JP2004530410A - 特異的ヌクレオチド配列の検出 - Google Patents
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Abstract
１以上の同定ヌクレオチド配列の存在を検出するために、エネルギー供与体とエネルギー受容体とを含む分子エネルギー転移ペアでそれぞれが標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。核酸鋳型を含有するポリメラーゼ連鎖反応混合物中で、２つの配列特異的オリゴヌクレオチドプライマー（一方は第１同定配列に特異的であり、もう一方は第２同定配列に特異的である）をリバースプライマーと共に使用する。その相補的同定配列のみを鋳型として使用して、各配列特異的プライマーが増幅を導く。第１および第２同定配列を表す得られたＰＣＲ産物は、２つのＭＥＴ標識プライマー（それぞれ、第１または第２のいずれかの同定配列を表すＰＣＲ産物に特異的である）を、両方の同定配列を表すＰＣＲ産物に相補的な別のプライマーと共に使用するＰＣＲ増幅により検出される。
Description
【０００１】
本出願は、２０００年１０月２４日付け出願の米国仮特許出願第６０／２４２，６７２号に基づく優先権の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、広義には、特異的ヌクレオチド配列の検出方法に関する。より詳しくは、本発明は、エネルギー供与体とエネルギー受容体とを含む分子エネルギー転移（ＭＥＴ）ペアで標識されたオリゴヌクレオチドからのシグナルの検出がサンプル中の特異的ヌクレオチド配列の存在を示す方法に関する。この方法は、他のヌクレオチドの環境中の単一ヌクレオチドを識別するのに十分な感度を有する。したがって、本発明はまた、一塩基（単一ヌクレオチド）多型（ＳＮＰ）のような核酸多型の検出に関する。
【０００３】
発明の背景
遺伝子中の或る同定ヌクレオチド配列は、疾患の存在、疾患に対する感受性または表現型を示唆する。これらの同定配列は個体の特定の遺伝子中の自発的変化（例えば、突然変異）を表したり、あるいは集団中に維持される遺伝子（例えば、対立遺伝子）の形態間の相違を表しうる。かかる変化または相違は遺伝子中のいくつかのヌクレオチドにおいて生じたり、あるいは単一ヌクレオチドにおいて生じうる。単一ヌクレオチドの変化または相違は、検出系に対する、より大きな挑戦に相当する。
【０００４】
遺伝子の対立遺伝子間を識別する同定配列は、関心のある相違が１つのヌクレオチド位置に存在する場合には、「一塩基多型」、すなわちＳＮＰを特徴づけると言われている。単一ヌクレオチドの変化は種々の遺伝病を引き起こすことが示されている。例えば、鎌状赤血球貧血は、ヒトβグロビン遺伝子の第６コドン中のアデニン残基からチミン残基へのトランスバージョン（塩基転換）により引き起こされる。このトランスバージョンは、ヘモグロビンのβグロビンサブユニット中のグルタミン酸残基からバリン残基への置換を引き起こして、デオキシヘモグロビン分子の溶解性を低下させ、そして、罹患赤血球の「鎌状化」をもたらす。鎌状赤血球は微小循環系中に捕捉され、多くの臓器を損傷させる。
【０００５】
Ｋａｎら，Ｌａｎｃｅｔ ２：９１０−１２（１９７８）は、ＨｐａＩ制限断片長多型に対する鎌状細胞対立遺伝子の連鎖に基づき、罹患個体からのＤＮＡを調べることにより鎌状赤血球を診断した最初の記載であった。その後、Ｇｅｅｖｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：５０８１−８５（１９８２）およびＣｈａｎｇら，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．３０７：３０−３２（１９８２）は、問題の突然変異がＤｄｅＩおよびＭｓｔＩＩの両方の切断部位に影響を及ぼし、したがって制限酵素分解により直接的に検出されうることを示した。Ｃｏｎｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２７８−８２（１９８３）は、配列特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを用いることによる単一ヌクレオチド変異の直接的検出のための、より一般的なアプローチを記載している。この方法においては、短い合成オリゴヌクレオチドプローブが、適当な条件下、１つの対立遺伝子のみにハイブリダイズする。
【０００６】
これらのアプローチのすべては、遅々たるもので、技術的には挑戦的であり、相応に大量のＤＮＡを必要とする。
【０００７】
Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０−５４（１９８５）により開発されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、少量の標的ＤＮＡの迅速な増幅を可能にした。ＰＣＲは、関心のある配列にまたがる位置でＤＮＡの反対鎖にアニールする２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。該ＤＮＡ配列の鋳型依存的合成の連続的ラウンドのために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント（Ｓａｉｋｉら（１９８５），前掲）またはテルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−９１（１９８８））のようなＤＮＡポリメラーゼを使用する。それぞれの新ラウンドの開始前に、ＤＮＡを変性させ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）酵素の場合には新鮮な酵素を加える。このようにして、標的配列の指数関数的増幅が達成される。
【０００８】
ついで、得られた増幅ＤＮＡを、配列特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（Ｓａｉｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３−６６（１９８６））、制限酵素切断（Ｓａｉｋｉら（１９８５），前掲；Ｃｈｅｈａｂら，Ｎａｔｕｒｅ ３２９：２９３−９４（１９８７））、オリゴヌクレオチドペアの連結（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−８０（１９８８））または連結増幅により、鎌状細胞突然変異のようなＤＮＡ配列変異の存在に関して容易に分析することができる。ＰＣＲは分析速度を迅速化させ、必要となるＤＮＡの量を減少させたが、それはＤＮＡ配列変異の分析方法を変化させるものではなかった。
【０００９】
その後、Ｗａｌｌａｃｅらの米国特許第５，６３９，６１１号は、鎌状細胞貧血を引き起こす対立遺伝子の検出に適していると言われている対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応を開示している。Ｗａｌｌａｃｅらは、ＰＣＲプライマーの１つの３’ヌクレオチドが鋳型とミスマッチ塩基対を形成する場合、低い効率で増幅が進行することを見出した。したがって、Ｗａｌｌａｃｅの方法では、特異的プライマーは特異的対立遺伝子のみの増幅を導く。複数ラウンドの増幅後の増幅断片の形成は、試験サンプル中の対立遺伝子の存在を示す。
【００１０】
Ｗａｌｌａｃｅの方法は制限消化および放射能標識ハイブリダイゼーションに対する改良に相当するが、該アプローチは依然として労力および時間を要するものである。この方法は、ゲル電気泳動を必要とすることに加えて、複数の増幅反応とサンプルの遺伝子型を同定するための検出反応とを行う必要がある。したがって、一塩基多型を含む同定配列を検出するための、より迅速で、あまり労力を要しない方法が必要とされている。
【００１１】
発明の概要
したがって、ゲノムサンプル中の同定配列の存在を検出する改良方法を提供することが、本発明の１つの目的である。
【００１２】
ゲノムサンプル中の同定配列の存在を検出するためのキットを提供することが、本発明のもう１つの目的である。
【００１３】
本発明のこれら及び他の目的を達成するために、本発明の１つの態様では、ＤＮＡサンプル中の第１同定配列または第２同定配列または両方の存在を判定するための方法が提供される。この方法は、
（Ａ）下記のヌクレオチド配列：
（ｉ）第１同定配列には特異的にハイブリダイズできるが第２同定配列とは特異的にハイブリダイズできない第１ヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）第１ヌクレオチド配列の５’末端における第２ヌクレオチド配列、
を含む第１オリゴヌクレオチドを準備すること、
（Ｂ）下記のヌクレオチド配列：
（ｉ）第２同定配列には特異的にハイブリダイズできるが第１同定配列には特異的にハイブリダイズできない第３ヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）第１ヌクレオチド配列の５’末端における第４ヌクレオチド配列、
を含む第２オリゴヌクレオチドを準備すること、
（Ｃ）第３オリゴヌクレオチドを準備すること、
（Ｄ）下記のヌクレオチド配列：
（ｉ）第５ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）第５ヌクレオチド配列の５’末端における第６ヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）第６ヌクレオチド配列の５’末端における第７ヌクレオチド配列、および
（ｉｖ）第７ヌクレオチド配列の５’末端における第８ヌクレオチド配列、
を含む第４オリゴヌクレオチドを準備すること、ここで、第５ヌクレオチド配列は第２ヌクレオチド配列と同一であり、第４オリゴヌクレオチドは、第６および第８ヌクレオチド配列のヌクレオチドを含有する第１ヘアピンを形成することが可能であり、第４オリゴヌクレオチドは、第１ヘアピンが形成されなければ第１検出シグナルを放出すること、
（Ｅ）下記のヌクレオチド配列：
（ｉ）第９ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）第９ヌクレオチド配列の５’末端における第１０ヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）第１０ヌクレオチド配列の５’末端における第１１ヌクレオチド配列、および
（ｉｖ）第１１ヌクレオチド配列の５’末端における第１２ヌクレオチド配列、
を含む第５オリゴヌクレオチドを準備すること、ここで、第９ヌクレオチド配列は第４ヌクレオチド配列と同一であり、第５オリゴヌクレオチドは、第１０および第１２ヌクレオチド配列のヌクレオチドを含有する第２ヘアピンを形成することが可能であり、第４オリゴヌクレオチドは、第２ヘアピンが形成されなければ第２検出シグナルを放出すること、
（Ｆ）ＤＮＡサンプル中に第１同定配列が存在する場合には、
（ｉ）第１オリゴヌクレオチドを第１同定配列にアニールさせること、
（ｉｉ）鋳型として第１同定配列を使用して第１オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長第１鎖を形成させること、ここで、第１同定配列は伸長第１鎖にアニールすること、
（ｉｉｉ）伸長第１鎖から第１同定配列を分離すること、
（ｉｖ）第３オリゴヌクレオチドを伸長第１鎖にアニールさせること、
（ｖ）鋳型として伸長第１鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長第２鎖を形成させること、ここで、伸長第１鎖は伸長第２鎖にアニールすること、
（ｖｉ）伸長第２鎖から伸長第１鎖を分離すること、
（ｖｉｉ）第４オリゴヌクレオチドを伸長第２鎖にアニールさせること、
（ｖｉｉｉ）鋳型として伸長第２鎖を使用して第４オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、二重伸長第１鎖を形成させること、ここで、二重伸長第１鎖は伸長第２鎖にアニールすること、
（ｉｘ）伸長第２鎖から二重伸長第１鎖を分離すること、
（ｘ）第３オリゴヌクレオチドを二重伸長第１鎖にアニールさせること、
（ｘｉ）鋳型として二重伸長第１鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、二重伸長第２鎖を形成させること、
（ｘｉｉ）場合により、二重伸長第１および第２鎖を増幅すること、
（ｘｉｉｉ）第１検出シグナルを検出すること、および
（ｘｉｖ）ＤＮＡサンプル中に第１同定配列が存在すると判定すること、
（Ｇ）ＤＮＡサンプル中に第２同定配列が存在する場合には、
（ｉ）第２オリゴヌクレオチドを第２同定配列にアニールさせること、
（ｉｉ）鋳型として第２同定配列を使用して第２オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長第３鎖を形成させること、ここで、第２同定配列は伸長第３鎖にアニールすること、
（ｉｉｉ）伸長第３鎖から第２同定配列を分離すること、
（ｉｖ）第３オリゴヌクレオチドを伸長第３鎖にアニールさせること、
（ｖ）鋳型として伸長第３鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長第４鎖を形成させること、ここで、伸長第３鎖は伸長第４鎖にアニールすること、
（ｖｉ）伸長第４鎖から伸長第３鎖を分離すること、
（ｖｉｉ）第５オリゴヌクレオチドを伸長第４鎖にアニールさせること、
（ｖｉｉｉ）鋳型として伸長第４鎖を使用して第５オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、二重伸長第３鎖を形成させること、ここで、二重伸長第３鎖は伸長第４鎖にアニールすること、
（ｉｘ）伸長第４鎖から二重伸長第３鎖を分離すること、
（ｘ）第３オリゴヌクレオチドを二重伸長第３鎖にアニールさせること、
（ｘｉ）鋳型として二重伸長第３鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、二重伸長第４鎖を形成させること、
（ｘｉｉ）場合により、二重伸長第３および第４鎖を増幅すること、
（ｘｉｉｉ）第２検出シグナルを検出すること、
（ｘｉｖ）ＤＮＡサンプル中に第２同定配列が存在すると判定すること、を含んでなる。好ましい実施形態においては、該増幅反応はＰＣＲであり、第１および第２供与成分のそれぞれは発蛍光団であり、一方、第１および第２受容成分のそれぞれは、発蛍光団により放出される光のクエンチャー（消光物質）である。
【００１４】
もう１つの実施形態においては、ＤＮＡサンプル中の第１同定配列または第２同定配列または両方の存在を判定するための方法であって、
（Ａ）サンプルを第１および第２オリゴヌクレオチドと接触させること、ここで、第１オリゴヌクレオチドは、
（ｉ）第１ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）第１ヌクレオチド配列の５’末端における第２ヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）第２ヌクレオチド配列の５’末端における第３ヌクレオチド配列、および
（ｉｖ）第３ヌクレオチド配列の５’末端における第４ヌクレオチド配列を含み、その際、第１オリゴヌクレオチドは、第２および第４ヌクレオチド配列のヌクレオチドを含有する第１ヘアピンを形成することが可能であり、そして、第１オリゴヌクレオチドは、第１ヘアピンが形成されなければ第１検出シグナルを放出すること、
第２オリゴヌクレオチドは、
（ｉ）第５ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）第５ヌクレオチド配列の５’末端における第６ヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）第６ヌクレオチド配列の５’末端における第７ヌクレオチド配列、および
（ｉｖ）第７ヌクレオチド配列の５’末端における第８ヌクレオチド配列を含み、その際、第２オリゴヌクレオチドは、第６および第８ヌクレオチド配列のヌクレオチドを含有する第２ヘアピンを形成することが可能であり、そして、第２オリゴヌクレオチドは、第２ヘアピンが形成されなければ第２検出シグナルを放出すること、
（Ｂ）（ｉ）サンプル中に第１同定配列が存在する場合には、ポリメラーゼを使用して第１オリゴヌクレオチドを二本鎖核酸中に取り込ませ、それにより、第１ヘアピンの形成を妨げること、
（ｉｉ）サンプル中に第２同定配列が存在する場合には、ポリメラーゼを使用して第２オリゴヌクレオチドを二本鎖核酸中に取り込ませ、それにより、第２ヘアピンの形成を妨げること、または
（ｉｉｉ）サンプル中に第１および第２同定配列の両方が存在する場合には、ポリメラーゼを使用して第１および第２オリゴヌクレオチドのそれぞれを二本鎖核酸中に取り込ませ、それにより、第１および第２ヘアピンのそれぞれの形成を妨げること、
（Ｃ）場合により、増幅反応を行い、それにより、
（ｉ）サンプル中に第１同定配列が存在する場合には、第１オリゴヌクレオチドを第１増幅産物中に取り込ませること、
（ｉｉ）サンプル中に第２同定配列が存在する場合には、第２オリゴヌクレオチドを第２増幅産物中に取り込ませること、または
（ｉｉｉ）サンプル中に第１同定配列が存在する場合には、第１オリゴヌクレオチドを第１増幅産物中に取り込ませ、かつ、サンプル中に第２同定配列が存在する場合には、第２オリゴヌクレオチドを第２増幅産物中に取り込ませること、
（Ｄ）（ｉ）第１シグナルが検出された場合には、サンプル中に第１同定配列が存在すると判定すること、
（ｉｉ）第２シグナルが検出された場合には、サンプル中に第２同定配列が存在すると判定すること、または
（ｉｉｉ）第１および第２シグナルが検出された場合には、サンプル中に第１および第２同定配列が存在すると判定すること、
を含んでなる方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、単一の核酸サンプル中の１以上の核酸多型を直接的に同定する方法を提供する。この改良された技術は２つの主要件を満足する。まず第１に、それは、取り込まれていないオリゴヌクレオチドを予め分離することなく核酸多型を検出することを可能にする。第２に、それは、標識オリゴヌクレオチドを増幅核酸サンプル中に取り込ませることにより、サンプル中の１以上の核酸多型の直接的な検出を可能にする。本発明はまた、単一のサンプル中の１以上の核酸多型の同定のためのキットに関する。そのようなキットは、核酸多型の存在が疾患または障害の存在または不存在と相互に関連づけられる診断キットでありうる。
【００１６】
本発明の他の目的、特徴および利点は以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。詳細な説明および実施例は、好ましい実施形態を示すものであり、例示のために記載されているにすぎず、本発明の精神および範囲内の種々の変更および修飾がこの詳細な説明から当業者に明らかとなるであろう。さらに、実施例は本発明の原理を示すものであり、当業者に明らかに有用であると思われるすべての例への本発明の応用を具体的に例示することを予期したものではない。
【００１７】
図面の説明
図１は、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーの一般的模式図を示す。
【００１８】
第１オリゴヌクレオチド（Ｏ１）は、第１ヌクレオチド配列（１）、および該第１ヌクレオチド配列の５’末端における第２ヌクレオチド配列（２）（陰影付き）を含む。
【００１９】
第２オリゴヌクレオチド（Ｏ２）は、第３ヌクレオチド配列（３）、および該第３ヌクレオチド配列の５’末端における第４ヌクレオチド配列（４）（黒塗り）を含む。
【００２０】
第３オリゴヌクレオチド（Ｏ３）はリバースプライマーを含む。
【００２１】
第４オリゴヌクレオチド（Ｏ４）は、第５ヌクレオチド配列（５）（陰影付き）、該第５ヌクレオチド配列の５’末端における第６ヌクレオチド（６）配列、該第６ヌクレオチド配列の５’末端における第７ヌクレオチド（７）配列、および第７ヌクレオチド配列の５’末端における第８ヌクレオチド配列（８）を含む。第５ヌクレオチド配列は第２ヌクレオチド配列と同一である。Ｏ４は、ヌクレオチド配列６および８を含有する第１ヘアピンを形成しうる。該ヘアピンが形成されなければ、Ｏ４はシグナルを放出する。
【００２２】
第５オリゴヌクレオチド（Ｏ５）は、第９ヌクレオチド配列（９）（黒塗り）、該第９ヌクレオチド配列の５’末端における第１０ヌクレオチド配列（１０）、該第１０ヌクレオチド配列の５’末端における第１１ヌクレオチド配列（１１）、および第１１ヌクレオチド配列の５’末端における第１２ヌクレオチド配列（１２）を含む。第９ヌクレオチド配列は第４ヌクレオチド配列と同一である。Ｏ５は、ヌクレオチド配列１０および１２のヌクレオチドを含有するヘアピンを形成しうる。該ヘアピンが形成されなければ、Ｏ５はシグナルを放出する。
【００２３】
図２は、本発明の方法の好ましい実施形態の１つを示す模式図である。それは、該ヘアピン形成オリゴヌクレオチドから離れた配列特異的プライマーを使用する。ＤＮＡサンプルが標的配列を含有する場合には、配列特異的フォワードプライマー（Ｏ１）は、ポリメラーゼ連鎖反応の１回目のサイクル中にアニールし伸長して、伸長第１鎖を形成する。後続サイクルにおいて、ヘアピン形成オリゴヌクレオチド（Ｏ４）が、取り込まれた配列特異的プライマーの５’尾部にアニールし（サイクル３のとおり）、二重伸長第１鎖の形成におけるプライマーとして作用する。さらに後のサイクル中に、ポリメラーゼが該二重伸長第１鎖を複製するにつれて、それは、取り込まれたオリゴヌクレオチドをそのヘアピン形成から排除し、伸長した発光性コンホメーションに導く（サイクル４のとおり）。この場合もまた、反復サイクルにより、放出シグナルの強度が増大するだろう。
【００２４】
図３は、（Ａ）ヘアピンコンホメーションおよび（Ｂ）伸長コンホメーションをとったオリゴヌクレオチドの構造の模式的例示である。要素（ａ）は、標的配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を示し、（ｂ）および（ｄ）は、互いにハイブリダイズしてヘアピンを形成するヌクレオチド配列を示し、（ｃ）は、（ｂ）を（ｄ）と連結し該ヘアピンのループを形成する配列を示す。（ｂ）および（ｄ）上の白丸および黒丸は、分子エネルギー転移分子のペアを示す。
【００２５】
図４は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる本発明の方法のもう１つの実施形態を示す。ヘアピン形成オリゴヌクレオチド（ａ）は、各同定配列に特異的なプライマー配列を含有する。ＤＮＡサンプルが標的配列を含有する場合には、ポリメラーゼ連鎖反応の１回目のサイクル中に、該特異的プライマーがアニールし伸長する（伸長第１鎖を形成する）。２回目のサイクルにおいて、ポリメラーゼが該伸長第１鎖を複製するにつれて、それは、取り込まれたオリゴヌクレオチドをそのヘアピン形成から排除し、伸長した発光性コンホメーションに導く。反復（ｎ）サイクルにより、放出シグナルの強度が増大するだろう。
【００２６】
図５Ａは、Ａ型対立遺伝子およびＧ型対立遺伝子に関するＣＹＰ１７遺伝子の遺伝子型決定の結果を示す。両プライマーは、それらの３’末端ヌクレオチドにおいて相違する。第２列はＦＡＭに関する蛍光測定値を示し、第３列はＳＲに関する蛍光測定値を示す。第１列は、試験したＣＹＰ１７ ＤＮＡの遺伝子型を示す。
【００２７】
図５Ｂは、一重（シングルプレックス）ＰＣＲ反応に対する多重（マルチプレックス）ＰＣＲ反応の利点を例示する。この図は、Ａ型およびＧ型対立遺伝子に関するＣＹＰ１７遺伝子の遺伝子型決定の結果を示す。Ａ特異的プライマーはＦＡＭで、Ｇ特異的プライマーはＳＲで標識されている。第１列：Ａ型対立遺伝子を含有するＣＹＰ１７ ＤＮＡサンプルを、Ａ特異的プライマーを使用する一重ＰＣＲ反応によりスクリーニングした。第２列：Ｇ型対立遺伝子を含有するＣＹＰ１７ ＤＮＡサンプルを、Ａ特異的プライマーを使用する一重ＰＣＲ反応によりスクリーニングした。第３列：Ａ型対立遺伝子を含有するＣＹＰ１７ ＤＮＡサンプルを、Ｇ特異的プライマーを使用する一重ＰＣＲ反応によりスクリーニングした。第４列：Ｇ型対立遺伝子を含有するＣＹＰ１７ ＤＮＡサンプルを、Ｇ特異的プライマーを使用する一重ＰＣＲ反応によりスクリーニングした。第５列：Ａ型およびＧ型の両方の対立遺伝子を含有するＣＹＰ１７ ＤＮＡサンプルを、Ａ特異的およびＧ特異的の両方のプライマーを使用する多重ＰＣＲ反応によりスクリーニングした。第６列：Ａ型およびＧ型の両方の対立遺伝子を含有するＣＹＰ１７ ＤＮＡサンプルを、Ａ特異的およびＧ特異的の両方のプライマーを使用する多重ＰＣＲ反応によりスクリーニングした。第１列と第２列との比較：ＦＡＭシグナルは、Ａ特異的プライマーを使用してＡ型およびＧ型ＤＮＡサンプルの両方において検出される。この結果は、一重ＰＣＲ反応においてＡ特異的プライマーを使用した場合に達成される低い対立遺伝子識別を示している。第３列と第４列との比較：ＳＲシグナルは、Ｇ特異的プライマーを使用してＡ型およびＧ型ＤＮＡサンプルの両方において検出される。この結果は、一重ＰＣＲ反応においてＧ特異的プライマーのみを使用した場合の低い対立遺伝子識別を示している。第５列と第６列との比較は、多重ＰＣＲ反応においてＡ特異的およびＧ特異的プライマーを使用した場合の高い対立遺伝子識別を示している。なぜなら、反対の対立遺伝子のシグナルが生成されなかったからである。
【００２８】
図６Ａは、Ａ型対立遺伝子およびＧ型対立遺伝子に関するＨＥＲ２遺伝子の遺伝子型決定の結果を示す。両プライマーは、それらの３’末端ヌクレオチドにおいて相違する。無ＤＮＡ対照はＮＤＣとして示されている。第１列はＦＡＭに関する蛍光測定値を示し、第２列はＳＲに関する蛍光測定値を示す。第３列は、試験したＨＥＲ２ ＤＮＡの遺伝子型を示す。
【００２９】
図６Ｂは、図５Ａの蛍光結果のグラフ表示を示す。該結果は、Ａ特異的およびＧ特異的の両方のプライマーを使用する多重ＰＣＲ反応の対立遺伝子識別を示している。
【００３０】
図７Ａは、Ｃ型対立遺伝子およびＴ型対立遺伝子に関するＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の遺伝子型決定の結果を示す。Ｃ特異的プライマーの３’末端ヌクレオチドは、該多型を検出するためのミスマッチを含有していた。Ｔ特異的プライマーの末端から２番目のヌクレオチドは、該多型を検出するためのミスマッチヌクレオチドを含有していた。無ＤＮＡ対照はＮＤＣとして示されている。第１列はＦＡＭに関する蛍光測定値を示し、第２列はＳＲに関する蛍光測定値を示す。第３列は、試験したＣＹＰ２Ｃ８ ＤＮＡの遺伝子型を示す。
