WO2004061130A1 - 塩基多型の同定方法 - Google Patents

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WO2004061130A1
WO2004061130A1 PCT/JP2002/013776 JP0213776W WO2004061130A1 WO 2004061130 A1 WO2004061130 A1 WO 2004061130A1 JP 0213776 W JP0213776 W JP 0213776W WO 2004061130 A1 WO2004061130 A1 WO 2004061130A1
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Yutaka Takarada
Yoshihiro Soya
Yoshihisa Kawamura
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Toyo Boseki Kabushiki Kaisha
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying a mutation or polymorphism in a nucleic acid sequence.
  • the present invention is particularly useful for diagnosis of genetic diseases, nucleotide polymorphism analysis, and the like.
  • a nucleotide polymorphism means having a nucleotide sequence different from that of a wild type.
  • Gene polymorphism plays an important role in drug metabolism as a cause of inter-individual variability in the occurrence of side effects and treatment failures, and is also known as a cause of individual differences such as the basic generation known as constitution. In addition, they also serve as genetic markers for many diseases. Therefore, the elucidation of these mutations is clinically important, and the phenotyping of rutin is particularly recommended for psychiatric patients and volunteers in clinical research (Gram and Brsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics. Commission of the European Communities, Luxembourg, 1990, pp. 87-96; Balant et al., Eur. J. Clin. Pharmacol.
  • nucleic acid sequence analysis method for detecting each genotype subsequent to the identification of the causative mutant gene is desired.
  • nucleic acid sequencing method As a conventional nucleic acid sequence analysis technique, for example, there is a nucleic acid sequencing method (sequencing method). Nucleic acid sequencing method has the ability to detect and identify nucleotide polymorphisms contained in nucleic acid sequences.It is a great deal of work to perform preparation of type ⁇ nucleic acids, DNA polymerase reaction, polyacrylamide gel electrophoresis, analysis of nucleic acid sequences, etc. Requires labor and time. In addition, although labor saving can be achieved by using a recent automatic sequencer, there is a problem that an expensive device is required.
  • a PCR (polymerase chain reaction) method Japanese Patent Publication No. 4-697960, Japanese Patent Publication No.
  • a method for detecting a point mutation in a gene using a gene amplification method such as that described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-957
  • a wild-type oligonucleotide completely complementary to the end region of the amplification region of the wild-type gene and a mutant-type oligonucleotide are used as one of the pair of oligonucleotides used in the gene amplification method.
  • a mutant oligonucleotide completely complementary to the end region of the gene amplification region is used.
  • the mutant oligonucleotide is a nucleotide whose 3 'end is complementary to a nucleotide having a predicted point mutation.
  • the sample gene is subjected to a gene amplification method using such oligonucleotides for wild type and mutant type separately. If the sample gene is wild-type, nucleic acid amplification will occur when using the wild-type oligonucleotide, but if a mutant-type oligonucleotide is used, the 3, 3 end of the oligonucleotide will correspond to the sample gene. Since it is not complementary to the nucleotide (mismatch), no elongation reaction occurs and no nucleic acid amplification occurs.
  • sample gene is mutated, amplification does not occur when the wild-type oligonucleotide is used, and amplification occurs when the mutated oligonucleotide is used. Therefore, it is possible to determine whether the sample gene is wild-type or mutant by examining whether or not the amplification can occur when each oligonucleotide is used, thereby identifying a point mutation in the sample gene. can do.
  • the amplified product is subjected to agarose gel electrophoresis, stained with a nucleic acid-specific binding fluorescent reagent such as ethidium diamide, and then irradiated with UV to amplify the amplified nucleic acid. Can be detected.
  • the amplified nucleic acid is immobilized on a nylon membrane and detected using a labeled probe. The southern plot method is used.
  • a method such as the hitch hybridization method has been developed.
  • a recently developed detection method uses fluorescence resonance energy transfer (FRET) instead of directly detecting the fluorescence intensity to detect the formation of a probe hybrid.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • Fluorescence resonance energy transfer occurs between the donor phosphor and the quencher dye (which may or may not be a phosphor), and the absorption spectrum of one (quencher) becomes the other (donor). Occurs when the two dyes come close to each other and overlap with the emission spectrum.
  • Dyes with are called donor / quencher dye pairs or energy transfer dye pairs.
  • the excited state energy of the donor phosphor is transferred to a nearby quencher by dipole interactions caused by the resonant dipole. As a result, quenching of the donor phosphor occurs. In some cases, when the quencher is also a phosphor, the fluorescence intensity may be enhanced.
  • FRET and related methods are based on monitoring the change in the fluorescent properties of one or both dye labels when two complementary oligonucleotides are combined by hybridization.
  • the change in the fluorescence characteristics is measured as a change in the amount of energy transfer or a change in the amount of fluorescence quenching, and is typically indicated as an increase in the fluorescence intensity of one of the dyes.
  • the target nucleotide sequence can be detected without separating the non-hybridized oligonucleotide and the hybridized oligonucleotide.
  • One is a donor fluorophore and the other is capable of producing a hybrid between two separate complementary oligonucleotides labeled with a quencher.
  • the nucleotide polymorphism can be identified by obtaining a FRET signal in a polymorphism-specific manner.
  • oligonucleotide does not form a hybrid
  • the donor and quencher can be linked to a single oligonucleotide such that there is a detectable difference in one or both fluorescence properties between the row and the hybridized case.
  • Tyagi and Kramer (1996; Natm'e Biotech. 14, 303-308) describe a hairpin structure labeled as above containing a detection sequence in a loop between the self-complementary arms of the hairpin structure forming the stem. Has been reported. The base-paired stem must melt in order for the detection sequence to hybridize to the target and cause reduced quenching. A "double hairpin" probe and how to use it can be found in B. Bagwell, et al.
  • Nucleotide polymorphisms can be identified using this method by selecting a nucleotide polymorphism-specific sequence as the target binding sequence.However, in general, differences in single nucleotides can be identified by oligonucleotide hybridization. Requires the setting of strict hybridization conditions.
  • nucleotide polymorphism can be identified by using a double-labeled detection probe as a nucleotide polymorphism-specific probe.
  • the amplified nucleic acid can be easily detected and the polymorphism can be identified by the method described above, the operation is complicated in the conventional method, and it is difficult to quantify the detected value. As a result, it became difficult to analyze the ratio of the wild-type signal to the polymorphic signal, and a great deal of work was required to accurately identify the polymorphism.
  • the electrophoresis method it is necessary to separately detect the wild type and the polymorphism, and it is difficult to accurately quantify the amount of the nucleic acid from the electrophoresis image.
  • the Southern blot method (sandwich hybridization) still requires a hybridization reaction with a probe, and the conditions must be strictly adjusted. Further, a step of removing an excessive probe is required, and the operation is very complicated.
  • the method using FRET enables uniform analysis and does not require removal of excess probe, which facilitates detection.However, two oligonucleotides that are differently labeled for each polymorphism Probes are required or doubly labeled probes are required.
  • An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems and to provide a method and a reagent capable of clearly and reproducibly detecting a polymorphism in a nucleic acid sequence.
  • FIG. 1 shows the fluorescence intensity of each sample in the detection of nucleotide polymorphism in the j33 adrenergic receptor gene.
  • the present inventors have conducted intensive studies and found that, compared to the above-described conventional method, a wild-type oligonucleotide and a nucleic acid sequence containing at least one specific nucleotide polymorphism site are labeled. ⁇ After reacting one or two kinds of mutant oligonucleotides simultaneously or separately, a nucleic acid specific label is acted on, and the nucleic acid specific label is By measuring the interaction, we found a method that does not require complicated detection operations and a large number of expensive labeled probes, and can easily obtain numerically coded data, and thus enables clear polymorphism identification. The invention has been completed.
  • the present invention has the following configuration.
  • nucleic acid-specific label is double-stranded nucleic acid-specific.
  • nucleic acid-specific label is a fluorescent dye.
  • [6] Perform a polymorphism-specific amplification reaction using at least one labeled oligonucleotide for wild type and one or two types of oligonucleotides for mutant type, and measure during and / or after the amplification reaction.
