合”二本鎖と“不適合”二本鎖のＴｍに相当する。
【００４４】 Ｔｍピークは、少なくとも８℃相違する。Ｔｍピークが高温であることは、所
与のＤＮＡサンプル中に、実験で使用した対立遺伝子特異的プローブに対応する
塩基配列が存在することを示す。対立遺伝子特異的プローブが、供試ＤＮＡの分
子と完全に適合するので、これを“適合”と称する。一方、Ｔｍピークが低温で
あることは、“不適合”であること、すなわち、供試ＤＮＡ中にハイブリッド形
成した配列が存在し、その配列が実験に使用した対立遺伝子特異的プローブに類
似するが、不完全な適合であることを意味する。２つの対立遺伝子系における典
型的なケースでは、この“不適合”は、プローブ配列によって表示されない対立
遺伝子である。しばしば単一のサンプルが両方のピークをもたらすが、これは供
試した２つの対立遺伝子がホモ接合であることを示す。
与のＤＮＡサンプル中に、実験で使用した対立遺伝子特異的プローブに対応する
塩基配列が存在することを示す。対立遺伝子特異的プローブが、供試ＤＮＡの分
子と完全に適合するので、これを“適合”と称する。一方、Ｔｍピークが低温で
あることは、“不適合”であること、すなわち、供試ＤＮＡ中にハイブリッド形
成した配列が存在し、その配列が実験に使用した対立遺伝子特異的プローブに類
似するが、不完全な適合であることを意味する。２つの対立遺伝子系における典
型的なケースでは、この“不適合”は、プローブ配列によって表示されない対立
遺伝子である。しばしば単一のサンプルが両方のピークをもたらすが、これは供
試した２つの対立遺伝子がホモ接合であることを示す。
【００４５】 結合ＤＮＡサンプルは、第２（または複数の後続する）対立遺伝子配列を含む
プローブを用いて、手順の工程４〜７で再処理することができ、得られたデータ
は上述したように分析される。２セットのデータを比較することで、どちらの対
立遺伝子がＤＮＡサンプルに存在するのかを高い精度で決定できる。ＤＮＡサン
プルが対立遺伝子１に特異的なプローブと“適合”し、対立遺伝子２に特異的な
プローブと“不適合”と評価された場合、このＤＮＡサンプルは“ホモ接合対立
遺伝子１”と評価される。一方、ＤＮＡサンプルが対立遺伝子１のプローブと“
不適合”で、対立遺伝子２のプローブと“適合”すると評価された場合、このＤ
ＮＡサンプルは“ホモ接合対立遺伝子２”と評価される。さらに、ＤＮＡサンプ
ルが両方の対立遺伝子と“適合”した場合は、当該サンプルは“対立遺伝子１と
２にヘテロ接合”と評価される。一次データ、第１微分係数および第２微分係数
のグラフの例は、７.１を参照されたい。
プローブを用いて、手順の工程４〜７で再処理することができ、得られたデータ
は上述したように分析される。２セットのデータを比較することで、どちらの対
立遺伝子がＤＮＡサンプルに存在するのかを高い精度で決定できる。ＤＮＡサン
プルが対立遺伝子１に特異的なプローブと“適合”し、対立遺伝子２に特異的な
プローブと“不適合”と評価された場合、このＤＮＡサンプルは“ホモ接合対立
遺伝子１”と評価される。一方、ＤＮＡサンプルが対立遺伝子１のプローブと“
不適合”で、対立遺伝子２のプローブと“適合”すると評価された場合、このＤ
ＮＡサンプルは“ホモ接合対立遺伝子２”と評価される。さらに、ＤＮＡサンプ
ルが両方の対立遺伝子と“適合”した場合は、当該サンプルは“対立遺伝子１と
２にヘテロ接合”と評価される。一次データ、第１微分係数および第２微分係数
のグラフの例は、７.１を参照されたい。
【００４６】３. 新規な発見 ３.１. 融解温度（Ｔｍ） この検定では、オリゴヌクレオチドのプローブがＤＮＡ標的から解離する温度
を、色素、緩衝液および塩化ナトリウム濃度の相互作用によって決定する。ＳＹ
ＢＲグリーンＩ色素は、プローブ／ＤＮＡ二本鎖構造を安定化させ、色素濃度を
上げることでＴｍを上昇させる。塩化ナトリウムと緩衝液の濃度を上げると、Ｔ
ｍが低下するのは、恐らく二本鎖ＤＮＡ構造に結合する（かつ、安定させる）色
素の潜在能力が低下するためと推測される。
を、色素、緩衝液および塩化ナトリウム濃度の相互作用によって決定する。ＳＹ
ＢＲグリーンＩ色素は、プローブ／ＤＮＡ二本鎖構造を安定化させ、色素濃度を
上げることでＴｍを上昇させる。塩化ナトリウムと緩衝液の濃度を上げると、Ｔ
ｍが低下するのは、恐らく二本鎖ＤＮＡ構造に結合する（かつ、安定させる）色
素の潜在能力が低下するためと推測される。
【００４７】３.２. 色素効果 ＳＹＢＲグリーンＩを二本鎖ＤＮＡ構造に挿入することによって、適合二本鎖
と不適合二本鎖とのＴｍの区別性が向上する。完璧に適合したＤＮＡ標的と完全
にハイブリッド形成した１５ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブと、中心位置で
不適合である標的とハイブリッド形成したプローブとのＴｍの相違は約８℃であ
る。標準ＤＮＡ溶液についての計算される融解温度から予想されるこの相違は、
約２〜３℃であった（これは、プローブのＤＮＡヌクレオチド配列によって変わ
る）。従って、ここではＤＡＳＨフォーマットは、対立遺伝子の識別についてポ
テンシャルを最適化する。
と不適合二本鎖とのＴｍの区別性が向上する。完璧に適合したＤＮＡ標的と完全
にハイブリッド形成した１５ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブと、中心位置で
不適合である標的とハイブリッド形成したプローブとのＴｍの相違は約８℃であ
る。標準ＤＮＡ溶液についての計算される融解温度から予想されるこの相違は、
約２〜３℃であった（これは、プローブのＤＮＡヌクレオチド配列によって変わ
る）。従って、ここではＤＡＳＨフォーマットは、対立遺伝子の識別についてポ
テンシャルを最適化する。
【００４８】 ＳＹＢＲグリーンＩは、また、二本鎖ＤＮＡの濃度と色素の濃度によって蛍光
が変化する効果を生む。従って、一定のＤＮＡ濃度において、ＳＹＢＲグリーン
色素レベルの滴定は、蛍光信号が最大値に到達するまで行う。これを“ＳＹＢＲ
グリーン効果”と名付けた。本検定で採用した色素の濃度（１：１０，０００で
希釈）は、典型的なマイクロタイタプレートウェルに結合できる量のＤＮＡに最
適のものである。
が変化する効果を生む。従って、一定のＤＮＡ濃度において、ＳＹＢＲグリーン
色素レベルの滴定は、蛍光信号が最大値に到達するまで行う。これを“ＳＹＢＲ
グリーン効果”と名付けた。本検定で採用した色素の濃度（１：１０，０００で
希釈）は、典型的なマイクロタイタプレートウェルに結合できる量のＤＮＡに最
適のものである。
【００４９】３.３. ヘペス緩衝液 ハイブリダイゼーション緩衝液の基本となるヘペスは、今回の検定で幾つかの
独特な特性を有している。この緩衝液と色素の組合せにおいて、プローブ／標的
ＤＮＡ複合体のＴｍは、ほとんどプローブ長さだけと相関関係にある。ＤＮＡ配
列状況（the DNA sequence context）、あるいは、Ｇ＋Ｃ量の変化は、観察され
たＴｍを変えることはない。これは、ＤＡＳＨ検定にとって極めて重要なことで
ある。
独特な特性を有している。この緩衝液と色素の組合せにおいて、プローブ／標的
ＤＮＡ複合体のＴｍは、ほとんどプローブ長さだけと相関関係にある。ＤＮＡ配
列状況（the DNA sequence context）、あるいは、Ｇ＋Ｃ量の変化は、観察され
たＴｍを変えることはない。これは、ＤＡＳＨ検定にとって極めて重要なことで
ある。
【００５０】３.４. ジメチル・スルホキシド（ＤＭＳＯ） 検定の完全性を危うくすることなくオリゴヌクレオチドプローブ／標的ＤＮＡ
複合体のＴｍを低下させるために、ＤＭＳＯはハイブリダイゼーション緩衝液に
加えることができる。唯一及ぼす影響は、両方の対立遺伝子のＴｍの違いに影響
を与えずに両両者のＴｍを下げることである。
複合体のＴｍを低下させるために、ＤＭＳＯはハイブリダイゼーション緩衝液に
加えることができる。唯一及ぼす影響は、両方の対立遺伝子のＴｍの違いに影響
を与えずに両両者のＴｍを下げることである。
【００５１】３.５. イオン性界面活性剤 ドデシル硫酸ナトリウムなどのイオン性界面活性剤を、濃度０．１％以下で使
用することは、蛍光信号を完全に破壊する。これは、色素との相互作用によるも
のと推測される。
用することは、蛍光信号を完全に破壊する。これは、色素との相互作用によるも
のと推測される。
【００５２】４. ＤＡＳＨアッセイ（検定）の構成要素 ４.１. 色素 モレキュラープローブ社（Molecular Probes）から入手したＳＹＢＲグリーン
Ｉ色素。４.２. プレート さまざまな供給元から入手したマイクロタイタプレート。パーキンエルマー社
（Perkin Elmer）から入手したマイクロアンプオプティカルプレート、キャップ
、チューブは、蛍光定量測定用に特に考案されている。４.３. オリゴヌクレオチド ＰＣＲプライマーと対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、インタ
ーアクティバ・バイオテクノロジー社（Interactiva Biotechnologie）から入手
し、全ては最良の質を確保するためHPLC精製した。４.４. 蛍光監視装置 ハイベイドＤＡＳＨシステム（ハイベイドリミテッド社：Hybaid Limited、英
国）、ＡＢＩ７７００（パーキンエルマー社、本発明のアッセイで使用のもの）
またはその他の検出温度制御装置。４.５. 緩衝液 緩衝液の全ての成分はシグマ社（Sigma）から入手。４.６. ソフトウエア サンプルデータの生データと、一次導関数および二次導関数を分析するために
開発されたソフトウエアは、キン・チュン・ウォン（アップサラ在住）によって
書かれた。
Ｉ色素。４.２. プレート さまざまな供給元から入手したマイクロタイタプレート。パーキンエルマー社
（Perkin Elmer）から入手したマイクロアンプオプティカルプレート、キャップ
、チューブは、蛍光定量測定用に特に考案されている。４.３. オリゴヌクレオチド ＰＣＲプライマーと対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、インタ
ーアクティバ・バイオテクノロジー社（Interactiva Biotechnologie）から入手
し、全ては最良の質を確保するためHPLC精製した。４.４. 蛍光監視装置 ハイベイドＤＡＳＨシステム（ハイベイドリミテッド社：Hybaid Limited、英
国）、ＡＢＩ７７００（パーキンエルマー社、本発明のアッセイで使用のもの）
またはその他の検出温度制御装置。４.５. 緩衝液 緩衝液の全ての成分はシグマ社（Sigma）から入手。４.６. ソフトウエア サンプルデータの生データと、一次導関数および二次導関数を分析するために
開発されたソフトウエアは、キン・チュン・ウォン（アップサラ在住）によって
書かれた。
【００５３】５. その他のアッセイフォーマット 別のフォーマットでＰＣＲ生成物のハイブリッド形成前にオリゴヌクレオチド
プローブをプレートに結合させることが可能であるが、試した結果、この設計で
はいくつかの技術的な問題が生じた。第１は二本鎖ＰＣＲ生成物を結合プローブ
にハイブリッド形成させる際の問題である。ＰＣＲ生成物のシンプルな加熱変性
と、それに続くプローブコート検定ウェル中での冷却が不十分となる。これはお
そらく置換反応、すなわち、ＰＣＲ生成物が二本鎖を修正し、標的配列にハイブ
リッド形成したプローブを置換することによるものと推測される。
プローブをプレートに結合させることが可能であるが、試した結果、この設計で
はいくつかの技術的な問題が生じた。第１は二本鎖ＰＣＲ生成物を結合プローブ
にハイブリッド形成させる際の問題である。ＰＣＲ生成物のシンプルな加熱変性
と、それに続くプローブコート検定ウェル中での冷却が不十分となる。これはお
そらく置換反応、すなわち、ＰＣＲ生成物が二本鎖を修正し、標的配列にハイブ
リッド形成したプローブを置換することによるものと推測される。
【００５４】 置換反応によって引起される煩雑さを排除するために、我々はハイブリッド形
成のためにＰＣＲ生成物から一本鎖ＤＮＡを生成することを試みた。このために
、ＰＣＲにおいて不等量の２つのプライマーを用い、理論的にＰＣＲ生成物（非
対称ＰＣＲ）の一本鎖を過剰に生成させた。これは検定をを僅かだが向上させた
。重要なのは、最適ＰＣＲ条件が、ＤＡＳＨアッセイの確実性に対する妥協の程
度によって変化することである。
成のためにＰＣＲ生成物から一本鎖ＤＮＡを生成することを試みた。このために
、ＰＣＲにおいて不等量の２つのプライマーを用い、理論的にＰＣＲ生成物（非
対称ＰＣＲ）の一本鎖を過剰に生成させた。これは検定をを僅かだが向上させた
。重要なのは、最適ＰＣＲ条件が、ＤＡＳＨアッセイの確実性に対する妥協の程
度によって変化することである。
【００５５】 遊離液中におけるＰＣＲ生成物の長さが長いことも問題である。これは反応速
度を遅くし、かつ、潜在的二次構造がハイブリダイゼーション反応を妨げる。さ
らに、ひとたび長い分子が短い固定プローブにハイブリッド形成されると、熱エ
ネルギーが加えられるにつれ、ＤＮＡ／プローブ複合体の時期尚早な解離が生じ
る。このフォーマットでは、全ての蛍光信号が極めて低温で失われてしまうため
、対立遺伝子間の識別が不可能であることが見出された。これはおそらく、ハイ
ブリッド形成されたＰＣＲ断片に、液中に突き出るような非ハイブリッド形成し
ていない長い尾部が存在することに起因する。温度が上昇するにつれ、長い分子
はハイブリッド形成された複合体のＴｍ特性によって変性されるよりも、むしろ
溶液運動によって引抜かれる。
度を遅くし、かつ、潜在的二次構造がハイブリダイゼーション反応を妨げる。さ
らに、ひとたび長い分子が短い固定プローブにハイブリッド形成されると、熱エ
ネルギーが加えられるにつれ、ＤＮＡ／プローブ複合体の時期尚早な解離が生じ
る。このフォーマットでは、全ての蛍光信号が極めて低温で失われてしまうため
、対立遺伝子間の識別が不可能であることが見出された。これはおそらく、ハイ
ブリッド形成されたＰＣＲ断片に、液中に突き出るような非ハイブリッド形成し
ていない長い尾部が存在することに起因する。温度が上昇するにつれ、長い分子
はハイブリッド形成された複合体のＴｍ特性によって変性されるよりも、むしろ
溶液運動によって引抜かれる。
【００５６】 プローブ結合フォーマットの最適化は、ＰＣＲ条件、緩衝液構成要素、アニー
リング戦略およびその他のパラメータを含むさらなる実験を必要とする。ハイブ
リッド形成のための一本鎖ＤＮＡ分子の生成に係わる問題および運動速度の考慮
は、ＤＮＡ分子結合フォーマットを利用することで回避できる。非ビオチニル化
（non-biotinylated）鎖は一本鎖ＤＮＡ生成物のために容易に溶出され、未熟置
換を含む運動制限は観察されない。
リング戦略およびその他のパラメータを含むさらなる実験を必要とする。ハイブ
リッド形成のための一本鎖ＤＮＡ分子の生成に係わる問題および運動速度の考慮
は、ＤＮＡ分子結合フォーマットを利用することで回避できる。非ビオチニル化
（non-biotinylated）鎖は一本鎖ＤＮＡ生成物のために容易に溶出され、未熟置
換を含む運動制限は観察されない。
【００５７】６. ＤＡＳＨ分析の実施例：ヒトＮＤＵＦＢ４遺伝子における重対立遺伝子の
単一ヌクレオチド多形性の対立遺伝子バージョンの検出 常染色体上に位置するヒトＮＤＵＦＢ４遺伝子における単一ヌクレオチド多形
性についてＤＡＳＨ実験を行った。これは“ＤＮＡ配列１”として図１に記載さ
れ、“Ａ”ヌクレオチドと、“Ｇ”ヌクレオチドとの重対立性から成る。３つの
ヒトゲノムＤＮＡサンプルであるＸ、Ｙ，Ｚが採用され、これらは先の配列分析
から、“Ａ”対立遺伝子がホモ接合、“Ｇ”対立遺伝子がホモ接合、それらの対
立遺伝子はヘテロ接合であると各々知られている。
単一ヌクレオチド多形性の対立遺伝子バージョンの検出 常染色体上に位置するヒトＮＤＵＦＢ４遺伝子における単一ヌクレオチド多形
性についてＤＡＳＨ実験を行った。これは“ＤＮＡ配列１”として図１に記載さ
れ、“Ａ”ヌクレオチドと、“Ｇ”ヌクレオチドとの重対立性から成る。３つの
ヒトゲノムＤＮＡサンプルであるＸ、Ｙ，Ｚが採用され、これらは先の配列分析
から、“Ａ”対立遺伝子がホモ接合、“Ｇ”対立遺伝子がホモ接合、それらの対
立遺伝子はヘテロ接合であると各々知られている。
【００５８】６.１. ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） ＤＮＡサンプルＸ、Ｙ、Ｚの５０ｎｇアリコートについて、“ＤＮＡ配列２”
および“ＤＮＡ配列３”として図１に記載されたＰＣＲプライマーを用いてＰＣ
Ｒが実施された。反応条件を下記に記す：総量２５ｍｌ中、２０ｎｇの“ＤＮＡ
配列２”プライマーと、１００ｎｇの“ＤＮＡ配列３”プライマーと、０．７５
ｕのアンプリタックゴールド（AmpliTaq-Gold）ポリメラーゼ（パーキンエルマ
ー社）と、１０％のジメチルスルホキシドと、１ｘパーキンエルマーＰＣＲ緩衝
液（１．５ｍＭのＭｇＣｌ２含有）と、各０．２ｍＭのｄＧＴＰと、ｄＡＴＰと
、ｄＴＴＰとｄＣＴＰとを含む。熱サイクルはタッチダウン（TouchDownTM）温
度サイクル装置（ハイベイド社製）を採用し、以下のサイクル条件とした： １
×（９４℃で１０分間、５０℃で３０秒、７２℃で３０秒）、１７×（９４℃で
１５秒間、５０℃で３０秒、７２℃で３０秒）、１８×（９４℃で１５秒間、５
０℃で３０秒、７２℃で１分）。これは、４８塩基対長さのＰＣＲ生成物を産出
し、このものは多形遺伝子座に及び、一本のＤＮＡ鎖の５’末端にビオチン部分
を持つた。
および“ＤＮＡ配列３”として図１に記載されたＰＣＲプライマーを用いてＰＣ
Ｒが実施された。反応条件を下記に記す：総量２５ｍｌ中、２０ｎｇの“ＤＮＡ
配列２”プライマーと、１００ｎｇの“ＤＮＡ配列３”プライマーと、０．７５
ｕのアンプリタックゴールド（AmpliTaq-Gold）ポリメラーゼ（パーキンエルマ
ー社）と、１０％のジメチルスルホキシドと、１ｘパーキンエルマーＰＣＲ緩衝
液（１．５ｍＭのＭｇＣｌ２含有）と、各０．２ｍＭのｄＧＴＰと、ｄＡＴＰと