【００３１】
図７Ｂは、図６Ａの蛍光結果のグラフ表示を示す。該結果は、Ｃ特異的およびＴ特異的の両方のプライマーを使用する多重ＰＣＲ反応の良好な対立遺伝子識別を示している。
【００３２】
図８Ａは、Ｃ型対立遺伝子およびＧ型対立遺伝子に関するＨＴＲ２Ｃ遺伝子の遺伝子型決定の結果を示す。Ｃ特異的およびＧ特異的プライマーの末端から３番目のヌクレオチドは、該多型を検出するためのミスマッチヌクレオチドを含有していた。無ＤＮＡ対照はＮＤＣとして示されている。第１列はＦＡＭに関する蛍光測定値を示し、第２列はＳＲに関する蛍光測定値を示す。第３列は、試験したＨＴＲ２Ｃ ＤＮＡの遺伝子型を示す。
【００３３】
図８Ｂは、図７Ａの蛍光結果のグラフ表示を示す。該結果は、Ｃ特異的およびＧ特異的の両方のプライマーを使用する多重ＰＣＲ反応の対立遺伝子識別を示している。
【００３４】
図９Ａは、野生型遺伝子および欠失突然変異体に関するＣＣＲ５遺伝子の遺伝子型決定の結果を示す。無ＤＮＡ対照はＮＤＣとして示されている。第１列はＦＡＭに関する蛍光測定値を示し、第２列はＳＲに関する蛍光測定値を示す。第３列は、試験したＣＣＲ５ ＤＮＡの遺伝子型を示す。
【００３５】
図９Ｂは、図８Ａの蛍光結果のグラフ表示を示す。該結果は、野生型および欠失突然変異体の両方のプライマーを使用する多重ＰＣＲ反応の良好な対立遺伝子識別を示している。
【００３６】
発明の開示
ＰＣＲに基づく方法は、特異的ヌクレオチド配列（同定配列）を検出するために見出されたものであり、従来の技術の欠点を伴わない。本発明は、標的配列中の遺伝的多型（例えば、ＳＮＰ）、挿入および欠失の迅速な検出を可能にする。多型の解明は、１以上の同定配列の存在を、配列特異的オリゴヌクレオチドプライマーへのそれらのハイブリダイゼーションにより判別することにより達成される。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）で標識したオリゴヌクレオチドの本発明者らの創造的使用は、これらのハイブリダイゼーションの迅速な特徴づけを可能にする。
【００３７】
本明細書で記載する「同定配列」（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、対立遺伝子のような集団中に維持される遺伝子の変異、または突然変異のような個体の特定の核酸配列中の自発的変化を表し得る特定のヌクレオチド酸を意味する。野生型からの相違または変化は、単一ヌクレオチドまたは数個のヌクレオチドを含む可能性があり、典型的には、特定の表現型、疾患または疾患感受性を示す。
【００３８】
個体からのゲノムサンプルは、該個体が或る遺伝子に関してホモ接合性であるか又はヘテロ接合性であるかに応じて、特定の遺伝子の２個の対立遺伝子を含みうる。したがって、ゲノムサンプルは、第１同定配列、第２同定配列、第１および第２の両方の同定配列を含有するか、またはいずれをも含有しない可能性がある。１つの実施形態においては、本発明は、第１同定配列、第２同定配列または両方の存在を同時に検出することにより、ＤＮＡサンプル中の遺伝的多型を同定する。この目的には、該サンプルを、工程（Ａ）において、第１および第２オリゴヌクレオチドと接触させる。該第１および第２オリゴヌクレオチドは、それらの末端３’ヌクレオチドにおいてのみ、それぞれから異なっている。もう１つの好ましい実施形態においては、それらのオリゴヌクレオチドは、３’末端以外の１個以上のヌクレオチドにおいて異なっている。例えば、各プライマーの３’末端から離れた第２、第３、第４または第５ヌクレオチドは、個々に又は組み合わせて、異なっていてもよい。
【００３９】
もう１つの実施形態においては、本発明は、種々の同定配列の存在を同時に判定するために使用することができる。例えば、特定の遺伝子が５つの可能な対立遺伝子を有する場合には、対応する同定配列に特異的な５つのオリゴヌクレオチドを同時に使用することができる。このようにして、該サンプルの遺伝子型を直ちに決定することができる。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態においては、２つの配列特異的オリゴヌクレオチドプライマー（一方は第１同定配列に特異的であり、もう一方は第２同定配列に特異的である）を、もう１つのプライマー（例えば、リバースプライマー）と共に、ゲノムＤＮＡ鋳型を含有するＰＣＲ混合物中で使用する。主として、プライマーの３’末端近くのヌクレオチドが特異性を決定する。したがって、配列特異的プライマーは、それらの末端３’ヌクレオチドのみにおいて、それぞれとは異なりうる。また、該プライマーは、３’末端ヌクレオチド以外の１個以上のヌクレオチドにおいて異なりうる。例えば、各プライマーの３’末端から離れた第２、第３、第４または第５ヌクレオチドは、個々に又は組み合わせて、異なりうる。３’末端ヌクレオチド以外のヌクレオチドが異なる場合には、該プライマー配列は多型をまたぐ（ｂｒｉｄｇｅ）であろう。ミスマッチの位置には無関係に、適当なアニーリング温度およびＰＣＲ条件下では、各配列特異的プライマーは、その相補的配列を鋳型として使用する増幅を導くに過ぎない。ついで、得られたＰＣＲ産物（標的配列に相当する）は、該ＰＣＲ産物にそれぞれが特異的である２つのＦＲＥＴ標識プライマーを、該ＰＣＲ産物に相補的なもう１つのプライマーと共に使用するＰＣＲ増幅を行うことにより検出される。
【００４１】
本発明のこの態様においては、上記方法は、以下の工程を含む：
【００４２】
工程（Ａ）においては、第１オリゴヌクレオチドを準備する。これは、（ｉ）第１同定配列には特異的にハイブリダイズしうるが、１以上のヌクレオチドのミスマッチのために第２同定配列には特異的にハイブリダイズし得ない第１ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１ヌクレオチド配列の５’末端における第２ヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
工程（Ｂ）においては、第２オリゴヌクレオチドを準備する。これは、（ｉ）第２同定配列には特異的にハイブリダイズしうるが、１以上のヌクレオチドのミスマッチのために第１同定配列には特異的にハイブリダイズし得ない第３ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第３ヌクレオチド配列の５’末端における第４ヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
工程（Ｃ）においては、第３オリゴヌクレオチドを準備する。
【００４５】
工程（Ｄ）においては、第４オリゴヌクレオチドを準備する。これは、（ｉ）第５ヌクレオチド配列、（ｉｉ）第５ヌクレオチド配列の５’末端における第６ヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）第６ヌクレオチド配列の５’末端における第７ヌクレオチド配列、および（ｉｖ）第７ヌクレオチド配列の５’末端における第８ヌクレオチド配列を含む。第５ヌクレオチド配列は第２ヌクレオチド配列と同一であり、第４オリゴヌクレオチドは、第６および第８ヌクレオチド配列のヌクレオチドを含有する第１ヘアピンを形成することが可能であり、第４オリゴヌクレオチドは、第１ヘアピンが形成されなければ第１検出シグナルを放出する。
【００４６】
工程（Ｅ）においては、第５オリゴヌクレオチドを準備する。これは、（ｉ）第９ヌクレオチド配列、（ｉｉ）第９ヌクレオチド配列の５’末端における第１０ヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）第１０ヌクレオチド配列の５’末端における第１１ヌクレオチド配列、および（ｉｖ）第１１ヌクレオチド配列の５’末端における第１２ヌクレオチド配列を含む。第９ヌクレオチド配列は第４ヌクレオチド配列と同一であり、第５オリゴヌクレオチドは、第１０および第１２ヌクレオチド配列のヌクレオチドを含有する第２ヘアピンを形成することが可能であり、第４オリゴヌクレオチドは、第２ヘアピンが形成されなければ第２検出シグナルを放出する。
【００４７】
工程（Ｆ）においては、ＤＮＡサンプル中に第１同定配列が存在する場合には、（ｉ）第１オリゴヌクレオチドを第１同定配列にアニールさせ、（ｉｉ）鋳型として第１同定配列を使用して第１オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長第１鎖を形成させ（ここで、第１同定配列は伸長鎖にアニールする）、（ｉｉｉ）伸長鎖から第１同定配列を分離し、（ｉｖ）第３オリゴヌクレオチドを伸長第１鎖にアニールさせ、（ｖ）鋳型として伸長第１鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長第２鎖を形成させ（ここで、伸長第１鎖は伸長第２鎖にアニールする）、（ｖｉ）伸長第２鎖から伸長第１鎖を分離し、（ｖｉｉ）第４オリゴヌクレオチドを伸長第２鎖にアニールさせ、（ｖｉｉｉ）鋳型として伸長第２鎖を使用して第４オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、二重伸長第１鎖を形成させ（ここで、二重伸長第１鎖は伸長第２鎖にアニールする）、（ｉｘ）伸長第２鎖から二重伸長第１鎖を分離し、（ｘ）第３オリゴヌクレオチドを二重伸長第１鎖にアニールさせ、（ｘｉ）鋳型として二重伸長第１鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、二重伸長第２鎖を形成させ、（ｘｉｉ）場合により、二重伸長第１および第２鎖を増幅し、（ｘｉｉｉ）第１検出シグナルを検出し、（ｘｉｖ）ＤＮＡサンプル中に第１同定配列が存在すると判定する。図２は、工程（Ｆ）の本質的部分を模式的に示したものである。
【００４８】
工程（Ｇ）においては、ＤＮＡサンプル中に第２同定配列が存在する場合には、（ｉ）第２オリゴヌクレオチドを第２同定配列にアニールさせ、（ｉｉ）鋳型として第２同定配列を使用して第２オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長第３鎖を形成させ（ここで、第２同定配列は伸長第３鎖にアニールする）、（ｉｉｉ）伸長第３鎖から第２同定配列を分離し、（ｉｖ）第３オリゴヌクレオチドを伸長第３鎖にアニールさせ、（ｖ）鋳型として伸長第３鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長第４鎖を形成させ（ここで、伸長第３鎖は伸長第４鎖にアニールする）、（ｖｉ）伸長第４鎖から伸長第３鎖を分離し、（ｖｉｉ）第５オリゴヌクレオチドを伸長第４鎖にアニールさせ、（ｖｉｉｉ）鋳型として伸長第４鎖を使用して第５オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、二重伸長第３鎖を形成させ（ここで、二重伸長第３鎖は伸長第４鎖にアニールする）、（ｉｘ）伸長第４鎖から二重伸長第３鎖を分離し、（ｘ）第３オリゴヌクレオチドを二重伸長第３鎖にアニールさせ、（ｘｉ）鋳型として二重伸長第３鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、二重伸長第４鎖を形成させる。ついで、（ｘｉｉ）場合により、二重伸長第３および第４鎖を増幅し、（ｘｉｉｉ）第２検出シグナルを検出し、そして（ｘｉｖ）ＤＮＡサンプル中に第２同定配列が存在すると判定する。
【００４９】
好ましくは、第４オリゴヌクレオチドは、第１ヘアピンが形成されない場合に限り第１検出シグナルを放出し、第５オリゴヌクレオチドは、第２ヘアピンが形成されない場合に限り第２検出シグナルを放出する。第１ヘアピンが形成されない場合に第４オリゴヌクレオチドにより放出される第１検出シグナルは、好ましくは、第１ヘアピンが形成された場合に第４オリゴヌクレオチドにより放出されるシグナルより強力であり、また、第２ヘアピンが形成されない場合に第５オリゴヌクレオチドにより放出される第２検出シグナルは、第２ヘアピンが形成された場合に第５オリゴヌクレオチドにより放出されるシグナルより強力である。第４オリゴヌクレオチドは、理想的には、第１ヘアピンが形成されない場合に限り第１検出シグナルを放出し、第５オリゴヌクレオチドは、第２ヘアピンが形成されない場合に限り第２検出シグナルを放出する。
【００５０】
好ましい実施形態においては、第４オリゴヌクレオチドは、第１エネルギーを放出しうる第１エネルギー供与成分と放出第１エネルギー量を吸収しうる第１エネルギー受容成分とを含む第１分子エネルギー転移ペアを含有する。第１供与成分は第６ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第１受容成分は第８ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しているか、または、第１受容成分は第６ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第１供与成分は第８ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、そして、第１受容成分は、第１ヘアピンが形成された場合に限り放出第１エネルギー量を吸収する。また、第５オリゴヌクレオチドは更に、第２エネルギーを放出しうる第２エネルギー供与成分と放出第２エネルギー量を吸収しうる第２エネルギー受容成分とを含む第２分子エネルギー転移ペアを含有する。第２供与成分は第１０ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第２受容成分は第１２ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しているか、または、第２受容成分は第１０ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第２供与成分は第１２ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、そして、第２受容成分は、第２ヘアピンが形成された場合に限り放出第２エネルギー量を吸収する。
【００５１】
第１および第２供与成分のそれぞれは発蛍光団でありうる。第１および第２受容成分のそれぞれは、発蛍光団から放出される光のクエンチャー（消光物質）である。好ましい第１および第２受容成分はＤＡＢＳＹＬであり、一方、好ましい第１供与成分はフルオレセインであり、好ましい第２受容成分はスルファローダミン（ｓｕｌｆａｒｈｏｄａｍｉｎｅ）であり、あるいはその逆であってもよい。
【００５２】
理想的には、増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応、例えば三重増幅（ｔｒｉａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、核酸配列に基づく増幅、鎖置換増幅、カスケードローリングサークル増幅、または増幅不応性突然変異系である。増幅反応をｉｎ ｓｉｔｕで行うことが可能である。
【００５３】
工程（Ｆ）（ｘｉｉ）は、理想的には、（ａ）二重伸長第２鎖から二重伸長第１鎖を分離し、（ｂ）第３オリゴヌクレオチドを二重伸長第１鎖にアニールさせ、第４オリゴヌクレオチドを二重伸長第２鎖にアニールさせ、（ｃ）鋳型として二重伸長第１鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、もう１つの二重伸長第２鎖を形成させ（ここで、二重伸長第１鎖はもう一方の二重伸長第２鎖にアニールする）、鋳型として二重伸長第２鎖を使用して第４オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、もう１つの二重伸長第１鎖を形成させ（ここで、二重伸長第２鎖はもう一方の二重伸長第１鎖にアニールする）、（ｄ）上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を有限回数反復させる（この場合、（ａ）においては、二重伸長第１および第２鎖は、それぞれ、（ｃ）の二重伸長第１鎖およびもう一方の二重伸長第２鎖であるか、または、それぞれ、（ｃ）のもう一方の二重伸長第１鎖および二重伸長第２鎖である）ことを含む。
【００５４】
工程（Ｇ）（ｘｉｉ）は、理想的には、二重伸長第４鎖から二重伸長第３鎖を分離し、（ｂ）第３オリゴヌクレオチドを二重伸長第３鎖にアニールさせ、第５オリゴヌクレオチドを二重伸長第４鎖にアニールさせ、（ｃ）鋳型として二重伸長第３鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、もう１つの二重伸長第４鎖を形成させ（ここで、二重伸長第３鎖はもう一方の二重伸長第４鎖にアニールする）、鋳型として二重伸長第４鎖を使用して第５オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、もう１つの二重伸長第３鎖を形成させ（ここで、二重伸長第４鎖はもう一方の二重伸長第３鎖にアニールする）、（ｄ）上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を有限回数反復させる（この場合、（ａ）においては、二重伸長第３および第４鎖は、それぞれ、（ｃ）の二重伸長第３鎖およびもう一方の二重伸長第４鎖であるか、または、それぞれ、（ｃ）のもう一方の二重伸長第３鎖および二重伸長第４鎖である）ことを含む。
【００５５】
分子エネルギー転移（ＭＥＴ）現象は、供与分子と受容分子との間でエネルギーが通過する過程である。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）は、少なくとも１つの発蛍光団が関与しており、ＭＥＴの一形態である。発蛍光団は、ある波長において光を吸収し、別の異なる波長において光を放出する化合物である。蛍光分光光度計を使用して、同時に、発蛍光団を励起する光を放出させ、発蛍光団から放出された光を検出する。ＦＲＥＴにおいては、発蛍光団は、光子を吸収した後このエネルギーを受容分子に転移する供与分子である。ＭＥＴまたはＦＲＥＴに関与する供与分子および受容分子は、それぞれ「ＭＥＴペア」および「ＦＲＥＴペア」と称される。Ｆｏｒｓｔｅｒ，Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ Ａ４：３２１−２７（１９９４）；Ｃｌｅｇｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１：３５３−８８（１９９２）。
【００５６】
２つの発蛍光団が接近しており、第１発蛍光団の発光スペクトルが第２発蛍光団の励起スペクトルとオーバーラップする場合には、第１発蛍光団の励起が、第２発蛍光団により吸収される光を第１発蛍光団に放出させ、続いて第２発蛍光団に光を放出させる。その結果、第１発蛍光団の蛍光は消光され、一方、第２発蛍光団の蛍光が増強される。しかし、第１発蛍光団のエネルギーが、発蛍光団ではない化合物に転移されると、非発蛍光団による後続の発光を伴うことなく、第１発蛍光団の蛍光は消光される。
【００５７】
ＦＲＥＴ現象は、核酸を検出するために利用されている。これらの方法の１つは、米国特許第５，８６６，３６６号（その全体の内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。該’３６６特許は、標的核酸配列を検出するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法においてプローブとして使用されるＦＲＥＴ標識ヘアピンオリゴヌクレオチドに関するものである。このオリゴヌクレオチドは、ＦＲＥＴペアを構成するエネルギー供与体およびエネルギー受容体を含有する。該供与体および受容体は、それぞれ、該オリゴヌクレオチドの第１および第２ヌクレオチド配列上に位置する。これらの２つのヌクレオチド配列は互いに相補的であり、したがって該オリゴヌクレオチド中でヘアピンを形成しうる。
【００５８】
第１および第２ヌクレオチド配列が互いにアニールすると、供与体および受容体は接近する。この空間的配置においては、受容体は供与体からの発光を吸収し、それにより供与体からのシグナルを消光する。しかし、それらのヌクレオチド配列が互いにアニールしなければ、供与体および受容体は離れており、受容体は、もはや供与体からの発光を吸収することができず、供与体からのシグナルは消光されない。
【００５９】
したがって、該オリゴヌクレオチドがＰＣＲ中に増幅産物内に取り込まれると、ヘアピンがほどけて、受容体からの供与体の分離およびそれに続く観察されうるシグナルの放出が生じる。しかし、該オリゴヌクレオチドがＰＣＲ産物内に取り込まれない場合には、ヘアピンはそのまま維持され、供与体からの発光は受容体により消光される。したがって、ＰＣＲ後のシグナルの検出は標的の存在を示すこととなる。
【００６０】
好ましい実施形態においては、（Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第１オリゴヌクレオチドの濃度は、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満または５ｎＭ未満、あるいは５〜５０ｎＭ、あるいは２０〜３０ｎＭ、あるいは約２５ｎＭである。（Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第４オリゴヌクレオチドの濃度は、好ましくは、５００ｎＭ未満、２５０ｎＭ未満または５０ｎＭ未満、あるいは５０〜５００ｎＭ、あるいは２００〜３００ｎＭ、あるいは約２５０ｎＭである。好ましくは、（Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第４オリゴヌクレオチドの濃度は、（Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第１オリゴヌクレオチドの濃度の少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５〜３０倍、１０〜２０倍、または約１０倍である。好ましくは、（Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第２オリゴヌクレオチドの濃度は、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満または５ｎＭ未満、あるいは５〜５０ｎＭ、あるいは２０〜３０ｎＭ、あるいは約２５ｎＭである。好ましくは、（Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第５オリゴヌクレオチドの濃度は、５００ｎＭ未満、２５０ｎＭ未満または５０ｎＭ未満、あるいは５０〜５００ｎＭ、あるいは２００〜３００ｎＭ、あるいは約２５０ｎＭである。好ましくは、（Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第５オリゴヌクレオチドの濃度は、（Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第２オリゴヌクレオチドの濃度の少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５〜３０倍、１０〜２０倍、または約１０倍である。
【００６１】
もう１つの実施形態においては、本発明は、核酸多型を直接同定するための方法を提供する。この場合、検出は反応チューブを開放することなく行うことができる。この実施形態（「閉チューブ」形式）は、多数の用途でのＰＣＲの使用を妨げている増幅産物によるキャリーオーバー（持ち込み）汚染の可能性を著しく減少させる。閉チューブ法はまた、サンプルのハイスループットをもたらし、完全自動化が可能である。
【００６２】
サンプル中の核酸は精製されていても、未精製のものであってもよい。特定の実施形態においては、本発明のオリゴヌクレオチドは、新鮮な又は保存された組織または細胞のサンプル上で行うｉｎ ｓｉｔｕ増幅反応において使用される。ｉｎ ｓｉｔｕ反応においては、増幅工程後に直接、標的の高精度かつ高感度な検出を可能にする方法を用いることが有利である。これとは対照的に、通常のｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ法では、パラフィン包埋組織において、ハイブリダイゼーション工程による検出を行う必要がある。なぜなら、例えばＣＮＳ、リンパ節および脾臓からの組織サンプル中に不変的に存在するＤＮＡ修復機構が、ＰＣＲ工程中のレポーターヌクレオチドの直接的取り込みによる検出を妨げるからである。典型的には、ビオチンまたはジゴキシゲニン成分で標識された通常の直鎖状プライマーをｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲにおいて使用する場合には、アニーリングおよび伸長工程を含む増幅反応中に、検出可能な標識がほとんど又は全く取り込まれない。さらに、そのような成分で標識されたヌクレオチドの取り込みを増強するように増幅反応条件を改変すると、許容し得ないほどに高いバックグラウンドおよび偽陽性の結果が得られる。これは、サンプル中のニックＤＮＡ中に標識ヌクレオチドを組み込む内因性ＤＮＡ修復酵素の活性のせいであると考えられる。他の研究者らは、別のタイプの単一標識ＰＣＲプライマーを使用することを試みているが（Ｎｕｏｖｏ，１９９７，ＰＣＲ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、十分な感度を達成することはできておらず、偽陰性の結果を招くことが多い。ハイブリダイゼーション工程およびそれに続く洗浄工程を必要とすることは、通常のｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲプロトコールに更なる時間と経費を追加する。したがって、増幅工程後に直接的に標的の高精度かつ高感度の検出を可能にする方法を用いることが有利である。そのような方法が本発明により提供される。
【００６３】
特定の実施形態においては、本発明の増幅反応を行った後に検出され測定される、供与成分により（例えば、クエンチャーが受容成分である場合）または受容成分により（例えば、発蛍光団または発色団が受容成分である場合）放出されるエネルギーは、サンプル中に元々存在する所定の標的配列の量と相関し、それにより、元のサンプル中に存在する所定の標的配列の量の測定を可能にする。したがって、本発明の方法は、所定の標的配列を含有する核酸多型の存在、染色体の数、またはＤＮＡもしくはＲＮＡの量を測定するために定量的に使用することができる。