  • a nucleic acid sequence containing a specific nucleotide polymorphism site contained in a sample is simultaneously labeled with at least one wild-type oligonucleotide and one or two mutant oligonucleotides as primers.
  • the elongation product is subjected to an elongation reaction in a polymorphism-specific manner, and then a nucleic acid-specific label is applied to the elongation product.
  • the interaction between the oligonucleotide label and the nucleic acid-specific label allows base polymorphism to be detected. How to identify.
  • nucleic acid-specific label is specific to a double-stranded nucleic acid.
  • nucleic acid-specific label is a fluorescent dye.
  • label of the oligonucleotide is a fluorescent dye.
  • a method for identifying a nucleotide polymorphism present in a specific nucleic acid sequence contained in a sample comprises the following steps:
  • An elongation reaction is performed by using at least one fluorescently labeled wild type oligonucleotide and one or two types of mutant type oligonucleotides as primers.
  • a complementary oligonucleotide is allowed to act on the extension product to cause an extension reaction to generate a double-stranded nucleic acid.
  • a method comprising:
  • the label of the oligonucleotide may be any label as long as it interacts with the nucleic acid-specific label.
  • FITC FITC
  • 6-FAM HEX
  • TET TAMRA
  • Texas Red ROX
  • LCRED 640 LCRED 705, Cy3, Cy5, rhodamine, etc., but not limited thereto.
  • Preferred labels are exemplified by Texas Red, R ⁇ X, LCRED 640, LCRED 705.
  • At least one oligonucleotide selected from the group consisting of a wild-type oligonucleotide and one or two mutant oligonucleotides is labeled with the label. Signs have the following combinations:
  • oligonucleotide When a wild-type oligonucleotide and one kind of mutant-type oligonucleotide are used, it is possible to label one or both oligonucleotides. Preferably, either one of the wild-type or mutant-type oligonucleotides is used. Oligonucleotides are preferably labeled, most preferably wild-type oligonucleotides.
  • oligonucleotides for wild type and oligo nucleotides for mutant type are labeled, they are labeled with different labels.
  • Preferred label combinations are Texas Red and LCRED 705 for the two labels and Texas Red, ROX and LCRED 705 for the three labels.
  • the fluorescence wavelengths of Cyber Green I and Texas Red after FRET are 612 nm, and those of Cyper Green I and LCRED 705 are different. Since the fluorescence wavelength after FRET is 705 nm, it is easy to determine which oligonucleotide was PCR amplified by measuring the fluorescence wavelength.
  • the position of the label for the wild-type or mutant-type oligonucleotide may be any position except the 3 'end, but is preferably the 5' end.
  • a nucleic acid-specific label is used for a nucleic acid on which a labeled oligonucleotide has reacted.
  • Any label can be used as long as it specifically binds and interacts with the label of the oligonucleotide, and a label specific to a double-stranded nucleic acid is preferable.
  • double-strand-specific labels include Cyber Green I (intermediate to double-strand), etidizumab-mido, ataridine orange, thiazonore orange, oxazole yellow, mouth-damine, pico green, etc. However, this is not the case.
  • Preferred nucleic acid-specific labels are Cyber Green I and Pico Green, particularly preferably Cyper Green I.
  • the nucleic acid-specific label for example, a double-stranded nucleic acid after PCR amplification using a wild-type oligonucleotide and a mutant-type oligonucleotide, which binds to a position near the label, contributes to FRET.
  • Cypergreen I when Cypergreen I is used as a nucleic acid-specific label, the label uniformly binds to the double-stranded nucleic acid, but the label that binds near the 5′-end label of the oligonucleotide contributes to FRET, resulting in amplification. It is easy to determine whether the obtained oligonucleotide corresponds to two or three types of wild-type or mutant-type oligonucleotides.
  • the determination of the nucleotide polymorphism by the interaction between the oligonucleotide label and the nucleic acid-specific label can be performed, for example, as follows.
  • the fluorescence wavelength of the oligonucleotide label is 11
  • the fluorescence wavelength of the nucleic acid-specific label is L2
  • the excitation wavelength of the nucleic acid-specific label is Lex
  • the detection signal FL1 ⁇ ex / ⁇ 1
  • detection signal FL2 ⁇ ⁇ / ⁇ 2
  • FL1 / FL2 based on the value of FL1 / FL2, it is determined whether it corresponds to wild type homo, hetero, mutant homo It can be determined.
  • the method of the present invention measures based on the fluorescence amount of the nucleic acid label and the fluorescence amount of FRET with the labeled oligonucleotide. For example, when wild-type oligonucleotides (unlabeled) and mutant oligonucleotides (labeled) are used, if the sample is wild-type homozygous (wild-type / wild-type), there is no FRET signal of the mutant-labeled oligonucleotide. Therefore, the only signal obtained is the signal of the nucleic acid-specific label.
  • the sample is a mutant homozygous (mutant / mutant)
  • the FRET signal of the mutant-labeled oligonucleotide and the mutant oligonucleotide Since two kinds of signals of the nucleic acid-specific labeling by the amplification product of the above are obtained, it is possible to easily discriminate between the wild type homolog and the mutant type homo.
  • Hetero wild type / mutant type
  • the chromosome containing a specific nucleotide polymorphism site or a fragment thereof contained in a sample is not particularly limited as long as it is a target nucleic acid containing a nucleotide polymorphism site that carries information on a target gene.
  • the target nucleic acid include an Alu sequence, exons and introns of a gene encoding a protein, and a promoter. More specifically, it includes genes related to various diseases including genetic diseases, drug metabolism, and lifestyle-related diseases (such as hypertension and diabetes). For example, hypertension includes the ACE (Angiotensin I Converting Enzyme) gene.
  • ACE Angiotensin I Converting Enzyme
  • a nucleic acid sequence may be simply referred to as a nucleic acid.
  • a mutant nucleic acid is a nucleic acid in which at least one, preferably one nucleotide, of a wild-type nucleic acid is point-mutated and replaced with another nucleotide, or inserted or deleted in a part of a wild-type nucleic acid.
  • a nucleic acid containing a sequence, etc., in which nucleotide at which site is mutated has been elucidated. It has been elucidated that the constitutions and the like differ depending on such nucleotide polymorphisms, and the method of the present invention detects whether or not the nucleic acid in the sample has such an expected mutation. Is the way.
  • the reaction that causes the wild-type oligonucleotide and the mutant oligonucleotide to act generally means that the target nucleic acid denatured into a single-stranded oligonucleotide has four oligonucleotides and four types of deoxynucleoside triphosphates (d By using NTP) and DNA polymerase, an oligonucleotide extension reaction using the target nucleic acid as a type II occurs, and a reaction in which a complementary strand of the nucleic acid sequence is synthesized is included.
  • NTP deoxynucleoside triphosphates
  • the wild-type oligonucleotide is an oligonucleotide having a sequence complementary to a chromosome containing a nucleotide polymorphism site having a normal phenotype or a fragment thereof, and is referred to as a mutant-type oligonucleotide.
  • a mutant-type oligonucleotide Is an oligonucleotide having a sequence complementary to a chromosome or a fragment thereof containing a nucleotide polymorphism site having a sequence different from that of the wild type.
  • the oligonucleotide used in the present invention is an oligonucleotide for wild type and mutant type.
  • the nucleotide at the 3 'end or the second nucleotide from the 3' end of the nucleotide was designed to correspond to the nucleotide of the mutant sequence.
  • each oligonucleotide must have at least the 3'-end or the 2nd sequence from the 3'-end. An elongation reaction occurs because they match.
  • the length of the oligonucleotide in the present invention is 13 to 35 bases, preferably 16 to 30 bases, and the above-mentioned mismatch site is present at least one in the oligonucleotide.
  • the position is not particularly limited as long as it is any one of from the 3 ′ end to the 5 ′ end, but is preferably a position close to the 3 ′ end, more preferably from the 3 ′ end. The third is preferred.
  • the elongation reaction is not expected, and when the nucleic acid sequence is ⁇ -shaped, a mismatch of two bases is generated together with the nucleotide polymorphism site, and the elongation reaction is strongly inhibited.
  • the above-mentioned wild-type oligonucleotide and one or two kinds of mutant-type oligonucleotides are allowed to act on a sample separately or simultaneously.