、ｄＴＴＰとｄＣＴＰとを含む。熱サイクルはタッチダウン（TouchDownTM）温
度サイクル装置（ハイベイド社製）を採用し、以下のサイクル条件とした： １
×（９４℃で１０分間、５０℃で３０秒、７２℃で３０秒）、１７×（９４℃で
１５秒間、５０℃で３０秒、７２℃で３０秒）、１８×（９４℃で１５秒間、５
０℃で３０秒、７２℃で１分）。これは、４８塩基対長さのＰＣＲ生成物を産出
し、このものは多形遺伝子座に及び、一本のＤＮＡ鎖の５’末端にビオチン部分
を持つた。
【００５９】６.２. ＰＣＲ生成物のマイクロタイタプレートへの結合 ＰＣＲ反応生成物は、等量の緩衝液Ｉ（１００ｍＭのヘペス、５０ｍＭのＮａ
Ｃｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）と混合し、ストレプタビジンを塗布し
た薄壁マイクロタイタプレート（ボーリンジャー・マンヘイム：Boehringer Man
nheim）の個別ウェルに移された。これを室温で１時間放置した。
Ｃｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）と混合し、ストレプタビジンを塗布し
た薄壁マイクロタイタプレート（ボーリンジャー・マンヘイム：Boehringer Man
nheim）の個別ウェルに移された。これを室温で１時間放置した。
【００６０】６.３. 非結合鎖の溶出 全量の溶液（非結合ＤＮＡおよびその他の試薬を含む）をマイクロタイタプレ
ートから完全に吸引除去した。その後直ちに、ウェルを５０ｍｌの０．１Ｍ Ｎ
ａＯＨで満たし、５分間室温で放置した。非ビオチニル化ＤＮＡ鎖（この時、結
合鎖から変性）を含むＮａＯＨ溶液が完全に除去された。
ートから完全に吸引除去した。その後直ちに、ウェルを５０ｍｌの０．１Ｍ Ｎ
ａＯＨで満たし、５分間室温で放置した。非ビオチニル化ＤＮＡ鎖（この時、結
合鎖から変性）を含むＮａＯＨ溶液が完全に除去された。
【００６１】６.４. 反応サンプルの中和 ウェルにＳＹＢＲグリーン色素を含む５０ｍｌの緩衝液を遅滞なく満たした（
１：１０，０００で希釈）。
１：１０，０００で希釈）。
【００６２】６.５. 第１の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブのハイブリッド形
成 ３０ｐｍｏｌの“Ｔプローブ”（図１に記載の“ＤＮＡ配列４”）を、水１ｍ
ｌで各ウェルに添加した。光学キャップ（パーキンエルマー社製）を用いて各ウ
ェルを密閉し、プレートとその中身を６０℃で加熱し、１５分以上かけて室温ま
で徐々に冷却した。これはタッチダウン（TouchDownTM）温度サイクル装置（ハ
イベイド社製）を用いて実施した。
成 ３０ｐｍｏｌの“Ｔプローブ”（図１に記載の“ＤＮＡ配列４”）を、水１ｍ
ｌで各ウェルに添加した。光学キャップ（パーキンエルマー社製）を用いて各ウ
ェルを密閉し、プレートとその中身を６０℃で加熱し、１５分以上かけて室温ま
で徐々に冷却した。これはタッチダウン（TouchDownTM）温度サイクル装置（ハ
イベイド社製）を用いて実施した。
【００６３】６.６. 非結合プローブの削除 光学キャップを外し、全量の溶液をマイクロタイタプレートから完全に吸引し
た。次にウェルをＳＹＢＲグリーンＩ色素（１：１０，０００で希釈）を含む５
０μｌの緩衝液Ｉで満たし、光学キャップを取り替えた。
た。次にウェルをＳＹＢＲグリーンＩ色素（１：１０，０００で希釈）を含む５
０μｌの緩衝液Ｉで満たし、光学キャップを取り替えた。
【００６４】６.７. 信号検出手順 マイクロタイタプレートをパーキンエルマー７７００（タックマン）装置に設
置し、毎秒０．１℃の定速度で３５℃から８０℃までにわたる温度範囲を含む加
熱期を適用した。この加熱期中、タックマン装置は反復してサンプルをアルゴン
レーザ光源（４８８ｎｍで濾波）で励起し、周波数域５４５〜５５０ｎｍで放出
される蛍光を収集した。いずれのウェルも7秒間隔でデータポイントを集めた。
置し、毎秒０．１℃の定速度で３５℃から８０℃までにわたる温度範囲を含む加
熱期を適用した。この加熱期中、タックマン装置は反復してサンプルをアルゴン
レーザ光源（４８８ｎｍで濾波）で励起し、周波数域５４５〜５５０ｎｍで放出
される蛍光を収集した。いずれのウェルも7秒間隔でデータポイントを集めた。
【００６５】６.８. 第２の対立遺伝子特異的プローブでの再プローブ 工程５で用いた“Ｔプローブ”を“Ｃプローブ”（図１の“ＤＮＡ配列５”）
と交換して上記工程３〜８を繰り返した。
と交換して上記工程３〜８を繰り返した。
【００６６】６.９. データ分析および結果の解釈 全てのウェルおよび両方のプローブについて、一次データを蛍光データ対時間
のグラフにプロットした。このデータは、8個のデータポイントのスライドウイ
ンドウから決定した平均蛍光値をプロットすると滑らかであった。こうして得ら
れた“一次”データを図２ａおよび２ｂに示した。次に、このグラフの負の微分
（導関数）曲線をプロットし、これを図３ａおよび３ｂに示した。そして、負の
第１微分曲線の微分曲線をプロットし、図４ａおよび４ｂに示し第２導関数を得
た。
のグラフにプロットした。このデータは、8個のデータポイントのスライドウイ
ンドウから決定した平均蛍光値をプロットすると滑らかであった。こうして得ら
れた“一次”データを図２ａおよび２ｂに示した。次に、このグラフの負の微分
（導関数）曲線をプロットし、これを図３ａおよび３ｂに示した。そして、負の
第１微分曲線の微分曲線をプロットし、図４ａおよび４ｂに示し第２導関数を得
た。
【００６７】 図３ａおよび３ｂにおいて、高温ピーク（Ｈ）と低温ピーク（Ｌ）は、最大変
性率のポイントを示していると考えられる。これらは、適合したプローブ標的Ｄ
ＮＡ二本鎖と、一塩基不適合のプローブ標的ＤＮＡ二本鎖それぞれのＤＡＳＨ信
号を示している。第２導関数曲線（図４）では、これらの点は曲線がＸ軸と交わ
る点から推理できる。これらは一次データ（図２）にも見られるが、ＤＡＳＨの
結果表示から差異を弁別するのは困難である。
性率のポイントを示していると考えられる。これらは、適合したプローブ標的Ｄ
ＮＡ二本鎖と、一塩基不適合のプローブ標的ＤＮＡ二本鎖それぞれのＤＡＳＨ信
号を示している。第２導関数曲線（図４）では、これらの点は曲線がＸ軸と交わ
る点から推理できる。これらは一次データ（図２）にも見られるが、ＤＡＳＨの
結果表示から差異を弁別するのは困難である。
【００６８】 サンプルＸとＹに関しては、一方の負の第１微分グラフに一つの適合（高温）
ピークが、他方の負の第１微分グラフに一つの不適合（低温）ピークが認められ
る。これはＸとＹがホモ接合サンプルであることを示している。ＸとＹが高温（
適合）ピークを付与する間のプロービングは、これらがどの対立遺伝子を含んで
いるかを示すものである。従って、Ｘは“Ｔプローブ”で高温ピークを形成する
ので、これは“Ａ”対立遺伝子ホモ接合体である。一方、Ｙは“Ｃプローブ”で
高温ピークを形成するので、“Ｇ”対立遺伝子ホモ接合体である。
ピークが、他方の負の第１微分グラフに一つの不適合（低温）ピークが認められ
る。これはＸとＹがホモ接合サンプルであることを示している。ＸとＹが高温（
適合）ピークを付与する間のプロービングは、これらがどの対立遺伝子を含んで
いるかを示すものである。従って、Ｘは“Ｔプローブ”で高温ピークを形成する
ので、これは“Ａ”対立遺伝子ホモ接合体である。一方、Ｙは“Ｃプローブ”で
高温ピークを形成するので、“Ｇ”対立遺伝子ホモ接合体である。
【００６９】 サンプルＺは、サンプルＸやＹとは異なる挙動を示す。サンプルＺは、“Ｃプ
ローブ”で高温ピークと低温ピークの両方を形成し、“Ｔプローブ”でも高温ピ
ークと低温ピーク（両ピークは隣接により単一の広いピークに統合される）を形
成する。そのため、このＤＮＡサンプルは、その中に存在する両プローブの対立
遺伝子相補的配列を有している。従って、Ｚは、“Ａ”対立遺伝子と“Ｇ”対立
遺伝子の両方を含むヘテロ接合サンプルと推理することができる。
ローブ”で高温ピークと低温ピークの両方を形成し、“Ｔプローブ”でも高温ピ
ークと低温ピーク（両ピークは隣接により単一の広いピークに統合される）を形
成する。そのため、このＤＮＡサンプルは、その中に存在する両プローブの対立
遺伝子相補的配列を有している。従って、Ｚは、“Ａ”対立遺伝子と“Ｇ”対立
遺伝子の両方を含むヘテロ接合サンプルと推理することができる。
【００７０】図１ ヒトＮＤＵＦＢ４遺伝子の多形性の対立遺伝子を評価するＤＡＳＨアッセイに使
用されるＤＮＡ配列 ＤＮＡ配列１（配列リストＳＥ１） これは、ヒトＮＤＵＦＢ４遺伝子の一部を示す４８塩基対のゲノムＤＮＡ配列
である。重対立遺伝子の単一ヌクレオチド多形性（ＧからＡ）が、配列中央に向
う括弧内に示されている。
用されるＤＮＡ配列 ＤＮＡ配列１（配列リストＳＥ１） これは、ヒトＮＤＵＦＢ４遺伝子の一部を示す４８塩基対のゲノムＤＮＡ配列
である。重対立遺伝子の単一ヌクレオチド多形性（ＧからＡ）が、配列中央に向
う括弧内に示されている。
【００７１】 ＤＮＡ配列２（配列リストＳＥ２） この配列は、ＤＮＡ配列１に示される対立遺伝子の多形性を検出するために、
ＤＡＳＨ検定で“ＰＣＲプライマー１”として使用するために設計された１９塩
基対のオリゴヌクレオチド配列である。これは、５’末端に結合したビオチン部
位を備える。
ＤＡＳＨ検定で“ＰＣＲプライマー１”として使用するために設計された１９塩
基対のオリゴヌクレオチド配列である。これは、５’末端に結合したビオチン部
位を備える。
【００７２】 ＤＮＡ配列３（配列リストＳＥ３） この配列は、ＤＮＡ配列１に示される対立遺伝子の多形性を検出するために、
ＤＡＳＨ検定で“ＰＣＲプライマー２”として使用するために設計された２１塩
基対のオリゴヌクレオチド配列である。
ＤＡＳＨ検定で“ＰＣＲプライマー２”として使用するために設計された２１塩
基対のオリゴヌクレオチド配列である。
【００７３】 ＤＮＡ配列４（配列リストＳＥ４） この配列は、ＤＮＡ配列１に示される対立遺伝子の多形性を検出するために、
ＤＡＳＨ検定で“Ｃプローブ”として使用するために設計された１５塩基対のオ
リゴヌクレオチド配列である。
ＤＡＳＨ検定で“Ｃプローブ”として使用するために設計された１５塩基対のオ
リゴヌクレオチド配列である。
【００７４】 ＤＮＡ配列５（配列リストＳＥ５） この配列は、ＤＮＡ配列１に示される対立遺伝子の多形性を検出するために、
ＤＡＳＨ検定で“Ｔプローブ”として使用するために設計された１５塩基対のオ
リゴヌクレオチド配列である。
ＤＡＳＨ検定で“Ｔプローブ”として使用するために設計された１５塩基対のオ
リゴヌクレオチド配列である。
【００７５】図２ ＮＤＵＦＢ４遺伝子の多形性に関するＤＡＳＨアッセイの一次データ （“Ｈ”および“Ｌ”は、それぞれ、適合および不適合プローブ−標的の複合
体の最大変性率ポイントを示す。Ｘ、Ｙ、ＺはサンプルＤＮＡである。） （２ａ）“Ｃプローブ”の結果
体の最大変性率ポイントを示す。Ｘ、Ｙ、ＺはサンプルＤＮＡである。） （２ａ）“Ｃプローブ”の結果
【００７６】 （２ｂ）“Ｔプローブ”の結果
【００７７】図３ ＮＤＵＦＢ４ゲノム遺伝子の多形性に関する負の一次導関数のＤＡＳＨアッセイ
データ （“Ｈ”および“Ｌ”は、それぞれ、適合および不適合プローブ−標的の複合
体の最大変性率ポイントを示す。Ｘ、Ｙ、ＺはサンプルＤＮＡである。） （３ａ）“Ｃプローブ”の結果
データ （“Ｈ”および“Ｌ”は、それぞれ、適合および不適合プローブ−標的の複合
体の最大変性率ポイントを示す。Ｘ、Ｙ、ＺはサンプルＤＮＡである。） （３ａ）“Ｃプローブ”の結果
【００７８】 （３ｂ）“Ｔプローブ”の結果
【００７９】図４ ＮＤＵＦＢ４遺伝子の多形性に関する二次導関数のＤＡＳＨアッセイデータ （“Ｈ”および“Ｌ”は、それぞれ、適合および不適合プローブ−標的の複合
体の最大変性率ポイントを示す。Ｘ、Ｙ、ＺはサンプルＤＮＡである。） （４ａ）“Ｃプローブ”の結果
体の最大変性率ポイントを示す。Ｘ、Ｙ、ＺはサンプルＤＮＡである。） （４ａ）“Ｃプローブ”の結果
【００８０】 （４ｂ）“Ｔプローブ”の結果
【００８１】 ７．補足説明７.１. グラフの例 ７.１.１. 一次データ 上記のグラフは、一つの対立遺伝子特異的プローブにて、３つの異なるＤＮＡ
サンプルを検定したデータを示したものである。サンプル“２８、２９、３０”
は、それぞれホモ接合適合サンプル、ホモ接合不適合サンプルおよびヘテロ接合
サンプルの典型的な結果を示している。ヘテロ接合のサンプル３０は、適合曲線
および不適合曲線両方の特性を示していることに留意されたい。は不適合プロ
ーブ／標的複合体のＴｍであり、は適合プローブ／標的複合体のＴｍである。
サンプルを検定したデータを示したものである。サンプル“２８、２９、３０”
は、それぞれホモ接合適合サンプル、ホモ接合不適合サンプルおよびヘテロ接合
サンプルの典型的な結果を示している。ヘテロ接合のサンプル３０は、適合曲線
および不適合曲線両方の特性を示していることに留意されたい。は不適合プロ
ーブ／標的複合体のＴｍであり、は適合プローブ／標的複合体のＴｍである。
【００８２】７.１.２. 負の一次導関数 このグラフは、３つのＤＮＡサンプルの負の一次導関数を図示したものである
。これらのＤＮＡサンプルは、一つの対立遺伝子特的プローブで検査された。サ
ンプル２８、２９、３０は、各々、プローブ対立遺伝子について、ホモ接合適合
、ホモ接合不適合およびヘテロ接合である。。は不適合プローブ／標的複合体
のＴｍであり、は適合プローブ／標的複合体のＴｍである。
。これらのＤＮＡサンプルは、一つの対立遺伝子特的プローブで検査された。サ
ンプル２８、２９、３０は、各々、プローブ対立遺伝子について、ホモ接合適合
、ホモ接合不適合およびヘテロ接合である。。は不適合プローブ／標的複合体
のＴｍであり、は適合プローブ／標的複合体のＴｍである。
【００８３】７.１.３. 二次導関数 このグラフは、３つのＤＮＡサンプルについての二次導関数を図示したもので
ある。サンプル２８、２９、３０は、ホモ接合適合、ホモ接合不適合、およびヘ
テロ接合をそれぞれ示している。は不適合プローブ／標的複合体のＴｍを、
は適合プローブ／標的複合体部位のＴｍを示す。
ある。サンプル２８、２９、３０は、ホモ接合適合、ホモ接合不適合、およびヘ
テロ接合をそれぞれ示している。は不適合プローブ／標的複合体のＴｍを、
は適合プローブ／標的複合体部位のＴｍを示す。
【００８４】７.１.４. ３つの異なる変異におけるヘペスによるＴｍの標準化 上のグラフは、３つの異なる変異について、サンプル２５〜２７、２８〜３０
、３１〜３３から得た一揃いの負の一次導関数データを示す。各セットのデータ
は、評価される個々の変異に相当する１５ｍｅｒの対立遺伝子特異的オリゴヌク
レオチドプローブに特異的な遺伝子座で検査された。これらのプローブが含有す
るＧとＣの割合は、４０〜７０％で変化した。融解温度理論によれば、プローブ
／標的複合体のＴｍはこれらの異なる配列によって変化すべきであるが、ヘペス
緩衝液を用いたＤＡＳＨ検定条件は、固定Ｔｍ値にデータを標準化させる。は
不適合プローブ／標的複合体のＴｍを、は適合プローブ／標的複合体のＴｍで
ある。
、３１〜３３から得た一揃いの負の一次導関数データを示す。各セットのデータ
は、評価される個々の変異に相当する１５ｍｅｒの対立遺伝子特異的オリゴヌク
レオチドプローブに特異的な遺伝子座で検査された。これらのプローブが含有す
るＧとＣの割合は、４０〜７０％で変化した。融解温度理論によれば、プローブ
／標的複合体のＴｍはこれらの異なる配列によって変化すべきであるが、ヘペス
緩衝液を用いたＤＡＳＨ検定条件は、固定Ｔｍ値にデータを標準化させる。は
不適合プローブ／標的複合体のＴｍを、は適合プローブ／標的複合体のＴｍで
ある。
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】平成１３年４月１０日（２００１．４．１０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の名称】 核酸多形現象の検出
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、核酸配列順序の変異、より詳しくは、天然ＤＮＡ塩基配列に発生す
る変異体（同質多型および突然変異）の評価に関する。
る変異体（同質多型および突然変異）の評価に関する。
【０００２】 例えばヒトなどの種のゲノムにおいて、任意の２つの等価染色体間におけるヌ
クレオチドの変異は、平均すると１０３につき１の割合であると推定される。そ
うした変異の大部分は機能的に中立であるが、ほんの少量は、疾病のリスクを含
むヒトの表現型的相違（phenotypic differences）を引き起こす。変異の遺伝子
座を含むＤＮＡ分節の染色体部分に対する対立遺伝子の特異プローブにおけるハ
イブリダイゼーションの程度を測定することにより、ＤＮＡの変異が調べられる
。この手法では、調査時に個体から採取したＤＮＡサンプルについて、“適合（
プローブと同一のＤＮＡの存在）”および“不適合（プローブと同一でないＤＮ
Ａの存在）”を記録することができる。しかし、こうした従来の手法には、適切
な差別的ハイブリダイゼーションを厳格に測定するのが困難であるという問題が
残る。従って、こうした問題点を改善して、信頼性が高く、より簡易な手法を確
立することが求められている。
クレオチドの変異は、平均すると１０３につき１の割合であると推定される。そ
うした変異の大部分は機能的に中立であるが、ほんの少量は、疾病のリスクを含
むヒトの表現型的相違（phenotypic differences）を引き起こす。変異の遺伝子
座を含むＤＮＡ分節の染色体部分に対する対立遺伝子の特異プローブにおけるハ
イブリダイゼーションの程度を測定することにより、ＤＮＡの変異が調べられる
。この手法では、調査時に個体から採取したＤＮＡサンプルについて、“適合（
プローブと同一のＤＮＡの存在）”および“不適合（プローブと同一でないＤＮ
Ａの存在）”を記録することができる。しかし、こうした従来の手法には、適切