【００６４】
本発明のもう１つの実施形態においては、第１オリゴヌクレオチドは、（ｉ）第１ヌクレオチド配列、（ｉｉ）第１ヌクレオチド配列の５’末端における第２ヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）第２ヌクレオチド配列の５’末端における第３ヌクレオチド配列、および（ｉｖ）第３ヌクレオチド配列の５’末端における第４ヌクレオチド配列を含有する。ハイブリダイゼーション条件下、第１オリゴヌクレオチドは、第２および第４ヌクレオチド配列のヌクレオチドを含有する第１ヘアピンを形成するであろう（図３Ａ）。逆に、第１オリゴヌクレオチドは、第１ヘアピンが形成されない場合には第１検出シグナルを放出する（図３Ｂ）。
【００６５】
第２オリゴヌクレオチドは、（ｉ）第５ヌクレオチド配列、（ｉｉ）第５ヌクレオチド配列の５’末端における第６ヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）第６ヌクレオチド配列の５’末端における第７ヌクレオチド配列、および（ｉｖ）第７ヌクレオチド配列の５’末端における第８ヌクレオチド配列を含有する。この場合も、第２オリゴヌクレオチドは、第６および第８ヌクレオチド配列のヌクレオチドを含有する第２ヘアピンを形成することが可能であり、そして第２オリゴヌクレオチドは、第２ヘアピンが形成されない場合には第２検出シグナルを放出する。
【００６６】
工程（Ｂ）においては、サンプル中に第１同定配列が存在する場合には、第１オリゴヌクレオチドはポリメラーゼにより二本鎖核酸中に取り込まれ、それにより第１ヘアピンの形成を妨げる（図４、２サイクルを通して）。あるいは、ポリメラーゼは、サンプル中に第２同定配列が存在する場合、二本鎖核酸中への第２オリゴヌクレオチドの組み込みを引き起こし、それにより第２ヘアピンの形成を妨げる。サンプル中に第１および第２同定配列の両方が存在する場合には、第１および第２オリゴヌクレオチドのそれぞれが二本鎖核酸中に取り込まれて、それぞれ第１および第２ヘアピンの形成を妨げる。
【００６７】
任意の工程である工程（Ｃ）においては、増幅反応を行う（図４、ｎサイクルを通して）。その結果は、（ｉ）サンプル中に第１同定配列が存在する場合の、第１増幅産物中への第１オリゴヌクレオチドの取り込み、（ｉｉ）サンプル中に第２同定配列が存在する場合の、第２増幅産物中への第２オリゴヌクレオチドの取り込み、または（ｉｉｉ）サンプル中に両方の同定配列が存在する場合の、第１増幅産物中への第１オリゴヌクレオチドの及び第２増幅産物中への第２オリゴヌクレオチドの取り込みである。工程（Ｄ）においては、サンプル中に第１同定配列が存在するか否か（すなわち、第１シグナルが検出されるか否か）、第２同定配列が存在するか否か（すなわち、第２シグナルが検出されるか否か）、またはサンプル中に両方の同定配列が存在するか否か（両方のシグナルが検出されるか否か）に関する判定を行う。
【００６８】
好ましくは、第１オリゴヌクレオチドは、第１ヘアピンが形成されない場合に限り第１検出シグナルを放出し、第２オリゴヌクレオチドは、第２ヘアピンが形成されない場合に限り第２検出シグナルを放出する。第１ヘアピンが形成されない場合に第１オリゴヌクレオチドにより放出される第１検出シグナルは、好ましくは、第１ヘアピンが形成された場合に第１オリゴヌクレオチドにより放出されるシグナルより強力であり、また、第２ヘアピンが形成されない場合に第２オリゴヌクレオチドにより放出される第２検出シグナルは、第２ヘアピンが形成された場合に第２オリゴヌクレオチドにより放出されるシグナルより強力である。
【００６９】
もう１つの実施形態においては、第１オリゴヌクレオチドは更に、第１エネルギーを放出しうる第１エネルギー供与成分と放出第１エネルギー量を吸収しうる第１エネルギー受容成分とを含む第１分子エネルギー転移ペアを含有する。第１供与成分は第２ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第１受容成分は第４ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しているか、または第１受容成分は第２ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第１供与成分は第４ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、そして、第１受容成分は、第１ヘアピンが形成された場合に限り放出第１エネルギー量を吸収する。また、第２オリゴヌクレオチドは更に、第２エネルギーを放出しうる第２エネルギー供与成分と放出第２エネルギー量を吸収しうる第２エネルギー受容成分とを含む第２分子エネルギー転移ペアを含有する。第２供与成分は第６ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第２受容成分は第８ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しているか、または第２受容成分は第６ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第２供与成分は第８ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、そして、第２受容成分は、第２ヘアピンが形成された場合に限り放出第２エネルギー量を吸収する。
【００７０】
第１および第２供与成分のそれぞれは発蛍光団であること、ならびに第１および第２受容成分のそれぞれは、発蛍光団から放出される光のクエンチャー（消光物質）であることが好ましい。第１および第２受容成分の具体例としてはＤＡＢＳＹＬが挙げられ、一方、第１供与成分はフルオレセインであり、第２受容成分はスルファローダミンでありうる。あるいは、第１供与成分はスルファローダミンであり、第２受容成分はフルオレセインである。
【００７１】
増幅反応は、理想的には、ポリメラーゼ連鎖反応、例えば三重増幅（ｔｒｉａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、核酸配列に基づく増幅、鎖置換増幅、カスケードローリングサークル増幅、または増幅不応性突然変異系である。増幅反応はｉｎ ｓｉｔｕで行うことが可能である。
【００７２】
本発明においては、「相補的」である核酸は、相補性から生じる所望の特性（例えば、ハイブリダイズする能力）が失われない限り、完全に又は不完全に相補的でありうる。
【００７３】
本発明の更なる態様は、第１同定配列または第２同定配列または両方の存在を判定するためのキットに関する。特定の実施形態においては、該キットは、１以上の容器中に第１〜第５オリゴヌクレオチドを含む。該キットは更に、本発明の増幅反応を行うための追加の成分を含みうる。増幅すべき標的核酸配列が、疾患または障害に関与しているものである場合には、該キットは、診断または予後判定のために使用することができる。特定の実施形態においては、核酸多型の検出および増幅を行うための本発明のフォワードおよびリバースプライマーと、所望により、エキソヌクレアーゼ活性をもつ及びもたないそれぞれ１種または２種のＤＮＡポリメラーゼとを、１以上の容器中に含むキットを提供する。三重増幅のためのキットは更に、ブロッキングオリゴヌクレオチドと、場合により、ＤＮＡリガーゼとを、１以上の容器中に含みうる。
【００７４】
容器中のオリゴヌクレオチドは、任意の形態、例えば、凍結乾燥形態または溶解状態（例えば、蒸留水または緩衝溶液）などでありうる。同一の増幅反応においてすぐに使用する複数のオリゴヌクレオチドは単一の容器中に組み合わせても、別々の容器中に入れてもよい。また、２以上の増幅（フォワードおよびリバース）プライマー対を含有する多重キットも提供され、その場合、各増幅産物から検出されるシグナルは異なる波長のものである（例えば、各プライマー対の供与成分が異なる波長において蛍光を発する）。そのような多重キットは少なくとも２つのそのようなプライマー対を含有する。
【００７５】
特定の実施形態においては、キットは、増幅を開始させることができるプライマー（好ましくは、１０〜１００または１０〜８０ヌクレオチドの範囲、より好ましくは、２０〜４０ヌクレオチドの範囲のもの）の対を、１以上の容器中に含む。そのようなプライマーは、ＰＣＲ（例えば、Ｉｎｎｉｓら，１９９０，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．を参照されたい）、競合的ＰＣＲ、競合的逆転写ＰＣＲ（Ｃｌｅｍｅｎｔｉら，１９９４，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．１１（１）：１−６；Ｓｉｅｂｅｒｔら，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ ３５９：５５７−５５８）、三重増幅、ＮＡＳＢＡおよび鎖置換を含むがこれらに限らない種々の増幅反応において増幅を開始させることが可能である。
【００７６】
ＰＣＲまたは鎖置換による増幅に使用するためのフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマー対は、２つの相補的核酸鎖の異なる鎖にそれぞれ相補的であるプライマーよりなり、一方のプライマーの、他方のプライマーの方向への伸長産物が核酸ポリメラーゼにより産生された場合には、その伸長産物は他方のプライマーの伸長産物の合成のための鋳型として働く。三重増幅に使用するための、フォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマー対は、２つの相補的核酸鎖の異なる鎖にそれぞれ相補的であるプライマーよりなり、一方のプライマーの、他方のプライマーの方向への伸長連結産物が核酸ポリメラーゼおよび核酸リガーゼにより産生された場合には、その伸長連結産物は他方のプライマーの伸長連結産物の合成のための鋳型として働きうる。これらの場合の増幅産物は、プライマー配列間（プライマーを含む）のサンプル中の核酸の内容物である。
【００７７】
もう１つの実施形態においては、第１同定配列または第２同定配列または両方の存在を判定するためのキットは、１以上の容器中に、（ａ）オリゴヌクレオチドプライマー（その一方または両方は、ＭＥＴを引き起こしうる消光成分および蛍光成分で標識されたヘアピンプライマーである）を含み、場合により、（ｂ）対照ＤＮＡ標的配列、（ｃ）増幅用の最適化バッファー、（ｄ）意図される増幅法のための適切な酵素、例えば、ＰＣＲ、三重増幅またはＳＤＡにはＤＮＡポリメラーゼ、あるいはＮＡＳＢＡには逆転写酵素、および（ｅ）増幅反応を実施するための１組の説明書を含みうる。そのような説明書には、例えば、該反応を行うための最適な条件、例えば温度、増幅のサイクル数、ｐＨ、塩などが記載されている。所望により、該キットは、（ｆ）蛍光発光を刺激し検出するための手段、例えば、該分析を行うための蛍光プレートリーダーまたは複合サーモサイクラー−プレートリーダーを備えていてもよい。
【００７８】
さらにもう１つの実施形態においては、三重増幅のためのキットを提供する。該キットは、フォワードおよびリバース伸長プライマーならびにブロッキングオリゴヌクレオチドを含む。フォワードまたはリバースプライマーのいずれかをＭＥＴ成分のペアの一方の成分で標識し、ブロッキングオリゴヌクレオチドを該ペアの他方のＭＥＴ成分で標識する。そのようなキットの１つの実施形態は、１以上の容器中に、（ａ）第１オリゴヌクレオチド、（ｂ）第２オリゴヌクレオチド（第１および第２オリゴヌクレオチドは三重増幅反応に使用するための直鎖状プライマーである）、（ｃ）第１オリゴヌクレオチドの配列に相補的であってハイブリダイズ可能な配列を含むブロッキングオリゴヌクレオチドである第３オリゴヌクレオチド（第１および第３オリゴヌクレオチドは、それぞれ、供与成分と受容成分とよりなる分子エネルギー転移ペアのメンバーである第１および第２成分で標識されており、その結果、第１および第３オリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズし、供与成分が励起されてエネルギーを放出すると、受容成分は供与成分により放出されたエネルギーを吸収する）を含み、そして（ｄ）別の容器中に核酸リガーゼを含む。
【００７９】
キットのもう１つの実施形態は、容器中に普遍的ヘアピンを含み、また、所望により、臭化シアンまたは核酸リガーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼ）を含有する第２容器を含む。
【００８０】
図２に示すような反応を行うためのキットは、１以上の容器中に、（ａ）第１および第２オリゴヌクレオチド、（ｂ）第３オリゴヌクレオチド（ここで、第１および第２オリゴヌクレオチドはフォワードプライマーであり、第３オリゴヌクレオチドは、核酸多型を同定するための増幅反応におけるＤＮＡ合成用のリバースプライマーであり、第１および第２オリゴヌクレオチドは、（ｉ）該核酸配列中の所定の標的配列に相補的でない５’配列、および（ｉｉ）所定の標的配列に相補的である３’配列を含み、１以上のミスマッチヌクレオチドを含みうる）、および（ｃ）第４オリゴヌクレオチド［これは、５’から３’の順序で、（ｉ）６〜３０ヌクレオチドの第１ヌクレオチド配列（ここで、第１ヌクレオチド配列中のヌクレオチドは、分子エネルギー転移ペアの供与成分および受容成分よりなる群から選ばれる第１成分で標識されており、供与成分は励起されると１以上の特定の波長のエネルギーを放出し、受容成分は供与成分により放出された１以上の特定の波長におけるエネルギーを吸収する）、（ｉｉ）３〜２０ヌクレオチドの一本鎖の第２ヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）６〜３０ヌクレオチドの第３ヌクレオチド配列（ここで、第３ヌクレオチド配列中のヌクレオチドは、供与成分および受容成分よりなる群から選ばれる第２成分で標識されており、第２成分は、第１ヌクレオチド配列を標識していない上記群のメンバーであり、第３ヌクレオチド配列は、第１ヌクレオチド配列と第３ヌクレオチド配列との間で二本鎖を形成するのに十分な程度に逆の順序で第１ヌクレオチド配列に相補的であり、そのため、第１成分と第２成分とは十分に接近していて、供与成分が励起されてエネルギーを放出すると、受容成分は供与成分により放出されたエネルギーを吸収する）、（ｉｖ）第３オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端における、１０〜２５ヌクレオチドの第４ヌクレオチド配列（これは、第１オリゴヌクレオチドプライマーの５’配列と同一である配列をその３’末端に含む）を含む］を含む。そのようなキットを三重増幅に使用する場合には、ブロッキングオリゴヌクレオチドも提供されうる。
【００８１】
本発明のもう１つのキットは、１以上の容器中に、（ａ）第１オリゴヌクレオチド、（ｂ）第２オリゴヌクレオチド（第１および第２オリゴヌクレオチドは互いにハイブリダイズ可能であり、第１オリゴヌクレオチドは供与成分で標識されており、第２オリゴヌクレオチドは受容成分で標識されており、供与および受容成分は分子エネルギー転移ペアであり、ここで、供与成分は励起されると１以上の特定の波長のエネルギーを放出し、受容成分は供与成分により放出された１以上の特定の波長におけるエネルギーを吸収する）を含み、そして（ｃ）別の容器中に核酸リガーゼを含む。
【００８２】
本発明のアプローチは、とりわけ、遺伝病の診断、キャリア（保因者）のスクリーニング、ＨＬＡタイピング、ヒト遺伝子マッピング、法科学および親子鑑定のための有効な手段を与える。本発明は、以下の実施例を参考にして更に詳しく説明されるが、これらの実施例は例示として記載されているに過ぎない。以下の実施例中のいかなる点も、本発明の全体的な精神および範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００８３】
実施例
実施例１：普遍的ＦＲＥＴプライマーによる一般的な増幅反応
１．プライマーの設計
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーの概要を図１に示す。
【００８４】
以下の実施例の目的においては、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、以下に記載するプライマーとして表示される。
【００８５】
Ｏ１は、本発明においては、「フォワードプライマー」と称される。これは、１以上の多型の検出のための１以上のミスマッチヌクレオチドを含有する配列特異的プライマーであり、ＦＡＭ普遍的プライマーに結合しうる。
【００８６】
Ｏ２は、本発明においては、「フォワードプライマー」と称される。これは、１以上の多型の検出のための１以上のミスマッチヌクレオチドを含有する第２配列特異的プライマーである。このプライマーは、ＳＲ普遍的プライマーに結合しうる。
【００８７】
Ｏ３は、本発明においては、「リバースプライマー」と称される。
【００８８】
Ｏ４は、本発明においては、「ＦＡＭ普遍的プライマー」と称される。
【００８９】
Ｏ５は、本発明においては、「ＳＲ普遍的プライマー」と称される。
【００９０】
フォワードおよびリバースプライマーの具体例は、表１および表２に記載されている。表１は、フォワードおよびリバースの両プライマーの代表的具体例を例示する。表１中の配列特異的フォワードプライマー対は、それらの末端３’ヌクレオチドにおいて異なる。表２は、フォワードおよびリバースの両プライマーの代表的具体例、ならびに多型を含有する遺伝子標的配列を例示する。
【００９１】
以下の実施例において使用する普遍的ＦＲＥＴプライマーは、以下の配列を含む：
緑（ＦＡＭ）プライマー：
（配列番号１）
赤（スルホローダミン（ＳＲ））プライマー：
（配列番号２）。
【００９２】
ヘアピンを形成しうる配列は両方の普遍的プライマーにおいて下線で示されており、斜体文字のＴは、ＤＡＢＳＹＬクエンチャーが塩基に結合している部位を示す。
【００９３】
【表１】
【００９４】
【表２】
【００９５】
１．増幅：
増幅反応は、Ｖｉｃｔｏｒ ＩＩ蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ）上で直接的に読み取ることが可能な、標準９６ウェルポリプロピレンＰＣＲプレート反応においてアセンブルした。あるいは反応をチューブ中で行い、ついで、蛍光測定用のプレートに移すことができる。ＰＣＲ増幅反応混合物を以下に示す。
【００９６】
２．反応混合物：最終容積は２０μｌとした。
＊ 代替酵素として、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（ＢＲＬ）が、同じバッファーと共に成功裏に使用された。
【００９７】
３．ＰＣＲ反応：
ＵｌｔｒａＰｌａｔｅをサイクルシーラー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で密封し、サーモサイクラーブロック（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９７００）上に配置し、予め９４℃に加熱した。９４℃で５分間加熱した後、３５サイクルの増幅反応（９４℃で１０秒、５５℃で２０秒、７２℃で４０秒）を行った。
【００９８】
４．蛍光測定
反応後、相互干渉（クロストーク）を防止するために該プレートを黒色支持体中に配置し、蛍光強度を緑色および赤色フィルターで測定した。いくつかの装置（２つの蛍光プレートリーダーおよび２つのデジタルカメラ）がサンプルの蛍光測定に適していることが判明した。
【００９９】
測定は、Ｖｉｃｔｏｒ ＩＩ 蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ）を使用して行った。ＳＲチャンネル用の追加の発光および励起フィルターが製造業者によりインストールされた。
【０１００】
実施例２：ＣＹＰ１７遺伝子中のＳＮＰを検出するための多重対立遺伝子特異的ＰＣＲ
１．増幅反応：
ヒトゲノムＤＮＡのサンプルを、ＣＹＰ１７遺伝子中の＊２対立遺伝子の存在に関して分析した。特に、Ａ型またはＧ型対立遺伝子の存在に関してＤＮＡサンプルを分析した。
【０１０１】
ＰＣＲ増幅反応プライマー
Ａ型対立遺伝子に特異的な未標識フォワードプライマーは、配列５’−ｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔＧＣＣＡＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＡＣＴＣＣＡＣＴ（配列番号１２）（ここで、ＦＡＭ標識プライマーの３’部分と同一の配列は小文字で示されている）を含んでいた。Ｇ型対立遺伝子に特異的な未標識フォワードプライマーは、配列５’−ｇａａｇｇｔｃｇｇａｇｔｃａａｃｇｇａｔｔＧＣＣＡＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＡＣＴＣＣＡＣＣ（ここで、ＳＲ標識プライマーの３’部分と同一の配列は小文字で示されている）を含んでいた。多型の同定に導いたヌクレオチドには下線が引いてある。該反応で使用したリバースプライマーは、配列ＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＣＴＴ（配列番号１４）を含んでいた。使用した普遍的ＦＲＥＴプライマーは、実施例１に記載のものと同一であった。
【０１０２】
２．増幅反応
多重ＰＣＲ反応が高レベルの対立遺伝子識別を達成しうるか否かを判定するために、３組の増幅反応を準備した。
【０１０３】
反応１（一重）：
ヒトゲノムＤＮＡを使用する増幅反応混合物は、実施例１に記載のものと同じであったが、次のような相違を含んでいた。この反応では、Ａ型対立遺伝子特異的プライマー、ＦＡＭ標識ヘアピンプライマーおよびリバースプライマーのみを使用した。
【０１０４】
反応２（一重）：
ヒトゲノムＤＮＡを使用する増幅反応混合物は、実施例１に記載のものと同じであったが、次のような相違を含んでいた。この反応では、Ｇ型対立遺伝子特異的プライマー、ＳＲ標識ヘアピンプライマーおよびリバースプライマーのみを使用した。
【０１０５】
反応３（多重）：
ヒトゲノムＤＮＡを使用する増幅反応混合物は、実施例１に記載のものと同じであった。この反応では、両方のフォワードプライマー、すなわち、Ｇ型対立遺伝子特異的プライマーおよびＡ型対立遺伝子特異的プライマー、ＳＲ標識ヘアピンプライマー、ＦＡＭ標識ヘアピンプライマーならびにリバースプライマーを使用した。両方の対立遺伝子特異的プライマーが同じ反応中に存在しているため、この反応は多重ＰＣＲ増幅の典型例である。
【０１０６】
３．ＰＣＲ反応
それらの３組の反応はそれぞれ、３つの「無ＤＮＡ対照」（ＮＤＣ）を含んでいた。混合物を予め９４℃で３分間加熱した後、９４℃で１０秒、５５℃で２０秒および７２℃で４０秒の熱サイクル（サーモサイクリング）（ＰＣＲ）を３５サイクル行った。
【０１０７】
４．蛍光測定
ＰＣＲ後、ＦＡＭについては５８５ｎｍおよびＳＲについては６２０ｎｍの発光フィルターを使用して、プレートリーダーで相対蛍光を測定した。無ＤＮＡ対照における平均蛍光シグナルを、各サンプル反応の対応シグナルから引き算した。補正蛍光シグナルをプロットで示す（図５Ｂ）。
【０１０８】
５．結果
結果を図５Ａおよび５Ｂに示す。図５Ａおよび５Ｂは、Ａ型特異的プライマーがＡ型およびＧ型の両方のＤＮＡ上でＦＡＭシグナルを生成し（１および２）、Ｇ特異的プライマーがＡ型およびＧ型の両方のＤＮＡでＳＲシグナルを生成したこと（３および４）を示している。したがって、これらのプライマーを別々に選択した場合には、対立遺伝子識別は低く、ＤＮＡ型を識別するのに十分ではなかった。しかしながら、Ａ特異的およびＧ特異的の両方のプライマーが同時に存在する場合（反応３、多重ＰＣＲ）（５および６）。
【０１０９】
実施例３：ＨＥＲ２遺伝子中のＳＮＰを検出するための多重対立遺伝子特異的ＰＣＲ
１．増幅反応：
ゲノムＤＮＡのサンプルを、ＨＥＲ２遺伝子中のＳＮＰの存在に関して分析した。特に、Ａ型またはＧ型対立遺伝子の存在に関してＤＮＡサンプルを分析した。
【０１１０】
ＰＣＲ増幅反応プライマー
プライマーおよび標的配列を表２（Ａ）に要約する。Ａ型対立遺伝子に特異的な未標識フォワードプライマーは、配列５’−ｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔＧＣＣＡＡＣＣＡＣＣＧＣＡＧＡＧＡＴ（配列番号ＸＸ）（ここで、ＦＡＭ標識プライマーの３’部分と同一の配列は小文字で示されており、多型の同定に導いたヌクレオチドには下線が引いてある）を含んでいた。Ｇ型対立遺伝子に特異的な未標識フォワードプライマーは、配列５’−ｇａａｇｇｔｃｇｇａｇｔｃａａｃｇｇａｔｔＧＣＣＡＡＣＣＡＣＣＧＣＡＧＡＧＡＣ（配列番号ＸＸ）（ここで、ＳＲ標識プライマーの３’部分と同一の配列は小文字で示されており、多型の同定に導いたヌクレオチドには下線が引いてある）を含んでいた。該反応で使用したリバースプライマーは、配列ＴＣＡＡＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＣＴＴ（配列番号ＸＸ）を含んでいた。使用した普遍的ＦＲＥＴプライマーは、実施例１に記載のものと同一であった。
【０１１１】
２．多重増幅反応：
ゲノムＤＮＡを使用する増幅反応混合物は、実施例１に記載のものと同じであった。この反応では、両方のフォワードプライマー、すなわち、Ｇ型対立遺伝子特異的プライマーおよびＡ型対立遺伝子特異的プライマー、ＳＲ標識ヘアピンプライマー、ＦＡＭ標識ヘアピンプライマーならびにリバースプライマーを使用した。
【０１１２】
３．ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応はそれぞれ、４つの「無ＤＮＡ対照」（ＮＤＣ）を含んでいた。混合物を予め９４℃で３分間加熱した後、９４℃で１０秒、５５℃で２０秒および７２℃で４０秒の熱サイクル（サーモサイクリング）（ＰＣＲ）を３５サイクル行った。
【０１１３】
４．蛍光測定
ＰＣＲ後、ＦＡＭについては５８５ｎｍおよびＳＲについては６２０ｎｍの発光フィルターを使用して、プレートリーダーで相対蛍光を測定した。無ＤＮＡ対照における平均蛍光シグナルを、各サンプル反応の対応シグナルから引き算した。補正蛍光シグナルをプロットで示す（図６Ａおよび６Ｂ）。