  • the method for extending an oligonucleotide can be basically performed using a conventional method.
  • a single-stranded denatured chromosome or a fragment thereof containing a specific nucleotide polymorphism site is combined with four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) and a DNA polymerase together with a wild-type oligonucleotide,
  • dNTPs deoxynucleoside triphosphates
  • a DNA polymerase elongated with the target nucleic acid as type II.
  • the extension reaction can be performed according to the method described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., 1989). Further, in the method for detecting a base polymorphism based on whether or not the oligonucleotide has been extended, if the target nucleic acid is not contained in an amount sufficient to detect the nucleic acid fragment, a nucleic acid fragment containing the polymorphic sequence may be previously detected. Amplification can also be performed by the following amplification reaction.
  • a method for amplifying a chromosome or a fragment containing a specific nucleotide polymorphism site can also be basically performed using a conventional method, and usually, a specific nucleotide polymorphism modified into a single strand.
  • a chromosome or a fragment thereof containing four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTPs), a DNA polymerase and a reverse primer, a wild-type oligonucleotide, and one or two types of mutant-type oligonucleotides (Corresponding to a formal primer) are used simultaneously or separately, and the target nucleic acid is amplified as a type III gene between the forward oligonucleotide and the reverse oligonucleotide.
  • nucleic acid amplification method examples include PCR, NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification method; Nature, Vol. 350, p. 91 (1991)), LCR (International Publication No. 89/12696, and JP-A-2-2934). ), SDA (Strand Displacement Amplification: Nucleic aGid research 3 ⁇ 4 20, 1691 Sada (1992)), RCR (International Publication 9 OZ1069), TMA (Transcription mediated amplification method; J. Clin. Microbiol. 31) :, P. 3270 (1993)).
  • the PCR method consists of three steps: denaturation, annealing, and elongation in the presence of a sample nucleic acid, four types of deoxynucleoside triphosphates, a pair of oligonucleotides, and a thermostable DNA polymerase.
  • This is a method of exponentially amplifying the sample nucleic acid region sandwiched between the pair of oligonucleotides by repeating the cycle. That is, in the denaturation step, the nucleic acid of the sample is denatured, and in the subsequent annealing step, each oligonucleotide is hybridized with a region on the single-stranded sample nucleic acid that is complementary to each oligonucleotide.
  • the DNA strand complementary to each single-stranded sample nucleic acid that becomes a type II by the action of DNA polymerase as a starting point is extended to obtain double-stranded DNA.
  • one double-stranded DNA is amplified into two double-stranded DNAs.
  • 'Thus if this cycle is repeated ⁇ times, the region of the sample DN ⁇ sandwiched between the pair of oligonucleotides is theoretically amplified 2 n times. Since the amplified DNA region exists in a large amount, it can be easily detected by a method such as electrophoresis. Therefore, by using the gene amplification method, it is possible to detect a very small amount (even a single molecule) of a sample nucleic acid, which was previously undetectable. It is always a widely used technology.
  • a gene amplification method is performed using a wild-type oligonucleotide capable of amplifying a wild-type nucleic acid and a mutant-type oligonucleotide capable of amplifying a mutant nucleic acid separately or simultaneously.
  • a reaction occurs when the sample nucleic acid is wild-type, but does not occur when the mutant nucleic acid is used. Conversely, when the sample nucleic acid is extended or amplified using the mutant oligonucleotide, the reaction occurs if the sample nucleic acid is mutant, but does not occur if the sample nucleic acid is wild-type. Therefore, one sample was divided into two, one was reacted using the wild-type oligonucleotide, and the other was performed using the mutant-type oligonucleotide to determine whether the reaction occurred.
  • sample nucleic acid is a wild type or a mutant type.
  • higher organisms, including humans have one father-derived gene and one maternal-derived gene for one type of gene. You can also distinguish between mutant, homozygous, or both. That is, in the case of heterozygous reaction, since both the wild-type gene and the mutant gene are present, a reaction occurs when the wild-type oligonucleotide is used or when the mutant-type oligonucleotide is used.
  • oligonucleotide can also be used for a hybridization method using a labeled oligonucleotide. That is, polymorphism-specific and wild-type-specific oligonucleotides are prepared for the target nucleic acid, and each oligonucleotide is allowed to act simultaneously or separately, so that the labeling of each oligonucleotide and the nucleic acid-specific label are performed. Nucleotide polymorphisms can be identified by detecting the interaction between the nucleotides.
  • the above-mentioned polymorphism-specific oligonucleotide is subjected to a nucleic acid amplification reaction such as PCR using the outer sequence where hybridization is performed as a primer, or after that, the above-mentioned polymorphism-specific probe is acted on to cause the nucleotide polymorphism. Identification is possible.
  • detection can be performed only once.
  • the kit includes a wild-type oligonucleotide and one or more It contains a reagent kit for detecting base polymorphisms containing two types of oligonucleotides for mutations, a DNA polymerase, and four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTPs).
  • dNTPs deoxynucleoside triphosphates
  • a reverse oligonucleotide may be further contained.
  • Oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 were synthesized by a phosphoramidite method using DNA synthesizer 392 manufactured by PerkinElmer Inc. The synthesis was performed according to the manual, and the deprotection of various oligonucleotides was carried out overnight at 55 ° C with ammonia water. Oligonucleotide purification was carried out on a Perkin Elmer 0PC column. Alternatively, we commissioned a DNA synthesis contract company (Japan Bioservice Co., Ltd., Saddy Co., Ltd., GENSETKK, Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd., etc.).
  • Oligo 1 has the wild-type ( ⁇ ) nucleotide sequence second from the 3 'end, and an artificial mismatch (C ⁇ A) third, and oligo 2 has the mutated (C) second from the 3' end.
  • Oligo 3 is an antisense strand, and has an artificial mismatch (C ⁇ A) at the third position, and is used as an oligonucleotide in an amplification reaction in combination with Oligos 1 and 2.
  • Examples 1 to 8 Using a DNA solution (samples 1 to 8) extracted from human leukocytes by the phenol-black mouth method as a sump ⁇ , the following reagents were added, and the base of the human ⁇ 3 adrenergic receptor gene was added under the following conditions. Polymorphism (Trp64Arg) was analyzed. A 25 ⁇ l solution containing the following reagents was prepared.
  • the amount of fluorescence intensity was measured with a fluorescent plate reader (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) in a dark room. That is, the detection signal FL1 (355/612), the detection signal FL 2 calculates (355/5 38) and FL1 / FL2, the value of FL1 / FL2, wild-type homo (T / T), to terrorist (C / T) and mutant homozygous (C / C) were detected.
  • the time required was a few minutes.
  • the fluorescence intensity of the sample was calculated using the following formula.
  • 538 nm indicates the fluorescence wavelength of the nucleic acid label
  • 612 nm indicates the fluorescence wavelength of FRET.
  • FL1 indicates the fluorescence intensity of wild type
  • FLsl indicates the fluorescence intensity of FRET
  • FLb1 indicates the fluorescence intensity of planck.
  • FL2 shows the fluorescence intensity of the amplified double-stranded nucleic acid
  • FLs2 shows the fluorescence intensity of the nucleic acid label
  • FLb1 shows the fluorescence intensity of Planck.
  • a preferred embodiment of the present invention is characterized in that FRET between a nucleic acid-specific label and an oligonucleotide is applied to two types (wild type and mutant type) in one type of FRET reaction.
  • FRET FRET
  • no special post-processing is required for detection, and easy and quick processing can be performed.
  • Cybergreen is excited at 355 nm and emits 538 nm of fluorescence.
  • Texas red is originally excited at 584 nm and emits 612 nm fluorescence.
  • excitation at 355 nm and fluorescence at 612 nm are obtained, based on which the wild type and the mutant type can be distinguished.
  • the CZC type has FRET signal (FL 1) and cyber green I nucleic acid labeling signal (FL 2) because FRET occurs in all amplification products, and the FL 1 ZFL 2 ratio is high. FRET does not occur in the amplification products ⁇ and ⁇ ⁇ , and only (FL2) of the nucleic acid labeling signal is strong. 2 ratio will be lower.
  • the FL1 / FL2 ratio shows an intermediate value since CZT produces half of the amplification product FRET signal. The above clearly shows that three types of measurements are possible.