な差別的ハイブリダイゼーションを厳格に測定するのが困難であるという問題が
残る。従って、こうした問題点を改善して、信頼性が高く、より簡易な手法を確
立することが求められている。
【０００３】 本発明は、 （ａ）変異の遺伝子座を含むＤＮＡ塩基配列の一本鎖と、 （ｂ）上記（ａ）の一本鎖を交雑して二本鎖を形成し、変異の１つの対立遺伝
子に対して特異的なオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ類似体のプローブと、 （ｃ）上記の（ａ）および（ｂ）の二本鎖構造に対して特異的であって、二本
鎖内で相互作用した際に独特に反応するマーカー から成る複合体を形成し、 （ｄ）該複合体を含む変性環境を定常的に高めるながら、マーカーと二本鎖と
の反応程度の出力信号を連続的に測定し、複合体の解離と考えられ、従って、上
記プローブ（ｂ）が上記一本鎖（ａ）と交雑している強さと相関関係にあるとこ
ろの、反応の出力信号に変化が起こる条件（以下、変性ポイントと称する）を記
録することならＤＮＡ変異の検出方法を提供する。
子に対して特異的なオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ類似体のプローブと、 （ｃ）上記の（ａ）および（ｂ）の二本鎖構造に対して特異的であって、二本
鎖内で相互作用した際に独特に反応するマーカー から成る複合体を形成し、 （ｄ）該複合体を含む変性環境を定常的に高めるながら、マーカーと二本鎖と
の反応程度の出力信号を連続的に測定し、複合体の解離と考えられ、従って、上
記プローブ（ｂ）が上記一本鎖（ａ）と交雑している強さと相関関係にあるとこ
ろの、反応の出力信号に変化が起こる条件（以下、変性ポイントと称する）を記
録することならＤＮＡ変異の検出方法を提供する。
【０００４】 上述したアッセイでは、複合体が最初に形成され、次に変性条件を適用して二
本鎖が解離するポイントを測定する。二本鎖の変性方法として加熱を採用する場
合、反応は以下の手順で実行される。初めに供試試料を冷却し、標的ＤＮＡにオ
リゴヌクレオチドまたはプローブを交雑させ、次に、制御および監視された状態
で定常的に加熱して変性温度を検出する。しかし、二本鎖ＤＮＡの形成は平衡反
応であり、両方向反応であると認められるので、上記の手順を逆にすることも可
能である。反応の全ての成分をまとめて上昇させ、次いで上と同様、制御および
監視された状況でこれらを冷却して、二本鎖（および複合体）が形成される温度
を検出する。この温度は“アニーリング”温度と称される。このアニーリング温
度は、“変性”温度に等しいと考えられるが、複合体が伴う化学作用に原因して
実際は別の値をとる。この等価原理は、本発明の目的のために、加熱以外の変性
／アニーリング条件が採用される場合にも、勿論適用可能である。
本鎖が解離するポイントを測定する。二本鎖の変性方法として加熱を採用する場
合、反応は以下の手順で実行される。初めに供試試料を冷却し、標的ＤＮＡにオ
リゴヌクレオチドまたはプローブを交雑させ、次に、制御および監視された状態
で定常的に加熱して変性温度を検出する。しかし、二本鎖ＤＮＡの形成は平衡反
応であり、両方向反応であると認められるので、上記の手順を逆にすることも可
能である。反応の全ての成分をまとめて上昇させ、次いで上と同様、制御および
監視された状況でこれらを冷却して、二本鎖（および複合体）が形成される温度
を検出する。この温度は“アニーリング”温度と称される。このアニーリング温
度は、“変性”温度に等しいと考えられるが、複合体が伴う化学作用に原因して
実際は別の値をとる。この等価原理は、本発明の目的のために、加熱以外の変性
／アニーリング条件が採用される場合にも、勿論適用可能である。
【０００５】 上記した方法は、所定の複合体が形成される以前に、且つ成分（ａ）（ｂ）が
交雑しない条件の下で、成分（ａ）〜（ｃ）を結合させ、その後、二本鎖及び複
合体が形成されるように、成分の環境条件を定常的に調節し、次いで、成分（ａ
）と（ｂ）のハイブリッド形成が生起したこと（以下、アニーリングポイントと
称す）を示す反応の出力信号を得る方法である。
交雑しない条件の下で、成分（ａ）〜（ｃ）を結合させ、その後、二本鎖及び複
合体が形成されるように、成分の環境条件を定常的に調節し、次いで、成分（ａ
）と（ｂ）のハイブリッド形成が生起したこと（以下、アニーリングポイントと
称す）を示す反応の出力信号を得る方法である。
【０００６】 従って、より具体的には、本発明に係るＤＮ変異の検出方法の一つは、 （ａ）変異の遺伝子座を含むＤＮＡ塩基配列の一本鎖と、 （ｂ）変異の一つの対立遺伝子に対して特異的で、かつ、上記の一本鎖（ａ）
と交雑して二本鎖を形成することができるオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ類似体
のプローブと、 （ｃ）前記（ａ）プラス（ｂ）の二本鎖構造に対して特異的であり、その二本
鎖と共に複合体を形成し、且つ、二本鎖内での相互作用に際して独特に反応する
マーカー からなる複合体の形成または解離を監視し、一本鎖（ａ）とプローブ（ｂ）から
形成される二本鎖に、マーカーが相互作用したことを示す出力信号を連続的に測
定し、複合体の形成または解離の原因と考えられ、従って、上記プローブ（ｂ）
が一本鎖（ａ）に交雑している強さと相関する反応の出力信号に変化が起きた条
件を記録することからなる。
と交雑して二本鎖を形成することができるオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ類似体
のプローブと、 （ｃ）前記（ａ）プラス（ｂ）の二本鎖構造に対して特異的であり、その二本
鎖と共に複合体を形成し、且つ、二本鎖内での相互作用に際して独特に反応する
マーカー からなる複合体の形成または解離を監視し、一本鎖（ａ）とプローブ（ｂ）から
形成される二本鎖に、マーカーが相互作用したことを示す出力信号を連続的に測
定し、複合体の形成または解離の原因と考えられ、従って、上記プローブ（ｂ）
が一本鎖（ａ）に交雑している強さと相関する反応の出力信号に変化が起きた条
件を記録することからなる。
【０００７】 また、本発明に係るＤＮＡの変異検出方法の他の一つは、 （ａ）変異の遺伝子座を含むＤＮＡ塩基配列の一本鎖と、 （ｂ）変異の一つの対立遺伝子に対して特異的で、かつ、上記の一本鎖（ａ）
を交二本鎖とするために一本鎖（ａ）と交雑することができるオリゴヌクレオチ
ド又はＤＮＡ類似体のプローブと、 （ｃ）前記の成分（ａ）プラス（ｂ）の二本鎖構造に対して特異的であり、そ
の二本鎖と共に複合体を形成し、且つ、二本鎖内での相互作用に際して独特に反
応するマーカー とを、 （ｉ）成分（ａ）が成分（ｂ）と交雑し、成分（ｃ）と共に複合体が形成され
る条件、または、 （ｉｉ）成分（ａ）と成分（ｂ）とが交雑せず、成分（ｃ）との複合体も形成
されない条件 の下で結合させ、しかる後、 （ｉ）形成された二本鎖が変性されて複合体が解離するか、あるいは、 （ｉｉ）二本鎖が形成されて複合体が形成される ように環境条件を徐々に且つ定常的に調節し、 さらに成分（ａ）と成分（ｂ）のハイブリダイゼーションの程度および成分（ｃ
）との複合体形成の程度を示す出力信号を継続的に測定し、 そして、（ｉ）複合体の解離または（ｉｉ）複合体の形成をそれぞれ示す出力信
号の変化が起こる条件を記録することかなる。
を交二本鎖とするために一本鎖（ａ）と交雑することができるオリゴヌクレオチ
ド又はＤＮＡ類似体のプローブと、 （ｃ）前記の成分（ａ）プラス（ｂ）の二本鎖構造に対して特異的であり、そ
の二本鎖と共に複合体を形成し、且つ、二本鎖内での相互作用に際して独特に反
応するマーカー とを、 （ｉ）成分（ａ）が成分（ｂ）と交雑し、成分（ｃ）と共に複合体が形成され
る条件、または、 （ｉｉ）成分（ａ）と成分（ｂ）とが交雑せず、成分（ｃ）との複合体も形成
されない条件 の下で結合させ、しかる後、 （ｉ）形成された二本鎖が変性されて複合体が解離するか、あるいは、 （ｉｉ）二本鎖が形成されて複合体が形成される ように環境条件を徐々に且つ定常的に調節し、 さらに成分（ａ）と成分（ｂ）のハイブリダイゼーションの程度および成分（ｃ
）との複合体形成の程度を示す出力信号を継続的に測定し、 そして、（ｉ）複合体の解離または（ｉｉ）複合体の形成をそれぞれ示す出力信
号の変化が起こる条件を記録することかなる。
【０００８】 ＤＮＡの二本鎖は多くの手法で変性可能である。採用される最も一般的な方法
は、ｐＨを上げるか、温度を上昇させることである。従って、定常的に制御され
た温度上昇が、変性“圧力”を二本鎖に付与するのに使用され、適合した二本鎖
および不適合の二本鎖が変性するポイントが調べられる。別法として、定常的に
制御されたｐＨ上昇を用いることもできる。さらに、本発明の原理は、ＤＮＡの
“マイクロチップ”フォーマット（平面上にサブｍｍスケールのアッセイ領域を
有し、電気チップへの取付け用ポテンシャル付き）の使用を許す。この場合、Ｄ
ＮＡの鎖（負の電荷も）を表面から押し出すのに、増大する負の電荷（電荷反発
）が利用できる可能性を開く。二本鎖の一方が面結合（surface bound）である
場合、このことはｐＨおよび温度に関してＤＮＡを変性させる傾向にある。
は、ｐＨを上げるか、温度を上昇させることである。従って、定常的に制御され
た温度上昇が、変性“圧力”を二本鎖に付与するのに使用され、適合した二本鎖
および不適合の二本鎖が変性するポイントが調べられる。別法として、定常的に
制御されたｐＨ上昇を用いることもできる。さらに、本発明の原理は、ＤＮＡの
“マイクロチップ”フォーマット（平面上にサブｍｍスケールのアッセイ領域を
有し、電気チップへの取付け用ポテンシャル付き）の使用を許す。この場合、Ｄ
ＮＡの鎖（負の電荷も）を表面から押し出すのに、増大する負の電荷（電荷反発
）が利用できる可能性を開く。二本鎖の一方が面結合（surface bound）である
場合、このことはｐＨおよび温度に関してＤＮＡを変性させる傾向にある。
【０００９】 どちらかの信号検出方法を選択するために、プローブと標的ＤＮＡの二本鎖の
変性（またはハイブリダイゼーション）を検出するための根拠として、二本鎖Ｄ
ＮＡおよび一本鎖ＤＮＡに対して異なった信号を与える任意のシステムを利用す
ることができる。二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡとの最もよく知られている物理化
学的相違は、これらの分子種によって生じる紫外線吸収スペクトルである。この
パラメータを利用するために装置が考案できる。
変性（またはハイブリダイゼーション）を検出するための根拠として、二本鎖Ｄ
ＮＡおよび一本鎖ＤＮＡに対して異なった信号を与える任意のシステムを利用す
ることができる。二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡとの最もよく知られている物理化
学的相違は、これらの分子種によって生じる紫外線吸収スペクトルである。この
パラメータを利用するために装置が考案できる。
【００１０】 上述した方法で用いられる好ましいマーカーは、蛍光性に基づくものである。
蛍光マーカーを使用する場合、本発明のＤＮＡ変異検出方法は、 （ａ）変異の遺伝子座を含むＤＮＡ塩基配列の一本鎖 （ｂ）変異の１つの対立遺伝子に対して特異的であり、上記一本鎖（ａ）と交
雑して二本鎖を形成するオリゴヌクレオチドのプローブ （ｃ）上記の一本鎖（ａ）とプローブ（ｂ）と形成される二本鎖に対して特異
的であり、二本鎖ＤＮＡに結びつくか、二本鎖ＤＮＡ内での相互作用した際に蛍
光を発するマーカー から成る複合体を形成させ、 複合体を含有する環境の温度を定常的に上昇させながら、発生する蛍光を連続的
に測定し、複合体の解離によって生起し、従って、プローブ（ｂ）が一本鎖（ａ
）に交雑した強さと相関関係を持つところの、蛍光の減少が起きた温度（以下、
融解温度と称す）を記録することからなる。
蛍光マーカーを使用する場合、本発明のＤＮＡ変異検出方法は、 （ａ）変異の遺伝子座を含むＤＮＡ塩基配列の一本鎖 （ｂ）変異の１つの対立遺伝子に対して特異的であり、上記一本鎖（ａ）と交
雑して二本鎖を形成するオリゴヌクレオチドのプローブ （ｃ）上記の一本鎖（ａ）とプローブ（ｂ）と形成される二本鎖に対して特異
的であり、二本鎖ＤＮＡに結びつくか、二本鎖ＤＮＡ内での相互作用した際に蛍
光を発するマーカー から成る複合体を形成させ、 複合体を含有する環境の温度を定常的に上昇させながら、発生する蛍光を連続的
に測定し、複合体の解離によって生起し、従って、プローブ（ｂ）が一本鎖（ａ
）に交雑した強さと相関関係を持つところの、蛍光の減少が起きた温度（以下、
融解温度と称す）を記録することからなる。
【００１１】 この方法を実行する場合、変異の異なる対立遺伝子に対して特異的なプローブ
をそれぞれ有する２つ又はそれ以上の一連の複合体を形成し、変異の対立遺伝子
がそれぞれ区別でき、好適にはホモ接合状態かヘテロ接合状態かが識別できるよ
うに、それぞれの複合体の転移点を観察するのが通例である。蛍光発光を利用す
る場合、出力信号曲線（蛍光測定）の負又正の第１又は第２微分係数（微分）を
参照して、融解温度は通常決定される。
をそれぞれ有する２つ又はそれ以上の一連の複合体を形成し、変異の対立遺伝子
がそれぞれ区別でき、好適にはホモ接合状態かヘテロ接合状態かが識別できるよ
うに、それぞれの複合体の転移点を観察するのが通例である。蛍光発光を利用す
る場合、出力信号曲線（蛍光測定）の負又正の第１又は第２微分係数（微分）を
参照して、融解温度は通常決定される。
【００１２】 本発明の方法は、支持材に取り付けられた一本鎖ＤＮＡにて実施されるのが有
利であって、さらに好ましくは、ビオチン／ストレプタビジン型（biotin/strep
tavidin type）相互作用にて実施される。一本鎖は、標的塩基配列をＰＣＲ増幅
した二本鎖ＤＮＡ生成物から導かれる。培養ウイルス性ゲノム、精製したクロー
ンＤＮＡなどのような複雑性の低い配列は、トレプタビジンなどで末端標識する
ことができ、特別な増幅なしで利用できる。長さで１００塩基対以上の、好まし
くは４０〜１００塩基対のＰＣＲ産物を検出の対象とすることが望ましい。複合
体は適当な緩衝液中において、一本鎖にプローブとマーカーを添加することで形
成することができる。
利であって、さらに好ましくは、ビオチン／ストレプタビジン型（biotin/strep
tavidin type）相互作用にて実施される。一本鎖は、標的塩基配列をＰＣＲ増幅
した二本鎖ＤＮＡ生成物から導かれる。培養ウイルス性ゲノム、精製したクロー
ンＤＮＡなどのような複雑性の低い配列は、トレプタビジンなどで末端標識する
ことができ、特別な増幅なしで利用できる。長さで１００塩基対以上の、好まし
くは４０〜１００塩基対のＰＣＲ産物を検出の対象とすることが望ましい。複合
体は適当な緩衝液中において、一本鎖にプローブとマーカーを添加することで形
成することができる。
【００１３】 上述したように、表面に拘束された標的ＤＮＡにてアッセイが実行される。し
かし、本発明は如何なる一形式に限定されるものではない。標的（ターゲット）
とプローブの両方が遊離液中にあっても差し支えない。また、上記の両者をある
割り当て領域に局在させることもできる。本発明の方法は、２つの種の間に二本
鎖を形成することを含むので、両方が局在しない場合、あるいは、いずれか一方
が局在する場合には、分子を結合させる拡散に頼るしかない。しかし、種を相互
に極めて近接して局在させた場合（たとえば、両者を表面に、または、両方を末
端部に接合させる）には、二本鎖の形成効率を向上させることができる。このこ
とはアッセイの基礎に変性を使用せずに、ハイブリダイゼーションを使用する場
合に特に重要である。また、これは変性に基づくフォーマットについて、初期の
ハイブリダイゼーション速度を高める。我々は、これを直接的に連鎖した標的配
列とプローブ配列ついて、すなわち、一方が他方の末端に連結した連鎖について
、両者間の無関係なＤＮＡの“スタッファー”配列と共に、適用して“ヒンジ”
を構成させた。
かし、本発明は如何なる一形式に限定されるものではない。標的（ターゲット）
とプローブの両方が遊離液中にあっても差し支えない。また、上記の両者をある
割り当て領域に局在させることもできる。本発明の方法は、２つの種の間に二本
鎖を形成することを含むので、両方が局在しない場合、あるいは、いずれか一方
が局在する場合には、分子を結合させる拡散に頼るしかない。しかし、種を相互
に極めて近接して局在させた場合（たとえば、両者を表面に、または、両方を末
端部に接合させる）には、二本鎖の形成効率を向上させることができる。このこ
とはアッセイの基礎に変性を使用せずに、ハイブリダイゼーションを使用する場
合に特に重要である。また、これは変性に基づくフォーマットについて、初期の
ハイブリダイゼーション速度を高める。我々は、これを直接的に連鎖した標的配
列とプローブ配列ついて、すなわち、一方が他方の末端に連結した連鎖について
、両者間の無関係なＤＮＡの“スタッファー”配列と共に、適用して“ヒンジ”
を構成させた。
【００１４】 本発明の方法は、単一のオリゴヌクレオチドプローブの使用に限定されるもの
ではない。標的ＤＮＡ配列に沿って順次アニール化される付加的なプローブを使
用することができる。これらの付加的なプローブは、直接連続して、換言すれば
、隙間なく配置される場合もあるし、そうでない場合もある。連続して配置され
たプローブは、十分確立された現象である“塩基積み上げ（base stacking）”
の化学作用で、相互に安定化する。また、隣接するプローブ間に直接物理結合を
構成することもできる。これらの余剰プローブから生じた余剰の二本鎖ＤＮＡは
、アッセイの信号レベルを高める。
ではない。標的ＤＮＡ配列に沿って順次アニール化される付加的なプローブを使
用することができる。これらの付加的なプローブは、直接連続して、換言すれば
、隙間なく配置される場合もあるし、そうでない場合もある。連続して配置され
たプローブは、十分確立された現象である“塩基積み上げ（base stacking）”