【０１１４】
５．結果
結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。この図は、Ａ特異的およびＧ特異的の両方のプライマーが同時に存在する場合の良好な対立遺伝子識別を示している。
【０１１５】
実施例４：多型をまたぐことによりＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中のＳＮＰを検出するための多重対立遺伝子特異的ＰＣＲ
１．増幅反応：
ゲノムＤＮＡのサンプルを、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中のＳＮＰの存在に関して分析した。特に、Ｃ型またはＴ型対立遺伝子の存在に関してＤＮＡサンプルを分析した。この反応で使用したプライマーは互いに相違する。Ｔ型対立遺伝子に特異的なプライマーは、その３’末端ヌクレオチド以外のヌクレオチドが異なるため、多型をまたいでいる（ｂｒｉｄｇｅ）。
【０１１６】
ＰＣＲ増幅反応プライマー
プライマーおよび標的配列を表２（Ｂ）に要約する。Ｃ型対立遺伝子に特異的な未標識フォワードプライマーは、配列５’−ｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔＧＴＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴＡＧＣＡＧＡＴＣＧ（配列番号ＸＸ）（ここで、ＦＡＭ標識プライマーの３’部分と同一の配列は小文字で示されており、多型の同定に導いたヌクレオチドには下線が引いてある）を含んでいた。Ｔ型対立遺伝子に特異的な未標識フォワードプライマーは、配列５’−ｇａａｇｇｔｃｇｇａｇｔｃａａｃｇｇａｔｔＧＴＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴＡＧＣＡＧＡＴＡＧ（配列番号ＸＸ）（ここで、ＳＲ標識プライマーの３’部分と同一の配列は小文字で示されており、多型の同定に導いたヌクレオチドには下線が引いてある）を含んでいた。このプライマーの場合、３’末端ヌクレオチドではなく、該プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチドが異なる。該反応で使用したリバースプライマーは、配列ＴＧＣＴＴＣＡＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＡＡＧＡＡＴ（配列番号ＸＸ）を含んでいた。使用した普遍的ＦＲＥＴプライマーは、実施例１に記載のものと同一であった。
【０１１７】
２．多重増幅反応：
ゲノムＤＮＡを使用する増幅反応混合物は、実施例１に記載のものと同じであった。この反応では、両方のフォワードプライマー、すなわち、Ｃ型対立遺伝子特異的プライマーおよびＴ型対立遺伝子特異的プライマー、ＳＲ標識ヘアピンプライマー、ＦＡＭ標識ヘアピンプライマーならびにリバースプライマーを使用した。
【０１１８】
３．ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応はそれぞれ、４つの「無ＤＮＡ対照」（ＮＤＣ）を含んでいた。混合物を予め９４℃で３分間加熱した後、９４℃で１０秒、５５℃で２０秒および７２℃で４０秒の熱サイクル（サーモサイクリング）（ＰＣＲ）を３５サイクル行った。
【０１１９】
４．蛍光測定
ＰＣＲ後、ＦＡＭについては５８５ｎｍおよびＳＲについては６２０ｎｍの発光フィルターを使用して、プレートリーダーで相対蛍光を測定した。無ＤＮＡ対照における平均蛍光シグナルを、各サンプル反応の対応シグナルから引き算した。補正蛍光シグナルをプロットで示す（図７Ａおよび７Ｂ）。
【０１２０】
５．結果
結果を図７Ａおよび７Ｂに示す。この図は、Ｃ特異的およびＴ特異的の両方のプライマーが同時に存在する場合の良好な対立遺伝子識別を示している。
【０１２１】
実施例５：多型をまたぐことによりＨＴＲ２Ｃ遺伝子中のＳＮＰを検出するための多重対立遺伝子特異的ＰＣＲ
１．増幅反応：
ゲノムＤＮＡのサンプルを、ＨＴＲ２Ｃ遺伝子中のＳＮＰの存在に関して分析した。特に、Ｃ型またはＧ型対立遺伝子の存在に関してＤＮＡサンプルを分析した。この反応で使用したプライマーは、３’末端ヌクレオチドから３番目のヌクレオチドが異なるため、多型をまたいでいる。
【０１２２】
ＰＣＲ増幅反応プライマー
プライマーおよび標的配列を表２（Ｃ）に要約する。Ｃ型対立遺伝子に特異的な未標識フォワードプライマーは、配列５’−ｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔＧＧＧＣＴＣＡＣＡＧＡＡＡＴＡＴＣＡＧＡＴ（配列番号ＸＸ）（ここで、ＦＡＭ標識プライマーの３’部分と同一の配列は小文字で示されており、多型の同定に導いたヌクレオチドには下線が引いてある）を含んでいた。Ｔ型対立遺伝子に特異的な未標識フォワードプライマーは、配列５’−ｇａａｇｇｔｃｇｇａｇｔｃａａｃｇｇａｔｔＧＧＧＣＴＣＡＣＡＧＡＡＡＴＡＴＣＡＣＡＴ（配列番号ＸＸ）（ここで、ＳＲ標識プライマーの３’部分と同一の配列は小文字で示されており、多型の同定に導いたヌクレオチドには下線が引いてある）を含んでいた。このプライマーの場合、３’末端ヌクレオチドではなく、該プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチドが異なる。該反応で使用したリバースプライマーは、配列ＴＧＣＡＣＣＴＡＡＴＴＧＧＣＣＴＡＴＴＧＧＴＴＴ（配列番号ＸＸ）を含んでいた。使用した普遍的ＦＲＥＴプライマーは、実施例１に記載のものと同一であった。
【０１２３】
２．多重増幅反応：
ゲノムＤＮＡを使用する増幅反応混合物は、実施例１に記載のものと同じであった。この反応では、両方のフォワードプライマー、すなわち、Ｇ型対立遺伝子特異的プライマーおよびＣ型対立遺伝子特異的プライマー、ＳＲ標識ヘアピンプライマー、ＦＡＭ標識ヘアピンプライマーならびにリバースプライマーを使用した。
【０１２４】
３．ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応はそれぞれ、４つの「無ＤＮＡ対照」（ＮＤＣ）を含んでいた。混合物を予め９４℃で３分間加熱した後、９４℃で１０秒、５５℃で２０秒および７２℃で４０秒の熱サイクル（サーモサイクリング）（ＰＣＲ）を３５サイクル行った。
【０１２５】
４．蛍光測定
ＰＣＲ後、ＦＡＭについては５８５ｎｍおよびＳＲについては６２０ｎｍの発光フィルターを使用して、プレートリーダーで相対蛍光を測定した。無ＤＮＡ対照における平均蛍光シグナルを、各サンプル反応の対応シグナルから引き算した。補正蛍光シグナルをプロットで示す（図８Ａおよび８Ｂ）。
【０１２６】
５．結果
結果を図８Ａおよび８Ｂに示す。この図は、Ｃ特異的およびＧ特異的の両方のプライマーが同時に存在する場合の良好な対立遺伝子識別を示している。
【０１２７】
実施例６：ＣＣＲ５遺伝子中の欠失を検出するための多重対立遺伝子特異的ＰＣＲ
１．増幅反応：
ゲノムＤＮＡのサンプルを、ＣＣＲ５遺伝子中の欠失の存在に関して分析した。特に、該遺伝子欠失の存在または不存在に関してＤＮＡサンプルを分析した。
【０１２８】
ＰＣＲ増幅反応プライマー
プライマーおよび標的配列を表２（Ｄ）に要約する。野生型対立遺伝子に特異的な未標識フォワードプライマーは、配列５’−ｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔＣＴＣＡＴＴＴＴＣＣＡＴＡＣＡＧＴＣＡ（配列番号ＸＸ）（ここで、ＦＡＭ標識プライマーの３’部分と同一の配列は小文字で示されており、野生型対立遺伝子の同定に導いたヌクレオチドには下線が引いてある）を含んでいた。突然変異対立遺伝子に特異的な未標識フォワードプライマーは、配列５’−ｇａａｇｇｔｃｇｇａｇｔｃａａｃｇｇａｔｔｇｃａｇｃｔｃｔｃａｔｔｔｔｃｃａｔａｃａｔｔａ（配列番号ＸＸ）（ここで、ＳＲ標識プライマーの３’部分と同一の配列は小文字で示されている）を含んでいた。該反応で使用したリバースプライマーは、配列ＡＣＣＡＧＣＣＣＣＡＡＧＡＴＧＡＣＴＡＴＣＴＴ（配列番号ＸＸ）を含んでいた。使用した普遍的ＦＲＥＴプライマーは、実施例１に記載のものと同一であった。
【０１２９】
２．多重増幅反応
ゲノムＤＮＡを使用する増幅反応混合物は、実施例１に記載のものと同じであった。この反応では、両方のフォワードプライマー、すなわち、野生型対立遺伝子特異的プライマーおよび突然変異対立遺伝子特異的プライマー、ＳＲ標識ヘアピンプライマー、ＦＡＭ標識ヘアピンプライマーならびにリバースプライマーを使用した。
【０１３０】
３．ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応はそれぞれ、４つの「無ＤＮＡ対照」（ＮＤＣ）を含んでいた。混合物を予め９４℃で３分間加熱した後、９４℃で１０秒、５５℃で２０秒および７２℃で４０秒の熱サイクル（サーモサイクリング）（ＰＣＲ）を３５サイクル行った。
【０１３１】
４．蛍光測定
ＰＣＲ後、ＦＡＭについては５８５ｎｍおよびＳＲについては６２０ｎｍの発光フィルターを使用して、プレートリーダーで相対蛍光を測定した。無ＤＮＡ対照における平均蛍光シグナルを、各サンプル反応の対応シグナルから引き算した。補正蛍光シグナルをプロットで示す（図９Ａおよび９Ｂ）。
【０１３２】
５．結果
結果を図９Ａおよび９Ｂに示す。この図は、野生型特異的および突然変異特異的の両方のプライマーが同時に存在する場合の良好な対立遺伝子識別を示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーの一般的模式図を示す。
【図２】
本発明の方法の好ましい実施形態の１つを示す模式図である。
【図３】
（Ａ）ヘアピンコンホメーションおよび（Ｂ）伸長コンホメーションをとったオリゴヌクレオチドの構造の模式図である。
【図４】
ポリメラーゼ連鎖反応を用いる本発明の方法のもう１つの実施形態を示す。
【図５】
図５Ａは、Ａ型対立遺伝子およびＧ型対立遺伝子に関するＣＹＰ１７遺伝子の遺伝子型決定の結果を示す。図５Ｂは、一重（シングルプレックス）ＰＣＲ反応に対する多重（マルチプレックス）ＰＣＲ反応の利点を示す。
【図６】
図６Ａは、Ａ型対立遺伝子およびＧ型対立遺伝子に関するＨＥＲ２遺伝子の遺伝子型決定の結果を示す。図６Ｂは、図５Ａの蛍光結果のグラフ表示を示す。
【図７】
図７Ａは、Ｃ型対立遺伝子およびＴ型対立遺伝子に関するＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の遺伝子型決定の結果を示す。図７Ｂは、図６Ａの蛍光結果のグラフ表示を示す。
【図８】
図８Ａは、Ｃ型対立遺伝子およびＧ型対立遺伝子に関するＨＴＲ２Ｃ遺伝子の遺伝子型決定の結果を示す。図８Ｂは、図７Ａの蛍光結果のグラフ表示を示す。
【図９】
図９Ａは、野生型遺伝子および欠失突然変異体に関するＣＣＲ５遺伝子の遺伝子型決定の結果を示す。図９Ｂは、図８Ａの蛍光結果のグラフ表示を示す。
本出願は、２０００年１０月２４日付け出願の米国仮特許出願第６０／２４２，６７２号に基づく優先権の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、広義には、特異的ヌクレオチド配列の検出方法に関する。より詳しくは、本発明は、エネルギー供与体とエネルギー受容体とを含む分子エネルギー転移（ＭＥＴ）ペアで標識されたオリゴヌクレオチドからのシグナルの検出がサンプル中の特異的ヌクレオチド配列の存在を示す方法に関する。この方法は、他のヌクレオチドの環境中の単一ヌクレオチドを識別するのに十分な感度を有する。したがって、本発明はまた、一塩基（単一ヌクレオチド）多型（ＳＮＰ）のような核酸多型の検出に関する。
【０００３】
発明の背景
遺伝子中の或る同定ヌクレオチド配列は、疾患の存在、疾患に対する感受性または表現型を示唆する。これらの同定配列は個体の特定の遺伝子中の自発的変化（例えば、突然変異）を表したり、あるいは集団中に維持される遺伝子（例えば、対立遺伝子）の形態間の相違を表しうる。かかる変化または相違は遺伝子中のいくつかのヌクレオチドにおいて生じたり、あるいは単一ヌクレオチドにおいて生じうる。単一ヌクレオチドの変化または相違は、検出系に対する、より大きな挑戦に相当する。
【０００４】
遺伝子の対立遺伝子間を識別する同定配列は、関心のある相違が１つのヌクレオチド位置に存在する場合には、「一塩基多型」、すなわちＳＮＰを特徴づけると言われている。単一ヌクレオチドの変化は種々の遺伝病を引き起こすことが示されている。例えば、鎌状赤血球貧血は、ヒトβグロビン遺伝子の第６コドン中のアデニン残基からチミン残基へのトランスバージョン（塩基転換）により引き起こされる。このトランスバージョンは、ヘモグロビンのβグロビンサブユニット中のグルタミン酸残基からバリン残基への置換を引き起こして、デオキシヘモグロビン分子の溶解性を低下させ、そして、罹患赤血球の「鎌状化」をもたらす。鎌状赤血球は微小循環系中に捕捉され、多くの臓器を損傷させる。
【０００５】
Ｋａｎら，Ｌａｎｃｅｔ ２：９１０−１２（１９７８）は、ＨｐａＩ制限断片長多型に対する鎌状細胞対立遺伝子の連鎖に基づき、罹患個体からのＤＮＡを調べることにより鎌状赤血球を診断した最初の記載であった。その後、Ｇｅｅｖｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：５０８１−８５（１９８２）およびＣｈａｎｇら，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．３０７：３０−３２（１９８２）は、問題の突然変異がＤｄｅＩおよびＭｓｔＩＩの両方の切断部位に影響を及ぼし、したがって制限酵素分解により直接的に検出されうることを示した。Ｃｏｎｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２７８−８２（１９８３）は、配列特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを用いることによる単一ヌクレオチド変異の直接的検出のための、より一般的なアプローチを記載している。この方法においては、短い合成オリゴヌクレオチドプローブが、適当な条件下、１つの対立遺伝子のみにハイブリダイズする。
【０００６】
これらのアプローチのすべては、遅々たるもので、技術的には挑戦的であり、相応に大量のＤＮＡを必要とする。
【０００７】
Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０−５４（１９８５）により開発されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、少量の標的ＤＮＡの迅速な増幅を可能にした。ＰＣＲは、関心のある配列にまたがる位置でＤＮＡの反対鎖にアニールする２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。該ＤＮＡ配列の鋳型依存的合成の連続的ラウンドのために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント（Ｓａｉｋｉら（１９８５），前掲）またはテルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−９１（１９８８））のようなＤＮＡポリメラーゼを使用する。それぞれの新ラウンドの開始前に、ＤＮＡを変性させ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）酵素の場合には新鮮な酵素を加える。このようにして、標的配列の指数関数的増幅が達成される。
【０００８】
ついで、得られた増幅ＤＮＡを、配列特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（Ｓａｉｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３−６６（１９８６））、制限酵素切断（Ｓａｉｋｉら（１９８５），前掲；Ｃｈｅｈａｂら，Ｎａｔｕｒｅ ３２９：２９３−９４（１９８７））、オリゴヌクレオチドペアの連結（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−８０（１９８８））または連結増幅により、鎌状細胞突然変異のようなＤＮＡ配列変異の存在に関して容易に分析することができる。ＰＣＲは分析速度を迅速化させ、必要となるＤＮＡの量を減少させたが、それはＤＮＡ配列変異の分析方法を変化させるものではなかった。
【０００９】
その後、Ｗａｌｌａｃｅらの米国特許第５，６３９，６１１号は、鎌状細胞貧血を引き起こす対立遺伝子の検出に適していると言われている対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応を開示している。Ｗａｌｌａｃｅらは、ＰＣＲプライマーの１つの３’ヌクレオチドが鋳型とミスマッチ塩基対を形成する場合、低い効率で増幅が進行することを見出した。したがって、Ｗａｌｌａｃｅの方法では、特異的プライマーは特異的対立遺伝子のみの増幅を導く。複数ラウンドの増幅後の増幅断片の形成は、試験サンプル中の対立遺伝子の存在を示す。
【００１０】
Ｗａｌｌａｃｅの方法は制限消化および放射能標識ハイブリダイゼーションに対する改良に相当するが、該アプローチは依然として労力および時間を要するものである。この方法は、ゲル電気泳動を必要とすることに加えて、複数の増幅反応とサンプルの遺伝子型を同定するための検出反応とを行う必要がある。したがって、一塩基多型を含む同定配列を検出するための、より迅速で、あまり労力を要しない方法が必要とされている。
【００１１】
発明の概要
したがって、ゲノムサンプル中の同定配列の存在を検出する改良方法を提供することが、本発明の１つの目的である。
【００１２】
ゲノムサンプル中の同定配列の存在を検出するためのキットを提供することが、本発明のもう１つの目的である。
【００１３】
本発明のこれら及び他の目的を達成するために、本発明の１つの態様では、ＤＮＡサンプル中の第１同定配列または第２同定配列または両方の存在を判定するための方法が提供される。この方法は、
（Ａ）下記のヌクレオチド配列：
（ｉ）第１同定配列には特異的にハイブリダイズできるが第２同定配列とは特異的にハイブリダイズできない第１ヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）第１ヌクレオチド配列の５’末端における第２ヌクレオチド配列、
を含む第１オリゴヌクレオチドを準備すること、
（Ｂ）下記のヌクレオチド配列：
（ｉ）第２同定配列には特異的にハイブリダイズできるが第１同定配列には特異的にハイブリダイズできない第３ヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）第１ヌクレオチド配列の５’末端における第４ヌクレオチド配列、
を含む第２オリゴヌクレオチドを準備すること、
（Ｃ）第３オリゴヌクレオチドを準備すること、
（Ｄ）下記のヌクレオチド配列：
（ｉ）第５ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）第５ヌクレオチド配列の５’末端における第６ヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）第６ヌクレオチド配列の５’末端における第７ヌクレオチド配列、および
（ｉｖ）第７ヌクレオチド配列の５’末端における第８ヌクレオチド配列、
を含む第４オリゴヌクレオチドを準備すること、ここで、第５ヌクレオチド配列は第２ヌクレオチド配列と同一であり、第４オリゴヌクレオチドは、第６および第８ヌクレオチド配列のヌクレオチドを含有する第１ヘアピンを形成することが可能であり、第４オリゴヌクレオチドは、第１ヘアピンが形成されなければ第１検出シグナルを放出すること、
（Ｅ）下記のヌクレオチド配列：
（ｉ）第９ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）第９ヌクレオチド配列の５’末端における第１０ヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）第１０ヌクレオチド配列の５’末端における第１１ヌクレオチド配列、および
（ｉｖ）第１１ヌクレオチド配列の５’末端における第１２ヌクレオチド配列、
を含む第５オリゴヌクレオチドを準備すること、ここで、第９ヌクレオチド配列は第４ヌクレオチド配列と同一であり、第５オリゴヌクレオチドは、第１０および第１２ヌクレオチド配列のヌクレオチドを含有する第２ヘアピンを形成することが可能であり、第４オリゴヌクレオチドは、第２ヘアピンが形成されなければ第２検出シグナルを放出すること、
（Ｆ）ＤＮＡサンプル中に第１同定配列が存在する場合には、
（ｉ）第１オリゴヌクレオチドを第１同定配列にアニールさせること、
（ｉｉ）鋳型として第１同定配列を使用して第１オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長第１鎖を形成させること、ここで、第１同定配列は伸長第１鎖にアニールすること、
（ｉｉｉ）伸長第１鎖から第１同定配列を分離すること、
（ｉｖ）第３オリゴヌクレオチドを伸長第１鎖にアニールさせること、
（ｖ）鋳型として伸長第１鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長第２鎖を形成させること、ここで、伸長第１鎖は伸長第２鎖にアニールすること、
（ｖｉ）伸長第２鎖から伸長第１鎖を分離すること、
（ｖｉｉ）第４オリゴヌクレオチドを伸長第２鎖にアニールさせること、
（ｖｉｉｉ）鋳型として伸長第２鎖を使用して第４オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、二重伸長第１鎖を形成させること、ここで、二重伸長第１鎖は伸長第２鎖にアニールすること、
（ｉｘ）伸長第２鎖から二重伸長第１鎖を分離すること、
（ｘ）第３オリゴヌクレオチドを二重伸長第１鎖にアニールさせること、
（ｘｉ）鋳型として二重伸長第１鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、二重伸長第２鎖を形成させること、
（ｘｉｉ）場合により、二重伸長第１および第２鎖を増幅すること、
（ｘｉｉｉ）第１検出シグナルを検出すること、および
（ｘｉｖ）ＤＮＡサンプル中に第１同定配列が存在すると判定すること、
（Ｇ）ＤＮＡサンプル中に第２同定配列が存在する場合には、
（ｉ）第２オリゴヌクレオチドを第２同定配列にアニールさせること、
（ｉｉ）鋳型として第２同定配列を使用して第２オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長第３鎖を形成させること、ここで、第２同定配列は伸長第３鎖にアニールすること、
（ｉｉｉ）伸長第３鎖から第２同定配列を分離すること、
（ｉｖ）第３オリゴヌクレオチドを伸長第３鎖にアニールさせること、
（ｖ）鋳型として伸長第３鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長第４鎖を形成させること、ここで、伸長第３鎖は伸長第４鎖にアニールすること、
（ｖｉ）伸長第４鎖から伸長第３鎖を分離すること、
（ｖｉｉ）第５オリゴヌクレオチドを伸長第４鎖にアニールさせること、
（ｖｉｉｉ）鋳型として伸長第４鎖を使用して第５オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、二重伸長第３鎖を形成させること、ここで、二重伸長第３鎖は伸長第４鎖にアニールすること、
（ｉｘ）伸長第４鎖から二重伸長第３鎖を分離すること、
（ｘ）第３オリゴヌクレオチドを二重伸長第３鎖にアニールさせること、
（ｘｉ）鋳型として二重伸長第３鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、二重伸長第４鎖を形成させること、
（ｘｉｉ）場合により、二重伸長第３および第４鎖を増幅すること、
（ｘｉｉｉ）第２検出シグナルを検出すること、
（ｘｉｖ）ＤＮＡサンプル中に第２同定配列が存在すると判定すること、を含んでなる。好ましい実施形態においては、該増幅反応はＰＣＲであり、第１および第２供与成分のそれぞれは発蛍光団であり、一方、第１および第２受容成分のそれぞれは、発蛍光団により放出される光のクエンチャー（消光物質）である。
【００１４】
もう１つの実施形態においては、ＤＮＡサンプル中の第１同定配列または第２同定配列または両方の存在を判定するための方法であって、
（Ａ）サンプルを第１および第２オリゴヌクレオチドと接触させること、ここで、第１オリゴヌクレオチドは、
（ｉ）第１ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）第１ヌクレオチド配列の５’末端における第２ヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）第２ヌクレオチド配列の５’末端における第３ヌクレオチド配列、および
（ｉｖ）第３ヌクレオチド配列の５’末端における第４ヌクレオチド配列を含み、その際、第１オリゴヌクレオチドは、第２および第４ヌクレオチド配列のヌクレオチドを含有する第１ヘアピンを形成することが可能であり、そして、第１オリゴヌクレオチドは、第１ヘアピンが形成されなければ第１検出シグナルを放出すること、
第２オリゴヌクレオチドは、
（ｉ）第５ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）第５ヌクレオチド配列の５’末端における第６ヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）第６ヌクレオチド配列の５’末端における第７ヌクレオチド配列、および
（ｉｖ）第７ヌクレオチド配列の５’末端における第８ヌクレオチド配列を含み、その際、第２オリゴヌクレオチドは、第６および第８ヌクレオチド配列のヌクレオチドを含有する第２ヘアピンを形成することが可能であり、そして、第２オリゴヌクレオチドは、第２ヘアピンが形成されなければ第２検出シグナルを放出すること、
（Ｂ）（ｉ）サンプル中に第１同定配列が存在する場合には、ポリメラーゼを使用して第１オリゴヌクレオチドを二本鎖核酸中に取り込ませ、それにより、第１ヘアピンの形成を妨げること、
（ｉｉ）サンプル中に第２同定配列が存在する場合には、ポリメラーゼを使用して第２オリゴヌクレオチドを二本鎖核酸中に取り込ませ、それにより、第２ヘアピンの形成を妨げること、または