  • a base-specific amplification reaction is performed using a fixed amount of oligonucleotide, and a nucleic acid-specific label is applied to the amplification reaction substance, so that the target can be easily and quickly obtained without complicated operations.
  • the nucleic acid gene polymorphism could be clearly determined.

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Abstract

本発明は、試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、少なくとも一つが標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを同時に又は別々に反応させた後、核酸特異標識を作用させて、該標識と核酸特異標識との相互作用により塩基多型を同定する方法に関する。また、本発明は、少なくとも一つが蛍光標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ、核酸特異標識を含む試料中に含まれる特定核酸配列に存在する塩基多型を同定するキットに関する。

Description

明細書
塩基多型の同定方法 技術分野
本発明は、 核酸配列の変異または多型の同定方法に関する。 本発明は、 遺伝病 の診断、 塩基多型解析等に際して特に有用である。
背景技術
本発明において、塩基多型とは野生型とは異なる塩基配列を有することをいう。 遺伝子の塩基多型は薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において個体 間変動の原因として重要な役割を果たし、 体質として知られる基礎代 »等の個人 差の原因としても知られている。 その上、 これらは多数の疾患の遺伝マーカーと しての働きもする。 それゆえ、 これら突然変異の解明は臨床的に重要であり、 ル 一チンの表現型分類が臨床研究における精神医学患者おょぴ自発志願者にとって 特に推奨され ό ( Gram および Brsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics. Commission of the European Communities, Luxembourg, 1990, 第 8 7〜9 6頁； Balantら、 Eur. J. Clin. Pharmacol. 第 3 6卷、 第 5 5 1〜
5 5 4頁、 （1989) )。 また、原因となる変異型遺伝子の同定に続くそれぞれの遺伝 子型の検出用の核酸配列分析法が所望される。
従来の核酸配列分析技術としては、 例えば核酸配列決定法 （シークェンシング 法） がある。 核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、 同定する ことができる力 錶型核酸の調製、 D N Aポリメラーゼ反応、 ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、 核酸配列の解析等を行うため多大な労力と時間が必要である。 また近年の自動シークェンサ一を用いることで省力化は行うことができるが、 高 価な装置が必要であるという問題がある。
—方、 遺伝子の点突然変異により引き起こされる遺伝病が種々知られており、 それらの中には、 遺伝子のどの部位がどのように点突然変異することにより遺伝 病が引き起こされるかわかっているものも少なくない。
このような予想される点突然変異を検出する方法として、 従来より、 P C R (polymerase chain reaction)法 (特公平 4 - 6 7 9 6 0号公報、 特公平 4― 6 7 9 5 7号公報） などの遺伝子増幅法を利用した遺伝子の点突然変異の検出方法 が知られている。 この方法では、 遺伝子増幅法に用いる一対のオリゴヌクレオチ ドのうちの一方のォリゴヌクレオチドとして、 野生型遺伝子の増幅領域の端部領 域に完全に相補的な野生型用オリゴヌクレオチドと、 変異型遺伝子の増幅領域の 端部領域に完全に相補的な変異型用オリゴヌクレオチドとを用いる。 変異型のォ リゴヌクレオチドは、 その 3 ' 末端が予想される点突然変異を起こしたヌクレオ チドに相補的なヌクレオチドになっている。 このような野生型及び変異型用オリ ゴヌクレオチドをそれぞれ別個に用いて試料遺伝子を遺伝子増幅法に供する。 試料遺伝子が野生型であれば、 野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には 核酸の増幅が起きるが、 変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には、 オリゴ ヌクレオチドの 3， 末端が試料遺伝子の対応ヌクレオチドと相補的ではない （ミ スマッチ） ので伸長反応が起きず、 核酸の増幅は起きない。 一方、 試料遺伝子が 変異型であれば、 逆に、 野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には増幅が起 きず、 変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きる。 従って、 各ォ リゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きる力否かを調べることにより、 試料 遺伝子が野生型か変異型かを判別することができ、 それによつて試料遺伝子中の 点突然変異を同定することができる。 この時増幅がおきたか否かを調べる方法と して、 増幅産物をァガロースゲル電気泳動した後、'ェチジゥムブ口マイド等の核 酸特異的結合蛍光試薬を用いて染色の後、 UV照射して増幅核酸の有無を検出でき る。 またほかの様式として、 ナイロン膜上に増幅核酸を固定し、 標識プローブを 用いて検出するサザンプロット法、 個体担体上に固定した捕足プローブで捕捉し た後検出プローブを作用させて検出するサンドィツチハイプリダイゼーション法 などが開発されてきた。 . また最近開発された検出方法は、 プローブのハイプリッド形成の検出に蛍光強 度を直接検出するのではなく、 蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence Resonance Energy Transfer; F R E T)の方法を利用している。蛍光共鳴エネルギ 一移動は、 ドナー蛍光体と消光剤色素 (蛍光体でも、 蛍光体でなくてもよい。 ）の 間で発生し、一方 (消光剤)の吸収スぺクトルがもう一方（ドナー)の発光スぺクトル とオーバーラップし、 この 2つの色素が近接したときに発生する。 これらの特性 を有する色素は、 ドナー/消光剤色素対またはエネルギー移動色素対と呼ばれる。 ドナー蛍光体の励起状態エネルギーは、 共鳴双極子により引き起こされる双極子 相互作用により、 近くの消光剤に移動される。 その結果、 ドナー蛍光体の消光が 起こる。 場合によっては、 消光剤も蛍光体の場合、 その蛍光強度が増強されるこ ともある。エネルギー移動効率は、ドナーと消光剤の距離に高度に依存しており、 これらの関係を予測する式が Forster(1948. Ann. Phys.2, 55-75)により開発され ている。 エネルギー移動効率が 50%であるドナーと消光剤色素の距離は Forster 距離 (Ro)と呼ばれる。 蛍光消光の機序として他に、 例えば、 電荷移動消光および 衝突消光等がある。
近接する 2つの色素の相互作用により消光を引き起こすことに基づくエネルギ 一移動とその他の機序は、 均一方式で実施できるため、 ヌクレオチド配列を検出 または同定する魅力的な手段である。 均一分析方式は、 1つの蛍光体標識の蛍光 の検出に基づく従来のプローブハイプリッド形成分析法よりも簡単である。 なぜ ならば、 一般に、 不均一分析はハイブリッド形成していない遊離標識からハイプ リッド形成した標識を分離する更なるステップを必要とするからである。
典型的には、 FRETおよび関連方法は、 2つの相補的ォリゴヌクレオチドがハ イブリッド形成により結合された時に、 一方または両方の色素標識の蛍光特性の 変化を監視することに基づくものである。この方式にお!/、て、蛍光特性の変化は、 エネルギー移動量の変化として、 あるいは蛍光消光量の変化として測定され、 典 型的には、 一方の色素の蛍光強度の増加として示される。 この方法においては、 ハイブリッド形成しないォリゴヌクレオチドとハイブリッド形成したォリゴヌク レオチドを分離せずに、 目的のヌクレオチド配列を検出することが可能である。 一方はドナー蛍光体で、 もう一方は消光剤で標識された 2つの別々の相補的オリ ゴヌクレオチドの間でハイプリッド形成を生じることができる。 この時一方のォ リゴヌクレオチドを塩基多型特異的配列を有する場合多型特異的に F R E Tシグ ナルが得られることで塩基多型の同定が可能となる。
F R E Tハイブリッド形成分析法に関する幾つかの方式が、 Nonisotopic DNA Probe Techniq es(l992. Academic Press, Inc., pags. 311-352)に概説されている。 あるいは、 オリゴヌクレオチドがハイプリッド形成していない場合と、 相補的配 列とハイプリッド形成した場合とで、 一方または両方の蛍光特性に検出可能な差 が生じるように、 ドナーと消光剤を 1つのオリゴヌクレオチドに結合させること ができる。
この方式においては、 典型的には、 オリゴヌクレオチドがハイプリッド形成す るとドナー蛍光は増加し、 エネルギー移動/消光は減少する。 例えば、 両端に標識 された自己相補的オリゴヌクレオチドがヘアピン構造を形成すると、 これによつ て 2つの蛍光体 (即ち、 5'末端と 3，末端)が近接し、エネルギー移動と消光が起こる。 自己相補的オリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドの中の相補的配列が ハイプリッド形成すると、 ヘアピン構造は破壌され、 2 つの色素間距離が拡大す るため消光は減少する。 ヘアピン構造の欠点は、 安定性が非常に高く、 非消光ハ イブリツド形成型への変換がしばしば遅く、 僅かにそちらに偏るだけで、 一般的 に性能は低い。
Tyagiおよび Kramer(1996.Natm'e Biotech.14, 303-308)は、 ステムを形成す るヘアピン構造の自己相補的アームの間のループ中に検出配列を含む上記の様に 標識されたヘアピン構造を報告している。 塩基対合したステムは、 検出配列が標 的とハイブリッド形成し、 消光の減少を引き起こすためには融解しなくてはなら ない。 「二重ヘアピン」 プローブとそれを利用する方法が、 B. Bagwell, et al.