の化学作用で、相互に安定化する。また、隣接するプローブ間に直接物理結合を
構成することもできる。これらの余剰プローブから生じた余剰の二本鎖ＤＮＡは
、アッセイの信号レベルを高める。
【００１５】１. 方法の原理 動的対立遺伝子特殊ハイブリダイゼーション（Dynamic Allele Specific Hybr
idization: DASH）と名付けられるた本発明の方法は、ＤＮＡ塩基配列における
単一ヌクレオチドの相違を検出して評価する技術である。このアッセイでは、二
本鎖ＤＮＡ（例えば、ＰＣＲ生成物）の一方の鎖が、固体表面に拘束され、他方
の鎖は除去される。変異の１つのバージョン（対立遺伝子）に対して特異的なオ
リゴヌクレオチドプローブが、拘束された一本鎖に交雑せしめられる。次に、二
本鎖ＤＮＡ（すなわち、ＤＮＡサンプルに交雑せしめられたオリゴヌクレオチド
プローブ）の存在下で特に蛍光を発する挿入染色（intercalating dye）を添加
する。反応物をある温度範囲内において一定速度で加熱し、蛍光を連続的に測定
する。温度が上昇するにつれ、オリゴヌクレオチドプローブが標的ＤＮＡから解
離する温度に達するまで、蛍光は徐々に減少する。この温度は融解温度、すなわ
ち、Ｔｍとして知られている。この温度において、蛍光発行が急激に減少する。
idization: DASH）と名付けられるた本発明の方法は、ＤＮＡ塩基配列における
単一ヌクレオチドの相違を検出して評価する技術である。このアッセイでは、二
本鎖ＤＮＡ（例えば、ＰＣＲ生成物）の一方の鎖が、固体表面に拘束され、他方
の鎖は除去される。変異の１つのバージョン（対立遺伝子）に対して特異的なオ
リゴヌクレオチドプローブが、拘束された一本鎖に交雑せしめられる。次に、二
本鎖ＤＮＡ（すなわち、ＤＮＡサンプルに交雑せしめられたオリゴヌクレオチド
プローブ）の存在下で特に蛍光を発する挿入染色（intercalating dye）を添加
する。反応物をある温度範囲内において一定速度で加熱し、蛍光を連続的に測定
する。温度が上昇するにつれ、オリゴヌクレオチドプローブが標的ＤＮＡから解
離する温度に達するまで、蛍光は徐々に減少する。この温度は融解温度、すなわ
ち、Ｔｍとして知られている。この温度において、蛍光発行が急激に減少する。
【００１６】 ＤＮＡ変異は、２つ又はそれ以上の対立遺伝子を有する。所与のＤＮＡサンプ
ルにどの対立遺伝子が存在するかを決定するために、変異の各バージョン用に対
して特異的なプローブが、ＤＮＡサンプルに対して検定（アッセイ）される。２
つのプロービングから得られた蛍光データの第１微分係数を比較することにより
、ＤＮＡサンプル中に、一方の又は両方の対立遺伝子が存在するかどうかを決定
することができる。
ルにどの対立遺伝子が存在するかを決定するために、変異の各バージョン用に対
して特異的なプローブが、ＤＮＡサンプルに対して検定（アッセイ）される。２
つのプロービングから得られた蛍光データの第１微分係数を比較することにより
、ＤＮＡサンプル中に、一方の又は両方の対立遺伝子が存在するかどうかを決定
することができる。
【００１７】２. 方法論 概要として、本方法は以下の工程からなる： １． テストＤＮＡ塩基配列のＰＣＲ増幅 ２． ＰＣＲ生成物の一本鎖の面への結合 ３． 未結合（unbound）ＤＮＡおよびＰＣＲ成分の溶出 ４． ｐＨの中和 ５． 対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成 ６． 過剰な対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの除去 ７． 加熱状態での蛍光の検出 (７ａ. 別の対立遺伝子プローブについての工程４〜７の反復) ８． 蛍光出力の分析
【００１８】２.１. ＰＣＲ増幅 ゲノムＤＮＡを試験するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて既
知の変異を含むＤＮＡセグメントを増幅させる。理想的な条件には、１８〜３０
ヌクレオチドの長いプライマーで短いＰＣＲセグメント（４０〜１００ｂｐ）を
増幅させることが含まれる。１個のプライマーは、後の工程で固体表面に拘束で
きるように、５’末端でビオチニル化（biotinylated）されている。タックゴー
ルド（Taq Gold）またはその他の“ホットスタート”型のＰＣＲ条件は、可能な
かぎりプライマー２量体のアーチファクトを制限するために使用される。有効な
ＰＣＲ緩衝条件は次のとおりであって、特定なＤＮＡ断片に適したサイクル時間
およびサイクル個数で採用される。 プライマー１（非ビオチニル化） １００ｎｇ プライマー２（ビオチニル化） ５０ｎｇ ＤＭＳＯ ５％ ヌクレオチド ｄＮＴＰにつき５．０ナノモル ＰＣＲ緩衝 ｌｘまで 酵素（タックゴールドなど） ０．７５ユニット 総水量 ２５μｌ
知の変異を含むＤＮＡセグメントを増幅させる。理想的な条件には、１８〜３０
ヌクレオチドの長いプライマーで短いＰＣＲセグメント（４０〜１００ｂｐ）を
増幅させることが含まれる。１個のプライマーは、後の工程で固体表面に拘束で
きるように、５’末端でビオチニル化（biotinylated）されている。タックゴー
ルド（Taq Gold）またはその他の“ホットスタート”型のＰＣＲ条件は、可能な
かぎりプライマー２量体のアーチファクトを制限するために使用される。有効な
ＰＣＲ緩衝条件は次のとおりであって、特定なＤＮＡ断片に適したサイクル時間
およびサイクル個数で採用される。 プライマー１（非ビオチニル化） １００ｎｇ プライマー２（ビオチニル化） ５０ｎｇ ＤＭＳＯ ５％ ヌクレオチド ｄＮＴＰにつき５．０ナノモル ＰＣＲ緩衝 ｌｘまで 酵素（タックゴールドなど） ０．７５ユニット 総水量 ２５μｌ
【００１９】 （固体表面上の結合サイトを競う）組み込まれていないビオチニル化プライマ
ーの量を制限するためには、２０ｎｇのビオチニル化プライマーで十分であると
定めた。１００ｎｇの非ビオチニル化プライマーにつき２０ｎｇのビオチニル化
プライマーの割合で、ＰＣＲ生成物の形成はなお有効であり、ビオチニル化プラ
イマーの濃度が低下すると、固体表面に結合する時のストレプタビジンサイトに
対する競合が減少する。
ーの量を制限するためには、２０ｎｇのビオチニル化プライマーで十分であると
定めた。１００ｎｇの非ビオチニル化プライマーにつき２０ｎｇのビオチニル化
プライマーの割合で、ＰＣＲ生成物の形成はなお有効であり、ビオチニル化プラ
イマーの濃度が低下すると、固体表面に結合する時のストレプタビジンサイトに
対する競合が減少する。
【００２０】 より長さの長いＰＣＲ生成物（１００塩基対以上）でも構わないが、斟酌すべ
き事柄がある。長いＰＣＲ生成物の場合、末端で運動が低下するので、変異はビ
オチニル化プライマーの方に位置させるべきである。二次構造はプローブの結合
を効果的に阻害するので、これは避けるべきである。さらに、長いＰＣＲ生成物
のプレート（plate）への結合効率が減じるが、これはおそらく分子拡散の運動
速度が遅いことだけでなく、二次構造の複雑性と関係しているものと推測される
。
き事柄がある。長いＰＣＲ生成物の場合、末端で運動が低下するので、変異はビ
オチニル化プライマーの方に位置させるべきである。二次構造はプローブの結合
を効果的に阻害するので、これは避けるべきである。さらに、長いＰＣＲ生成物
のプレート（plate）への結合効率が減じるが、これはおそらく分子拡散の運動
速度が遅いことだけでなく、二次構造の複雑性と関係しているものと推測される
。
【００２１】 長さの短いＰＣＲ生成物（４０〜１００塩基対）が、いくつかの理由から好ま
しい。プライマー２量体のアーチフェクトは、短いＰＣＲ生成物で少なくなる。
加えて、短い生成物を増幅した場合に、ＰＣＲの全体効率がしばしば優れたもの
になる。固体表面への結合能力が十分に増加した場合、ＤＡＳＨ検定（アッセイ
）への複合ＰＣＲの利用が検討できる。短いＰＣＲは、複合ＰＣＲの効率だけで
なく、表面への結合にも寄与する。
しい。プライマー２量体のアーチフェクトは、短いＰＣＲ生成物で少なくなる。
加えて、短い生成物を増幅した場合に、ＰＣＲの全体効率がしばしば優れたもの
になる。固体表面への結合能力が十分に増加した場合、ＤＡＳＨ検定（アッセイ
）への複合ＰＣＲの利用が検討できる。短いＰＣＲは、複合ＰＣＲの効率だけで
なく、表面への結合にも寄与する。
【００２２】２.２. ＰＣＲ生成物の一本鎖の固体表面への結合 ここで使用した結合面フォーマットは、ストレプタビジン(さまざまな製造業
者から入手可能)でコートされた９６ウェルマイクロタイタプレート（96 well m
icrotitre plate）である。室温において、１個のＰＣＲからの全量（２５μｌ
）を、２５μｌの緩衝液Ｉ（緩衝液に関する２.２.１〜２.２.３の項参照）と共
に、ストレプタビジン被膜したプレートのウェル(くぼみ)内に収める。ＰＣＲ生
成物は、プレートに塗布したストレプタビジンに結合するＰＣＲ生成物上のビオ
チン標識を介してプレートに物理的に結合する。これを任意の場所で５分〜２４
時間放置して結合を進行させる。結合は、１時間以内に９０％完了するので、通
常、３０分〜２時間で最大効率に達する。典型的には、最大効率においてＰＣＲ
生成物の２０％未満がプレートと結合する。結合溶液を取り除いて第２のウェル
に移すことにより、第２のウェルを満たすことができる。
者から入手可能)でコートされた９６ウェルマイクロタイタプレート（96 well m
icrotitre plate）である。室温において、１個のＰＣＲからの全量（２５μｌ
）を、２５μｌの緩衝液Ｉ（緩衝液に関する２.２.１〜２.２.３の項参照）と共
に、ストレプタビジン被膜したプレートのウェル(くぼみ)内に収める。ＰＣＲ生
成物は、プレートに塗布したストレプタビジンに結合するＰＣＲ生成物上のビオ
チン標識を介してプレートに物理的に結合する。これを任意の場所で５分〜２４
時間放置して結合を進行させる。結合は、１時間以内に９０％完了するので、通
常、３０分〜２時間で最大効率に達する。典型的には、最大効率においてＰＣＲ
生成物の２０％未満がプレートと結合する。結合溶液を取り除いて第２のウェル
に移すことにより、第２のウェルを満たすことができる。
【００２３】 この工程においても、またこれに続く工程においても大切なことは、反応チュ
ーブ（マイクロタイタプレートのウェル）内に気泡が存在しないことである。気
泡はマイクロタイタプレート表面と溶液間の反応を阻害するので、各インキュベ
ーションの前に除去すべきである。気泡の除去は、ピペットチップまたはウェル
を指で軽くたたいて行うことができる。さらに、工程と工程の間で、反応チュー
ブからなるべく溶液を除去することも必要である。次の工程に入る前に、ウェル
の底に溶液が視認できなくなることで、反応チューブは“空”の状態になったと
認められる。
ーブ（マイクロタイタプレートのウェル）内に気泡が存在しないことである。気
泡はマイクロタイタプレート表面と溶液間の反応を阻害するので、各インキュベ
ーションの前に除去すべきである。気泡の除去は、ピペットチップまたはウェル
を指で軽くたたいて行うことができる。さらに、工程と工程の間で、反応チュー
ブからなるべく溶液を除去することも必要である。次の工程に入る前に、ウェル
の底に溶液が視認できなくなることで、反応チューブは“空”の状態になったと
認められる。
【００２４】２.２.１ ヘペス緩衝液（緩衝液Ｉ） 緩衝液Ｉは、ヘペス １００ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、ＥＤＴＡ １０ｍＭか
らなり、ｐＨは７である。この緩衝液を選択したことには重大な理由がある。当
該緩衝液は、Ｇ＋Ｃの含有量に関係なく、オリゴヌクレオチドの長さに基づいて
Ｔｍｓ（融解温度）を劇的に標定化させ、標準化させるからである。例えば、図
７.１.４.に示すデータを参照されたい。多くのその他の緩衝液も、対立遺伝子
の十分な識別を可能にしているが、観察された絶対的Ｔｍは、Ｇ＋Ｃの含有量に
応じて大きく変化する。
らなり、ｐＨは７である。この緩衝液を選択したことには重大な理由がある。当
該緩衝液は、Ｇ＋Ｃの含有量に関係なく、オリゴヌクレオチドの長さに基づいて
Ｔｍｓ（融解温度）を劇的に標定化させ、標準化させるからである。例えば、図
７.１.４.に示すデータを参照されたい。多くのその他の緩衝液も、対立遺伝子
の十分な識別を可能にしているが、観察された絶対的Ｔｍは、Ｇ＋Ｃの含有量に
応じて大きく変化する。
【００２５】２.２.２. その他の緩衝液およびｐＨ ＳＳＰＥ、ＳＳＣ、ＴＥＮ、ＴＥＳ、ＭＥＳおよびリン酸緩衝液が試され、全
ての実験の完全性を維持した。緩衝液を変えると、オリゴヌクレオチド／標的Ｄ
ＮＡの二本鎖で観察されるＴｍｓが変化した。ＤＮＡ標的に適合したオリゴプロ
ーブのＴｍと、標的に交雑して不適合のオリゴ体のＴｍとの関係は、８〜１０℃
で一定してほとんど変化がなかった。上記の緩衝液のｐＨは６.０〜９.８の範囲
に維持した。この範囲のｐＨによる顕著な影響は見られなかった。ｐＨが６.０
以下では、分析されたＤＮＡは退化の傾向にあり、ｐＨが１０およびそれ以上で
は、Ｔｍが室温近くまで低下し、効率的な蛍光測定が妨げられた。
ての実験の完全性を維持した。緩衝液を変えると、オリゴヌクレオチド／標的Ｄ
ＮＡの二本鎖で観察されるＴｍｓが変化した。ＤＮＡ標的に適合したオリゴプロ
ーブのＴｍと、標的に交雑して不適合のオリゴ体のＴｍとの関係は、８〜１０℃
で一定してほとんど変化がなかった。上記の緩衝液のｐＨは６.０〜９.８の範囲
に維持した。この範囲のｐＨによる顕著な影響は見られなかった。ｐＨが６.０
以下では、分析されたＤＮＡは退化の傾向にあり、ｐＨが１０およびそれ以上で
は、Ｔｍが室温近くまで低下し、効率的な蛍光測定が妨げられた。
【００２６】 ２.２.３. 緩衝液／塩化ナトリウム濃度 上記の緩衝液に関し、緩衝液とＮａＣｌの濃度（１ｍＭ〜４００ｍＭ）の範囲
を試験した。塩化ナトリウムの濃度が低いと、緩衝液の濃度が増加するにつれ、
観察されたＴｍは低下した。例えば、ＮａＣｌが０.０Ｍで、濃度が１、１０、
４０、１００ｍＭのヘペス緩衝液では、Ｔｍ値が１回の実験中それぞれ８８℃、
８４℃、７８℃、７２℃と低下した。
を試験した。塩化ナトリウムの濃度が低いと、緩衝液の濃度が増加するにつれ、
観察されたＴｍは低下した。例えば、ＮａＣｌが０.０Ｍで、濃度が１、１０、
４０、１００ｍＭのヘペス緩衝液では、Ｔｍ値が１回の実験中それぞれ８８℃、
８４℃、７８℃、７２℃と低下した。
【００２７】 ＮａＣｌ濃度が１０ｍＭを超えると、緩衝液の濃度よりも、塩化ナトリウムの
濃度が、Ｔｍ値に影響を及ぼす主な要因となる。緩衝液の濃度同様、ＮａＣｌ濃
度が上昇すると、Ｔｍ値が低下する傾向がある。ＮａＣｌ濃度を１ｍＭ〜８００
ｍＭの範囲で試験した。濃度が２００ｍＭを超えると、データの評価が困難にな
る（曲線がランダムな変動を示す）。
濃度が、Ｔｍ値に影響を及ぼす主な要因となる。緩衝液の濃度同様、ＮａＣｌ濃
度が上昇すると、Ｔｍ値が低下する傾向がある。ＮａＣｌ濃度を１ｍＭ〜８００
ｍＭの範囲で試験した。濃度が２００ｍＭを超えると、データの評価が困難にな
る（曲線がランダムな変動を示す）。
【００２８】２.２.４. プラスチック製品 採用したマイクロタイタプレートおよびチューブは、蛍光発光しないプラスチ
ック製であることが必要で、これにより検定から付加的なバックグラウンドを排
除することができる。マイクロタイタプレートおよびチューブは、チューブの外
から検出されるいかなる蛍光も排除するために、艶消し加工（frosted）される
。従って、プレートもカップも実質的に実験のバックグラウンド対象ではない。
殆どすべてのバックグラウンド蛍光は、物理的装置（励起／検出装置）によって
斟酌される。
ック製であることが必要で、これにより検定から付加的なバックグラウンドを排
除することができる。マイクロタイタプレートおよびチューブは、チューブの外
から検出されるいかなる蛍光も排除するために、艶消し加工（frosted）される
。従って、プレートもカップも実質的に実験のバックグラウンド対象ではない。
殆どすべてのバックグラウンド蛍光は、物理的装置（励起／検出装置）によって
斟酌される。
【００２９】２.３. ＰＣＲ生成物の第２の鎖の溶出 ひとたびＰＣＲ生成物がプレートに結合すると、非結合ＰＣＲ試薬は吸引除去
され、５０μｌのＮａＯＨ溶液が添加される。こうしてＰＣＲ生成物を変性させ
、ビオチン／ストレプタビジンの相互作用によりプレートに結合された一本鎖Ｄ
ＮＡが残る。二本鎖ＰＣＲ生成物を確かに変性させるのに必要なＮａＯＨの最小
濃度は、０．０５Ｍであるが、０．１Ｍは濃度の不正確さに対するゆとりであっ
て、爾後の反応を邪魔することはない。０．１ＭのＮａＯＨ中でＰＣＲ生成物を
完全変性するには、０．５〜５．０分を要した。これ以上の長時間は有害ではな
いが、不必要である。残余の全てのＰＣＲ成分（組み込まれていないプライマー
、ヌクレオチド、酵素など）を、非ビオチニル生成物の鎖と共に除去するために
、溶出液を吸引した。
され、５０μｌのＮａＯＨ溶液が添加される。こうしてＰＣＲ生成物を変性させ
、ビオチン／ストレプタビジンの相互作用によりプレートに結合された一本鎖Ｄ
ＮＡが残る。二本鎖ＰＣＲ生成物を確かに変性させるのに必要なＮａＯＨの最小
濃度は、０．０５Ｍであるが、０．１Ｍは濃度の不正確さに対するゆとりであっ
て、爾後の反応を邪魔することはない。０．１ＭのＮａＯＨ中でＰＣＲ生成物を
完全変性するには、０．５〜５．０分を要した。これ以上の長時間は有害ではな
いが、不必要である。残余の全てのＰＣＲ成分（組み込まれていないプライマー
、ヌクレオチド、酵素など）を、非ビオチニル生成物の鎖と共に除去するために
、溶出液を吸引した。
【００３０】２.４. ｐＨの中和 二本鎖ＤＮＡに特異な蛍光色素を含む緩衝液Ｉの溶液を調製する。ここでは“
ＳＹＢＲ グリーンＩ”色素を用いる。ＤＡＳＨアッセイにおける当該色素の最
適濃度は、１：１０，０００である。色素濃度の微細な変動は結果に影響しない
。しかし、ＳＹＢＲグリーンＩ色素の特性に関し、注意すべきことがある（２.