（ｉｉｉ）サンプル中に第１および第２同定配列の両方が存在する場合には、ポリメラーゼを使用して第１および第２オリゴヌクレオチドのそれぞれを二本鎖核酸中に取り込ませ、それにより、第１および第２ヘアピンのそれぞれの形成を妨げること、
（Ｃ）場合により、増幅反応を行い、それにより、
（ｉ）サンプル中に第１同定配列が存在する場合には、第１オリゴヌクレオチドを第１増幅産物中に取り込ませること、
（ｉｉ）サンプル中に第２同定配列が存在する場合には、第２オリゴヌクレオチドを第２増幅産物中に取り込ませること、または
（ｉｉｉ）サンプル中に第１同定配列が存在する場合には、第１オリゴヌクレオチドを第１増幅産物中に取り込ませ、かつ、サンプル中に第２同定配列が存在する場合には、第２オリゴヌクレオチドを第２増幅産物中に取り込ませること、
（Ｄ）（ｉ）第１シグナルが検出された場合には、サンプル中に第１同定配列が存在すると判定すること、
（ｉｉ）第２シグナルが検出された場合には、サンプル中に第２同定配列が存在すると判定すること、または
（ｉｉｉ）第１および第２シグナルが検出された場合には、サンプル中に第１および第２同定配列が存在すると判定すること、
を含んでなる方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、単一の核酸サンプル中の１以上の核酸多型を直接的に同定する方法を提供する。この改良された技術は２つの主要件を満足する。まず第１に、それは、取り込まれていないオリゴヌクレオチドを予め分離することなく核酸多型を検出することを可能にする。第２に、それは、標識オリゴヌクレオチドを増幅核酸サンプル中に取り込ませることにより、サンプル中の１以上の核酸多型の直接的な検出を可能にする。本発明はまた、単一のサンプル中の１以上の核酸多型の同定のためのキットに関する。そのようなキットは、核酸多型の存在が疾患または障害の存在または不存在と相互に関連づけられる診断キットでありうる。
【００１６】
本発明の他の目的、特徴および利点は以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。詳細な説明および実施例は、好ましい実施形態を示すものであり、例示のために記載されているにすぎず、本発明の精神および範囲内の種々の変更および修飾がこの詳細な説明から当業者に明らかとなるであろう。さらに、実施例は本発明の原理を示すものであり、当業者に明らかに有用であると思われるすべての例への本発明の応用を具体的に例示することを予期したものではない。
【００１７】
図面の説明
図１は、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーの一般的模式図を示す。
【００１８】
第１オリゴヌクレオチド（Ｏ１）は、第１ヌクレオチド配列（１）、および該第１ヌクレオチド配列の５’末端における第２ヌクレオチド配列（２）（陰影付き）を含む。
【００１９】
第２オリゴヌクレオチド（Ｏ２）は、第３ヌクレオチド配列（３）、および該第３ヌクレオチド配列の５’末端における第４ヌクレオチド配列（４）（黒塗り）を含む。
【００２０】
第３オリゴヌクレオチド（Ｏ３）はリバースプライマーを含む。
【００２１】
第４オリゴヌクレオチド（Ｏ４）は、第５ヌクレオチド配列（５）（陰影付き）、該第５ヌクレオチド配列の５’末端における第６ヌクレオチド（６）配列、該第６ヌクレオチド配列の５’末端における第７ヌクレオチド（７）配列、および第７ヌクレオチド配列の５’末端における第８ヌクレオチド配列（８）を含む。第５ヌクレオチド配列は第２ヌクレオチド配列と同一である。Ｏ４は、ヌクレオチド配列６および８を含有する第１ヘアピンを形成しうる。該ヘアピンが形成されなければ、Ｏ４はシグナルを放出する。
【００２２】
第５オリゴヌクレオチド（Ｏ５）は、第９ヌクレオチド配列（９）（黒塗り）、該第９ヌクレオチド配列の５’末端における第１０ヌクレオチド配列（１０）、該第１０ヌクレオチド配列の５’末端における第１１ヌクレオチド配列（１１）、および第１１ヌクレオチド配列の５’末端における第１２ヌクレオチド配列（１２）を含む。第９ヌクレオチド配列は第４ヌクレオチド配列と同一である。Ｏ５は、ヌクレオチド配列１０および１２のヌクレオチドを含有するヘアピンを形成しうる。該ヘアピンが形成されなければ、Ｏ５はシグナルを放出する。
【００２３】
図２は、本発明の方法の好ましい実施形態の１つを示す模式図である。それは、該ヘアピン形成オリゴヌクレオチドから離れた配列特異的プライマーを使用する。ＤＮＡサンプルが標的配列を含有する場合には、配列特異的フォワードプライマー（Ｏ１）は、ポリメラーゼ連鎖反応の１回目のサイクル中にアニールし伸長して、伸長第１鎖を形成する。後続サイクルにおいて、ヘアピン形成オリゴヌクレオチド（Ｏ４）が、取り込まれた配列特異的プライマーの５’尾部にアニールし（サイクル３のとおり）、二重伸長第１鎖の形成におけるプライマーとして作用する。さらに後のサイクル中に、ポリメラーゼが該二重伸長第１鎖を複製するにつれて、それは、取り込まれたオリゴヌクレオチドをそのヘアピン形成から排除し、伸長した発光性コンホメーションに導く（サイクル４のとおり）。この場合もまた、反復サイクルにより、放出シグナルの強度が増大するだろう。
【００２４】
図３は、（Ａ）ヘアピンコンホメーションおよび（Ｂ）伸長コンホメーションをとったオリゴヌクレオチドの構造の模式的例示である。要素（ａ）は、標的配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を示し、（ｂ）および（ｄ）は、互いにハイブリダイズしてヘアピンを形成するヌクレオチド配列を示し、（ｃ）は、（ｂ）を（ｄ）と連結し該ヘアピンのループを形成する配列を示す。（ｂ）および（ｄ）上の白丸および黒丸は、分子エネルギー転移分子のペアを示す。
【００２５】
図４は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる本発明の方法のもう１つの実施形態を示す。ヘアピン形成オリゴヌクレオチド（ａ）は、各同定配列に特異的なプライマー配列を含有する。ＤＮＡサンプルが標的配列を含有する場合には、ポリメラーゼ連鎖反応の１回目のサイクル中に、該特異的プライマーがアニールし伸長する（伸長第１鎖を形成する）。２回目のサイクルにおいて、ポリメラーゼが該伸長第１鎖を複製するにつれて、それは、取り込まれたオリゴヌクレオチドをそのヘアピン形成から排除し、伸長した発光性コンホメーションに導く。反復（ｎ）サイクルにより、放出シグナルの強度が増大するだろう。
【００２６】
図５Ａは、Ａ型対立遺伝子およびＧ型対立遺伝子に関するＣＹＰ１７遺伝子の遺伝子型決定の結果を示す。両プライマーは、それらの３’末端ヌクレオチドにおいて相違する。第２列はＦＡＭに関する蛍光測定値を示し、第３列はＳＲに関する蛍光測定値を示す。第１列は、試験したＣＹＰ１７ ＤＮＡの遺伝子型を示す。
【００２７】
図５Ｂは、一重（シングルプレックス）ＰＣＲ反応に対する多重（マルチプレックス）ＰＣＲ反応の利点を例示する。この図は、Ａ型およびＧ型対立遺伝子に関するＣＹＰ１７遺伝子の遺伝子型決定の結果を示す。Ａ特異的プライマーはＦＡＭで、Ｇ特異的プライマーはＳＲで標識されている。第１列：Ａ型対立遺伝子を含有するＣＹＰ１７ ＤＮＡサンプルを、Ａ特異的プライマーを使用する一重ＰＣＲ反応によりスクリーニングした。第２列：Ｇ型対立遺伝子を含有するＣＹＰ１７ ＤＮＡサンプルを、Ａ特異的プライマーを使用する一重ＰＣＲ反応によりスクリーニングした。第３列：Ａ型対立遺伝子を含有するＣＹＰ１７ ＤＮＡサンプルを、Ｇ特異的プライマーを使用する一重ＰＣＲ反応によりスクリーニングした。第４列：Ｇ型対立遺伝子を含有するＣＹＰ１７ ＤＮＡサンプルを、Ｇ特異的プライマーを使用する一重ＰＣＲ反応によりスクリーニングした。第５列：Ａ型およびＧ型の両方の対立遺伝子を含有するＣＹＰ１７ ＤＮＡサンプルを、Ａ特異的およびＧ特異的の両方のプライマーを使用する多重ＰＣＲ反応によりスクリーニングした。第６列：Ａ型およびＧ型の両方の対立遺伝子を含有するＣＹＰ１７ ＤＮＡサンプルを、Ａ特異的およびＧ特異的の両方のプライマーを使用する多重ＰＣＲ反応によりスクリーニングした。第１列と第２列との比較：ＦＡＭシグナルは、Ａ特異的プライマーを使用してＡ型およびＧ型ＤＮＡサンプルの両方において検出される。この結果は、一重ＰＣＲ反応においてＡ特異的プライマーを使用した場合に達成される低い対立遺伝子識別を示している。第３列と第４列との比較：ＳＲシグナルは、Ｇ特異的プライマーを使用してＡ型およびＧ型ＤＮＡサンプルの両方において検出される。この結果は、一重ＰＣＲ反応においてＧ特異的プライマーのみを使用した場合の低い対立遺伝子識別を示している。第５列と第６列との比較は、多重ＰＣＲ反応においてＡ特異的およびＧ特異的プライマーを使用した場合の高い対立遺伝子識別を示している。なぜなら、反対の対立遺伝子のシグナルが生成されなかったからである。
【００２８】
図６Ａは、Ａ型対立遺伝子およびＧ型対立遺伝子に関するＨＥＲ２遺伝子の遺伝子型決定の結果を示す。両プライマーは、それらの３’末端ヌクレオチドにおいて相違する。無ＤＮＡ対照はＮＤＣとして示されている。第１列はＦＡＭに関する蛍光測定値を示し、第２列はＳＲに関する蛍光測定値を示す。第３列は、試験したＨＥＲ２ ＤＮＡの遺伝子型を示す。
【００２９】
図６Ｂは、図５Ａの蛍光結果のグラフ表示を示す。該結果は、Ａ特異的およびＧ特異的の両方のプライマーを使用する多重ＰＣＲ反応の対立遺伝子識別を示している。
【００３０】
図７Ａは、Ｃ型対立遺伝子およびＴ型対立遺伝子に関するＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の遺伝子型決定の結果を示す。Ｃ特異的プライマーの３’末端ヌクレオチドは、該多型を検出するためのミスマッチを含有していた。Ｔ特異的プライマーの末端から２番目のヌクレオチドは、該多型を検出するためのミスマッチヌクレオチドを含有していた。無ＤＮＡ対照はＮＤＣとして示されている。第１列はＦＡＭに関する蛍光測定値を示し、第２列はＳＲに関する蛍光測定値を示す。第３列は、試験したＣＹＰ２Ｃ８ ＤＮＡの遺伝子型を示す。
【００３１】
図７Ｂは、図６Ａの蛍光結果のグラフ表示を示す。該結果は、Ｃ特異的およびＴ特異的の両方のプライマーを使用する多重ＰＣＲ反応の良好な対立遺伝子識別を示している。
【００３２】
図８Ａは、Ｃ型対立遺伝子およびＧ型対立遺伝子に関するＨＴＲ２Ｃ遺伝子の遺伝子型決定の結果を示す。Ｃ特異的およびＧ特異的プライマーの末端から３番目のヌクレオチドは、該多型を検出するためのミスマッチヌクレオチドを含有していた。無ＤＮＡ対照はＮＤＣとして示されている。第１列はＦＡＭに関する蛍光測定値を示し、第２列はＳＲに関する蛍光測定値を示す。第３列は、試験したＨＴＲ２Ｃ ＤＮＡの遺伝子型を示す。
【００３３】
図８Ｂは、図７Ａの蛍光結果のグラフ表示を示す。該結果は、Ｃ特異的およびＧ特異的の両方のプライマーを使用する多重ＰＣＲ反応の対立遺伝子識別を示している。
【００３４】
図９Ａは、野生型遺伝子および欠失突然変異体に関するＣＣＲ５遺伝子の遺伝子型決定の結果を示す。無ＤＮＡ対照はＮＤＣとして示されている。第１列はＦＡＭに関する蛍光測定値を示し、第２列はＳＲに関する蛍光測定値を示す。第３列は、試験したＣＣＲ５ ＤＮＡの遺伝子型を示す。
【００３５】
図９Ｂは、図８Ａの蛍光結果のグラフ表示を示す。該結果は、野生型および欠失突然変異体の両方のプライマーを使用する多重ＰＣＲ反応の良好な対立遺伝子識別を示している。
【００３６】
発明の開示
ＰＣＲに基づく方法は、特異的ヌクレオチド配列（同定配列）を検出するために見出されたものであり、従来の技術の欠点を伴わない。本発明は、標的配列中の遺伝的多型（例えば、ＳＮＰ）、挿入および欠失の迅速な検出を可能にする。多型の解明は、１以上の同定配列の存在を、配列特異的オリゴヌクレオチドプライマーへのそれらのハイブリダイゼーションにより判別することにより達成される。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）で標識したオリゴヌクレオチドの本発明者らの創造的使用は、これらのハイブリダイゼーションの迅速な特徴づけを可能にする。
【００３７】
本明細書で記載する「同定配列」（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、対立遺伝子のような集団中に維持される遺伝子の変異、または突然変異のような個体の特定の核酸配列中の自発的変化を表し得る特定のヌクレオチド酸を意味する。野生型からの相違または変化は、単一ヌクレオチドまたは数個のヌクレオチドを含む可能性があり、典型的には、特定の表現型、疾患または疾患感受性を示す。
【００３８】
個体からのゲノムサンプルは、該個体が或る遺伝子に関してホモ接合性であるか又はヘテロ接合性であるかに応じて、特定の遺伝子の２個の対立遺伝子を含みうる。したがって、ゲノムサンプルは、第１同定配列、第２同定配列、第１および第２の両方の同定配列を含有するか、またはいずれをも含有しない可能性がある。１つの実施形態においては、本発明は、第１同定配列、第２同定配列または両方の存在を同時に検出することにより、ＤＮＡサンプル中の遺伝的多型を同定する。この目的には、該サンプルを、工程（Ａ）において、第１および第２オリゴヌクレオチドと接触させる。該第１および第２オリゴヌクレオチドは、それらの末端３’ヌクレオチドにおいてのみ、それぞれから異なっている。もう１つの好ましい実施形態においては、それらのオリゴヌクレオチドは、３’末端以外の１個以上のヌクレオチドにおいて異なっている。例えば、各プライマーの３’末端から離れた第２、第３、第４または第５ヌクレオチドは、個々に又は組み合わせて、異なっていてもよい。
【００３９】
もう１つの実施形態においては、本発明は、種々の同定配列の存在を同時に判定するために使用することができる。例えば、特定の遺伝子が５つの可能な対立遺伝子を有する場合には、対応する同定配列に特異的な５つのオリゴヌクレオチドを同時に使用することができる。このようにして、該サンプルの遺伝子型を直ちに決定することができる。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態においては、２つの配列特異的オリゴヌクレオチドプライマー（一方は第１同定配列に特異的であり、もう一方は第２同定配列に特異的である）を、もう１つのプライマー（例えば、リバースプライマー）と共に、ゲノムＤＮＡ鋳型を含有するＰＣＲ混合物中で使用する。主として、プライマーの３’末端近くのヌクレオチドが特異性を決定する。したがって、配列特異的プライマーは、それらの末端３’ヌクレオチドのみにおいて、それぞれとは異なりうる。また、該プライマーは、３’末端ヌクレオチド以外の１個以上のヌクレオチドにおいて異なりうる。例えば、各プライマーの３’末端から離れた第２、第３、第４または第５ヌクレオチドは、個々に又は組み合わせて、異なりうる。３’末端ヌクレオチド以外のヌクレオチドが異なる場合には、該プライマー配列は多型をまたぐ（ｂｒｉｄｇｅ）であろう。ミスマッチの位置には無関係に、適当なアニーリング温度およびＰＣＲ条件下では、各配列特異的プライマーは、その相補的配列を鋳型として使用する増幅を導くに過ぎない。ついで、得られたＰＣＲ産物（標的配列に相当する）は、該ＰＣＲ産物にそれぞれが特異的である２つのＦＲＥＴ標識プライマーを、該ＰＣＲ産物に相補的なもう１つのプライマーと共に使用するＰＣＲ増幅を行うことにより検出される。
【００４１】
本発明のこの態様においては、上記方法は、以下の工程を含む：
【００４２】
工程（Ａ）においては、第１オリゴヌクレオチドを準備する。これは、（ｉ）第１同定配列には特異的にハイブリダイズしうるが、１以上のヌクレオチドのミスマッチのために第２同定配列には特異的にハイブリダイズし得ない第１ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１ヌクレオチド配列の５’末端における第２ヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
工程（Ｂ）においては、第２オリゴヌクレオチドを準備する。これは、（ｉ）第２同定配列には特異的にハイブリダイズしうるが、１以上のヌクレオチドのミスマッチのために第１同定配列には特異的にハイブリダイズし得ない第３ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第３ヌクレオチド配列の５’末端における第４ヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
工程（Ｃ）においては、第３オリゴヌクレオチドを準備する。
【００４５】
工程（Ｄ）においては、第４オリゴヌクレオチドを準備する。これは、（ｉ）第５ヌクレオチド配列、（ｉｉ）第５ヌクレオチド配列の５’末端における第６ヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）第６ヌクレオチド配列の５’末端における第７ヌクレオチド配列、および（ｉｖ）第７ヌクレオチド配列の５’末端における第８ヌクレオチド配列を含む。第５ヌクレオチド配列は第２ヌクレオチド配列と同一であり、第４オリゴヌクレオチドは、第６および第８ヌクレオチド配列のヌクレオチドを含有する第１ヘアピンを形成することが可能であり、第４オリゴヌクレオチドは、第１ヘアピンが形成されなければ第１検出シグナルを放出する。
【００４６】
工程（Ｅ）においては、第５オリゴヌクレオチドを準備する。これは、（ｉ）第９ヌクレオチド配列、（ｉｉ）第９ヌクレオチド配列の５’末端における第１０ヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）第１０ヌクレオチド配列の５’末端における第１１ヌクレオチド配列、および（ｉｖ）第１１ヌクレオチド配列の５’末端における第１２ヌクレオチド配列を含む。第９ヌクレオチド配列は第４ヌクレオチド配列と同一であり、第５オリゴヌクレオチドは、第１０および第１２ヌクレオチド配列のヌクレオチドを含有する第２ヘアピンを形成することが可能であり、第４オリゴヌクレオチドは、第２ヘアピンが形成されなければ第２検出シグナルを放出する。
【００４７】
工程（Ｆ）においては、ＤＮＡサンプル中に第１同定配列が存在する場合には、（ｉ）第１オリゴヌクレオチドを第１同定配列にアニールさせ、（ｉｉ）鋳型として第１同定配列を使用して第１オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長第１鎖を形成させ（ここで、第１同定配列は伸長鎖にアニールする）、（ｉｉｉ）伸長鎖から第１同定配列を分離し、（ｉｖ）第３オリゴヌクレオチドを伸長第１鎖にアニールさせ、（ｖ）鋳型として伸長第１鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長第２鎖を形成させ（ここで、伸長第１鎖は伸長第２鎖にアニールする）、（ｖｉ）伸長第２鎖から伸長第１鎖を分離し、（ｖｉｉ）第４オリゴヌクレオチドを伸長第２鎖にアニールさせ、（ｖｉｉｉ）鋳型として伸長第２鎖を使用して第４オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、二重伸長第１鎖を形成させ（ここで、二重伸長第１鎖は伸長第２鎖にアニールする）、（ｉｘ）伸長第２鎖から二重伸長第１鎖を分離し、（ｘ）第３オリゴヌクレオチドを二重伸長第１鎖にアニールさせ、（ｘｉ）鋳型として二重伸長第１鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、二重伸長第２鎖を形成させ、（ｘｉｉ）場合により、二重伸長第１および第２鎖を増幅し、（ｘｉｉｉ）第１検出シグナルを検出し、（ｘｉｖ）ＤＮＡサンプル中に第１同定配列が存在すると判定する。図２は、工程（Ｆ）の本質的部分を模式的に示したものである。
【００４８】
工程（Ｇ）においては、ＤＮＡサンプル中に第２同定配列が存在する場合には、（ｉ）第２オリゴヌクレオチドを第２同定配列にアニールさせ、（ｉｉ）鋳型として第２同定配列を使用して第２オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長第３鎖を形成させ（ここで、第２同定配列は伸長第３鎖にアニールする）、（ｉｉｉ）伸長第３鎖から第２同定配列を分離し、（ｉｖ）第３オリゴヌクレオチドを伸長第３鎖にアニールさせ、（ｖ）鋳型として伸長第３鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長第４鎖を形成させ（ここで、伸長第３鎖は伸長第４鎖にアニールする）、（ｖｉ）伸長第４鎖から伸長第３鎖を分離し、（ｖｉｉ）第５オリゴヌクレオチドを伸長第４鎖にアニールさせ、（ｖｉｉｉ）鋳型として伸長第４鎖を使用して第５オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、二重伸長第３鎖を形成させ（ここで、二重伸長第３鎖は伸長第４鎖にアニールする）、（ｉｘ）伸長第４鎖から二重伸長第３鎖を分離し、（ｘ）第３オリゴヌクレオチドを二重伸長第３鎖にアニールさせ、（ｘｉ）鋳型として二重伸長第３鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、二重伸長第４鎖を形成させる。ついで、（ｘｉｉ）場合により、二重伸長第３および第４鎖を増幅し、（ｘｉｉｉ）第２検出シグナルを検出し、そして（ｘｉｖ）ＤＮＡサンプル中に第２同定配列が存在すると判定する。
【００４９】
好ましくは、第４オリゴヌクレオチドは、第１ヘアピンが形成されない場合に限り第１検出シグナルを放出し、第５オリゴヌクレオチドは、第２ヘアピンが形成されない場合に限り第２検出シグナルを放出する。第１ヘアピンが形成されない場合に第４オリゴヌクレオチドにより放出される第１検出シグナルは、好ましくは、第１ヘアピンが形成された場合に第４オリゴヌクレオチドにより放出されるシグナルより強力であり、また、第２ヘアピンが形成されない場合に第５オリゴヌクレオチドにより放出される第２検出シグナルは、第２ヘアピンが形成された場合に第５オリゴヌクレオチドにより放出されるシグナルより強力である。第４オリゴヌクレオチドは、理想的には、第１ヘアピンが形成されない場合に限り第１検出シグナルを放出し、第５オリゴヌクレオチドは、第２ヘアピンが形成されない場合に限り第２検出シグナルを放出する。
【００５０】
好ましい実施形態においては、第４オリゴヌクレオチドは、第１エネルギーを放出しうる第１エネルギー供与成分と放出第１エネルギー量を吸収しうる第１エネルギー受容成分とを含む第１分子エネルギー転移ペアを含有する。第１供与成分は第６ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第１受容成分は第８ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しているか、または、第１受容成分は第６ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第１供与成分は第８ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、そして、第１受容成分は、第１ヘアピンが形成された場合に限り放出第１エネルギー量を吸収する。また、第５オリゴヌクレオチドは更に、第２エネルギーを放出しうる第２エネルギー供与成分と放出第２エネルギー量を吸収しうる第２エネルギー受容成分とを含む第２分子エネルギー転移ペアを含有する。第２供与成分は第１０ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第２受容成分は第１２ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しているか、または、第２受容成分は第１０ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第２供与成分は第１２ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、そして、第２受容成分は、第２ヘアピンが形成された場合に限り放出第２エネルギー量を吸収する。
【００５１】
第１および第２供与成分のそれぞれは発蛍光団でありうる。第１および第２受容成分のそれぞれは、発蛍光団から放出される光のクエンチャー（消光物質）である。好ましい第１および第２受容成分はＤＡＢＳＹＬであり、一方、好ましい第１供与成分はフルオレセインであり、好ましい第２受容成分はスルファローダミン（ｓｕｌｆａｒｈｏｄａｍｉｎｅ）であり、あるいはその逆であってもよい。
【００５２】
理想的には、増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応、例えば三重増幅（ｔｒｉａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、核酸配列に基づく増幅、鎖置換増幅、カスケードローリングサークル増幅、または増幅不応性突然変異系である。増幅反応をｉｎ ｓｉｔｕで行うことが可能である。
【００５３】
工程（Ｆ）（ｘｉｉ）は、理想的には、（ａ）二重伸長第２鎖から二重伸長第１鎖を分離し、（ｂ）第３オリゴヌクレオチドを二重伸長第１鎖にアニールさせ、第４オリゴヌクレオチドを二重伸長第２鎖にアニールさせ、（ｃ）鋳型として二重伸長第１鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、もう１つの二重伸長第２鎖を形成させ（ここで、二重伸長第１鎖はもう一方の二重伸長第２鎖にアニールする）、鋳型として二重伸長第２鎖を使用して第４オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、もう１つの二重伸長第１鎖を形成させ（ここで、二重伸長第２鎖はもう一方の二重伸長第１鎖にアニールする）、（ｄ）上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を有限回数反復させる（この場合、（ａ）においては、二重伸長第１および第２鎖は、それぞれ、（ｃ）の二重伸長第１鎖およびもう一方の二重伸長第２鎖であるか、または、それぞれ、（ｃ）のもう一方の二重伸長第１鎖および二重伸長第２鎖である）ことを含む。
【００５４】