(1994. Nucl. Acids Res. 22, 2424-2425;米国特許 No.5,607,834)に報告されてい る。 これらの構造はヘアピン構造内に標的結合配列を含んでおり、 従って、 標的 とヘアピン構造の自己相補的配列との間に競合的ハイプリッド形成が関与してい る。 Bagwellは、 ミスマッチによりヘアピン構造を不安定化させることにより、 不利なハイプリッド形成速度論の問題を解決している。
標的結合配列に塩基多型特異的配列を選択することでこの方法を用いて塩基多 型の同定が可能であるが、 一般的に 1塩基の違いをオリゴヌクレオチドのハイプ リダイゼーション法により見分けるためには厳密なハイブリダイゼーシヨン条件 の設定が必要となる。
核酸増幅を検出するためにエネルギー移動またはその他の蛍光消光の機序を利 用する均一方法も報告されている。 L. G. Lee, et al. (1993. Nuc. Acids Res.21,
3761-3766)は、 PCR中に標的増幅に特異的に二重標識検出プローブが切断される リアルタイム検出方法を開示している。 検出プローブが増幅プライマーの下流で ハイブリッド形成されると、 Taqポリメラーゼの 5'-3'ェキソヌクレアーゼ活性が 検出プローブを消化し、エネルギー移動対を形成する 2つの蛍光色素を分離する。 この方法にぉ 、ても二重標識検出プローブを塩基多型特異的プローブとするこ とで塩基多型の同定が可能である。
上記のような方法により増幅核酸を検出し、 容易に多型を同定が行えるように 思われるが、 実際には、 従来の方法では操作は煩雑であり、 検出値を数値化する ことが困難であり、 その為に野生型シグナルと多型シグナルの比をとると言った 解析が困難となり、 正確な多型を同定するには多大な作業が必要であった。
たとえば電気泳動法によれば野生型及び多型を別々に検出する必要がありまた 泳動像から核酸量を正確に数値化することは困難である。 まだサザンプロット法 ゃサンドィッチノヽィブリダイゼーション法ではプローブとのハイブリダイゼーシ ヨン反応が必要であり、 その条件を厳密に整える必要がある。 更には過剰なプロ ーブを除去する工程が必要であり、 操作は非常に煩雑である。
また F R E Tを用いた方法は均一分析が可能であり過剰なプローブの除去等 が不必要で検出が容易になっているが、 各多型特異的に、 異なる標識を付与した 2本のォリゴヌクレオチドプローブが必要であったり、 2重標識プローブが必要 である。
本発明の目的は、 上記のような課題を解決して、 明確にかつ再現性よく核酸配 列中の多型を検出することができる方法及びそのための試薬を提供することであ る。
図面の簡単な説明
図 1は、 j3 3 adrenergic receptor遺伝子の塩基多型の検出における各試料の 蛍光強度を示す。
発明の開示
本発明者らは、 上記事情に鑑み、 鋭意研究の結果、 上記の従来法に対して、 特 定の塩基多型部位を含む核酸配列に、 少なくとも一つが標識されている野生型用 オリゴヌクレオチド及ぴ 1種又は 2種の変異型用オリゴヌクレオチドを同時に又 は別々に反応させた後、 核酸特異標識を作用させて、 該標識と核酸特異標識との 相互作用を測定することで、 煩雑な検出操作や高価な標識プローブを多数必要と せずまた容易に数値ィヒしたデータが得られ、 したがって明確な多型同定が可能と なる方法を見出し、 本発明を完成させるに至った。
すなわち、 本発明は以下のような構成からなる。
[ 1 ] 試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、 少なくとも一 つが標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び 1種又は 2種の変異型用ォ リゴヌクレオチドを同時に又は別々に反応させた後、核酸特異標識を作用させて、 該標識と核酸特異標識との相互作用により塩基多型を同定する方法。
[2] 核酸特異標識が 2本鎖核酸特異的であることを特徴とする [1] に記載 の方法。
[3] 核酸特異標識が蛍光色素であることを特徴とする [1] 及び [2] に記 載の方法。
[4] オリゴヌクレオチドの標識が蛍光色素である事を特徴とする [ 1 ]〜 [ 3 ] に記載の方法。
[5] 相互作用が蛍光共鳴エネルギー移動であることを特徴とする [ 1 ]〜 [4 ] に記載の方法。
[6] 少なくとも一つが標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び 1種 又は 2種の変異型用オリゴヌクレオチドを用いて多型特異的増幅反応を行い、 増 幅反応中及びまたは反応後に測定することを特徴とする [1] 〜 [5] 記載の方 法。
[7] 試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、 少なくとも一 つが標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及ぴ 1種又は 2種の変異型用ォ リゴヌクレオチドをプライマーとして同時に又は別々に作用させ、 多型特異的に 伸長反応を行った後、 伸長生成物に核酸特異的標識を作用させ、 該オリゴヌタレ ォチドの標識と該核酸特異的標識の相互作用により、 塩基多型を同定する方法。
[8] 核酸特異標識が 2本鎖核酸特異的であることを特徴とする [7] に記載 の方法。
[9] 核酸特異標識が蛍光色素であることを特徴とする [7] 及び 8に記載の 方法。 [10] オリゴヌクレオチドの標識が蛍光色素である事を特徴とする [7] 〜 [9] に記載の方法。
[11]相互作用が蛍光共鳴エネルギー移動であることを特徴とする [7：！〜 [1 0] に記載の方法。
[12] 試料中に含まれる特定の核酸配列が予め増幅されていることを特徴とす る [7] 〜 [11] に記載の方法。
[13] 少なくとも一つが標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び 1種 又は 2種の変異型用オリゴヌクレオチドを用いて多型特異的増幅反応を行い、 増 幅反応中及びまたは反応後に測定することを特徴とする [7] 〜 [12] 記載の 方法。
[14] 試料中に含まれる特定核酸配列に存在する塩基多型を同定する方法に おいて、 以下の工程、
1) 少なくとも一つが蛍光標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び 1種又は 2種の変異型用オリゴヌクレオチドをプライマーとして作用さ せ、 伸長反応を行う。
2) 伸長生成物を変性させ 1本鎖にした後、 伸長生成物に相補的なオリゴヌク レオチドを作用させ、 伸長反応を行い 2本鎖核酸を生成させる。
3) 2本鎖核酸特異的蛍光色素を作用させ、 該蛍光色素とオリゴヌクレオチド の標識との相互作用及び核酸特異標識の蛍光信号を測定する。
を含むことを特徴とする方法。
[15] 相互作用が蛍光共鳴エネルギー移動であることを特徴とする [14] に記載の方法。
[16] 試料中に含まれる特定の核酸配列が予め増幅されていることを特徴と する [14] 〜 [15] に記載の方法。
[17] 工程 1及ぴ 2を繰り返して、 増幅反応を行い、 増幅反応中及びまたは 反応後に測定することを特徴とする [14] 〜 [16] 記載の方法。
[18] 少なくとも一つが蛍光標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及 び 1種又は 2種の変異型用オリゴヌクレオチド、 ポリメラーゼ、 核酸特異標識を 含む試料中に含まれる特定核酸配列に存在する塩基多型を同定するキット。 以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明において、 オリゴヌクレオチドの標識は核酸特異標識と相互作用を起こ す標識であれば何でもよく、 例えば F I TC， 6 - FAM, HEX, TET, T AMRA, テキサスレッド、 ROX、 LCRED 640 LCRED 705、 C y 3、 Cy 5、 ローダミン等があるがこの限りではない。 好ましい標識は、 テキ サスレッド、 R〇X、 LCRED 640、 L C R E D 705が例示される。 野生 型用オリゴヌクレオチド及ぴ 1種または 2種の変異型用オリゴヌクレオチドから なる群から選ばれる少なくとも 1種のオリゴヌクレオチドが該標識で標識される。 標識は、 以下の組み合わせがある ：
Figure imgf000009_0001