７.２.、３.１.、３.２.参照）。５０μｌの緩衝液Ｉ／色素溶液を反応チューブ
に添加する。この緩衝液は、残存ＮａＯＨを中和すると共に、次の工程でのハイ
ブリッド形成の緩衝に寄与する。供試ＤＮＡ分子での二次構造の形成を最小限に
するために、次工程に進むまでの時間遅延は最小にすべきである。
ＳＹＢＲ グリーンＩ”色素を用いる。ＤＡＳＨアッセイにおける当該色素の最
適濃度は、１：１０，０００である。色素濃度の微細な変動は結果に影響しない
。しかし、ＳＹＢＲグリーンＩ色素の特性に関し、注意すべきことがある（２.
７.２.、３.１.、３.２.参照）。５０μｌの緩衝液Ｉ／色素溶液を反応チューブ
に添加する。この緩衝液は、残存ＮａＯＨを中和すると共に、次の工程でのハイ
ブリッド形成の緩衝に寄与する。供試ＤＮＡ分子での二次構造の形成を最小限に
するために、次工程に進むまでの時間遅延は最小にすべきである。
【００３１】２.５. 対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブのハイブリッド形成 ＳＹＢＲグリーンＩ色素は、オリゴヌクレオチドプローブと供試ＤＮＡとの相
互作用を安定させるので、最終工程のハイブリッド形成溶液に含有させる。３０
ｐｍｏｌｓ（１μｌ容積中）のオリゴヌクレオチドプローブが、反応チューブに
添加される。、プローブは、中和緩衝液としても加えることができる。当該量の
プローブによりハイブリッド形成が数秒以内に完了し、従って、この工程では実
際上インキュベーション時間を必要としない。加熱工程および冷却工程を実施（
５０℃より高温に加熱し、１５分以上をかけて室温まで徐々に冷却する）し、非
結合のプローブをウェルから洗い流し、５０μｌの緩衝液Ｉ／色素の溶液を再充
填することにより、最適結果が得られる。プローブの量を少なくすると、インキ
ュベーション期間を長くする必要があるが、高濃度にしてもアニーリングに要す
る時間は短くはならない。プローブの詳細については、２.５.１.を参照された
い。
互作用を安定させるので、最終工程のハイブリッド形成溶液に含有させる。３０
ｐｍｏｌｓ（１μｌ容積中）のオリゴヌクレオチドプローブが、反応チューブに
添加される。、プローブは、中和緩衝液としても加えることができる。当該量の
プローブによりハイブリッド形成が数秒以内に完了し、従って、この工程では実
際上インキュベーション時間を必要としない。加熱工程および冷却工程を実施（
５０℃より高温に加熱し、１５分以上をかけて室温まで徐々に冷却する）し、非
結合のプローブをウェルから洗い流し、５０μｌの緩衝液Ｉ／色素の溶液を再充
填することにより、最適結果が得られる。プローブの量を少なくすると、インキ
ュベーション期間を長くする必要があるが、高濃度にしてもアニーリングに要す
る時間は短くはならない。プローブの詳細については、２.５.１.を参照された
い。
【００３２】２.５.１. プローブの設計と利用 ３つの異なる変異座について、１３〜２５塩基対長さのプローブを試験した。
これらの全ての長さで対立遺伝子の識別が可能であるが、最適なプローブ長さは
、１５塩基対である。１３ｍｅｒのプローブは室温付近の温度で変性したが、本
技術では理想的でないと判断した。２５ｍｅｒのプローブは高輝度の蛍光（蛍光
性は二本鎖ＤＮＡ長さの関数）を発したが、対立遺伝子の識別は最小であった。
１５ｍｅｒのプローブは十分な蛍光輝度を有し、対立遺伝子の間で高い識別性を
示した。
これらの全ての長さで対立遺伝子の識別が可能であるが、最適なプローブ長さは
、１５塩基対である。１３ｍｅｒのプローブは室温付近の温度で変性したが、本
技術では理想的でないと判断した。２５ｍｅｒのプローブは高輝度の蛍光（蛍光
性は二本鎖ＤＮＡ長さの関数）を発したが、対立遺伝子の識別は最小であった。
１５ｍｅｒのプローブは十分な蛍光輝度を有し、対立遺伝子の間で高い識別性を
示した。
【００３３】 ハイブリッド形成したプローブにおける変異の位置も調査された。１５ｍｅｒ
のプローブでは、変異位置がプローブの中心から３番目（in the central third
）に位置した時に最良の識別が得られることが分かった。単一の塩基変異におい
ては、変異位置は中央にあるのが最良である。変異位置が中心から２塩基分移動
すると、検定の識別性が低下する。
のプローブでは、変異位置がプローブの中心から３番目（in the central third
）に位置した時に最良の識別が得られることが分かった。単一の塩基変異におい
ては、変異位置は中央にあるのが最良である。変異位置が中心から２塩基分移動
すると、検定の識別性が低下する。
【００３４】 固体サポート上でプローブをＤＮＡ標的に素早くハイブリッド形成させるため
には、３０ｐｍｏｌｓが有効であるが判明した。この場合、蛍光の検出前にプロ
ーブを削除することが必要である。ハイブリッド形成にごく少量のプローブ（１
〜５ｐｍｏｌ）を使用し、余剰プローブを除去せずにその後の工程を実施する別
法も試験した。対立遺伝子の識別は可能であったが、蛍光値が低く、結果も大き
くばらついた。プレートへの結合能力がより高い場合、検定に要する工程数を減
らす上でこの方向は有効かもしれない。
には、３０ｐｍｏｌｓが有効であるが判明した。この場合、蛍光の検出前にプロ
ーブを削除することが必要である。ハイブリッド形成にごく少量のプローブ（１
〜５ｐｍｏｌ）を使用し、余剰プローブを除去せずにその後の工程を実施する別
法も試験した。対立遺伝子の識別は可能であったが、蛍光値が低く、結果も大き
くばらついた。プレートへの結合能力がより高い場合、検定に要する工程数を減
らす上でこの方向は有効かもしれない。
【００３５】２.６. 余剰プローブの削除 ハイブリッド形成していないプローブ分子を除去するために、バイブリッド形
成溶液は吸引され、５０μｌの緩衝液Ｉ／色素が加えられる。そして、実験は加
熱および蛍光検出段階へと進む。
成溶液は吸引され、５０μｌの緩衝液Ｉ／色素が加えられる。そして、実験は加
熱および蛍光検出段階へと進む。
【００３６】２.７. 蛍光検出および加熱方式 マイクロタイタプレートを加熱／検出装置内に設置する。融解温度プロフィー
ルを作成するのに必要とされるような、温度変調と蛍光検出を同時に行える装置
は、幾つか存在する。これらの装置には、対立遺伝子の自動評価を行うために特
に作成されたハイベイド（Hybaid）からの“ＤＡＳＨマシン”と、本明細書に掲
載したデータの作成に使用されたパーキンエルマー７７００（タックマン：Taqm
an）装置が含まれる。蛍光を継続的に監視しながら、サンプルプレートを〜２５
℃から〜９０℃に加熱する。大部分のサンプルは６５℃±１０℃で変性する。加
熱速度（昇温速度）が少なくとも０．０１〜１．０℃／１秒の範囲で変化しても
、対立遺伝子の識別を殆ど損なわない。通常、０．１℃／１秒で検定を行った。
タックマン装置のハードウエアに関する詳細は、２.７.１.を参照されたい。
ルを作成するのに必要とされるような、温度変調と蛍光検出を同時に行える装置
は、幾つか存在する。これらの装置には、対立遺伝子の自動評価を行うために特
に作成されたハイベイド（Hybaid）からの“ＤＡＳＨマシン”と、本明細書に掲
載したデータの作成に使用されたパーキンエルマー７７００（タックマン：Taqm
an）装置が含まれる。蛍光を継続的に監視しながら、サンプルプレートを〜２５
℃から〜９０℃に加熱する。大部分のサンプルは６５℃±１０℃で変性する。加
熱速度（昇温速度）が少なくとも０．０１〜１．０℃／１秒の範囲で変化しても
、対立遺伝子の識別を殆ど損なわない。通常、０．１℃／１秒で検定を行った。
タックマン装置のハードウエアに関する詳細は、２.７.１.を参照されたい。
【００３７】２.７.１. パーキンエルマー７７００（タックマン）配列検出器 検出装置は、二本鎖ＤＮＡ特異的蛍光色素が発する発光分光を検出し、かつ、
蛍光のデータポイントが導き出された温度トラックを保持しなければならない。
励起光源周波数は、ＤＡＳＨ検定で使用された色素の要求と一致しなければなら
ない。例えば、４８８ｎｍ周波数近くで励起するＳＹＢＲグリーンＩ等の色素で
は、アルゴンレーザまたはハロゲンランプ（４８８ｎｍ周波数が濾波される）は
、色素分子を励起させるのに十分である。タックマン装置には、蛍光分子を励起
させるアルゴンレーザが装備される。フィルターを設けて、アルゴンレーザスペ
クトル中の波長４８８ｎｍ以外の他のずべての波長を除去する。
蛍光のデータポイントが導き出された温度トラックを保持しなければならない。
励起光源周波数は、ＤＡＳＨ検定で使用された色素の要求と一致しなければなら
ない。例えば、４８８ｎｍ周波数近くで励起するＳＹＢＲグリーンＩ等の色素で
は、アルゴンレーザまたはハロゲンランプ（４８８ｎｍ周波数が濾波される）は
、色素分子を励起させるのに十分である。タックマン装置には、蛍光分子を励起
させるアルゴンレーザが装備される。フィルターを設けて、アルゴンレーザスペ
クトル中の波長４８８ｎｍ以外の他のずべての波長を除去する。
【００３８】 タックマン装置のＣＣＤカメラは、５００〜６００ｎｍの周波数範囲を検出す
る。蛍光信号は５ｎｍの“ビン”に記録される。そして“ビン１”が５００〜５
０５ｎｍの蛍光データを収容する。目下の構成では、ＤＡＳＨ検定に利用した光
の周波数範囲はビン９（５４５〜５５０ｎｍ）であるが、このビンだけが有効と
いうわけではない。
る。蛍光信号は５ｎｍの“ビン”に記録される。そして“ビン１”が５００〜５
０５ｎｍの蛍光データを収容する。目下の構成では、ＤＡＳＨ検定に利用した光
の周波数範囲はビン９（５４５〜５５０ｎｍ）であるが、このビンだけが有効と
いうわけではない。
【００３９】２.７.２. 蛍光色素 採用する色素は、二本鎖ＤＮＡの存在下での蛍光が、これを含まない溶液中で
の蛍光に比較して、少なくとも１０倍以上であるという特異性を備えることが求
められる。ここでは、特異的な信号の増大が〜１０００倍である“ＳＹＢＲグリ
ーンＩ”色素が使用されている。
の蛍光に比較して、少なくとも１０倍以上であるという特異性を備えることが求
められる。ここでは、特異的な信号の増大が〜１０００倍である“ＳＹＢＲグリ
ーンＩ”色素が使用されている。
【００４０】 ＳＹＢＲグリーンＩ色素の最適濃度は、サンプル中に存在するＤＮＡの量に直
接依存する。これを“ＳＹＢＲグリーン効果”と名付ける。使用される色素の量
が、所与のＤＮＡ量に対する最適濃度より低い場合又は高い場合は、検定で観察
される全体としての蛍光が減少する。この検定における色素の最適希釈率は１：
１０，０００である。
接依存する。これを“ＳＹＢＲグリーン効果”と名付ける。使用される色素の量
が、所与のＤＮＡ量に対する最適濃度より低い場合又は高い場合は、検定で観察
される全体としての蛍光が減少する。この検定における色素の最適希釈率は１：
１０，０００である。
【００４１】 別の色素についても試験した結果、ビスタグリーン（アマーシャム：Amersham
）は、ＳＹＢＲグリーンＩとほぼ同一の特性を備え、ＤＡＳＨ検定に代替色素と
して利用可能である。アクリジニウムオレンジや臭化エチジウムなどのその他の
色素は、多くの蛍光バックグラウンドを与えるので、ＤＡＳＨ検定には適当でな
い。Ｙｏ−ＰｒｏＩやＴｏ−ＰｒｏＩなどのその他の色素は、タックマン装置で
の光源とフィルターとの組合せに適当なものがないため、検定していない。
）は、ＳＹＢＲグリーンＩとほぼ同一の特性を備え、ＤＡＳＨ検定に代替色素と
して利用可能である。アクリジニウムオレンジや臭化エチジウムなどのその他の
色素は、多くの蛍光バックグラウンドを与えるので、ＤＡＳＨ検定には適当でな
い。Ｙｏ−ＰｒｏＩやＴｏ−ＰｒｏＩなどのその他の色素は、タックマン装置で
の光源とフィルターとの組合せに適当なものがないため、検定していない。
【００４２】２.７.３. 検定溶液添加物 様々な添加物の検定への影響を見極めるため、いろいろな添加剤を検査した。
ホルムアミドのような一般的な不安定剤をスクリーニングしたところ、検定には
無益であると認められた。さらに、テトラメチル塩化アンモニウム（ＴＭＡＣ）
、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびデキストラン硫酸塩のようなハイブリッ
ド形成試薬を検査したところ、これらも検定に不規則性を生じさせることが判明
した。極微量のイオン性界面活性剤でさえ、蛍光信号を完全に破壊する。非イオ
ン性界面活性剤は、反応チューブに気泡を生成させる傾向があることを除いて、
否定的な影響を示さなかった。非イオン性界面活性剤を用いる場合には、ＤＡＳ
Ｈ検定におけるさまざまな工程で、反応チューブに気泡が残らないように細心の
注意を払う必要があった。ジメチルスルホキシドが、唯一の有益な添加剤である
ことが見出され、観察されたＴｍ値を低下させるために、このものは５０％また
はそれ以下の割合で添加することができる。
ホルムアミドのような一般的な不安定剤をスクリーニングしたところ、検定には
無益であると認められた。さらに、テトラメチル塩化アンモニウム（ＴＭＡＣ）
、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびデキストラン硫酸塩のようなハイブリッ
ド形成試薬を検査したところ、これらも検定に不規則性を生じさせることが判明
した。極微量のイオン性界面活性剤でさえ、蛍光信号を完全に破壊する。非イオ
ン性界面活性剤は、反応チューブに気泡を生成させる傾向があることを除いて、
否定的な影響を示さなかった。非イオン性界面活性剤を用いる場合には、ＤＡＳ
Ｈ検定におけるさまざまな工程で、反応チューブに気泡が残らないように細心の
注意を払う必要があった。ジメチルスルホキシドが、唯一の有益な添加剤である
ことが見出され、観察されたＴｍ値を低下させるために、このものは５０％また
はそれ以下の割合で添加することができる。
【００４３】２.８. 蛍光出力の分析 温度グラフに対する出力蛍光の解釈は、以下のように行うのが便宜的である。
一次データのグラフは、検定がどの程度うまく実行されたか、すなわち、蛍光の
レベルがどの程度であり、どのサンプルが失敗したかに関する一般的情報を得る
のに利用する。対立遺伝子の評価には、一連のサンプル（同一の対立遺伝子特異
的プローブでハイブリッド形成された異なるＤＮＡ）の結果を、蛍光値の第１微
分係数の負数に沿ってプロットする。好適には、既知の遺伝子型ＤＮＡを一連の
サンプルに含ませる。２個の対立遺伝子について、２つの異なるピークがグラフ
に観察される。これらのピークは、一次データにおける蛍光減少（変性したプロ
ーブおよび標的の二本鎖）の最大比率に対応する。従って、この２つのピークは
、プローブおよび標的の“適合”二本鎖と“不適合”二本鎖のＴｍに相当する。
一次データのグラフは、検定がどの程度うまく実行されたか、すなわち、蛍光の
レベルがどの程度であり、どのサンプルが失敗したかに関する一般的情報を得る
のに利用する。対立遺伝子の評価には、一連のサンプル（同一の対立遺伝子特異
的プローブでハイブリッド形成された異なるＤＮＡ）の結果を、蛍光値の第１微
分係数の負数に沿ってプロットする。好適には、既知の遺伝子型ＤＮＡを一連の
サンプルに含ませる。２個の対立遺伝子について、２つの異なるピークがグラフ
に観察される。これらのピークは、一次データにおける蛍光減少（変性したプロ
ーブおよび標的の二本鎖）の最大比率に対応する。従って、この２つのピークは
、プローブおよび標的の“適合”二本鎖と“不適合”二本鎖のＴｍに相当する。
【００４４】 Ｔｍピークは、少なくとも８℃相違する。Ｔｍピークが高温であることは、所
与のＤＮＡサンプル中に、実験で使用した対立遺伝子特異的プローブに対応する
塩基配列が存在することを示す。対立遺伝子特異的プローブが、供試ＤＮＡの分
子と完全に適合するので、これを“適合”と称する。一方、Ｔｍピークが低温で
あることは、“不適合”であること、すなわち、供試ＤＮＡ中にハイブリッド形
成した配列が存在し、その配列が実験に使用した対立遺伝子特異的プローブに類
似するが、不完全な適合であることを意味する。２つの対立遺伝子系における典
型的なケースでは、この“不適合”は、プローブ配列によって表示されない対立
遺伝子である。しばしば単一のサンプルが両方のピークをもたらすが、これは供
試した２つの対立遺伝子がホモ接合であることを示す。
与のＤＮＡサンプル中に、実験で使用した対立遺伝子特異的プローブに対応する
塩基配列が存在することを示す。対立遺伝子特異的プローブが、供試ＤＮＡの分
子と完全に適合するので、これを“適合”と称する。一方、Ｔｍピークが低温で
あることは、“不適合”であること、すなわち、供試ＤＮＡ中にハイブリッド形
成した配列が存在し、その配列が実験に使用した対立遺伝子特異的プローブに類
似するが、不完全な適合であることを意味する。２つの対立遺伝子系における典
型的なケースでは、この“不適合”は、プローブ配列によって表示されない対立
遺伝子である。しばしば単一のサンプルが両方のピークをもたらすが、これは供
試した２つの対立遺伝子がホモ接合であることを示す。
【００４５】 結合ＤＮＡサンプルは、第２（または複数の後続する）対立遺伝子配列を含む
プローブを用いて、手順の工程４〜７で再処理することができ、得られたデータ
は上述したように分析される。２セットのデータを比較することで、どちらの対
立遺伝子がＤＮＡサンプルに存在するのかを高い精度で決定できる。ＤＮＡサン
プルが対立遺伝子１に特異的なプローブと“適合”し、対立遺伝子２に特異的な
プローブと“不適合”と評価された場合、このＤＮＡサンプルは“ホモ接合対立
遺伝子１”と評価される。一方、ＤＮＡサンプルが対立遺伝子１のプローブと“
不適合”で、対立遺伝子２のプローブと“適合”すると評価された場合、このＤ
ＮＡサンプルは“ホモ接合対立遺伝子２”と評価される。さらに、ＤＮＡサンプ
ルが両方の対立遺伝子と“適合”した場合は、当該サンプルは“対立遺伝子１と
２にヘテロ接合”と評価される。一次データ、第１微分係数および第２微分係数
のグラフの例は、７.１を参照されたい。
プローブを用いて、手順の工程４〜７で再処理することができ、得られたデータ
は上述したように分析される。２セットのデータを比較することで、どちらの対
立遺伝子がＤＮＡサンプルに存在するのかを高い精度で決定できる。ＤＮＡサン
プルが対立遺伝子１に特異的なプローブと“適合”し、対立遺伝子２に特異的な
プローブと“不適合”と評価された場合、このＤＮＡサンプルは“ホモ接合対立
遺伝子１”と評価される。一方、ＤＮＡサンプルが対立遺伝子１のプローブと“
不適合”で、対立遺伝子２のプローブと“適合”すると評価された場合、このＤ
ＮＡサンプルは“ホモ接合対立遺伝子２”と評価される。さらに、ＤＮＡサンプ
ルが両方の対立遺伝子と“適合”した場合は、当該サンプルは“対立遺伝子１と
２にヘテロ接合”と評価される。一次データ、第１微分係数および第２微分係数
のグラフの例は、７.１を参照されたい。
【００４６】３. 新規な発見 ３.１. 融解温度（Ｔｍ） この検定では、オリゴヌクレオチドのプローブがＤＮＡ標的から解離する温度
を、色素、緩衝液および塩化ナトリウム濃度の相互作用によって決定する。ＳＹ
ＢＲグリーンＩ色素は、プローブ／ＤＮＡ二本鎖構造を安定化させ、色素濃度を
上げることでＴｍを上昇させる。塩化ナトリウムと緩衝液の濃度を上げると、Ｔ
ｍが低下するのは、恐らく二本鎖ＤＮＡ構造に結合する（かつ、安定させる）色
素の潜在能力が低下するためと推測される。
を、色素、緩衝液および塩化ナトリウム濃度の相互作用によって決定する。ＳＹ
ＢＲグリーンＩ色素は、プローブ／ＤＮＡ二本鎖構造を安定化させ、色素濃度を
上げることでＴｍを上昇させる。塩化ナトリウムと緩衝液の濃度を上げると、Ｔ
ｍが低下するのは、恐らく二本鎖ＤＮＡ構造に結合する（かつ、安定させる）色
素の潜在能力が低下するためと推測される。
【００４７】３.２. 色素効果 ＳＹＢＲグリーンＩを二本鎖ＤＮＡ構造に挿入することによって、適合二本鎖
と不適合二本鎖とのＴｍの区別性が向上する。完璧に適合したＤＮＡ標的と完全
にハイブリッド形成した１５ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブと、中心位置で
不適合である標的とハイブリッド形成したプローブとのＴｍの相違は約８℃であ
る。標準ＤＮＡ溶液についての計算される融解温度から予想されるこの相違は、
約２〜３℃であった（これは、プローブのＤＮＡヌクレオチド配列によって変わ
る）。従って、ここではＤＡＳＨフォーマットは、対立遺伝子の識別についてポ