工程（Ｇ）（ｘｉｉ）は、理想的には、二重伸長第４鎖から二重伸長第３鎖を分離し、（ｂ）第３オリゴヌクレオチドを二重伸長第３鎖にアニールさせ、第５オリゴヌクレオチドを二重伸長第４鎖にアニールさせ、（ｃ）鋳型として二重伸長第３鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、もう１つの二重伸長第４鎖を形成させ（ここで、二重伸長第３鎖はもう一方の二重伸長第４鎖にアニールする）、鋳型として二重伸長第４鎖を使用して第５オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、もう１つの二重伸長第３鎖を形成させ（ここで、二重伸長第４鎖はもう一方の二重伸長第３鎖にアニールする）、（ｄ）上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を有限回数反復させる（この場合、（ａ）においては、二重伸長第３および第４鎖は、それぞれ、（ｃ）の二重伸長第３鎖およびもう一方の二重伸長第４鎖であるか、または、それぞれ、（ｃ）のもう一方の二重伸長第３鎖および二重伸長第４鎖である）ことを含む。
【００５５】
分子エネルギー転移（ＭＥＴ）現象は、供与分子と受容分子との間でエネルギーが通過する過程である。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）は、少なくとも１つの発蛍光団が関与しており、ＭＥＴの一形態である。発蛍光団は、ある波長において光を吸収し、別の異なる波長において光を放出する化合物である。蛍光分光光度計を使用して、同時に、発蛍光団を励起する光を放出させ、発蛍光団から放出された光を検出する。ＦＲＥＴにおいては、発蛍光団は、光子を吸収した後このエネルギーを受容分子に転移する供与分子である。ＭＥＴまたはＦＲＥＴに関与する供与分子および受容分子は、それぞれ「ＭＥＴペア」および「ＦＲＥＴペア」と称される。Ｆｏｒｓｔｅｒ，Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ Ａ４：３２１−２７（１９９４）；Ｃｌｅｇｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１：３５３−８８（１９９２）。
【００５６】
２つの発蛍光団が接近しており、第１発蛍光団の発光スペクトルが第２発蛍光団の励起スペクトルとオーバーラップする場合には、第１発蛍光団の励起が、第２発蛍光団により吸収される光を第１発蛍光団に放出させ、続いて第２発蛍光団に光を放出させる。その結果、第１発蛍光団の蛍光は消光され、一方、第２発蛍光団の蛍光が増強される。しかし、第１発蛍光団のエネルギーが、発蛍光団ではない化合物に転移されると、非発蛍光団による後続の発光を伴うことなく、第１発蛍光団の蛍光は消光される。
【００５７】
ＦＲＥＴ現象は、核酸を検出するために利用されている。これらの方法の１つは、米国特許第５，８６６，３６６号（その全体の内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。該’３６６特許は、標的核酸配列を検出するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法においてプローブとして使用されるＦＲＥＴ標識ヘアピンオリゴヌクレオチドに関するものである。このオリゴヌクレオチドは、ＦＲＥＴペアを構成するエネルギー供与体およびエネルギー受容体を含有する。該供与体および受容体は、それぞれ、該オリゴヌクレオチドの第１および第２ヌクレオチド配列上に位置する。これらの２つのヌクレオチド配列は互いに相補的であり、したがって該オリゴヌクレオチド中でヘアピンを形成しうる。
【００５８】
第１および第２ヌクレオチド配列が互いにアニールすると、供与体および受容体は接近する。この空間的配置においては、受容体は供与体からの発光を吸収し、それにより供与体からのシグナルを消光する。しかし、それらのヌクレオチド配列が互いにアニールしなければ、供与体および受容体は離れており、受容体は、もはや供与体からの発光を吸収することができず、供与体からのシグナルは消光されない。
【００５９】
したがって、該オリゴヌクレオチドがＰＣＲ中に増幅産物内に取り込まれると、ヘアピンがほどけて、受容体からの供与体の分離およびそれに続く観察されうるシグナルの放出が生じる。しかし、該オリゴヌクレオチドがＰＣＲ産物内に取り込まれない場合には、ヘアピンはそのまま維持され、供与体からの発光は受容体により消光される。したがって、ＰＣＲ後のシグナルの検出は標的の存在を示すこととなる。
【００６０】
好ましい実施形態においては、（Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第１オリゴヌクレオチドの濃度は、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満または５ｎＭ未満、あるいは５〜５０ｎＭ、あるいは２０〜３０ｎＭ、あるいは約２５ｎＭである。（Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第４オリゴヌクレオチドの濃度は、好ましくは、５００ｎＭ未満、２５０ｎＭ未満または５０ｎＭ未満、あるいは５０〜５００ｎＭ、あるいは２００〜３００ｎＭ、あるいは約２５０ｎＭである。好ましくは、（Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第４オリゴヌクレオチドの濃度は、（Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第１オリゴヌクレオチドの濃度の少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５〜３０倍、１０〜２０倍、または約１０倍である。好ましくは、（Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第２オリゴヌクレオチドの濃度は、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満または５ｎＭ未満、あるいは５〜５０ｎＭ、あるいは２０〜３０ｎＭ、あるいは約２５ｎＭである。好ましくは、（Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第５オリゴヌクレオチドの濃度は、５００ｎＭ未満、２５０ｎＭ未満または５０ｎＭ未満、あるいは５０〜５００ｎＭ、あるいは２００〜３００ｎＭ、あるいは約２５０ｎＭである。好ましくは、（Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第５オリゴヌクレオチドの濃度は、（Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第２オリゴヌクレオチドの濃度の少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５〜３０倍、１０〜２０倍、または約１０倍である。
【００６１】
もう１つの実施形態においては、本発明は、核酸多型を直接同定するための方法を提供する。この場合、検出は反応チューブを開放することなく行うことができる。この実施形態（「閉チューブ」形式）は、多数の用途でのＰＣＲの使用を妨げている増幅産物によるキャリーオーバー（持ち込み）汚染の可能性を著しく減少させる。閉チューブ法はまた、サンプルのハイスループットをもたらし、完全自動化が可能である。
【００６２】
サンプル中の核酸は精製されていても、未精製のものであってもよい。特定の実施形態においては、本発明のオリゴヌクレオチドは、新鮮な又は保存された組織または細胞のサンプル上で行うｉｎ ｓｉｔｕ増幅反応において使用される。ｉｎ ｓｉｔｕ反応においては、増幅工程後に直接、標的の高精度かつ高感度な検出を可能にする方法を用いることが有利である。これとは対照的に、通常のｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ法では、パラフィン包埋組織において、ハイブリダイゼーション工程による検出を行う必要がある。なぜなら、例えばＣＮＳ、リンパ節および脾臓からの組織サンプル中に不変的に存在するＤＮＡ修復機構が、ＰＣＲ工程中のレポーターヌクレオチドの直接的取り込みによる検出を妨げるからである。典型的には、ビオチンまたはジゴキシゲニン成分で標識された通常の直鎖状プライマーをｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲにおいて使用する場合には、アニーリングおよび伸長工程を含む増幅反応中に、検出可能な標識がほとんど又は全く取り込まれない。さらに、そのような成分で標識されたヌクレオチドの取り込みを増強するように増幅反応条件を改変すると、許容し得ないほどに高いバックグラウンドおよび偽陽性の結果が得られる。これは、サンプル中のニックＤＮＡ中に標識ヌクレオチドを組み込む内因性ＤＮＡ修復酵素の活性のせいであると考えられる。他の研究者らは、別のタイプの単一標識ＰＣＲプライマーを使用することを試みているが（Ｎｕｏｖｏ，１９９７，ＰＣＲ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、十分な感度を達成することはできておらず、偽陰性の結果を招くことが多い。ハイブリダイゼーション工程およびそれに続く洗浄工程を必要とすることは、通常のｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲプロトコールに更なる時間と経費を追加する。したがって、増幅工程後に直接的に標的の高精度かつ高感度の検出を可能にする方法を用いることが有利である。そのような方法が本発明により提供される。
【００６３】
特定の実施形態においては、本発明の増幅反応を行った後に検出され測定される、供与成分により（例えば、クエンチャーが受容成分である場合）または受容成分により（例えば、発蛍光団または発色団が受容成分である場合）放出されるエネルギーは、サンプル中に元々存在する所定の標的配列の量と相関し、それにより、元のサンプル中に存在する所定の標的配列の量の測定を可能にする。したがって、本発明の方法は、所定の標的配列を含有する核酸多型の存在、染色体の数、またはＤＮＡもしくはＲＮＡの量を測定するために定量的に使用することができる。
【００６４】
本発明のもう１つの実施形態においては、第１オリゴヌクレオチドは、（ｉ）第１ヌクレオチド配列、（ｉｉ）第１ヌクレオチド配列の５’末端における第２ヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）第２ヌクレオチド配列の５’末端における第３ヌクレオチド配列、および（ｉｖ）第３ヌクレオチド配列の５’末端における第４ヌクレオチド配列を含有する。ハイブリダイゼーション条件下、第１オリゴヌクレオチドは、第２および第４ヌクレオチド配列のヌクレオチドを含有する第１ヘアピンを形成するであろう（図３Ａ）。逆に、第１オリゴヌクレオチドは、第１ヘアピンが形成されない場合には第１検出シグナルを放出する（図３Ｂ）。
【００６５】
第２オリゴヌクレオチドは、（ｉ）第５ヌクレオチド配列、（ｉｉ）第５ヌクレオチド配列の５’末端における第６ヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）第６ヌクレオチド配列の５’末端における第７ヌクレオチド配列、および（ｉｖ）第７ヌクレオチド配列の５’末端における第８ヌクレオチド配列を含有する。この場合も、第２オリゴヌクレオチドは、第６および第８ヌクレオチド配列のヌクレオチドを含有する第２ヘアピンを形成することが可能であり、そして第２オリゴヌクレオチドは、第２ヘアピンが形成されない場合には第２検出シグナルを放出する。
【００６６】
工程（Ｂ）においては、サンプル中に第１同定配列が存在する場合には、第１オリゴヌクレオチドはポリメラーゼにより二本鎖核酸中に取り込まれ、それにより第１ヘアピンの形成を妨げる（図４、２サイクルを通して）。あるいは、ポリメラーゼは、サンプル中に第２同定配列が存在する場合、二本鎖核酸中への第２オリゴヌクレオチドの組み込みを引き起こし、それにより第２ヘアピンの形成を妨げる。サンプル中に第１および第２同定配列の両方が存在する場合には、第１および第２オリゴヌクレオチドのそれぞれが二本鎖核酸中に取り込まれて、それぞれ第１および第２ヘアピンの形成を妨げる。
【００６７】
任意の工程である工程（Ｃ）においては、増幅反応を行う（図４、ｎサイクルを通して）。その結果は、（ｉ）サンプル中に第１同定配列が存在する場合の、第１増幅産物中への第１オリゴヌクレオチドの取り込み、（ｉｉ）サンプル中に第２同定配列が存在する場合の、第２増幅産物中への第２オリゴヌクレオチドの取り込み、または（ｉｉｉ）サンプル中に両方の同定配列が存在する場合の、第１増幅産物中への第１オリゴヌクレオチドの及び第２増幅産物中への第２オリゴヌクレオチドの取り込みである。工程（Ｄ）においては、サンプル中に第１同定配列が存在するか否か（すなわち、第１シグナルが検出されるか否か）、第２同定配列が存在するか否か（すなわち、第２シグナルが検出されるか否か）、またはサンプル中に両方の同定配列が存在するか否か（両方のシグナルが検出されるか否か）に関する判定を行う。
【００６８】
好ましくは、第１オリゴヌクレオチドは、第１ヘアピンが形成されない場合に限り第１検出シグナルを放出し、第２オリゴヌクレオチドは、第２ヘアピンが形成されない場合に限り第２検出シグナルを放出する。第１ヘアピンが形成されない場合に第１オリゴヌクレオチドにより放出される第１検出シグナルは、好ましくは、第１ヘアピンが形成された場合に第１オリゴヌクレオチドにより放出されるシグナルより強力であり、また、第２ヘアピンが形成されない場合に第２オリゴヌクレオチドにより放出される第２検出シグナルは、第２ヘアピンが形成された場合に第２オリゴヌクレオチドにより放出されるシグナルより強力である。
【００６９】
もう１つの実施形態においては、第１オリゴヌクレオチドは更に、第１エネルギーを放出しうる第１エネルギー供与成分と放出第１エネルギー量を吸収しうる第１エネルギー受容成分とを含む第１分子エネルギー転移ペアを含有する。第１供与成分は第２ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第１受容成分は第４ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しているか、または第１受容成分は第２ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第１供与成分は第４ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、そして、第１受容成分は、第１ヘアピンが形成された場合に限り放出第１エネルギー量を吸収する。また、第２オリゴヌクレオチドは更に、第２エネルギーを放出しうる第２エネルギー供与成分と放出第２エネルギー量を吸収しうる第２エネルギー受容成分とを含む第２分子エネルギー転移ペアを含有する。第２供与成分は第６ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第２受容成分は第８ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しているか、または第２受容成分は第６ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第２供与成分は第８ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、そして、第２受容成分は、第２ヘアピンが形成された場合に限り放出第２エネルギー量を吸収する。
【００７０】
第１および第２供与成分のそれぞれは発蛍光団であること、ならびに第１および第２受容成分のそれぞれは、発蛍光団から放出される光のクエンチャー（消光物質）であることが好ましい。第１および第２受容成分の具体例としてはＤＡＢＳＹＬが挙げられ、一方、第１供与成分はフルオレセインであり、第２受容成分はスルファローダミンでありうる。あるいは、第１供与成分はスルファローダミンであり、第２受容成分はフルオレセインである。
【００７１】
増幅反応は、理想的には、ポリメラーゼ連鎖反応、例えば三重増幅（ｔｒｉａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、核酸配列に基づく増幅、鎖置換増幅、カスケードローリングサークル増幅、または増幅不応性突然変異系である。増幅反応はｉｎ ｓｉｔｕで行うことが可能である。
【００７２】
本発明においては、「相補的」である核酸は、相補性から生じる所望の特性（例えば、ハイブリダイズする能力）が失われない限り、完全に又は不完全に相補的でありうる。
【００７３】
本発明の更なる態様は、第１同定配列または第２同定配列または両方の存在を判定するためのキットに関する。特定の実施形態においては、該キットは、１以上の容器中に第１〜第５オリゴヌクレオチドを含む。該キットは更に、本発明の増幅反応を行うための追加の成分を含みうる。増幅すべき標的核酸配列が、疾患または障害に関与しているものである場合には、該キットは、診断または予後判定のために使用することができる。特定の実施形態においては、核酸多型の検出および増幅を行うための本発明のフォワードおよびリバースプライマーと、所望により、エキソヌクレアーゼ活性をもつ及びもたないそれぞれ１種または２種のＤＮＡポリメラーゼとを、１以上の容器中に含むキットを提供する。三重増幅のためのキットは更に、ブロッキングオリゴヌクレオチドと、場合により、ＤＮＡリガーゼとを、１以上の容器中に含みうる。
【００７４】
容器中のオリゴヌクレオチドは、任意の形態、例えば、凍結乾燥形態または溶解状態（例えば、蒸留水または緩衝溶液）などでありうる。同一の増幅反応においてすぐに使用する複数のオリゴヌクレオチドは単一の容器中に組み合わせても、別々の容器中に入れてもよい。また、２以上の増幅（フォワードおよびリバース）プライマー対を含有する多重キットも提供され、その場合、各増幅産物から検出されるシグナルは異なる波長のものである（例えば、各プライマー対の供与成分が異なる波長において蛍光を発する）。そのような多重キットは少なくとも２つのそのようなプライマー対を含有する。
【００７５】
特定の実施形態においては、キットは、増幅を開始させることができるプライマー（好ましくは、１０〜１００または１０〜８０ヌクレオチドの範囲、より好ましくは、２０〜４０ヌクレオチドの範囲のもの）の対を、１以上の容器中に含む。そのようなプライマーは、ＰＣＲ（例えば、Ｉｎｎｉｓら，１９９０，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．を参照されたい）、競合的ＰＣＲ、競合的逆転写ＰＣＲ（Ｃｌｅｍｅｎｔｉら，１９９４，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．１１（１）：１−６；Ｓｉｅｂｅｒｔら，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ ３５９：５５７−５５８）、三重増幅、ＮＡＳＢＡおよび鎖置換を含むがこれらに限らない種々の増幅反応において増幅を開始させることが可能である。
【００７６】
ＰＣＲまたは鎖置換による増幅に使用するためのフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマー対は、２つの相補的核酸鎖の異なる鎖にそれぞれ相補的であるプライマーよりなり、一方のプライマーの、他方のプライマーの方向への伸長産物が核酸ポリメラーゼにより産生された場合には、その伸長産物は他方のプライマーの伸長産物の合成のための鋳型として働く。三重増幅に使用するための、フォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマー対は、２つの相補的核酸鎖の異なる鎖にそれぞれ相補的であるプライマーよりなり、一方のプライマーの、他方のプライマーの方向への伸長連結産物が核酸ポリメラーゼおよび核酸リガーゼにより産生された場合には、その伸長連結産物は他方のプライマーの伸長連結産物の合成のための鋳型として働きうる。これらの場合の増幅産物は、プライマー配列間（プライマーを含む）のサンプル中の核酸の内容物である。
【００７７】
もう１つの実施形態においては、第１同定配列または第２同定配列または両方の存在を判定するためのキットは、１以上の容器中に、（ａ）オリゴヌクレオチドプライマー（その一方または両方は、ＭＥＴを引き起こしうる消光成分および蛍光成分で標識されたヘアピンプライマーである）を含み、場合により、（ｂ）対照ＤＮＡ標的配列、（ｃ）増幅用の最適化バッファー、（ｄ）意図される増幅法のための適切な酵素、例えば、ＰＣＲ、三重増幅またはＳＤＡにはＤＮＡポリメラーゼ、あるいはＮＡＳＢＡには逆転写酵素、および（ｅ）増幅反応を実施するための１組の説明書を含みうる。そのような説明書には、例えば、該反応を行うための最適な条件、例えば温度、増幅のサイクル数、ｐＨ、塩などが記載されている。所望により、該キットは、（ｆ）蛍光発光を刺激し検出するための手段、例えば、該分析を行うための蛍光プレートリーダーまたは複合サーモサイクラー−プレートリーダーを備えていてもよい。
【００７８】
さらにもう１つの実施形態においては、三重増幅のためのキットを提供する。該キットは、フォワードおよびリバース伸長プライマーならびにブロッキングオリゴヌクレオチドを含む。フォワードまたはリバースプライマーのいずれかをＭＥＴ成分のペアの一方の成分で標識し、ブロッキングオリゴヌクレオチドを該ペアの他方のＭＥＴ成分で標識する。そのようなキットの１つの実施形態は、１以上の容器中に、（ａ）第１オリゴヌクレオチド、（ｂ）第２オリゴヌクレオチド（第１および第２オリゴヌクレオチドは三重増幅反応に使用するための直鎖状プライマーである）、（ｃ）第１オリゴヌクレオチドの配列に相補的であってハイブリダイズ可能な配列を含むブロッキングオリゴヌクレオチドである第３オリゴヌクレオチド（第１および第３オリゴヌクレオチドは、それぞれ、供与成分と受容成分とよりなる分子エネルギー転移ペアのメンバーである第１および第２成分で標識されており、その結果、第１および第３オリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズし、供与成分が励起されてエネルギーを放出すると、受容成分は供与成分により放出されたエネルギーを吸収する）を含み、そして（ｄ）別の容器中に核酸リガーゼを含む。
【００７９】
キットのもう１つの実施形態は、容器中に普遍的ヘアピンを含み、また、所望により、臭化シアンまたは核酸リガーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼ）を含有する第２容器を含む。
【００８０】
図２に示すような反応を行うためのキットは、１以上の容器中に、（ａ）第１および第２オリゴヌクレオチド、（ｂ）第３オリゴヌクレオチド（ここで、第１および第２オリゴヌクレオチドはフォワードプライマーであり、第３オリゴヌクレオチドは、核酸多型を同定するための増幅反応におけるＤＮＡ合成用のリバースプライマーであり、第１および第２オリゴヌクレオチドは、（ｉ）該核酸配列中の所定の標的配列に相補的でない５’配列、および（ｉｉ）所定の標的配列に相補的である３’配列を含み、１以上のミスマッチヌクレオチドを含みうる）、および（ｃ）第４オリゴヌクレオチド［これは、５’から３’の順序で、（ｉ）６〜３０ヌクレオチドの第１ヌクレオチド配列（ここで、第１ヌクレオチド配列中のヌクレオチドは、分子エネルギー転移ペアの供与成分および受容成分よりなる群から選ばれる第１成分で標識されており、供与成分は励起されると１以上の特定の波長のエネルギーを放出し、受容成分は供与成分により放出された１以上の特定の波長におけるエネルギーを吸収する）、（ｉｉ）３〜２０ヌクレオチドの一本鎖の第２ヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）６〜３０ヌクレオチドの第３ヌクレオチド配列（ここで、第３ヌクレオチド配列中のヌクレオチドは、供与成分および受容成分よりなる群から選ばれる第２成分で標識されており、第２成分は、第１ヌクレオチド配列を標識していない上記群のメンバーであり、第３ヌクレオチド配列は、第１ヌクレオチド配列と第３ヌクレオチド配列との間で二本鎖を形成するのに十分な程度に逆の順序で第１ヌクレオチド配列に相補的であり、そのため、第１成分と第２成分とは十分に接近していて、供与成分が励起されてエネルギーを放出すると、受容成分は供与成分により放出されたエネルギーを吸収する）、（ｉｖ）第３オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端における、１０〜２５ヌクレオチドの第４ヌクレオチド配列（これは、第１オリゴヌクレオチドプライマーの５’配列と同一である配列をその３’末端に含む）を含む］を含む。そのようなキットを三重増幅に使用する場合には、ブロッキングオリゴヌクレオチドも提供されうる。
【００８１】
本発明のもう１つのキットは、１以上の容器中に、（ａ）第１オリゴヌクレオチド、（ｂ）第２オリゴヌクレオチド（第１および第２オリゴヌクレオチドは互いにハイブリダイズ可能であり、第１オリゴヌクレオチドは供与成分で標識されており、第２オリゴヌクレオチドは受容成分で標識されており、供与および受容成分は分子エネルギー転移ペアであり、ここで、供与成分は励起されると１以上の特定の波長のエネルギーを放出し、受容成分は供与成分により放出された１以上の特定の波長におけるエネルギーを吸収する）を含み、そして（ｃ）別の容器中に核酸リガーゼを含む。
【００８２】
本発明のアプローチは、とりわけ、遺伝病の診断、キャリア（保因者）のスクリーニング、ＨＬＡタイピング、ヒト遺伝子マッピング、法科学および親子鑑定のための有効な手段を与える。本発明は、以下の実施例を参考にして更に詳しく説明されるが、これらの実施例は例示として記載されているに過ぎない。以下の実施例中のいかなる点も、本発明の全体的な精神および範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００８３】
実施例
実施例１：普遍的ＦＲＥＴプライマーによる一般的な増幅反応
１．プライマーの設計
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーの概要を図１に示す。
【００８４】
以下の実施例の目的においては、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、以下に記載するプライマーとして表示される。
【００８５】
Ｏ１は、本発明においては、「フォワードプライマー」と称される。これは、１以上の多型の検出のための１以上のミスマッチヌクレオチドを含有する配列特異的プライマーであり、ＦＡＭ普遍的プライマーに結合しうる。