野生型用オリゴヌクレオチドと 1種の変異型用オリゴヌクレオチドを用いる場 合、 いずれか一方または両方のオリゴヌクレオチドを標識することが可能である 力 好ましくは野生型用または変異型用のいずれか一方のオリゴヌクレオチドを 標識するのがよく、 最も好ましくは野生型オリゴヌクレオチドを標識するのがよ い。
野生型用オリゴヌクレオチド及ぴ変異型用ォリゴヌクレオチドの 2種または 3 種が標識されている場合、 これらは異なる標識でラベルされる。 好ましい標識の 組み合わせとしては、 2種の標識の場合テキサスレッドと LCRED 705、 3 種の標識の場合テキサスレツドと ROXと LCRED 705である。
標識として、 テキサスレッド） と LCRED 705を使用し、 核酸特異標識と してサイバーグリーン Iを使用した場合、 サイバーグリーン I とテキサスレッド の FRET後の蛍光波長は 612 nm、 サイパーグリーン Iと LCRED705 の FRET後の蛍光波長は 705 nmであるので、 蛍光波長を測定することによ り、 どのオリゴヌクレオチドが P CR増幅されたのかが容易に判別できる。
野生型用または変異型用オリゴヌクレオチドの標識の位置としては、 3 ' 末端を 除くどの位置でもよいが、 好ましくは 5 '末端である。
本発明において核酸特異標識は標識オリゴヌクレオチドが反応を行った核酸に 特異的に結合し、 該オリゴヌクレオチドの標識と相互作用すれば何でもよく、 好 ましくは 2本鎖核酸に特異的な標識が好ましい。 2本鎖特異標識としては 2本鎖 にインターカーレートするサイバーグリーン I (Syber Green I)、 ェチジゥムブ口 マイド、 アタリジンオレンジ、 チアゾーノレオレンジ、 ォキサゾールイエロー、 口 ーダミン、ピコグリーン等があるがこの限りではない。好ましい核酸特異標識は、 サイバーグリーン I、 ピコグリーンであり、 特に好ましくはサイパーグリーン I である。
好ましい実施形態の 1つにおいて、 該核酸特異標識は、 例えば野生型用及び変 異型用オリゴヌクレオチドを用いた P C R増幅後の 2本鎖核酸において、 標識の 近傍位置に結合するものが F R E Tに寄与する。 例えば核酸特異標識としてサイ パーグリーン Iを用いた場合、 該標識は 2本鎖核酸に一様に結合するが、 オリゴ ヌクレオチドの 5 '末端の標識近くに結合したものが F R E Tに寄与し、 増幅さ れたォリゴヌクレオチドが 2種または 3種の野生型用若しくは変異型用ォリゴヌ クレオチドのいずれに該当するのかが容易に分かる。
オリゴヌクレオチド標識及び核酸特異標識として蛍光標識を用いた場合、 オリ ゴヌクレオチドの標識と核酸特異標識との相互作用による塩基多型の決定は、 例 えば以下のように行うことが可能である。
核酸特異標識と相互作用する場合 （例えば F R E T ) のオリゴヌクレオチド標 識の蛍光波長を 1 1、 核酸特異標識の蛍光波長を L 2、 核酸特異標識の励起波長 を L exとすると、 検出シグナル FL1 ( λ ex/ λ 1 )、 検出シグナル FL2 ( λ βχ/ λ 2 ) 及び FL1/FL2を算出し、 FL1/FL2の値により、 野生型ホモ、 ヘテロ、 変異型ホモ のレ、ずれに該当するのかを判定可能である。
好ましい実施形態の 1つにおいて、 本発明の方法は核酸標識の蛍光量と標識し たオリゴヌクレチドとの F R E Tの蛍光量に基づき測定する。 例えば、 野生型ォ リゴヌクレオチド （標識無し） と変異型オリゴヌクレオチド （標識有り） を用い ると、 サンプルが野生型ホモ （野生型/野生型） の場合変異型標識オリゴヌタレ ォチドの F R E Tのシグナルがないので、 得られるシグナルは核酸特異標識のシ グナルだけである。 一方、 サンプルが変異型ホモ （変異型/変異型） の場合変異 型標識ォリゴヌクレオチドの F R E Tのシグナルと、 変異型ォリゴヌクレオチド の増幅産物による核酸特異標識のシグナルの 2種のシグナルが得られるので、 野 生型ホモと変異型ホモを容易に判別することが可能である。 ヘテロ （野生型/変 異型） は、比 (FL1/FL2)をとつたとき、野生型ホモと変異型ホモの中間の値を示す ことで、 判別可能である。
試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片は、 目的の遺 伝子の情報を担う塩基多型部位を含む標的核酸であれば、 特に制限されない。 該 標的核酸の例としては、 Alu配列、 蛋白質をコードする遺伝子のェキソンやイン トロン、 プロモーターなどが例示できる。 より具体的には、 遺伝病を含む各種疾 患、薬物代謝、生活習慣病（高血圧、糖尿病等） に関連する遺伝子が挙げられる。 例えば、 高血圧として A C E (Angiotensin I Converting Enzyme)遺伝子が挙げら れる。
本発明において、 核酸配列を単に核酸ということがある。 変異型核酸とは、 野 生型核酸のうち少なくとも 1つ、 好ましくは 1つのヌクレオチドが点突然変異し て他のヌクレオチドに置換されているものや、 野生型核酸の一部に挿入、 欠失配 列等を含む核酸のことであり、 どの部位のヌクレオチドが変異しているかが解明 されているものである。 このような塩基多型により体質等が異なつていることが 解明されてきており、 本発明の方法は試科中の核酸がこのような予想される変異 を有しているか否かを検查する方法である。
本発明において、 野生型オリゴヌクレオチドと変異型オリゴヌクレオチドを作 用させる反応とは一般的に'、 一本鎖に変性した標的核酸にォリゴヌクレオチド、 4種類のデォキシヌクレオシド三リン酸 （d N T P ) と D NAポリメラーゼを作 用させることで、 標的核酸を鎳型とするオリゴヌクレオチド伸長反応が起こり核 酸配列の相補鎖が合成される反応を含む。
本発明において、 野生型用オリゴヌクレオチドとは、 通常の表現型を有してい る塩基多型部位を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するオリゴヌクレ ォチドであって、 変異型用オリゴヌクレオチドとは、 野生型とは異なる配列を有 している塩基多型部位を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するオリゴ ヌクレオチドである。
本発明に用いられる上記オリゴヌクレオチドは、 野生型及び変異型用オリゴヌ クレオチドの 3 ' 末端もしくは 3 '末端から 2番目のヌクレオチドが変異型配列 のヌクレオチドと対応するように設計された。 このように設計した場合野生型用 オリゴヌクレオチド Z野生型核酸及び変異型用オリゴヌクレオチド /変異型核酸 の組合せにおいて、 各ォリゴヌクレオチドは少なくとも 3 '末端もしくは 3 ' 末 端から 2番目の配列までは一致する為伸長反応は起こる。 一方、 野生型用オリゴ ヌクレオチド Z変異型核酸及び変異型用オリゴヌクレオチド /野生型核酸の組合 せにおいてはオリゴヌクレオチドの 3 '末端もしくは 3 '末端より 2番目の塩基、 さらにもう 1塩基の人為的ミスマッチがあるため伸長反応が起こらない。
本発明におけるオリゴヌクレオチドの長さとしては、 1 3〜3 5塩基、 好まし くは、 1 6〜 3 0塩基であり、 上記ミスマッチ部位は、 該オリゴヌクレオチド中 に少なくとも 1つ存在する。 また、 その位置は、 3 ' 末端の 3番目から 5 ' 末端 までのいずれかであれば、 特に限定されないが、 好ましくは、 3 ' 末端の 3番目 に近い位置、 より好ましくは、 3 ' 末端から 3番目が好ましい。
3番目に人為的ミスマッチを用いた場合、 伸長反応を期待しなレ、核酸配列を铸 型とした時には、 塩基多型部位と併せて 2塩基のミスマッチとなり、 伸長反応が 強く阻害される。
本発明においては、 上記野生型用オリゴヌクレオチドと 1種又は 2種の変異型 用オリゴヌクレオチドを、 試料に別々、 又は同時に作用させる。
本発明において、 オリゴヌクレオチドの伸長方法は、 基本的には、 従来の方法 を用いて行うことができる。 通常、 一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含 む染色体又はその断片に、 4種類のデォキシヌクレオシド三リン酸 （d N T P ) 及び D N Aポリメラーゼと共に、 野生型用オリゴヌクレオチドと、 1種又は 2種 の変異型用オリゴヌクレオチドを同時又はそれぞれ別個に用いて作用させること で、 標的核酸を錄型としてオリゴヌクレオチドが伸長する。