テンシャルを最適化する。
と不適合二本鎖とのＴｍの区別性が向上する。完璧に適合したＤＮＡ標的と完全
にハイブリッド形成した１５ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブと、中心位置で
不適合である標的とハイブリッド形成したプローブとのＴｍの相違は約８℃であ
る。標準ＤＮＡ溶液についての計算される融解温度から予想されるこの相違は、
約２〜３℃であった（これは、プローブのＤＮＡヌクレオチド配列によって変わ
る）。従って、ここではＤＡＳＨフォーマットは、対立遺伝子の識別についてポ
テンシャルを最適化する。
【００４８】 ＳＹＢＲグリーンＩは、また、二本鎖ＤＮＡの濃度と色素の濃度によって蛍光
が変化する効果を生む。従って、一定のＤＮＡ濃度において、ＳＹＢＲグリーン
色素レベルの滴定は、蛍光信号が最大値に到達するまで行う。これを“ＳＹＢＲ
グリーン効果”と名付けた。本検定で採用した色素の濃度（１：１０，０００で
希釈）は、典型的なマイクロタイタプレートウェルに結合できる量のＤＮＡに最
適のものである。
が変化する効果を生む。従って、一定のＤＮＡ濃度において、ＳＹＢＲグリーン
色素レベルの滴定は、蛍光信号が最大値に到達するまで行う。これを“ＳＹＢＲ
グリーン効果”と名付けた。本検定で採用した色素の濃度（１：１０，０００で
希釈）は、典型的なマイクロタイタプレートウェルに結合できる量のＤＮＡに最
適のものである。
【００４９】３.３. ヘペス緩衝液 ハイブリダイゼーション緩衝液の基本となるヘペスは、今回の検定で幾つかの
独特な特性を有している。この緩衝液と色素の組合せにおいて、プローブ／標的
ＤＮＡ複合体のＴｍは、ほとんどプローブ長さだけと相関関係にある。ＤＮＡ配
列状況（the DNA sequence context）、あるいは、Ｇ＋Ｃ量の変化は、観察され
たＴｍを変えることはない。これは、ＤＡＳＨ検定にとって極めて重要なことで
ある。
独特な特性を有している。この緩衝液と色素の組合せにおいて、プローブ／標的
ＤＮＡ複合体のＴｍは、ほとんどプローブ長さだけと相関関係にある。ＤＮＡ配
列状況（the DNA sequence context）、あるいは、Ｇ＋Ｃ量の変化は、観察され
たＴｍを変えることはない。これは、ＤＡＳＨ検定にとって極めて重要なことで
ある。
【００５０】３.４. ジメチル・スルホキシド（ＤＭＳＯ） 検定の完全性を危うくすることなくオリゴヌクレオチドプローブ／標的ＤＮＡ
複合体のＴｍを低下させるために、ＤＭＳＯはハイブリダイゼーション緩衝液に
加えることができる。唯一及ぼす影響は、両方の対立遺伝子のＴｍの違いに影響
を与えずに両両者のＴｍを下げることである。
複合体のＴｍを低下させるために、ＤＭＳＯはハイブリダイゼーション緩衝液に
加えることができる。唯一及ぼす影響は、両方の対立遺伝子のＴｍの違いに影響
を与えずに両両者のＴｍを下げることである。
【００５１】３.５. イオン性界面活性剤 ドデシル硫酸ナトリウムなどのイオン性界面活性剤を、濃度０．１％以下で使
用することは、蛍光信号を完全に破壊する。これは、色素との相互作用によるも
のと推測される。
用することは、蛍光信号を完全に破壊する。これは、色素との相互作用によるも
のと推測される。
【００５２】４. ＤＡＳＨアッセイ（検定）の構成要素 ４.１. 色素 モレキュラープローブ社（Molecular Probes）から入手したＳＹＢＲグリーン
Ｉ色素。４.２. プレート さまざまな供給元から入手したマイクロタイタプレート。パーキンエルマー社
（Perkin Elmer）から入手したマイクロアンプオプティカルプレート、キャップ
、チューブは、蛍光定量測定用に特に考案されている。４.３. オリゴヌクレオチド ＰＣＲプライマーと対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、インタ
ーアクティバ・バイオテクノロジー社（Interactiva Biotechnologie）から入手
し、全ては最良の質を確保するためHPLC精製した。４.４. 蛍光監視装置 ハイベイドＤＡＳＨシステム（ハイベイドリミテッド社：Hybaid Limited、英
国）、ＡＢＩ７７００（パーキンエルマー社、本発明のアッセイで使用のもの）
またはその他の検出温度制御装置。４.５. 緩衝液 緩衝液の全ての成分はシグマ社（Sigma）から入手。４.６. ソフトウエア サンプルデータの生データと、一次導関数および二次導関数を分析するために
開発されたソフトウエアは、キン・チュン・ウォン（アップサラ在住）によって
書かれた。
Ｉ色素。４.２. プレート さまざまな供給元から入手したマイクロタイタプレート。パーキンエルマー社
（Perkin Elmer）から入手したマイクロアンプオプティカルプレート、キャップ
、チューブは、蛍光定量測定用に特に考案されている。４.３. オリゴヌクレオチド ＰＣＲプライマーと対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、インタ
ーアクティバ・バイオテクノロジー社（Interactiva Biotechnologie）から入手
し、全ては最良の質を確保するためHPLC精製した。４.４. 蛍光監視装置 ハイベイドＤＡＳＨシステム（ハイベイドリミテッド社：Hybaid Limited、英
国）、ＡＢＩ７７００（パーキンエルマー社、本発明のアッセイで使用のもの）
またはその他の検出温度制御装置。４.５. 緩衝液 緩衝液の全ての成分はシグマ社（Sigma）から入手。４.６. ソフトウエア サンプルデータの生データと、一次導関数および二次導関数を分析するために
開発されたソフトウエアは、キン・チュン・ウォン（アップサラ在住）によって
書かれた。
【００５３】５. その他のアッセイフォーマット 別のフォーマットでＰＣＲ生成物のハイブリッド形成前にオリゴヌクレオチド
プローブをプレートに結合させることが可能であるが、試した結果、この設計で
はいくつかの技術的な問題が生じた。第１は二本鎖ＰＣＲ生成物を結合プローブ
にハイブリッド形成させる際の問題である。ＰＣＲ生成物のシンプルな加熱変性
と、それに続くプローブコート検定ウェル中での冷却が不十分となる。これはお
そらく置換反応、すなわち、ＰＣＲ生成物が二本鎖を修正し、標的配列にハイブ
リッド形成したプローブを置換することによるものと推測される。
プローブをプレートに結合させることが可能であるが、試した結果、この設計で
はいくつかの技術的な問題が生じた。第１は二本鎖ＰＣＲ生成物を結合プローブ
にハイブリッド形成させる際の問題である。ＰＣＲ生成物のシンプルな加熱変性
と、それに続くプローブコート検定ウェル中での冷却が不十分となる。これはお
そらく置換反応、すなわち、ＰＣＲ生成物が二本鎖を修正し、標的配列にハイブ
リッド形成したプローブを置換することによるものと推測される。
【００５４】 置換反応によって引起される煩雑さを排除するために、我々はハイブリッド形
成のためにＰＣＲ生成物から一本鎖ＤＮＡを生成することを試みた。このために
、ＰＣＲにおいて不等量の２つのプライマーを用い、理論的にＰＣＲ生成物（非
対称ＰＣＲ）の一本鎖を過剰に生成させた。これは検定をを僅かだが向上させた
。重要なのは、最適ＰＣＲ条件が、ＤＡＳＨアッセイの確実性に対する妥協の程
度によって変化することである。
成のためにＰＣＲ生成物から一本鎖ＤＮＡを生成することを試みた。このために
、ＰＣＲにおいて不等量の２つのプライマーを用い、理論的にＰＣＲ生成物（非
対称ＰＣＲ）の一本鎖を過剰に生成させた。これは検定をを僅かだが向上させた
。重要なのは、最適ＰＣＲ条件が、ＤＡＳＨアッセイの確実性に対する妥協の程
度によって変化することである。
【００５５】 遊離液中におけるＰＣＲ生成物の長さが長いことも問題である。これは反応速
度を遅くし、かつ、潜在的二次構造がハイブリダイゼーション反応を妨げる。さ
らに、ひとたび長い分子が短い固定プローブにハイブリッド形成されると、熱エ
ネルギーが加えられるにつれ、ＤＮＡ／プローブ複合体の時期尚早な解離が生じ
る。このフォーマットでは、全ての蛍光信号が極めて低温で失われてしまうため
、対立遺伝子間の識別が不可能であることが見出された。これはおそらく、ハイ
ブリッド形成されたＰＣＲ断片に、液中に突き出るような非ハイブリッド形成し
ていない長い尾部が存在することに起因する。温度が上昇するにつれ、長い分子
はハイブリッド形成された複合体のＴｍ特性によって変性されるよりも、むしろ
溶液運動によって引抜かれる。
度を遅くし、かつ、潜在的二次構造がハイブリダイゼーション反応を妨げる。さ
らに、ひとたび長い分子が短い固定プローブにハイブリッド形成されると、熱エ
ネルギーが加えられるにつれ、ＤＮＡ／プローブ複合体の時期尚早な解離が生じ
る。このフォーマットでは、全ての蛍光信号が極めて低温で失われてしまうため
、対立遺伝子間の識別が不可能であることが見出された。これはおそらく、ハイ
ブリッド形成されたＰＣＲ断片に、液中に突き出るような非ハイブリッド形成し
ていない長い尾部が存在することに起因する。温度が上昇するにつれ、長い分子
はハイブリッド形成された複合体のＴｍ特性によって変性されるよりも、むしろ
溶液運動によって引抜かれる。
【００５６】 プローブ結合フォーマットの最適化は、ＰＣＲ条件、緩衝液構成要素、アニー
リング戦略およびその他のパラメータを含むさらなる実験を必要とする。ハイブ
リッド形成のための一本鎖ＤＮＡ分子の生成に係わる問題および運動速度の考慮
は、ＤＮＡ分子結合フォーマットを利用することで回避できる。非ビオチニル化
（non-biotinylated）鎖は一本鎖ＤＮＡ生成物のために容易に溶出され、未熟置
換を含む運動制限は観察されない。
リング戦略およびその他のパラメータを含むさらなる実験を必要とする。ハイブ
リッド形成のための一本鎖ＤＮＡ分子の生成に係わる問題および運動速度の考慮
は、ＤＮＡ分子結合フォーマットを利用することで回避できる。非ビオチニル化
（non-biotinylated）鎖は一本鎖ＤＮＡ生成物のために容易に溶出され、未熟置
換を含む運動制限は観察されない。
【００５７】６. ＤＡＳＨ分析の実施例：ヒトＮＤＵＦＢ４遺伝子における重対立遺伝子の
単一ヌクレオチド多形性の対立遺伝子バージョンの検出 常染色体上に位置するヒトＮＤＵＦＢ４遺伝子における単一ヌクレオチド多形
性についてＤＡＳＨ実験を行った。これは“ＤＮＡ配列１”として図１に記載さ
れ、“Ａ”ヌクレオチドと、“Ｇ”ヌクレオチドとの重対立性から成る。３つの
ヒトゲノムＤＮＡサンプルであるＸ、Ｙ，Ｚが採用され、これらは先の配列分析
から、“Ａ”対立遺伝子がホモ接合、“Ｇ”対立遺伝子がホモ接合、それらの対
立遺伝子はヘテロ接合であると各々知られている。
単一ヌクレオチド多形性の対立遺伝子バージョンの検出 常染色体上に位置するヒトＮＤＵＦＢ４遺伝子における単一ヌクレオチド多形
性についてＤＡＳＨ実験を行った。これは“ＤＮＡ配列１”として図１に記載さ
れ、“Ａ”ヌクレオチドと、“Ｇ”ヌクレオチドとの重対立性から成る。３つの
ヒトゲノムＤＮＡサンプルであるＸ、Ｙ，Ｚが採用され、これらは先の配列分析
から、“Ａ”対立遺伝子がホモ接合、“Ｇ”対立遺伝子がホモ接合、それらの対
立遺伝子はヘテロ接合であると各々知られている。
【００５８】６.１. ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） ＤＮＡサンプルＸ、Ｙ、Ｚの５０ｎｇアリコートについて、“ＤＮＡ配列２”
および“ＤＮＡ配列３”として図１に記載されたＰＣＲプライマーを用いてＰＣ
Ｒが実施された。反応条件を下記に記す：総量２５ｍｌ中、２０ｎｇの“ＤＮＡ
配列２”プライマーと、１００ｎｇの“ＤＮＡ配列３”プライマーと、０．７５
ｕのアンプリタックゴールド（AmpliTaq-Gold）ポリメラーゼ（パーキンエルマ
ー社）と、１０％のジメチルスルホキシドと、１ｘパーキンエルマーＰＣＲ緩衝
液（１．５ｍＭのＭｇＣｌ２含有）と、各０．２ｍＭのｄＧＴＰと、ｄＡＴＰと
、ｄＴＴＰとｄＣＴＰとを含む。熱サイクルはタッチダウン（TouchDownTM）温
度サイクル装置（ハイベイド社製）を採用し、以下のサイクル条件とした： １
×（９４℃で１０分間、５０℃で３０秒、７２℃で３０秒）、１７×（９４℃で
１５秒間、５０℃で３０秒、７２℃で３０秒）、１８×（９４℃で１５秒間、５
０℃で３０秒、７２℃で１分）。これは、４８塩基対長さのＰＣＲ生成物を産出
し、このものは多形遺伝子座に及び、一本のＤＮＡ鎖の５’末端にビオチン部分
を持つた。
および“ＤＮＡ配列３”として図１に記載されたＰＣＲプライマーを用いてＰＣ
Ｒが実施された。反応条件を下記に記す：総量２５ｍｌ中、２０ｎｇの“ＤＮＡ
配列２”プライマーと、１００ｎｇの“ＤＮＡ配列３”プライマーと、０．７５
ｕのアンプリタックゴールド（AmpliTaq-Gold）ポリメラーゼ（パーキンエルマ
ー社）と、１０％のジメチルスルホキシドと、１ｘパーキンエルマーＰＣＲ緩衝
液（１．５ｍＭのＭｇＣｌ２含有）と、各０．２ｍＭのｄＧＴＰと、ｄＡＴＰと
、ｄＴＴＰとｄＣＴＰとを含む。熱サイクルはタッチダウン（TouchDownTM）温
度サイクル装置（ハイベイド社製）を採用し、以下のサイクル条件とした： １
×（９４℃で１０分間、５０℃で３０秒、７２℃で３０秒）、１７×（９４℃で
１５秒間、５０℃で３０秒、７２℃で３０秒）、１８×（９４℃で１５秒間、５
０℃で３０秒、７２℃で１分）。これは、４８塩基対長さのＰＣＲ生成物を産出
し、このものは多形遺伝子座に及び、一本のＤＮＡ鎖の５’末端にビオチン部分
を持つた。
【００５９】６.２. ＰＣＲ生成物のマイクロタイタプレートへの結合 ＰＣＲ反応生成物は、等量の緩衝液Ｉ（１００ｍＭのヘペス、５０ｍＭのＮａ
Ｃｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）と混合し、ストレプタビジンを塗布し
た薄壁マイクロタイタプレート（ボーリンジャー・マンヘイム：Boehringer Man
nheim）の個別ウェルに移された。これを室温で１時間放置した。
Ｃｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）と混合し、ストレプタビジンを塗布し
た薄壁マイクロタイタプレート（ボーリンジャー・マンヘイム：Boehringer Man
nheim）の個別ウェルに移された。これを室温で１時間放置した。
【００６０】６.３. 非結合鎖の溶出 全量の溶液（非結合ＤＮＡおよびその他の試薬を含む）をマイクロタイタプレ
ートから完全に吸引除去した。その後直ちに、ウェルを５０ｍｌの０．１Ｍ Ｎ
ａＯＨで満たし、５分間室温で放置した。非ビオチニル化ＤＮＡ鎖（この時、結
合鎖から変性）を含むＮａＯＨ溶液が完全に除去された。
ートから完全に吸引除去した。その後直ちに、ウェルを５０ｍｌの０．１Ｍ Ｎ
ａＯＨで満たし、５分間室温で放置した。非ビオチニル化ＤＮＡ鎖（この時、結
合鎖から変性）を含むＮａＯＨ溶液が完全に除去された。
【００６１】６.４. 反応サンプルの中和 ウェルにＳＹＢＲグリーン色素を含む５０ｍｌの緩衝液を遅滞なく満たした（
１：１０，０００で希釈）。
１：１０，０００で希釈）。
【００６２】６.５. 第１の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブのハイブリッド形
成 ３０ｐｍｏｌの“Ｔプローブ”（図１に記載の“ＤＮＡ配列４”）を、水１ｍ
ｌで各ウェルに添加した。光学キャップ（パーキンエルマー社製）を用いて各ウ
ェルを密閉し、プレートとその中身を６０℃で加熱し、１５分以上かけて室温ま
で徐々に冷却した。これはタッチダウン（TouchDownTM）温度サイクル装置（ハ
イベイド社製）を用いて実施した。
成 ３０ｐｍｏｌの“Ｔプローブ”（図１に記載の“ＤＮＡ配列４”）を、水１ｍ
ｌで各ウェルに添加した。光学キャップ（パーキンエルマー社製）を用いて各ウ
ェルを密閉し、プレートとその中身を６０℃で加熱し、１５分以上かけて室温ま
で徐々に冷却した。これはタッチダウン（TouchDownTM）温度サイクル装置（ハ
イベイド社製）を用いて実施した。
【００６３】６.６. 非結合プローブの削除 光学キャップを外し、全量の溶液をマイクロタイタプレートから完全に吸引し
た。次にウェルをＳＹＢＲグリーンＩ色素（１：１０，０００で希釈）を含む５
０μｌの緩衝液Ｉで満たし、光学キャップを取り替えた。
た。次にウェルをＳＹＢＲグリーンＩ色素（１：１０，０００で希釈）を含む５
０μｌの緩衝液Ｉで満たし、光学キャップを取り替えた。
【００６４】６.７. 信号検出手順 マイクロタイタプレートをパーキンエルマー７７００（タックマン）装置に設
置し、毎秒０．１℃の定速度で３５℃から８０℃までにわたる温度範囲を含む加
熱期を適用した。この加熱期中、タックマン装置は反復してサンプルをアルゴン
レーザ光源（４８８ｎｍで濾波）で励起し、周波数域５４５〜５５０ｎｍで放出
される蛍光を収集した。いずれのウェルも7秒間隔でデータポイントを集めた。
置し、毎秒０．１℃の定速度で３５℃から８０℃までにわたる温度範囲を含む加
熱期を適用した。この加熱期中、タックマン装置は反復してサンプルをアルゴン
レーザ光源（４８８ｎｍで濾波）で励起し、周波数域５４５〜５５０ｎｍで放出
される蛍光を収集した。いずれのウェルも7秒間隔でデータポイントを集めた。
【００６５】６.８. 第２の対立遺伝子特異的プローブでの再プローブ 工程５で用いた“Ｔプローブ”を“Ｃプローブ”と交換して上記工程３〜８を
繰り返した（“ＤＮＡ配列５”として図１に示す）。
繰り返した（“ＤＮＡ配列５”として図１に示す）。
【００６６】６.９. データ分析および結果の解釈 全てのウェルおよび両方のプローブについて、一次データを蛍光データ対時間
のグラフにプロットした。このデータは、8個のデータポイントのスライドウイ
ンドウから決定した平均蛍光値をプロットすると滑らかであった。こうして得ら
れた“一次”データを図１ａおよび１ｂに示した。次に、このグラフの負の微分
（導関数）曲線をプロットし、これを図２ａおよび２ｂに示した。そして、負の
第１微分曲線の微分曲線をプロットし、図３ａおよび３ｂに示し第２導関数を得
た。
のグラフにプロットした。このデータは、8個のデータポイントのスライドウイ
ンドウから決定した平均蛍光値をプロットすると滑らかであった。こうして得ら
れた“一次”データを図１ａおよび１ｂに示した。次に、このグラフの負の微分
（導関数）曲線をプロットし、これを図２ａおよび２ｂに示した。そして、負の
第１微分曲線の微分曲線をプロットし、図３ａおよび３ｂに示し第２導関数を得
た。
【００６７】 図２ａおよび２ｂにおいて、高温ピーク（Ｈ）と低温ピーク（Ｌ）は、最大変
性率のポイントを示していると考えられる。これらは、適合したプローブ標的Ｄ
ＮＡ二本鎖と、一塩基不適合のプローブ標的ＤＮＡ二本鎖それぞれのＤＡＳＨ信
号を示している。第２導関数曲線（図３ａおよび３ｂ）では、これらの点は曲線
がＸ軸と交わる点から推理できる。これらは一次データ（図１ａおよび１ｂ）に
も見られるが、ＤＡＳＨの結果表示から差異を弁別するのは困難である。
性率のポイントを示していると考えられる。これらは、適合したプローブ標的Ｄ
ＮＡ二本鎖と、一塩基不適合のプローブ標的ＤＮＡ二本鎖それぞれのＤＡＳＨ信
号を示している。第２導関数曲線（図３ａおよび３ｂ）では、これらの点は曲線
がＸ軸と交わる点から推理できる。これらは一次データ（図１ａおよび１ｂ）に
も見られるが、ＤＡＳＨの結果表示から差異を弁別するのは困難である。
【００６８】 サンプルＸとＹに関しては、一方の負の第１微分グラフに一つの適合（高温）
ピークが、他方の負の第１微分グラフに一つの不適合（低温）ピークが認められ
る。これはＸとＹがホモ接合サンプルであることを示している。ＸとＹが高温（
適合）ピークを付与する間のプロービングは、これらがどの対立遺伝子を含んで
いるかを示すものである。従って、Ｘは“Ｔプローブ”で高温ピークを形成する
ので、これは“Ａ”対立遺伝子ホモ接合体である。一方、Ｙは“Ｃプローブ”で
高温ピークを形成するので、“Ｇ”対立遺伝子ホモ接合体である。
ピークが、他方の負の第１微分グラフに一つの不適合（低温）ピークが認められ
る。これはＸとＹがホモ接合サンプルであることを示している。ＸとＹが高温（
適合）ピークを付与する間のプロービングは、これらがどの対立遺伝子を含んで
いるかを示すものである。従って、Ｘは“Ｔプローブ”で高温ピークを形成する