【００８６】
Ｏ２は、本発明においては、「フォワードプライマー」と称される。これは、１以上の多型の検出のための１以上のミスマッチヌクレオチドを含有する第２配列特異的プライマーである。このプライマーは、ＳＲ普遍的プライマーに結合しうる。
【００８７】
Ｏ３は、本発明においては、「リバースプライマー」と称される。
【００８８】
Ｏ４は、本発明においては、「ＦＡＭ普遍的プライマー」と称される。
【００８９】
Ｏ５は、本発明においては、「ＳＲ普遍的プライマー」と称される。
【００９０】
フォワードおよびリバースプライマーの具体例は、表１および表２に記載されている。表１は、フォワードおよびリバースの両プライマーの代表的具体例を例示する。表１中の配列特異的フォワードプライマー対は、それらの末端３’ヌクレオチドにおいて異なる。表２は、フォワードおよびリバースの両プライマーの代表的具体例、ならびに多型を含有する遺伝子標的配列を例示する。
【００９１】
以下の実施例において使用する普遍的ＦＲＥＴプライマーは、以下の配列を含む：
緑（ＦＡＭ）プライマー：
赤（スルホローダミン（ＳＲ））プライマー：
【００９２】
ヘアピンを形成しうる配列は両方の普遍的プライマーにおいて下線で示されており、斜体文字のＴは、ＤＡＢＳＹＬクエンチャーが塩基に結合している部位を示す。
【００９３】
【表１】
【表２】
１．増幅：
増幅反応は、Ｖｉｃｔｏｒ ＩＩ蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ）上で直接的に読み取ることが可能な、標準９６ウェルポリプロピレンＰＣＲプレート反応においてアセンブルした。あるいは反応をチューブ中で行い、ついで、蛍光測定用のプレートに移すことができる。ＰＣＲ増幅反応混合物を以下に示す。
【００９６】
２．反応混合物：最終容積は２０μｌとした。
【００９７】
３．ＰＣＲ反応：
ＵｌｔｒａＰｌａｔｅをサイクルシーラー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で密封し、サーモサイクラーブロック（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９７００）上に配置し、予め９４℃に加熱した。９４℃で５分間加熱した後、３５サイクルの増幅反応（９４℃で１０秒、５５℃で２０秒、７２℃で４０秒）を行った。
【００９８】
４．蛍光測定
反応後、相互干渉（クロストーク）を防止するために該プレートを黒色支持体中に配置し、蛍光強度を緑色および赤色フィルターで測定した。いくつかの装置（２つの蛍光プレートリーダーおよび２つのデジタルカメラ）がサンプルの蛍光測定に適していることが判明した。
【００９９】
測定は、Ｖｉｃｔｏｒ ＩＩ 蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ）を使用して行った。ＳＲチャンネル用の追加の発光および励起フィルターが製造業者によりインストールされた。
【０１００】
実施例２：ＣＹＰ１７遺伝子中のＳＮＰを検出するための多重対立遺伝子特異的ＰＣＲ
１．増幅反応：
ヒトゲノムＤＮＡのサンプルを、ＣＹＰ１７遺伝子中の＊２対立遺伝子の存在に関して分析した。特に、Ａ型またはＧ型対立遺伝子の存在に関してＤＮＡサンプルを分析した。
【０１０１】
ＰＣＲ増幅反応プライマー
Ａ型対立遺伝子に特異的な未標識フォワードプライマーは、配列５’−ｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔＧＣＣＡＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＡＣＴＣＣＡＣＴ（配列番号１２）（ここで、ＦＡＭ標識プライマーの３’部分と同一の配列は小文字で示されている）を含んでいた。Ｇ型対立遺伝子に特異的な未標識フォワードプライマーは、配列５’−ｇａａｇｇｔｃｇｇａｇｔｃａａｃｇｇａｔｔＧＣＣＡＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＡＣＴＣＣＡＣＣ（ここで、ＳＲ標識プライマーの３’部分と同一の配列は小文字で示されている）を含んでいた。多型の同定に導いたヌクレオチドには下線が引いてある。該反応で使用したリバースプライマーは、配列ＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＣＴＴ（配列番号１４）を含んでいた。使用した普遍的ＦＲＥＴプライマーは、実施例１に記載のものと同一であった。
【０１０２】
２．増幅反応
多重ＰＣＲ反応が高レベルの対立遺伝子識別を達成しうるか否かを判定するために、３組の増幅反応を準備した。
【０１０３】
反応１（一重）：
ヒトゲノムＤＮＡを使用する増幅反応混合物は、実施例１に記載のものと同じであったが、次のような相違を含んでいた。この反応では、Ａ型対立遺伝子特異的プライマー、ＦＡＭ標識ヘアピンプライマーおよびリバースプライマーのみを使用した。
【０１０４】
反応２（一重）：
ヒトゲノムＤＮＡを使用する増幅反応混合物は、実施例１に記載のものと同じであったが、次のような相違を含んでいた。この反応では、Ｇ型対立遺伝子特異的プライマー、ＳＲ標識ヘアピンプライマーおよびリバースプライマーのみを使用した。
【０１０５】
反応３（多重）：
ヒトゲノムＤＮＡを使用する増幅反応混合物は、実施例１に記載のものと同じであった。この反応では、両方のフォワードプライマー、すなわち、Ｇ型対立遺伝子特異的プライマーおよびＡ型対立遺伝子特異的プライマー、ＳＲ標識ヘアピンプライマー、ＦＡＭ標識ヘアピンプライマーならびにリバースプライマーを使用した。両方の対立遺伝子特異的プライマーが同じ反応中に存在しているため、この反応は多重ＰＣＲ増幅の典型例である。
【０１０６】
３．ＰＣＲ反応
それらの３組の反応はそれぞれ、３つの「無ＤＮＡ対照」（ＮＤＣ）を含んでいた。混合物を予め９４℃で３分間加熱した後、９４℃で１０秒、５５℃で２０秒および７２℃で４０秒の熱サイクル（サーモサイクリング）（ＰＣＲ）を３５サイクル行った。
【０１０７】
４．蛍光測定
ＰＣＲ後、ＦＡＭについては５８５ｎｍおよびＳＲについては６２０ｎｍの発光フィルターを使用して、プレートリーダーで相対蛍光を測定した。無ＤＮＡ対照における平均蛍光シグナルを、各サンプル反応の対応シグナルから引き算した。補正蛍光シグナルをプロットで示す（図５Ｂ）。
【０１０８】
５．結果
結果を図５Ａおよび５Ｂに示す。図５Ａおよび５Ｂは、Ａ型特異的プライマーがＡ型およびＧ型の両方のＤＮＡ上でＦＡＭシグナルを生成し（１および２）、Ｇ特異的プライマーがＡ型およびＧ型の両方のＤＮＡでＳＲシグナルを生成したこと（３および４）を示している。したがって、これらのプライマーを別々に選択した場合には、対立遺伝子識別は低く、ＤＮＡ型を識別するのに十分ではなかった。しかしながら、Ａ特異的およびＧ特異的の両方のプライマーが同時に存在する場合（反応３、多重ＰＣＲ）（５および６）。
【０１０９】
実施例３：ＨＥＲ２遺伝子中のＳＮＰを検出するための多重対立遺伝子特異的ＰＣＲ
１．増幅反応：
ゲノムＤＮＡのサンプルを、ＨＥＲ２遺伝子中のＳＮＰの存在に関して分析した。特に、Ａ型またはＧ型対立遺伝子の存在に関してＤＮＡサンプルを分析した。
【０１１０】
ＰＣＲ増幅反応プライマー
プライマーおよび標的配列を表２（Ａ）に要約する。Ａ型対立遺伝子に特異的な未標識フォワードプライマーは、配列５’−ｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔＧＣＣＡＡＣＣＡＣＣＧＣＡＧＡＧＡＴ（配列番号ＸＸ）（ここで、ＦＡＭ標識プライマーの３’部分と同一の配列は小文字で示されており、多型の同定に導いたヌクレオチドには下線が引いてある）を含んでいた。Ｇ型対立遺伝子に特異的な未標識フォワードプライマーは、配列５’−ｇａａｇｇｔｃｇｇａｇｔｃａａｃｇｇａｔｔＧＣＣＡＡＣＣＡＣＣＧＣＡＧＡＧＡＣ（配列番号ＸＸ）（ここで、ＳＲ標識プライマーの３’部分と同一の配列は小文字で示されており、多型の同定に導いたヌクレオチドには下線が引いてある）を含んでいた。該反応で使用したリバースプライマーは、配列ＴＣＡＡＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＣＴＴ（配列番号ＸＸ）を含んでいた。使用した普遍的ＦＲＥＴプライマーは、実施例１に記載のものと同一であった。
【０１１１】
２．多重増幅反応：
ゲノムＤＮＡを使用する増幅反応混合物は、実施例１に記載のものと同じであった。この反応では、両方のフォワードプライマー、すなわち、Ｇ型対立遺伝子特異的プライマーおよびＡ型対立遺伝子特異的プライマー、ＳＲ標識ヘアピンプライマー、ＦＡＭ標識ヘアピンプライマーならびにリバースプライマーを使用した。
【０１１２】
３．ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応はそれぞれ、４つの「無ＤＮＡ対照」（ＮＤＣ）を含んでいた。混合物を予め９４℃で３分間加熱した後、９４℃で１０秒、５５℃で２０秒および７２℃で４０秒の熱サイクル（サーモサイクリング）（ＰＣＲ）を３５サイクル行った。
【０１１３】
４．蛍光測定
ＰＣＲ後、ＦＡＭについては５８５ｎｍおよびＳＲについては６２０ｎｍの発光フィルターを使用して、プレートリーダーで相対蛍光を測定した。無ＤＮＡ対照における平均蛍光シグナルを、各サンプル反応の対応シグナルから引き算した。補正蛍光シグナルをプロットで示す（図６Ａおよび６Ｂ）。
【０１１４】
５．結果
結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。この図は、Ａ特異的およびＧ特異的の両方のプライマーが同時に存在する場合の良好な対立遺伝子識別を示している。
【０１１５】
実施例４：多型をまたぐことによりＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中のＳＮＰを検出するための多重対立遺伝子特異的ＰＣＲ
１．増幅反応：
ゲノムＤＮＡのサンプルを、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中のＳＮＰの存在に関して分析した。特に、Ｃ型またはＴ型対立遺伝子の存在に関してＤＮＡサンプルを分析した。この反応で使用したプライマーは互いに相違する。Ｔ型対立遺伝子に特異的なプライマーは、その３’末端ヌクレオチド以外のヌクレオチドが異なるため、多型をまたいでいる（ｂｒｉｄｇｅ）。
【０１１６】
ＰＣＲ増幅反応プライマー
プライマーおよび標的配列を表２（Ｂ）に要約する。Ｃ型対立遺伝子に特異的な未標識フォワードプライマーは、配列５’−ｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔＧＴＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴＡＧＣＡＧＡＴＣＧ（配列番号ＸＸ）（ここで、ＦＡＭ標識プライマーの３’部分と同一の配列は小文字で示されており、多型の同定に導いたヌクレオチドには下線が引いてある）を含んでいた。Ｔ型対立遺伝子に特異的な未標識フォワードプライマーは、配列５’−ｇａａｇｇｔｃｇｇａｇｔｃａａｃｇｇａｔｔＧＴＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴＡＧＣＡＧＡＴＡＧ（配列番号ＸＸ）（ここで、ＳＲ標識プライマーの３’部分と同一の配列は小文字で示されており、多型の同定に導いたヌクレオチドには下線が引いてある）を含んでいた。このプライマーの場合、３’末端ヌクレオチドではなく、該プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチドが異なる。該反応で使用したリバースプライマーは、配列ＴＧＣＴＴＣＡＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＡＡＧＡＡＴ（配列番号ＸＸ）を含んでいた。使用した普遍的ＦＲＥＴプライマーは、実施例１に記載のものと同一であった。
【０１１７】
２．多重増幅反応：
ゲノムＤＮＡを使用する増幅反応混合物は、実施例１に記載のものと同じであった。この反応では、両方のフォワードプライマー、すなわち、Ｃ型対立遺伝子特異的プライマーおよびＴ型対立遺伝子特異的プライマー、ＳＲ標識ヘアピンプライマー、ＦＡＭ標識ヘアピンプライマーならびにリバースプライマーを使用した。
【０１１８】
３．ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応はそれぞれ、４つの「無ＤＮＡ対照」（ＮＤＣ）を含んでいた。混合物を予め９４℃で３分間加熱した後、９４℃で１０秒、５５℃で２０秒および７２℃で４０秒の熱サイクル（サーモサイクリング）（ＰＣＲ）を３５サイクル行った。
【０１１９】
４．蛍光測定
ＰＣＲ後、ＦＡＭについては５８５ｎｍおよびＳＲについては６２０ｎｍの発光フィルターを使用して、プレートリーダーで相対蛍光を測定した。無ＤＮＡ対照における平均蛍光シグナルを、各サンプル反応の対応シグナルから引き算した。補正蛍光シグナルをプロットで示す（図７Ａおよび７Ｂ）。
【０１２０】
５．結果
結果を図７Ａおよび７Ｂに示す。この図は、Ｃ特異的およびＴ特異的の両方のプライマーが同時に存在する場合の良好な対立遺伝子識別を示している。
【０１２１】
実施例５：多型をまたぐことによりＨＴＲ２Ｃ遺伝子中のＳＮＰを検出するための多重対立遺伝子特異的ＰＣＲ
１．増幅反応：
ゲノムＤＮＡのサンプルを、ＨＴＲ２Ｃ遺伝子中のＳＮＰの存在に関して分析した。特に、Ｃ型またはＧ型対立遺伝子の存在に関してＤＮＡサンプルを分析した。この反応で使用したプライマーは、３’末端ヌクレオチドから３番目のヌクレオチドが異なるため、多型をまたいでいる。
【０１２２】
ＰＣＲ増幅反応プライマー
プライマーおよび標的配列を表２（Ｃ）に要約する。Ｃ型対立遺伝子に特異的な未標識フォワードプライマーは、配列５’−ｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔＧＧＧＣＴＣＡＣＡＧＡＡＡＴＡＴＣＡＧＡＴ（配列番号ＸＸ）（ここで、ＦＡＭ標識プライマーの３’部分と同一の配列は小文字で示されており、多型の同定に導いたヌクレオチドには下線が引いてある）を含んでいた。Ｔ型対立遺伝子に特異的な未標識フォワードプライマーは、配列５’−ｇａａｇｇｔｃｇｇａｇｔｃａａｃｇｇａｔｔＧＧＧＣＴＣＡＣＡＧＡＡＡＴＡＴＣＡＣＡＴ（配列番号ＸＸ）（ここで、ＳＲ標識プライマーの３’部分と同一の配列は小文字で示されており、多型の同定に導いたヌクレオチドには下線が引いてある）を含んでいた。このプライマーの場合、３’末端ヌクレオチドではなく、該プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチドが異なる。該反応で使用したリバースプライマーは、配列ＴＧＣＡＣＣＴＡＡＴＴＧＧＣＣＴＡＴＴＧＧＴＴＴ（配列番号ＸＸ）を含んでいた。使用した普遍的ＦＲＥＴプライマーは、実施例１に記載のものと同一であった。
【０１２３】
２．多重増幅反応：
ゲノムＤＮＡを使用する増幅反応混合物は、実施例１に記載のものと同じであった。この反応では、両方のフォワードプライマー、すなわち、Ｇ型対立遺伝子特異的プライマーおよびＣ型対立遺伝子特異的プライマー、ＳＲ標識ヘアピンプライマー、ＦＡＭ標識ヘアピンプライマーならびにリバースプライマーを使用した。
【０１２４】
３．ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応はそれぞれ、４つの「無ＤＮＡ対照」（ＮＤＣ）を含んでいた。混合物を予め９４℃で３分間加熱した後、９４℃で１０秒、５５℃で２０秒および７２℃で４０秒の熱サイクル（サーモサイクリング）（ＰＣＲ）を３５サイクル行った。
【０１２５】
４．蛍光測定
ＰＣＲ後、ＦＡＭについては５８５ｎｍおよびＳＲについては６２０ｎｍの発光フィルターを使用して、プレートリーダーで相対蛍光を測定した。無ＤＮＡ対照における平均蛍光シグナルを、各サンプル反応の対応シグナルから引き算した。補正蛍光シグナルをプロットで示す（図８Ａおよび８Ｂ）。
【０１２６】
５．結果
結果を図８Ａおよび８Ｂに示す。この図は、Ｃ特異的およびＧ特異的の両方のプライマーが同時に存在する場合の良好な対立遺伝子識別を示している。
【０１２７】
実施例６：ＣＣＲ５遺伝子中の欠失を検出するための多重対立遺伝子特異的ＰＣＲ
１．増幅反応：
ゲノムＤＮＡのサンプルを、ＣＣＲ５遺伝子中の欠失の存在に関して分析した。特に、該遺伝子欠失の存在または不存在に関してＤＮＡサンプルを分析した。
【０１２８】
ＰＣＲ増幅反応プライマー
プライマーおよび標的配列を表２（Ｄ）に要約する。野生型対立遺伝子に特異的な未標識フォワードプライマーは、配列５’−ｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔＣＴＣＡＴＴＴＴＣＣＡＴＡＣＡＧＴＣＡ（配列番号ＸＸ）（ここで、ＦＡＭ標識プライマーの３’部分と同一の配列は小文字で示されており、野生型対立遺伝子の同定に導いたヌクレオチドには下線が引いてある）を含んでいた。突然変異対立遺伝子に特異的な未標識フォワードプライマーは、配列５’−ｇａａｇｇｔｃｇｇａｇｔｃａａｃｇｇａｔｔｇｃａｇｃｔｃｔｃａｔｔｔｔｃｃａｔａｃａｔｔａ（配列番号ＸＸ）（ここで、ＳＲ標識プライマーの３’部分と同一の配列は小文字で示されている）を含んでいた。該反応で使用したリバースプライマーは、配列ＡＣＣＡＧＣＣＣＣＡＡＧＡＴＧＡＣＴＡＴＣＴＴ（配列番号ＸＸ）を含んでいた。使用した普遍的ＦＲＥＴプライマーは、実施例１に記載のものと同一であった。
【０１２９】
２．多重増幅反応
ゲノムＤＮＡを使用する増幅反応混合物は、実施例１に記載のものと同じであった。この反応では、両方のフォワードプライマー、すなわち、野生型対立遺伝子特異的プライマーおよび突然変異対立遺伝子特異的プライマー、ＳＲ標識ヘアピンプライマー、ＦＡＭ標識ヘアピンプライマーならびにリバースプライマーを使用した。
【０１３０】
３．ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応はそれぞれ、４つの「無ＤＮＡ対照」（ＮＤＣ）を含んでいた。混合物を予め９４℃で３分間加熱した後、９４℃で１０秒、５５℃で２０秒および７２℃で４０秒の熱サイクル（サーモサイクリング）（ＰＣＲ）を３５サイクル行った。
【０１３１】
４．蛍光測定
ＰＣＲ後、ＦＡＭについては５８５ｎｍおよびＳＲについては６２０ｎｍの発光フィルターを使用して、プレートリーダーで相対蛍光を測定した。無ＤＮＡ対照における平均蛍光シグナルを、各サンプル反応の対応シグナルから引き算した。補正蛍光シグナルをプロットで示す（図９Ａおよび９Ｂ）。
【０１３２】
５．結果
結果を図９Ａおよび９Ｂに示す。この図は、野生型特異的および突然変異特異的の両方のプライマーが同時に存在する場合の良好な対立遺伝子識別を示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーの一般的模式図を示す。
【図２】
本発明の方法の好ましい実施形態の１つを示す模式図である。
【図３】
（Ａ）ヘアピンコンホメーションおよび（Ｂ）伸長コンホメーションをとったオリゴヌクレオチドの構造の模式図である。
【図４】
ポリメラーゼ連鎖反応を用いる本発明の方法のもう１つの実施形態を示す。
【図５】
図５Ａは、Ａ型対立遺伝子およびＧ型対立遺伝子に関するＣＹＰ１７遺伝子の遺伝子型決定の結果を示す。図５Ｂは、一重（シングルプレックス）ＰＣＲ反応に対する多重（マルチプレックス）ＰＣＲ反応の利点を示す。
【図６】
図６Ａは、Ａ型対立遺伝子およびＧ型対立遺伝子に関するＨＥＲ２遺伝子の遺伝子型決定の結果を示す。図６Ｂは、図５Ａの蛍光結果のグラフ表示を示す。
【図７】
図７Ａは、Ｃ型対立遺伝子およびＴ型対立遺伝子に関するＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の遺伝子型決定の結果を示す。図７Ｂは、図６Ａの蛍光結果のグラフ表示を示す。
【図８】
図８Ａは、Ｃ型対立遺伝子およびＧ型対立遺伝子に関するＨＴＲ２Ｃ遺伝子の遺伝子型決定の結果を示す。図８Ｂは、図７Ａの蛍光結果のグラフ表示を示す。
【図９】
図９Ａは、野生型遺伝子および欠失突然変異体に関するＣＣＲ５遺伝子の遺伝子型決定の結果を示す。図９Ｂは、図８Ａの蛍光結果のグラフ表示を示す。
Claims (65)
- サンプル中の第１同定配列または第２同定配列または両方の存在を判定するための方法であって、
（Ａ）下記のヌクレオチド配列：
（ｉ）第１同定配列に特異的にハイブリダイズできるが、第２同定配列には特異的にハイブリダイズできない第１ヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）第１ヌクレオチド配列の５’末端における第２ヌクレオチド配列、
を含む第１オリゴヌクレオチドを準備すること、
（Ｂ）下記のヌクレオチド配列：
（ｉ）第２同定配列に特異的にハイブリダイズできるが、第１同定配列には特異的にハイブリダイズできない第３ヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）第１ヌクレオチド配列の５’末端における第４ヌクレオチド配列、
を含む第２オリゴヌクレオチドを準備すること、
（Ｃ）第３オリゴヌクレオチドを準備すること、
（Ｄ）下記のヌクレオチド配列：
（ｉ）第５ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）第５ヌクレオチド配列の５’末端における第６ヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）第６ヌクレオチド配列の５’末端における第７ヌクレオチド配列、および
（ｉｖ）第７ヌクレオチド配列の５’末端における第８ヌクレオチド配列、
を含む第４オリゴヌクレオチドを準備すること、ここで、第５ヌクレオチド配列は第２ヌクレオチド配列と同一であり、第４オリゴヌクレオチドは、第６および第８ヌクレオチド配列のヌクレオチドを含有する第１ヘアピンを形成することが可能であり、第４オリゴヌクレオチドは、第１ヘアピンが形成されなければ第１検出シグナルを放出すること、
（Ｅ）下記のヌクレオチド配列：
（ｉ）第９ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）第９ヌクレオチド配列の５’末端における第１０ヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）第１０ヌクレオチド配列の５’末端における第１１ヌクレオチド配列、および
（ｉｖ）第１１ヌクレオチド配列の５’末端における第１２ヌクレオチド配列、
を含む第５オリゴヌクレオチドを準備すること、ここで、第９ヌクレオチド配列は第４ヌクレオチド配列と同一であり、第５オリゴヌクレオチドは、第１０および第１２ヌクレオチド配列のヌクレオチドを含有する第２ヘアピンを形成することが可能であり、第４オリゴヌクレオチドは、第２ヘアピンが形成されなければ第２検出シグナルを放出すること、
（Ｆ）サンプル中に第１同定配列が存在する場合には、
（ｉ）第１オリゴヌクレオチドを第１同定配列にアニールさせること、
（ｉｉ）鋳型として第１同定配列を使用して第１オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長第１鎖を形成させること、ここで、第１同定配列は伸長第１鎖にアニールすること、
（ｉｉｉ）伸長第１鎖から第１同定配列を分離すること、
（ｉｖ）第３オリゴヌクレオチドを伸長第１鎖にアニールさせること、
（ｖ）鋳型として伸長第１鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長第２鎖を形成させること、ここで、伸長第１鎖は伸長第２鎖にアニールすること、
（ｖｉ）伸長第２鎖から伸長第１鎖を分離すること、
（ｖｉｉ）第４オリゴヌクレオチドを伸長第２鎖にアニールさせること、
（ｖｉｉｉ）鋳型として伸長第２鎖を使用して第４オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、二重伸長第１鎖を形成させること、ここで、二重伸長第１鎖は伸長第２鎖にアニールすること、
（ｉｘ）伸長第２鎖から二重伸長第１鎖を分離すること、
（ｘ）第３オリゴヌクレオチドを二重伸長第１鎖にアニールさせること、
（ｘｉ）鋳型として二重伸長第１鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、二重伸長第２鎖を形成させること、
（ｘｉｉ）場合により、二重伸長第１および第２鎖を増幅すること、
（ｘｉｉｉ）第１検出シグナルを検出すること、および
（ｘｉｖ）サンプル中に第１同定配列が存在すると判定すること、
（Ｇ）サンプル中に第２同定配列が存在する場合には、
（ｉ）第２オリゴヌクレオチドを第２同定配列にアニールさせること、
（ｉｉ）鋳型として第２同定配列を使用して第２オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長第３鎖を形成させること、ここで、第２同定配列は伸長第３鎖にアニールすること、
（ｉｉｉ）伸長第３鎖から第２同定配列を分離すること、
（ｉｖ）第３オリゴヌクレオチドを伸長第３鎖にアニールさせること、
（ｖ）鋳型として伸長第３鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長第４鎖を形成させること、ここで、伸長第３鎖は伸長第４鎖にアニールすること、
（ｖｉ）伸長第４鎖から伸長第３鎖を分離すること、
（ｖｉｉ）第５オリゴヌクレオチドを伸長第４鎖にアニールさせること、
（ｖｉｉｉ）鋳型として伸長第４鎖を使用して第５オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、二重伸長第３鎖を形成させること、ここで、二重伸長第３鎖は伸長第４鎖にアニールすること、
（ｉｘ）伸長第４鎖から二重伸長第３鎖を分離すること、
（ｘ）第３オリゴヌクレオチドを二重伸長第３鎖にアニールさせること、
（ｘｉ）鋳型として二重伸長第３鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、二重伸長第４鎖を形成させること、
（ｘｉｉ）場合により、二重伸長第３および第４鎖を増幅すること、
（ｘｉｉｉ）第２検出シグナルを検出すること、
（ｘｉｖ）サンプル中に第２同定配列が存在すると判定すること、