該伸 fe反応は、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrookら、 1 9 8 9 )に記載の方法に従って行うことができる。また、該オリゴヌクレオチドが伸 長された力否かによって塩基多型を検出する方法において、 標的核酸が検出する のに十分な量が含まれていない場合、 予め前記多型配列を含む核酸断片を以下に 示す増幅反応によって、 増幅しておくことも可能である。 本発明において、 特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片の増幅方法も、 基 本的には、 従来の方法を用いて行うことができ、 通常、 一本鎖に変性させた特定 の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、 4種類のデォキシヌクレオシド三 リン酸 （dNTP) 及び DNAポリメラーゼ及びリバースプライマーと共に、 野 生型用オリゴヌクレオチドと、 1種又は 2種の変異型用オリゴヌクレオチド （フ ォーヮ一ドプライマ一に相当） を同時又はそれぞれ別個に用いて作用させること で、 標的核酸を鎳型としてファワードオリゴヌクレオチドとリバースオリゴヌク レオチドの間で増幅される。
核酸増幅方法としては、 PCR、 NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification method ; N a t u r e 第 350卷、第 91頁（1991))、 L C R (国 際公開 89/12696号公報、 特開平 2— 2934号公報）、 SDA (Strand Displacement Amplification： Nucleic aGid research ¾ 20 、 第 1691貞 (1992))、 RCR (国際公開 9 OZ 1 06 9号公報）、 TMA (Transcription mediated amplification method； J. Clin. Microbiol. 第 31： 、 第 3270頁 (1993)) などが挙げられる。
なかでも PC R法は、 試料核酸、 4種類のデォキシヌクレオシド三リン酸、 一 対のォリゴヌクレオチド及び耐熱性 D N Aポリメラーゼの存在下で、 変性、 ァニ 一リング、 伸長の 3工程からなるサイクルを繰り返すことにより、 上記一対のォ リゴヌクレオチドで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法であ る。 すなわち、 変性工程で試料の核酸を変性し、 続くアニーリング工程において 各ォリゴヌクレオチドと、 それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイ ブリダィズさせ、 続く伸長工程で、 各オリゴヌクレオチドを起点として DN Aポ リメラーゼの働きにより铸型となる各一本鎖試料核酸に相補的な DNA鎖を伸長 させ、 二本鎖 DNAとする。 この 1サイクルにより、 1本の二本鎖 DNAが 2本 の二本鎖 DNAに増幅される。'従って、 このサイクルを η回繰り返せば、 理論上 上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれた試料 DN Αの領域は 2 n倍に増幅され る。 増幅された DN A領域は大量に存在するので、 電気泳動等の方法により容易 に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、 極めて微量 （1分子でも可） の試料核酸をも検出することが可能であり、 最近非 常に広く用いられている技術である。
上記のような核酸増幅法を利用した方法では、 野生型核酸を増幅できる野生型 用オリゴヌクレオチドと、 変異型核酸を増幅できる変異型用オリゴヌクレオチド をそれぞれ別個又は同時に用いて遺伝子増幅法を行う。
野生型用オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った 場合、 試料核酸が野生型であれば反応が起きるが、 変異型では反応が起きない。 逆に、 変異型用オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行 つた場合、 試料核酸が変異型であれば反応が起きるが、 野生型であれば反応は起 こらない。 従って、 一つの試料を二つに分け、 一方は野生型用オリゴヌクレオチ ドを用いて反応を行い、他方は変異型用オリゴヌクレオチドを用いて反応を行レ、、 反応が起ったか否かを調べることにより、 試料核酸が野生型であるか変異型であ るかを明確に知ることができる。 特に、 ヒトを始め、 高等生物は、 1種類の遺伝 子について、 父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子をそれぞれ 1つずつ有してい るが、 この方法によれば、 試料遺伝子が野生型のホモか、 変異型のホモか、 ある いは、 両方のへテロかを区別することもできる。 すなわち、 ヘテロの場合には、 野生型遺伝子と変異型遺伝子が共に存在するから野生型用ォリゴヌクレオチドを 用いた場合も変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合も反応が起きる。
本発明においては、 標識オリゴヌクレオチドを用いるハイブリダィゼーション 法にも利用できる。 すなわち、 標的核酸に対し、 多型特異的及び野生型特異的ォ リゴヌクレオチドを用意して、 各オリゴヌクレオチドを同時及ぴまたは別々に作 用させて、 各オリゴヌクレオチドの標識と核酸特異的標識との相互作用を検出す ることで、 塩基多型の同定が可能である。 更には上記多型特異オリゴヌクレオチ ドがハイプリダイゼーションを行う外側の配列をプライマーとして用いて P C R 等の核酸増幅反応を行いながらもしくはその後に上記多型特異プローブを作用さ せることで塩基多型の同定が可能である。
野生型用オリゴヌクレオチドと変異型用オリゴヌクレオチドに異なる標識を用 いた場合には、 1回で検出が可能である。
キット
本努明において、 キットとしては、 野生型用オリゴヌクレオチド及ぴ 1種又は 2種の変異型用オリゴヌクレオチド、 D N Aポリメラーゼ、 4種類のデォキシヌ クレオシド三リン酸 （d N T P ) を含む塩基多型検出用試薬キットを含むもので ある。
増幅によって検出する場合には、 更に、 リバースオリゴヌクレオチドを含んで いてもよい。
発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。 もっとも、 本発明は下 記実施例に限定されるものではない。
実施例 1 3 adrenergic receptor遺伝子の塩基多型 （Trp64Arg)の検出 ( 1 ) β 3 adrenergic receptor遺伝子の 190番目の多型を検出するオリゴヌ クレオチドの合成
パーキンエルマ一社製 DNAシンセサイザー 392型を用いて、 ホスホアミダイト 法にて、 配列番号 1〜3に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド （以下、 オリゴ 1〜3と示す） を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオ チドの脱保護はァンモニァ水で 55°C、 一夜実施した。 オリゴヌクレオチドの精製 はパーキンエルマ一社 0PCカラムにて実施した。もしくは DNA合成受託会社 ( (株） 日本バイオサービス、 （株） サヮディー、 G E N S E T KK、 アマシャムフアルマ シァ バイオテク （株） 等） に依頼した。
オリゴ 1は 3'末端から 2番目に野生型 (Τ)のヌクレオチド配列、および 3番目に 人為的ミスマッチ（C→A)を有し、オリゴ 2は 3'末端から 2番目に変異型 (C)のヌク レオチド配列、 および 3番目に人為的ミスマッチ (C→A)を有し、 オリゴ 3がアン チセンス鎖であり、 オリゴ 1、 2 と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチド として使用される。
( 2 ) ?0^法にょる)3 3 adrenergic receptor遺伝子多型の解析
(i) PCR法による増幅反応
ヒ ト白血球からフ-ノール ·クロ口フオルム法により抽出した DNA溶液 （検体 1〜8 ) をサンプ^^として使用して、 下記試薬を添加して、 下記条件によりヒト β 3 adrenergic receptor遺伝子の塩基多型 （Trp64Arg)を解析した。 以下の試薬を含む 25 μ 1溶液を調製した。
Taq DNAポリメラーゼ反応液