ので、これは“Ａ”対立遺伝子ホモ接合体である。一方、Ｙは“Ｃプローブ”で
高温ピークを形成するので、“Ｇ”対立遺伝子ホモ接合体である。
【００６９】 サンプルＺは、サンプルＸやＹとは異なる挙動を示す。サンプルＺは、“Ｃプ
ローブ”で高温ピークと低温ピークの両方を形成し、“Ｔプローブ”でも高温ピ
ークと低温ピーク（両ピークは隣接により単一の広いピークに統合される）を形
成する。そのため、このＤＮＡサンプルは、その中に存在する両プローブの対立
遺伝子相補的配列を有している。従って、Ｚは、“Ａ”対立遺伝子と“Ｇ”対立
遺伝子の両方を含むヘテロ接合サンプルと推理することができる。
ローブ”で高温ピークと低温ピークの両方を形成し、“Ｔプローブ”でも高温ピ
ークと低温ピーク（両ピークは隣接により単一の広いピークに統合される）を形
成する。そのため、このＤＮＡサンプルは、その中に存在する両プローブの対立
遺伝子相補的配列を有している。従って、Ｚは、“Ａ”対立遺伝子と“Ｇ”対立
遺伝子の両方を含むヘテロ接合サンプルと推理することができる。
【００７０】ヒトＮＤＵＦＢ４遺伝子の多形性の対立遺伝子を評価するＤＡＳＨアッセイに使
用されるＤＮＡ配列を以下に示す。 ＤＮＡ配列１（配列リストＳＥ１） これは、ヒトＮＤＵＦＢ４遺伝子の一部を示す４８塩基対のゲノムＤＮＡ配列
である。重対立遺伝子の単一ヌクレオチド多形性（ＧからＡ）が、配列中央に向
う括弧内に示されている。
用されるＤＮＡ配列を以下に示す。 ＤＮＡ配列１（配列リストＳＥ１） これは、ヒトＮＤＵＦＢ４遺伝子の一部を示す４８塩基対のゲノムＤＮＡ配列
である。重対立遺伝子の単一ヌクレオチド多形性（ＧからＡ）が、配列中央に向
う括弧内に示されている。
【００７１】 ＤＮＡ配列２（配列リストＳＥ２） この配列は、ＤＮＡ配列１に示される対立遺伝子の多形性を検出するために、
ＤＡＳＨ検定で“ＰＣＲプライマー１”として使用するために設計された１９塩
基対のオリゴヌクレオチド配列である。これは、５’末端に結合したビオチン部
位を備える。
ＤＡＳＨ検定で“ＰＣＲプライマー１”として使用するために設計された１９塩
基対のオリゴヌクレオチド配列である。これは、５’末端に結合したビオチン部
位を備える。
【００７２】 ＤＮＡ配列３（配列リストＳＥ３） この配列は、ＤＮＡ配列１に示される対立遺伝子の多形性を検出するために、
ＤＡＳＨ検定で“ＰＣＲプライマー２”として使用するために設計された２１塩
基対のオリゴヌクレオチド配列である。
ＤＡＳＨ検定で“ＰＣＲプライマー２”として使用するために設計された２１塩
基対のオリゴヌクレオチド配列である。
【００７３】 ＤＮＡ配列４（配列リストＳＥ４） この配列は、ＤＮＡ配列１に示される対立遺伝子の多形性を検出するために、
ＤＡＳＨ検定で“Ｃプローブ”として使用するために設計された１５塩基対のオ
リゴヌクレオチド配列である。
ＤＡＳＨ検定で“Ｃプローブ”として使用するために設計された１５塩基対のオ
リゴヌクレオチド配列である。
【００７４】 ＤＮＡ配列５（配列リストＳＥ５） この配列は、ＤＮＡ配列１に示される対立遺伝子の多形性を検出するために、
ＤＡＳＨ検定で“Ｔプローブ”として使用するために設計された１５塩基対のオ
リゴヌクレオチド配列である。
ＤＡＳＨ検定で“Ｔプローブ”として使用するために設計された１５塩基対のオ
リゴヌクレオチド配列である。
【００７５】 図１ａおよび１ｂは、ＮＤＵＦＢ４遺伝子の多形性に関するＤＡＳＨアッセイ
の一次データをそれぞれ示すものであって、“Ｈ”および“Ｌ”は、それぞれ、
適合および不適合プローブ−標的の二本鎖の最大変性率ポイントを示す。Ｘ、Ｙ
、ＺはサンプルＤＮＡである。図１ａは“Ｃプローブ”の結果を、図１ｂは“Ｔ
プローブ”の結果をそれぞれ示す。
の一次データをそれぞれ示すものであって、“Ｈ”および“Ｌ”は、それぞれ、
適合および不適合プローブ−標的の二本鎖の最大変性率ポイントを示す。Ｘ、Ｙ
、ＺはサンプルＤＮＡである。図１ａは“Ｃプローブ”の結果を、図１ｂは“Ｔ
プローブ”の結果をそれぞれ示す。
【００７６】 図２ａおよび２ｂは、ＮＤＵＦＢ４ゲノム遺伝子の多形性に関する負の一次導
関数のＤＡＳＨアッセイデータをそれぞれ示すものであって、“Ｈ”および“Ｌ
”は、それぞれ、適合および不適合プローブ−標的の二本鎖の最大変性率ポイン
トを示す。Ｘ、Ｙ、ＺはサンプルＤＮＡである。図２ａは“Ｃプローブ”の結果
を、図２ｂは“Ｔプローブ”の結果をそれぞれ示す。
関数のＤＡＳＨアッセイデータをそれぞれ示すものであって、“Ｈ”および“Ｌ
”は、それぞれ、適合および不適合プローブ−標的の二本鎖の最大変性率ポイン
トを示す。Ｘ、Ｙ、ＺはサンプルＤＮＡである。図２ａは“Ｃプローブ”の結果
を、図２ｂは“Ｔプローブ”の結果をそれぞれ示す。
【００７７】 図３ａおよび３ｂは、ＮＤＵＦＢ４遺伝子の多形性に関する二次導関数のＤＡ
ＳＨアッセイデータをそれぞれ示すものであって、“Ｈ”および“Ｌ”は、それ
ぞれ、適合および不適合プローブ−標的の二本鎖の最大変性率ポイントを示す。
Ｘ、Ｙ、ＺはサンプルＤＮＡである。図３ａは“Ｃプローブ”の結果を、図３ｂ
は“Ｔプローブ”の結果をそれぞれ示す。
ＳＨアッセイデータをそれぞれ示すものであって、“Ｈ”および“Ｌ”は、それ
ぞれ、適合および不適合プローブ−標的の二本鎖の最大変性率ポイントを示す。
Ｘ、Ｙ、ＺはサンプルＤＮＡである。図３ａは“Ｃプローブ”の結果を、図３ｂ
は“Ｔプローブ”の結果をそれぞれ示す。
【００７８】７.１. グラフの例 ７.１.１. 一次データ 図４は、一つの対立遺伝子特異的プローブにて、３つの異なるＤＮＡサンプル
を検定したデータを示したものである。サンプル“２８、２９、３０”は、それ
ぞれホモ接合適合サンプル、ホモ接合不適合サンプルおよびヘテロ接合サンプル
の典型的な結果を示している。ヘテロ接合のサンプル３０は、適合曲線および不
適合曲線両方の特性を示していることに留意されたい。は不適合プローブ／標
的二本鎖のＴｍであり、は適合プローブ／標的二本鎖のＴｍである。
を検定したデータを示したものである。サンプル“２８、２９、３０”は、それ
ぞれホモ接合適合サンプル、ホモ接合不適合サンプルおよびヘテロ接合サンプル
の典型的な結果を示している。ヘテロ接合のサンプル３０は、適合曲線および不
適合曲線両方の特性を示していることに留意されたい。は不適合プローブ／標
的二本鎖のＴｍであり、は適合プローブ／標的二本鎖のＴｍである。
【００７９】７.１.２. 負の一次導関数 ３つのＤＮＡサンプルの負の一次導関数を図５に示す。これらのＤＮＡサンプ
ルは、一つの対立遺伝子特的プローブで検査された。サンプル２８、２９、３０
は、各々、プローブ対立遺伝子について、ホモ接合適合、ホモ接合不適合および
ヘテロ接合である。は不適合プローブ／標的二本鎖のＴｍであり、は適合プ
ローブ／標的二本鎖のＴｍである。
ルは、一つの対立遺伝子特的プローブで検査された。サンプル２８、２９、３０
は、各々、プローブ対立遺伝子について、ホモ接合適合、ホモ接合不適合および
ヘテロ接合である。は不適合プローブ／標的二本鎖のＴｍであり、は適合プ
ローブ／標的二本鎖のＴｍである。
【００８０】７.１.３. 二次導関数 ３つのＤＮＡサンプルについての二次導関数を図６に示す。サンプル２８、２
９、３０は、ホモ接合適合、ホモ接合不適合、およびヘテロ接合をそれぞれ示し
ている。は不適合プローブ／標的二本鎖のＴｍを、は適合プローブ／標的二
本鎖のＴｍを示す。
９、３０は、ホモ接合適合、ホモ接合不適合、およびヘテロ接合をそれぞれ示し
ている。は不適合プローブ／標的二本鎖のＴｍを、は適合プローブ／標的二
本鎖のＴｍを示す。
【００８１】７.１.４. ３つの異なる変異におけるヘペスによるＴｍの標準化 図７は、３つの異なる変異について、サンプル２５〜２７、２８〜３０、３１
〜３３から得た一揃いの負の一次導関数データを示す。各セットのデータは、評
価される個々の変異に相当する１５ｍｅｒの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチ
ドプローブに特異的な遺伝子座で検査された。これらのプローブが含有するＧと
Ｃの割合は、４０〜７０％で変化した。融解温度理論によれば、プローブ／標的
複合体のＴｍはこれらの異なる配列によって変化すべきであるが、ヘペス緩衝液
を用いたＤＡＳＨ検定条件は、固定Ｔｍ値にデータを標準化させる。は不適合
プローブ／標的二本鎖のＴｍを、は適合プローブ／標的二本鎖のＴｍである。
〜３３から得た一揃いの負の一次導関数データを示す。各セットのデータは、評
価される個々の変異に相当する１５ｍｅｒの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチ
ドプローブに特異的な遺伝子座で検査された。これらのプローブが含有するＧと
Ｃの割合は、４０〜７０％で変化した。融解温度理論によれば、プローブ／標的
複合体のＴｍはこれらの異なる配列によって変化すべきであるが、ヘペス緩衝液
を用いたＤＡＳＨ検定条件は、固定Ｔｍ値にデータを標準化させる。は不適合
プローブ／標的二本鎖のＴｍを、は適合プローブ／標的二本鎖のＴｍである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
（ａ）は“Ｃプローブ”の結果を示すＤＡＳＨアッセイの一次データグラフで
あり、（ｂ）は“Ｔプローブ”の結果を示すＤＡＳＨアッセイの一次データグラ
フである。
あり、（ｂ）は“Ｔプローブ”の結果を示すＤＡＳＨアッセイの一次データグラ
フである。
【図２】
（ａ）は“Ｃプローブ”の結果を示すＮＤＵＦＢ４遺伝子の多形性に関する負
の一次導関数のＤＡＳＨアッセイのデータグラフでり、（ｂ）は“Ｔプローブ”
の結果を示すＮＤＵＦＢ４遺伝子の多形性に関する負の一次導関数のＤＡＳＨア
ッセイのデータグラフである。
の一次導関数のＤＡＳＨアッセイのデータグラフでり、（ｂ）は“Ｔプローブ”
の結果を示すＮＤＵＦＢ４遺伝子の多形性に関する負の一次導関数のＤＡＳＨア
ッセイのデータグラフである。
【図３】
（ａ）は“Ｃプローブ”の結果を示すＮＤＵＦＢ４遺伝子の多形性に関する負
の一次導関数のＤＡＳＨアッセイのデータグラフであり、（ｂ）は“Ｔプローブ
”の結果を示すＮＤＵＦＢ４遺伝子の多形性に関する二次導関数のＤＡＳＨアッ
セイのデータグラフである。
の一次導関数のＤＡＳＨアッセイのデータグラフであり、（ｂ）は“Ｔプローブ
”の結果を示すＮＤＵＦＢ４遺伝子の多形性に関する二次導関数のＤＡＳＨアッ
セイのデータグラフである。
【図４】
一つの対立遺伝子特異的プローブで評価した3個の異なるＤＮＡサンプルのデ
ータを示すグラフである。
ータを示すグラフである。
【図５】
3個のＤＮＡサンプルの負の一次導関数のグラフである。
【図６】
3個のＤＮＡサンプルの二次導関数のグラフである。
【図７】
複数のＤＮＡサンプルに関する標準化データの一次導関数を示すグラフである
。
。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA09 FA10 HA14 HA20 4B063 QA12 QA17 QQ42 QR32 QR41 QR48 QR56 QR62 QR66 QR82 QS25 QS34 QS36 QX02
Claims (16)
- 【請求項１】 （ａ）変異の遺伝子座を含むＤＮＡ塩基配列の一本鎖と； （ｂ）上記一本鎖（ａ）の一本鎖とハイブリッド形成して二本鎖を形成可能で、
変異の１つの対立遺伝子に対して特異的なオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ類似体
のプローブと； （ｃ）前記二本鎖で複合体を形成する一本鎖（ａ）およびプローブ（ｂ）の二本
鎖構造に特異的であって、二本鎖と共に複合体を形成し、かつ、二本鎖内で相互
作用を行った際に独特に反応するマーカー とで構成される複合体の形成または解離を監視することでＤＮＡの変異を検出す
る方法であって、 一本鎖（ａ）とプローブ（ｂ）から形成される二本鎖にマーカーが相互作用し
たことを示す出力信号を連続的に測定し、複合体の形成または解離に原因し、従
って、一本鎖（ａ）にプローブ（ｂ）がハイブリッド形成していた強さと相関す
るところの、反応の出力信号に変化が生じた条件を記録することを包含するＤＮ
Ａ変異の検出方法。 - 【請求項２】 （ａ）変異の遺伝子座を含むＤＮＡ塩基配列の一本鎖と、 （ｂ）変異の一つの対立遺伝子に対して特異的で、かつ、上記の一本鎖（ａ）と
ハイブリッド形成して二本鎖を形成するオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ類似体の
プローブと、（ｃ）上記（ａ）および（ｂ）の二本鎖構造に対して特異的で、か
つ、二本鎖内で相互反応した際に独特に反応するマーカーとを （ｉ）成分（ａ）と成分（ｂ）がハイブリッド形成し、かつ、成分（ｃ）と複合
体が形成される条件、または、 （ｉｉ）成分（ａ）と成分（ｂ）とがハイブリッド形成さず、成分（ｃ）との複
合体も形成されない条件で 合体させた後、 （ｉ）形成された二本鎖が変性して複合体の解離が起こるように、または、 （ｉｉ）二本鎖の形成が、従って複合体の形成が起こるように 環境条件を定常的にかつ漸進的に調節し、 （ａ）と（ｂ）のハイブリダイゼーションの程度および成分（ｃ）との複合体の
形成の程度を示す出力信号を測定し、 さらに、（ｉ）複合体の解離または（ｉｉ）複合体の形成を示すところの、出力
信号に変化が起こった条件を記録することからなるＤＮＡ変異の検出方法。 - 【請求項３】 （ａ）変異の遺伝子座を含むＤＮＡ塩基配列の一本鎖と、 （ｂ）上記一本鎖（ａ）とハイブリッド形成して二本鎖を形成する変異の１つの
対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ類似体のプローブと、 （ｃ）上記（ａ）と（ｂ）の二本鎖造に特異的で、かつ、二重構造内で相互作用
した際に独特に反応するマーカー から成る複合体を形成し、 複合体を含む変性環境を定常的に高めながら、マーカおよび二本鎖との反応程度
の出力信号を連続的に測定し、複合体の解離が原因し、従って、プローブ（ｂ）
が一本鎖（ａ）にハイブリッド形成された強さと相関するところの、反応出力信
号に変化が起きた条件（以下、変性ポイントと称す）を記録することを包含する
ＤＮＡ変異の検出方法。 - 【請求項４】 （ａ）変異の遺伝子座を含むＤＮＡ塩基配列の一本鎖と、 （ｂ）変異の一つの対立遺伝子に特異的で、かつ、上記の一本鎖（ａ）とハイブ
リッド形成して二本鎖を形成するオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ類似体のプロー
ブと、 （ｃ）前記（ａ）および（ｂ）の二本鎖に特異的で、かつ、二本鎖内で相互作用
する際に独特に反応するマーカーとを、複合体が形成される以前に、かつ（ａ）
と（ｂ）がハイブリッド形成しない条件下でされない条件下で合体させ、 二本鎖が形成され、複合体が形成されるように環境条件を定常的に調節し、 （ａ）と（ｂ）のハイブリッド形成が生起したことを示す出力信号（これをアニ
ーリングポイントと呼ぶ）を測定することからなるＤＮＡ変異の検出方法。 - 【請求項５】 各々が変異の異なる対立遺伝子に特異的なプローブを有する
２つあるいはそれ以上の一連の複合体を形成し、変異の対立遺伝子が識別される
ように、、場合によっては、ホモ接合状態かヘテロ接合状態かが識別できるよう
に、個々の変性条件あるいはアニーリング条件（例えば、変性温度またはアニー
リング温度）を観察することを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載の方法。 - 【請求項６】 マーカーが二本鎖ＤＮＡに挿入された場合に蛍光するマーカ
ーである請求項１〜５の何れかに記載の方法。 - 【請求項７】 変性ポイントまたはアニーリングポイントが、蛍光測定曲線
の一次導関数を参照して決定される請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 変性ポイントまたはアニーリングポイントが、蛍光測定曲線
の二次導関数を参照して決定される請求項６記載の方法。 - 【請求項９】 一本鎖が支持材に付着されている先行前記請求項の何れかに
記載の方法。 - 【請求項１０】 上記の付着が、ビオチン／ストレプタビジン型の相互作用
によってなされている請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 複合体が、適当な緩衝液内においてプローブとマーカを一
本鎖に添加することによって形成される先行請求項の何れかに記載の方法。 - 【請求項１２】 緩衝液がヘペス緩衝液である請求項１０記載の方法。
- 【請求項１３】 蛍光挿入色素を用い、このときの色素がＳＹＢＲグリーン
Ｉである先行請求項の何れかに記載の方法。 - 【請求項１４】 一本鎖が、標的配列をＰＣＲ増幅した二本鎖ＤＮＡ生成物
から派生させる先行請求項の何れかに記載の方法。 - 【請求項１５】 前記ＰＣＲ生成物は少なくとも１００塩基対の長さである
請求項１４記載の方法。 - 【請求項１６】 前記ＰＣＲ生成物は４０〜１００塩基対の長さである請求
項１４記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9821989.2 | 1998-10-08 | ||
| GBGB9821989.2A GB9821989D0 (en) | 1998-10-08 | 1998-10-08 | Detection of nucleic acid polymorphism |
| PCT/GB1999/003329 WO2000020633A1 (en) | 1998-10-08 | 1999-10-07 | Detection of nucleic acid polymorphism |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002526123A true JP2002526123A (ja) | 2002-08-20 |
Family
ID=10840243
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000574725A Pending JP2002526123A (ja) | 1998-10-08 | 1999-10-07 | 核酸多形現象の検出 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7179589B2 (ja) |
| EP (1) | EP1117832B1 (ja) |
| JP (1) | JP2002526123A (ja) |
| AT (1) | ATE427999T1 (ja) |
| AU (1) | AU744929B2 (ja) |
| DE (1) | DE69940698D1 (ja) |
| GB (1) | GB9821989D0 (ja) |
| WO (1) | WO2000020633A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2009130797A1 (ja) * | 2008-04-22 | 2011-08-11 | 東洋鋼鈑株式会社 | Ａｂｏ式血液型を判定するためのプローブセット |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6656692B2 (en) | 1999-12-21 | 2003-12-02 | Ingeneus Corporation | Parallel or antiparallel, homologous or complementary binding of nucleic acids or analogues thereof to form duplex, triplex or quadruplex complexes |
| US6420115B1 (en) | 1999-12-21 | 2002-07-16 | Ingeneus Corporation | Cation mediated triplex hybridization assay |
| US6900300B1 (en) | 2000-09-19 | 2005-05-31 | Ingeneus Corporation | Quadruplex DNA and duplex probe systems |