を含んでなる上記方法。 - サンプルがゲノムＤＮＡサンプルである、請求項１記載の方法。
- 第４オリゴヌクレオチドが、第１ヘアピンが形成されない場合に限り第１検出シグナルを放出し、第５オリゴヌクレオチドが、第２ヘアピンが形成されない場合に限り第２検出シグナルを放出する、請求項１記載の方法。
- 第１ヘアピンが形成されない場合に第４オリゴヌクレオチドにより放出される第１検出シグナルは、第１ヘアピンが形成された場合に第４オリゴヌクレオチドにより放出されるシグナルより強力であり、そして、第２ヘアピンが形成されない場合に第５オリゴヌクレオチドにより放出される第２検出シグナルは、第２ヘアピンが形成された場合に第５オリゴヌクレオチドにより放出されるシグナルより強力である、請求項１記載の方法。
- 第４オリゴヌクレオチドは、第１ヘアピンが形成されない場合に限り第１検出シグナルを放出し、そして、第５オリゴヌクレオチドは、第２ヘアピンが形成されない場合に限り第２検出シグナルを放出する、請求項１記載の方法。
- 第４オリゴヌクレオチドが更に、第１エネルギーを放出できる第１エネルギー供与成分と放出第１エネルギーの量を吸収できる第１エネルギー受容成分とを含む第１分子エネルギー転移ペアを含有し、
第１供与成分が第２ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第１受容成分が第４ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しているか、または、第１受容成分が第２ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第１供与成分が第４ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、そして、第１受容成分は、第１ヘアピンが形成された場合に限り放出第１エネルギーの量を吸収し、
第５オリゴヌクレオチドが更に、第２エネルギーを放出できる第２エネルギー供与成分と放出第２エネルギーの量を吸収できる第２エネルギー受容成分とを含む第２分子エネルギー転移ペアを含有し、
第２供与成分が第６ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第２受容成分が第８ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しているか、または、第２受容成分が第６ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第２供与成分が第８ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、そして、第２受容成分は、第２ヘアピンが形成された場合に限り放出第２エネルギーの量を吸収する、請求項１記載の方法。 - 第１および第２供与成分のそれぞれが発蛍光団であり、第１および第２受容成分のそれぞれが、発蛍光団から放出される光のクエンチャーである、請求項１記載の方法。
- 第１および第２受容成分がＤＡＢＳＹＬであり、ここで、第１供与成分がフルオレセインで、第２受容成分がスルファローダミンであるか、または、第１供与成分がスルファローダミンで、第２受容成分がフルオレセインである、請求項８記載の方法。
- 増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１記載の方法。
- 増幅反応が三重増幅、核酸配列に基づく増幅、鎖置換増幅、カスケードローリングサークル増幅、または増幅不応性突然変異系である、請求項１記載の方法。
- 増幅反応をｉｎ ｓｉｔｕで行う、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｘｉｉ）が、
（ａ）二重伸長第２鎖から二重伸長第１鎖を分離すること、
（ｂ）第３オリゴヌクレオチドを二重伸長第１鎖にアニールさせ、第４オリゴヌクレオチドを二重伸長第２鎖にアニールさせること、
（ｃ）鋳型として二重伸長第１鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、もう１つの二重伸長第２鎖を形成させること、ここで、二重伸長第１鎖はもう一方の二重伸長第２鎖にアニールすること、鋳型として二重伸長第２鎖を使用して第４オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、もう１つの二重伸長第１鎖を形成させること、ここで、二重伸長第２鎖はもう一方の二重伸長第１鎖にアニールすること、および
（ｄ）上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を有限回数反復すること、
を含み、ここで、（ａ）においては、二重伸長第１および第２鎖が、それぞれ、（ｃ）の二重伸長第１鎖およびもう一方の二重伸長第２鎖であるか、または、それぞれ、（ｃ）のもう一方の二重伸長第１鎖および二重伸長第２鎖である、請求項１記載の方法。 - （Ｇ）（ｘｉｉ）が、
（ａ）二重伸長第４鎖から二重伸長第３鎖を分離すること、
（ｂ）第３オリゴヌクレオチドを二重伸長第３鎖にアニールさせ、第５オリゴヌクレオチドを二重伸長第４鎖にアニールさせること、
（ｃ）鋳型として二重伸長第３鎖を使用して第３オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、もう１つの二重伸長第４鎖を形成させること、ここで、二重伸長第３鎖はもう一方の二重伸長第４鎖にアニールすること、鋳型として二重伸長第４鎖を使用して第５オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、もう１つの二重伸長第３鎖を形成させること、ここで、二重伸長第４鎖はもう一方の二重伸長第３鎖にアニールすること、
（ｄ）上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を有限回数反復させること、
を含み、ここで、（ａ）においては、二重伸長第３および第４鎖が、それぞれ、（ｃ）の二重伸長第３鎖およびもう一方の二重伸長第４鎖であるか、または、それぞれ、（ｃ）のもう一方の二重伸長第３鎖および二重伸長第４鎖である、請求項１記載の方法。 - （Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第１オリゴヌクレオチドの濃度が５０ｎＭ未満である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第１オリゴヌクレオチドの濃度が２５ｎＭ未満である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第１オリゴヌクレオチドの濃度が５ｎＭ未満である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第１オリゴヌクレオチドの濃度が５〜５０ｎＭである、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第１オリゴヌクレオチドの濃度が２０〜３０ｎＭである、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第１オリゴヌクレオチドの濃度が約２５ｎＭである、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第４オリゴヌクレオチドの濃度が５００ｎＭ未満である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第４オリゴヌクレオチドの濃度が２５０ｎＭ未満である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第４オリゴヌクレオチドの濃度が５０ｎＭ未満である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第４オリゴヌクレオチドの濃度が５０〜５００ｎＭである、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第４オリゴヌクレオチドの濃度が２００〜３００ｎＭである、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第４オリゴヌクレオチドの濃度が約２５０ｎＭである、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第４オリゴヌクレオチドの濃度が、（Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第１オリゴヌクレオチドの濃度の少なくとも５倍である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第４オリゴヌクレオチドの濃度が、（Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第１オリゴヌクレオチドの濃度の少なくとも１０倍である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第４オリゴヌクレオチドの濃度が、（Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第１オリゴヌクレオチドの濃度の少なくとも２０倍である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第４オリゴヌクレオチドの濃度が、（Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第１オリゴヌクレオチドの濃度の少なくとも３０倍である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第４オリゴヌクレオチドの濃度が、（Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第１オリゴヌクレオチドの濃度の５〜３０倍である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第４オリゴヌクレオチドの濃度が、（Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第１オリゴヌクレオチドの濃度の１０〜２０倍である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第４オリゴヌクレオチドの濃度が、（Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第１オリゴヌクレオチドの濃度の約１０倍である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第２オリゴヌクレオチドの濃度が５０ｎＭ未満である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第２オリゴヌクレオチドの濃度が２５ｎＭ未満である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第２オリゴヌクレオチドの濃度が５ｎＭ未満である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第２オリゴヌクレオチドの濃度が５〜５０ｎＭである、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第２オリゴヌクレオチドの濃度が２０〜３０ｎＭである、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第２オリゴヌクレオチドの濃度が約２５ｎＭである、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第５オリゴヌクレオチドの濃度が５００ｎＭ未満である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第５オリゴヌクレオチドの濃度が２５０ｎＭ未満である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第５オリゴヌクレオチドの濃度が５０ｎＭ未満である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第５オリゴヌクレオチドの濃度が５０〜５００ｎＭである、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第５オリゴヌクレオチドの濃度が２００〜３００ｎＭである、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第５オリゴヌクレオチドの濃度が約２５０ｎＭである、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第５オリゴヌクレオチドの濃度が、（Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第２オリゴヌクレオチドの濃度の少なくとも５倍である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第５オリゴヌクレオチドの濃度が、（Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第２オリゴヌクレオチドの濃度の少なくとも１０倍である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第５オリゴヌクレオチドの濃度が、（Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第２オリゴヌクレオチドの濃度の少なくとも２０倍である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第５オリゴヌクレオチドの濃度が、（Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第２オリゴヌクレオチドの濃度の少なくとも３０倍である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第５オリゴヌクレオチドの濃度が、（Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第２オリゴヌクレオチドの濃度の５〜３０倍である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第５オリゴヌクレオチドの濃度が、（Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第２オリゴヌクレオチドの濃度の１０〜２０倍である、請求項１記載の方法。
- （Ｆ）（ｖｉｉ）を行う反応混合物中の第５オリゴヌクレオチドの濃度が、（Ｆ）（ｉ）を行う反応混合物中の第２オリゴヌクレオチドの濃度の約１０倍である、請求項１記載の方法。
- サンプル中の第１同定配列または第２同定配列または両方の存在を判定するための方法であって、
（Ａ）サンプルを第１および第２オリゴヌクレオチドと接触させること、ここで、第１オリゴヌクレオチドは、
（ｉ）第１ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）第１ヌクレオチド配列の５’末端における第２ヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）第２ヌクレオチド配列の５’末端における第３ヌクレオチド配列、および
（ｉｖ）第３ヌクレオチド配列の５’末端における第４ヌクレオチド配列を含み、その際、第１オリゴヌクレオチドは、第２および第４ヌクレオチド配列のヌクレオチドを含有する第１ヘアピンを形成することが可能であり、そして、第１オリゴヌクレオチドは、第１ヘアピンが形成されなければ第１検出シグナルを放出すること、
第２オリゴヌクレオチドは、
（ｉ）第５ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）第５ヌクレオチド配列の５’末端における第６ヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）第６ヌクレオチド配列の５’末端における第７ヌクレオチド配列、および
（ｉｖ）第７ヌクレオチド配列の５’末端における第８ヌクレオチド配列を含み、その際、第２オリゴヌクレオチドは、第６および第８ヌクレオチド配列のヌクレオチドを含有する第２ヘアピンを形成することが可能であり、そして、第２オリゴヌクレオチドは、第２ヘアピンが形成されなければ第２検出シグナルを放出すること、
（Ｂ）（ｉ）サンプル中に第１同定配列が存在する場合には、ポリメラーゼを使用して第１オリゴヌクレオチドを二本鎖核酸中に取り込ませ、それにより、第１ヘアピンの形成を妨げること、
（ｉｉ）サンプル中に第２同定配列が存在する場合には、ポリメラーゼを使用して第２オリゴヌクレオチドを二本鎖核酸中に取り込ませ、それにより、第２ヘアピンの形成を妨げること、または
（ｉｉｉ）サンプル中に第１および第２同定配列の両方が存在する場合には、ポリメラーゼを使用して第１および第２オリゴヌクレオチドのそれぞれを二本鎖核酸中に取り込ませ、それにより、第１および第２ヘアピンのそれぞれの形成を妨げること、
（Ｃ）場合により、増幅反応を行い、それにより、
（ｉ）サンプル中に第１同定配列が存在する場合には、第１オリゴヌクレオチドを第１増幅産物中に取り込ませること、
（ｉｉ）サンプル中に第２同定配列が存在する場合には、第２オリゴヌクレオチドを第２増幅産物中に取り込ませること、または
（ｉｉｉ）サンプル中に第１同定配列が存在する場合には、第１オリゴヌクレオチドを第１増幅産物中に取り込ませ、かつ、サンプル中に第２同定配列が存在する場合には、第２オリゴヌクレオチドを第２増幅産物中に取り込ませること、
（Ｄ）（ｉ）第１シグナルが検出された場合には、サンプル中に第１同定配列が存在すると判定すること、
（ｉｉ）第２シグナルが検出された場合には、サンプル中に第２同定配列が存在すると判定すること、または
（ｉｉｉ）第１および第２シグナルが検出された場合には、サンプル中に第１および第２同定配列が存在すると判定すること、
を含んでなる上記方法。 - サンプルがゲノムＤＮＡサンプルである、請求項１記載の方法。
- 第１オリゴヌクレオチドは、第１ヘアピンが形成されない場合に限り第１検出シグナルを放出し、そして、第２オリゴヌクレオチドは、第２ヘアピンが形成されない場合に限り第２検出シグナルを放出する、請求項１記載の方法。
- 第１ヘアピンが形成されない場合に第１オリゴヌクレオチドにより放出される第１検出シグナルは、第１ヘアピンが形成された場合に第１オリゴヌクレオチドにより放出されるシグナルより強力であり、そして、第２ヘアピンが形成されない場合に第２オリゴヌクレオチドにより放出される第２検出シグナルは、第２ヘアピンが形成された場合に第２オリゴヌクレオチドにより放出されるシグナルより強力である、請求項１記載の方法。
- 第１オリゴヌクレオチドは、第１ヘアピンが形成されない場合に限り第１検出シグナルを放出し、そして、第２オリゴヌクレオチドは、第２ヘアピンが形成されない場合に限り第２検出シグナルを放出する、請求項１記載の方法。
- 第１オリゴヌクレオチドが更に、第１エネルギーを放出できる第１エネルギー供与成分と放出第１エネルギーの量を吸収できる第１エネルギー受容成分とを含む第１分子エネルギー転移ペアを含有し、
第１供与成分が第２ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第１受容成分が第４ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しているか、または第１受容成分が第２ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第１供与成分が第４ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、そして、第１受容成分は、第１ヘアピンが形成された場合に限り放出第１エネルギーの量を吸収し、
第２オリゴヌクレオチドが更に、第２エネルギーを放出できる第２エネルギー供与成分と放出第２エネルギーの量を吸収できる第２エネルギー受容成分とを含む第２分子エネルギー転移ペアを含有し、
第２供与成分が第６ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第２受容成分が第８ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しているか、または第２受容成分が第６ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、かつ第２供与成分が第８ヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合しており、そして、第２受容成分は、第２ヘアピンが形成された場合に限り放出第２エネルギーの量を吸収する、請求項１記載の方法。 - 第１および第２供与成分のそれぞれが発蛍光団であり、第１および第２受容成分のそれぞれが、発蛍光団から放出される光のクエンチャーである、請求項６記載の方法。
- 第１および第２受容成分がＤＡＢＳＹＬであり、ここで、第１供与成分がフルオレセインで、第２受容成分がスルファローダミンであるか、または第１供与成分がスルファローダミンで、第２受容成分がフルオレセインである、請求項７記載の方法。
- 増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１記載の方法。
- 増幅反応が三重増幅、核酸配列に基づく増幅、鎖置換増幅、カスケードローリングサークル増幅、または増幅不応性突然変異系である、請求項１記載の方法。
- 増幅反応をｉｎ ｓｉｔｕで行う、請求項１記載の方法。
- サンプル中の第１同定配列または第２同定配列または両方の存在を判定するためのキットであって、１以上の容器中に、
（ａ）第１および第２オリゴヌクレオチド、
（ｂ）第３オリゴヌクレオチド、ここで、第１および第２オリゴヌクレオチドは核酸多型を同定するための増幅反応におけるＤＮＡ合成用のフォワードプライマーであり、第３オリゴヌクレオチドはリバースプライマーであり、そして、第１および第２オリゴヌクレオチドは、（ｉ）該核酸配列中の予め選択された標的配列に相補的でない５’配列と、（ｉｉ）前記の予め選択された標的配列に相補的である３’配列とを含み、１個以上のミスマッチヌクレオチドを含みうること、および
（ｃ）第４オリゴヌクレオチド、ただし、これは、５’から３’の順序で、
（ｉ）６〜３０ヌクレオチドの第１ヌクレオチド配列、ここで、第１ヌクレオチド配列中のヌクレオチドは、分子エネルギー転移ペアの供与成分および受容成分よりなる群から選ばれる第１成分で標識されており、供与成分は、励起されると１以上の特定の波長のエネルギーを放出し、受容成分は、供与成分により放出された１以上の特定の波長のエネルギーを吸収すること、
（ｉｉ）３〜２０ヌクレオチドの一本鎖第２ヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）６〜３０ヌクレオチドの第３ヌクレオチド配列、ここで、第３ヌクレオチド配列中のヌクレオチドは、供与成分および受容成分よりなる群から選ばれる第２成分で標識されており、第２成分は、第１ヌクレオチド配列を標識していない上記群のメンバーであり、第３ヌクレオチド配列は、第１ヌクレオチド配列と第３ヌクレオチド配列との間で二本鎖を形成するのに十分な程度に逆の順序で第１ヌクレオチド配列に相補的であり、そのため、第１成分と第２成分とは十分に接近していて、供与成分が励起されてエネルギーを放出すると、受容成分は供与成分により放出されたエネルギーを吸収すること、
（ｉｖ）第３オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端における、１０〜２５ヌクレオチドの第４ヌクレオチド配列、ただし、これは、第１オリゴヌクレオチドプライマーの５’配列と同一である配列をその３’末端に含むこと、
を含むこと、
を含んでなる上記キット。 - 更に第５オリゴヌクレオチドを含んでなり、これは、５’から３’の順序で、
（ｉ）６〜３０ヌクレオチドの第１ヌクレオチド配列、ここで、第１ヌクレオチド配列中のヌクレオチドは、分子エネルギー転移ペアの供与成分および受容成分よりなる群から選ばれる第１成分で標識されており、供与成分は、励起されると１以上の特定の波長のエネルギーを放出し、受容成分は供与成分により放出された１以上の特定の波長のエネルギーを吸収すること、
（ｉｉ）３〜２０ヌクレオチドの一本鎖第２ヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）６〜３０ヌクレオチドの第３ヌクレオチド配列、ここで、第３ヌクレオチド配列中のヌクレオチドは、供与成分および受容成分よりなる群から選ばれる第２成分で標識されており、第２成分は、第１ヌクレオチド配列を標識していない上記群のメンバーであり、第３ヌクレオチド配列は、第１ヌクレオチド配列と第３ヌクレオチド配列との間で二本鎖を形成するのに十分な程度に逆の順序で第１ヌクレオチド配列に相補的であり、そのため、第１成分と第２成分とは十分に接近していて、供与成分が励起されてエネルギーを放出すると、受容成分は供与成分により放出されたエネルギーを吸収すること、
（ｉｖ）第３オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端における、１０〜２５ヌクレオチドの第４ヌクレオチド配列、ただし、これは、第２オリゴヌクレオチドプライマーの５’配列と同一である配列をその３’末端に含むこと、
を含むものである、請求項６３記載のキット。 - 第１同定配列または第２同定配列または両方の存在を判定するためのキットであって、１以上の容器中に、（ａ）オリゴヌクレオチドプライマー、ただし、そのうちの１以上は、ＭＥＴを引き起こしうる消光成分および蛍光成分で標識されたヘアピンプライマーであること、および、場合により、（ｂ）対照ＤＮＡ標的配列、（ｃ）増幅用の最適化バッファー、（ｄ）意図される増幅方法のための適当な酵素、例えば、ＰＣＲまたは三重増幅またはＳＤＡにはＤＮＡポリメラーゼ、あるいはＮＡＳＢＡには逆転写酵素、および（ｅ）増幅反応を実施するための１組の説明書、を含んでなるキット。
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