オリゴ 1およぴ または 2
(オリゴ 1は未標識、 オリゴ 2は 5'を Texas Redにより標識） 5 pmol オリゴ 3 (未標識） 5 pmol
X 10緩衝液 2. 5 \
2mM dNTP 2. 5 μ 1
25 raM MgCl 2 1. 5 μ 1
Taq DNAポリメラーゼ 1. 3 U
抽出 DNA溶液 100 ng
増幅条件
95°C · 5分
95°C · 30秒、 62. 5°C · 30秒、 72°C、 30秒 （35サイクル）
72°C · 2分。
(i i) FRETによる検出
(i)の増幅反応液 5 μ 1を Syber Greenl (Molecular probes社）の溶液 100 μ 1に 加えて、 室温にて 10 分間反応させた。 これによつて、 増幅されたヒ ト ]3 3 adrenergic receptor遺伝子断片中に Syber Green I力 S取り込まれる。
次に、暗室中で蛍光プレートリーダー（大日本製薬社）で蛍光強度量を測定した。 すなわち、検出シグナル FL1 (355/612)、検出シグナル FL2 (355/538)及び FL1/FL2 を算出し、 FL1/FL2の値により、野生型ホモ (T/T)、へテ口（C/T)、変異型ホモ（C/C) のいずれに該当するのかを検出した。
所要時間は数分であつた。
得られた蛍光強度から、 以下の計算式を用いて試料の蛍光強度量を算出した。
[式 1 ] FL 1 (試料の蛍光強度） FLsl- FLbl
FL b l ： Negative Control (試科が未添加） の励起波長： 355 nm /蛍光波長 612 nm における蛍光強度
FL s 1：各試料の励 ^3波長： 355 nm /蛍光波長 612 nmにおける蛍光強度
[式 2 ] FL 2 (試料の蛍光強度） =FLs2- FLb2 FL b 2 : Negative Control (試料が未添加） の励起波長： 355 nm /蛍光波長 538 nm における蛍光強度
FLs 2：各試料の励起波長： 355 nm/蛍光波長 538 nmにおける蛍光強度
ここで、 538 nmは核酸標識の蛍光波長を示し、 612 n mは F R E Tの蛍 光波長を示す。
また、 F L 1は野生型の蛍光強度を示し、 FLslは F RETの蛍光強度を示し、 F L b 1はプランクの蛍光強度を示す。
同様に、 FL 2は増幅 2本鎖核酸の蛍光強度を示し、 FLs2は核酸標識の蛍光 強度を示し、 FLb 1はプランクの蛍光強度を示す。
本発明の好ましい実施形態において、 核酸特異標識とオリゴヌクレオチドとの FRETで、 1種の FRET反応で 2種類 （野生型と変異型） の型分けに応用し た点に特徴を有する。 FRETを利用することで、 野生型及び変異型オリゴヌク レオチドすべてに標識を付ける必要がなく、 オリゴヌクレオチドの準備が容易で ある。 また、 検出に際しても特別な後処理が不要であり、 容易かつ迅速な処理が できる。
サイバーグリーンは、 355 nmで励起され、 538 n mの蛍光を発する。 テキサスレツドは本来 584 nmで励起され、 6 12 nmの蛍光を発する。 本発明の実施例では、 サイバーグリーンからの FRETを起こすので、 355 nmでの励起、 及び 612 nmでの蛍光が得られ、 これに基づき、 野生型及び変 異型を識別可能である。
結果を表 1及び図 1に示す。
表 1
Figure imgf000018_0001
表 1において、 CZCタイプは増幅産物すべてに FRETが起こっているので FRETシグナル （F L 1 ) およびサイバーグリーン Iの核酸標識シグナル （F L 2) もあり、 FL 1ZFL 2比が高くなる。 Τ,Τの増幅産物には F R E Tが 起こらず核酸標識シグナルの （FL2) のみが強くでるので 1 ？し2比が 低くなる。 CZTは増幅産物の半分が FRETシグナルを生じるので、 FL1/ F L 2比は中間的値を示す。以上により明らかに 3typeの測定が可能となってい る。
上記のように、 一定量のオリゴヌクレオチドを用いて、 塩基特異的増幅反応を 行い、 増幅反応物質に核酸特異的標識を作用させることによって、 煩雑な操作を 経ることなく、 容易にかつ迅速に標的核酸遺伝子多型を明確に判定することがで きた。

Claims

請求の範囲
I . 試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、 少なくとも一 つが標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び 1種又は 2種の変異型用ォ リゴヌクレオチドを同時に又は別々に反応させた後、核酸特異標識を作用させて、 該標識と核酸特異標識との相互作用により塩基多型を同定する方法。
2 . 核酸特異標識が 2本鎖核酸特異的であることを特徴とする請求項 1に記 載の方法。
3 . 核酸特異標識が蛍光色素であることを特徴とする請求項 1及び 2に記載 の方法。
4 . オリゴヌクレオチドの標識が蛍光色素である事を特徴とする請求項 1〜 3に記載の方法。
5 . 相互作用が蛍光共鳴エネルギー移動であることを特^:とする請求項 1〜 4に記載の方法。
6 . 少なくとも一つが標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び 1種 又は 2種の変異型用オリゴヌクレオチドを用いて多型特異的増幅反応を行い、 増 幅反応中及ぴまたは反応後に測定することを特徴とする請求項 1〜 5記載の方法。
7 . 試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、 少なくとも一 つが標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及ぴ 1種又は 2種の変異型用ォ リゴヌクレオチドをプライマーとして同時に又は別々に作用させ、 多型特異的に 伸長反応を行った後、 伸長生成物に核酸特異的標識を作用させ、 該オリゴヌタレ ォチドの標識と該核酸特異的標識の相互作用により、 塩基多型を同定する方法。
8 . 核酸特異標識が 2本鎖核酸特異的であることを特徴とする請求項 7に記 載の方法。
9 . 核酸特異標識が蛍光色素であることを特徴とする請求項 7及び 8に記載 の方法。
1 0. オリゴヌクレオチドの標識が蛍光色素である事を特徴とする請求項 7 〜 9に記載の方法。
I I . 相互作用が蛍光共鳴エネルギー移動であることを特徴とする請求項 7 〜 1 0に記載の方法。
1 2 . 試料中に含まれる特定の核酸配列が予め増幅されていることを特徴と する請求項 7〜1 1に記載の方法。
1 3 . 少なくとも一つが標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び 1 種又は 2種の変異型用オリゴヌクレオチドを用いて多型特異的増幅反応を行い、 増幅反応中及びまたは反応後に測定することを特徴とする請求項 7〜1 2記載の 方法。
1 4 . 試料中に含まれる特定核酸配列に存在する塩基多型を同定する方法に おいて、 以下の行程、
1 ) 少なくとも一つが蛍光標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及ぴ 1種又は 2種の変異型用オリゴヌクレオチドをプライマーとして作用さ せ、 伸長反応を行う。
2 ) 伸長生成物を変性させ 1本鎖にした後、 伸長生成物に相補的なォリゴヌク レオチドを作用させ、 伸長反応を行レヽ 2本鎖核酸を生成させる。
3 ) 2本鎖核酸特異的蛍光色素を作用させ、 該蛍光色素とオリゴヌクレオチド の標識との相互作用及び核酸特異標識の蛍光信号を測定する。
を含むことを特徴とする方法。
1 5 . 相互作用が蛍光共鳴エネルギー移動であることを特徴とする請求項 1 4に記載の方法。
1 6 . 試料中に含まれる特定の核酸配列が予め増幅されていることを特徴と する請求項 1 4〜 1 5に記載の方法。
1 7 . 行程 1及ぴ 2を繰り返して、 増幅反応を行い、 増幅反応中及びまたは 反応後に測定することを特徴とする請求項 1 4〜1 6記載の方法。
1 8 . 少なくとも一つが蛍光標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及 び 1種又は 2種の変異型用オリゴヌクレオチド、 ポリメラーゼ、 核酸特異標識を 含む試料中に含まれる特定核酸配列に存在する塩基多型を同定するキット。
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