| US6403313B1 (en) * | 1999-12-21 | 2002-06-11 | Ingeneus Corporation | Fluorescent intensity assay for duplex and triplex nucleic acid hybridization solution utilizing fluorescent intercalators |
| US6858390B2 (en) | 1998-12-31 | 2005-02-22 | Ingeneus Corporation | Aptamers containing sequences of nucleic acid or nucleic acid analogues bound homologously, or in novel complexes |
| US6911536B1 (en) | 1999-12-21 | 2005-06-28 | Ingeneus Corporation | Triplex and quadruplex catalytic hybridization |
| US7309569B2 (en) | 1999-12-21 | 2007-12-18 | Ingeneus, Inc. | Parallel or antiparallel, homologous or complementary binding of nucleic acids or analogues thereof to form duplex, triplex or quadruplex complexes |
| US6924108B2 (en) | 1999-12-21 | 2005-08-02 | Ingeneus Corporation | Nucleic acid binding enhancement by conjugation with nucleotides, nucleosides, bases and/or their analogues |
| US6927027B2 (en) | 1999-12-21 | 2005-08-09 | Ingeneus Corporation | Nucleic acid multiplex formation |
| US7052844B2 (en) | 1999-12-21 | 2006-05-30 | Ingeneus, Inc. | Purification of DS-DNA using heteropolymeric capture probes and a triplex, quadruplex or homologous duplex binding mechanism |
| US6982147B2 (en) | 2000-01-24 | 2006-01-03 | Ingeneus Corporation | Apparatus for assaying biopolymer binding by means of multiple measurements under varied conditions |
| US6613524B1 (en) | 2000-01-24 | 2003-09-02 | Ingeneus Corporation | Amperometric affinity assay and electrically stimulated complexes of nucleic acids |
| US7220541B2 (en) | 2000-01-24 | 2007-05-22 | Ingeneus, Inc. | Homogeneous assay of biopolymer binding by means of multiple measurements under varied conditions |
| WO2001059144A1 (en) | 2000-02-10 | 2001-08-16 | The Penn State Research Foundation | Method of analyzing single nucleotide polymorphisms using melting curve and restriction endonuclease digestion |
| US20020182622A1 (en) * | 2001-02-01 | 2002-12-05 | Yusuke Nakamura | Method for SNP (single nucleotide polymorphism) typing |
| AU2003286573B2 (en) * | 2002-10-23 | 2009-09-10 | Idaho Technology, Inc. | Amplicon melting analysis with saturation dyes |
| EP1437416A1 (en) * | 2002-10-24 | 2004-07-14 | Ben Gao | Method and equipment to monitor nucleic acid hybridization on a dna chip using four-dimensional parameters |
| WO2004061130A1 (ja) * | 2002-12-27 | 2004-07-22 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | 塩基多型の同定方法 |
| WO2004097371A2 (en) * | 2003-04-25 | 2004-11-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | System and method for the detection of analytes |
| US9317922B2 (en) | 2003-05-16 | 2016-04-19 | Board Of Regents The University Of Texas System | Image and part recognition technology |
| US7956175B2 (en) | 2003-09-11 | 2011-06-07 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of bacteria |
| US9657347B2 (en) | 2004-04-20 | 2017-05-23 | University of Utah Research Foundation and BioFire Defense, LLC | Nucleic acid melting analysis with saturation dyes |
| JP3916086B2 (ja) * | 2004-06-29 | 2007-05-16 | ソニー株式会社 | ハイブリダイゼーションなどの相互作用を検出する方法及び検出部、該検出部を備えるバイオアッセイ用基板、ハイブリダイゼーションなどの相互作用を検出する装置、並びに試薬キット |
| WO2006127609A2 (en) | 2005-05-23 | 2006-11-30 | The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs | Polymorphism in the macrophage migration inhibitory factor (mif) gene as marker for prostate cancer |
| US20070072193A1 (en) * | 2005-09-27 | 2007-03-29 | Shah Manish M | Ligand arrays having controlled feature size, and methods of making and using the same |
| US20070154892A1 (en) * | 2005-12-30 | 2007-07-05 | Simon Wain-Hobson | Differential amplification of mutant nucleic acids by PCR in a mixure of nucleic acids |
| US8309304B2 (en) | 2006-02-10 | 2012-11-13 | The University Of Hong Kong | Label-free optical sensing and characterization of biomolecules by d8 or d10 metal complexes |
| US8057989B2 (en) | 2006-02-10 | 2011-11-15 | The University Of Hong Kong | Label-free optical sensing and characterization of biomolecules by d8 or d10 metal complexes |
| US7555933B2 (en) | 2006-08-01 | 2009-07-07 | Thermo Fisher Scientific Inc. | Method and software for detecting vacuum concentrator ends-of-runs |
| WO2009151982A1 (en) * | 2008-05-30 | 2009-12-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of francisella |
| US8219324B2 (en) * | 2008-09-12 | 2012-07-10 | Roche Molecular Systems, Inc. | Real-time PCR elbow calling by equation-less algorithm |
| US20100129796A1 (en) * | 2008-11-24 | 2010-05-27 | Micah Halpern | Dye probe fluorescence resonance energy transfer genotyping |
| EP2436777B1 (en) | 2009-05-26 | 2015-08-19 | Xiamen University | Method for detecting variations in nucleic acid sequences |
| US10176293B2 (en) | 2012-10-02 | 2019-01-08 | Roche Molecular Systems, Inc. | Universal method to determine real-time PCR cycle threshold values |
| CN106908655B (zh) * | 2017-03-06 | 2019-06-14 | 广东顺德工业设计研究院(广东顺德创新设计研究院) | 光电信号峰值检测方法与系统 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4824776A (en) * | 1985-07-25 | 1989-04-25 | Molecular Biosystems, Inc. | Method for increasing the sensitivity of nucleic acid hybridization assays |
| DE69125441T2 (de) * | 1990-09-28 | 1997-11-06 | Toshiba Kawasaki Kk | Verfahren zum Gennachweis |
| US6048690A (en) * | 1991-11-07 | 2000-04-11 | Nanogen, Inc. | Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis |
| AU3140293A (en) * | 1991-11-22 | 1993-06-15 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | Device and method for detection of compounds which intercalate with nucleic acids |
| EP0730662A4 (en) * | 1993-09-10 | 1999-11-24 | Genevue Inc | OPTICAL DETECTION OF THE POSITION OF OLIGONUCLEOTIDES ON LARGE DNA MOLECULES |
| EP0720659A1 (en) * | 1993-09-23 | 1996-07-10 | Zeneca Limited | Nucleic acid detection with energy transfer |
| PT1179600E (pt) * | 1996-06-04 | 2005-08-31 | Univ Utah Res Found | Monitorizacao da hibridacao durante a rcp |
| AU6534898A (en) * | 1997-02-14 | 1998-09-08 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Detection of double-stranded dna in a homogeneous solution |
| US6406845B1 (en) * | 1997-05-05 | 2002-06-18 | Trustees Of Tuft College | Fiber optic biosensor for selectively detecting oligonucleotide species in a mixed fluid sample |
| GB9725197D0 (en) * | 1997-11-29 | 1998-01-28 | Secr Defence | Detection system |
| AU2002246811A1 (en) * | 2000-12-29 | 2002-08-06 | Chromagen, Inc. | Scanning spectrophotometer for high throughput fluorescence detection |
-
1998
- 1998-10-08 GB GBGB9821989.2A patent/GB9821989D0/en not_active Ceased
-
1999
- 1999-10-07 EP EP99949176A patent/EP1117832B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-07 AT AT99949176T patent/ATE427999T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-10-07 JP JP2000574725A patent/JP2002526123A/ja active Pending
- 1999-10-07 WO PCT/GB1999/003329 patent/WO2000020633A1/en active IP Right Grant
- 1999-10-07 DE DE69940698T patent/DE69940698D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-07 AU AU62160/99A patent/AU744929B2/en not_active Ceased
-
2001
- 2001-01-05 US US09/755,747 patent/US7179589B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2009130797A1 (ja) * | 2008-04-22 | 2011-08-11 | 東洋鋼鈑株式会社 | Ａｂｏ式血液型を判定するためのプローブセット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU744929B2 (en) | 2002-03-07 |
| GB9821989D0 (en) | 1998-12-02 |
| US7179589B2 (en) | 2007-02-20 |
| AU6216099A (en) | 2000-04-26 |
| EP1117832A1 (en) | 2001-07-25 |
| ATE427999T1 (de) | 2009-04-15 |
| US20010046670A1 (en) | 2001-11-29 |
| WO2000020633A1 (en) | 2000-04-13 |
| EP1117832B1 (en) | 2009-04-08 |
| DE69940698D1 (ja) | 2009-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2002526123A (ja) | 核酸多形現象の検出 | |
| JP5112592B2 (ja) | ハイブリダイゼーション・ビーコン、並びに迅速に配列を検出および判別する方法 | |
| US10240189B2 (en) | Solid support assay systems and methods utilizing non-standard bases | |
| JP3937136B2 (ja) | 塩基多型の検出方法 | |
| US6506568B2 (en) | Method of analyzing single nucleotide polymorphisms using melting curve and restriction endonuclease digestion | |
| WO1992016657A1 (en) | Method of identifying a nucleotide present at a defined position in a nucleic acid | |
| WO2002018659A2 (en) | Method for determining alleles | |
| AU2473900A (en) | Primer extension methods utilizing donor and acceptor molecules for detecting nucleic acids | |
| US20060008826A1 (en) | Method for determining alleles | |
| JP4228041B2 (ja) | 塩基多型の検出方法 | |
| US6593092B2 (en) | Beta 2 adrenergic polymorphism detection | |
| EP1683872A1 (en) | Method of increasing discrimination for a single base mismatch using hurdle DNA's and artificially mismatched probes | |
| AU6676898A (en) | Nucleic acid analysis methods | |
| KR20120124029A (ko) | 다형 검출용 프로브, 다형 검출 방법, 약효 판정 방법 및 다형 검출용 시약 키트 | |
| JP2002017399A (ja) | 塩基多型を検出する方法 | |
| US20070269803A1 (en) | Fluorogenic Nucleic Acid Probes Including Lna for Methods to Detect and/or Quantify Nucleic Acid Analytes | |
| JP4310675B2 (ja) | 塩基多型の同定方法 | |
| JP2005287499A (ja) | 塩基多型の同定方法 | |
| CA2426346A1 (en) | Genotyping using partially-complementary probes |