WO2009081967A1 - 標的核酸配列の増幅方法およびそれに用いるプローブ - Google Patents

標的核酸配列の増幅方法およびそれに用いるプローブ Download PDF

Info

Publication number
WO2009081967A1
WO2009081967A1 PCT/JP2008/073537 JP2008073537W WO2009081967A1 WO 2009081967 A1 WO2009081967 A1 WO 2009081967A1 JP 2008073537 W JP2008073537 W JP 2008073537W WO 2009081967 A1 WO2009081967 A1 WO 2009081967A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
probe
nucleic acid
amplification
temperature
double
Prior art date
Application number
PCT/JP2008/073537
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Mitsuharu Hirai
Satoshi Majima
Toshiya Hosomi
Original Assignee
Arkray, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Arkray, Inc. filed Critical Arkray, Inc.
Priority to EP08865229A priority Critical patent/EP2224017A4/en
Priority to US12/810,266 priority patent/US20100273173A1/en
Priority to JP2009522264A priority patent/JPWO2009081967A1/ja
Publication of WO2009081967A1 publication Critical patent/WO2009081967A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/107—Temperature of melting, i.e. Tm

Definitions

  • the present invention relates to a method for amplifying a target nucleic acid sequence in the presence of a probe and a probe used therefor.
  • the present invention also relates to a method for suppressing amplification inhibition of a target nucleic acid sequence in the presence of a probe, and a method for analyzing a target nucleic acid sequence.
  • Tm melting temperature
  • the absorbance is about 1.5 times the absorbance at the start of heating (absorbance of only double-stranded nucleic acids), thereby melting. It can be judged that it has been completed. Based on this phenomenon, the melting temperature Tm (° C.) is generally defined as the temperature at which the absorbance reaches 50% of the total increase in absorbance.
  • the single nucleotide polymorphism is caused by single base substitution (point mutation) at the detection target site. For this reason, in order to analyze what kind of polymorphism the detection target site is, it is necessary to determine the difference of one base. Therefore, in the above-described Tm analysis, this single base difference is analyzed by a difference in Tm value. This will be specifically described below.
  • the polymorphism in the detection target site is referred to as a mutant type and a wild type for convenience.
  • the Tm value is higher as the homology of the double-stranded nucleic acid is higher, and lower as the homology is lower. Therefore, for example, when a detection probe (hereinafter referred to as “mutant probe”) that is completely complementary to a target nucleic acid sequence including a mutant detection target site is designed, the mutant probe and the detection target site are mutated.
  • a Tm mut value of a double-stranded nucleic acid with a target sequence that is a type is higher than a Tm wild value of a double-stranded nucleic acid with a target sequence in which the mutant probe and the target site to be detected are a wild type; Become.
  • polymorphism can be analyzed as follows.
  • the Tm mut value and the Tm wild value when the mutant probe is used are determined in advance as evaluation criteria. Subsequently, a double-stranded nucleic acid is formed between the target nucleic acid sequence to be analyzed whose base of the detection target site is unknown and the mutant probe, and the formed double-stranded nucleic acid is subjected to a heat treatment, and the temperature rises. A signal value such as absorbance indicating the dissociation of the double-stranded nucleic acid is measured. Then, a melting curve showing the fluctuation of the signal value accompanying the temperature change is created, and it is confirmed whether a peak exists in any of the previously determined Tm mut value and Tm wild value.
  • the detection target site in the target nucleic acid sequence is a mutant polymorph.
  • the detection target site in the target nucleic acid sequence is a wild-type polymorphism. It can also be determined whether the polymorphism is homozygous or heterozygous.
  • wild-type probe when using a detection probe that is completely complementary to a target nucleic acid sequence including a wild-type detection target site (hereinafter referred to as “wild-type probe”), the wild-type probe and the detection target site are used as evaluation criteria.
  • the Tm wild value of a double-stranded nucleic acid with a target sequence that is a wild type and the Tm mut value of a double-stranded nucleic acid with a target sequence whose detection target site is a mutant type are set. , Can be judged in the same way.
  • the Tm wild value of a double-stranded nucleic acid between the wild-type probe and a target sequence whose detection target site is wild-type is the target sequence whose mutant type is the wild-type probe and detection target site.
  • a higher value than the Tm mut value of the double-stranded nucleic acid is a higher value than the Tm mut value of the double-stranded nucleic acid.
  • the target nucleic acid sequence is amplified in the presence of the detection probe, and the reaction solution after the amplification reaction As is, signal values are measured.
  • the step of separately adding the detection probe to the reaction solution after the amplification reaction can be omitted, so that simplification is possible.
  • a detection probe is added to the reaction solution in advance, for example, the sealed state of the reaction solution can be maintained, so that contamination can be prevented.
  • a probe is added to the reaction solution to perform Tm analysis, and an amplification reaction is performed in the presence of the probe, and the reaction solution is used for Tm analysis.
  • the latter method has the following problems. That is, even when using a target nucleic acid sequence whose polymorphism is known, i.e., a target nucleic acid sequence whose peak is known in which of Tm wild value and Tm mut value is used, it is difficult to discriminate because the peak is small, Or it is a problem that a peak is not seen.
  • an object of the present invention is to provide an amplification method capable of amplifying a target nucleic acid sequence even in the presence of a probe, a method for suppressing amplification inhibition by the probe, a method for analyzing a target nucleic acid sequence, and a probe used therefor To do.
  • the amplification method of the present invention is a method of amplifying a target nucleic acid sequence in a template nucleic acid in the presence of a probe, Amplifying the target nucleic acid sequence by an extension reaction from a primer in the presence of a probe capable of hybridizing to the target nucleic acid sequence;
  • a probe a probe having a melting temperature of a double-stranded nucleic acid formed from the probe and a complementary strand to the probe is equal to or lower than a reaction temperature of the extension reaction is used.
  • the target nucleic acid sequence is also referred to as a target sequence in the present invention.
  • the method for suppressing amplification inhibition according to the present invention is a method for suppressing amplification inhibition that suppresses the inhibition of amplification of the target nucleic acid sequence in the amplification of the target nucleic acid sequence in the template nucleic acid in the presence of the probe.
  • the amplification method is the amplification method of the present invention.
  • the analysis method of the present invention is a method for analyzing a target nucleic acid sequence using a probe capable of hybridizing to the target nucleic acid sequence, and includes the following steps (A) and (B).
  • (A) The step of amplifying the target nucleic acid sequence in the template nucleic acid in the presence of the probe by the amplification method of the present invention
  • (B) After the step (A), the temperature of the reaction solution in the step (A) is changed.
  • the probe of the present invention is a probe for use in the amplification method of the present invention, and when the double-stranded nucleic acid is formed with the probe and a complementary strand to the probe, the double-stranded nucleic acid
  • the probe is characterized in that the melting temperature of the probe is not higher than the reaction temperature of the extension reaction.
  • the inventors of the present invention conducted intensive studies to elucidate the cause of the above-described problems when performing an amplification reaction in the presence of a probe and performing a Tm analysis using the reaction solution.
  • the probe previously added to the reaction solution before the amplification reaction hybridizes to the template nucleic acid during the amplification reaction, for example, by inhibiting primer annealing or extension from the annealed primer.
  • amplification will not occur sufficiently despite the presence of the target sequence, and as a result it is difficult to detect the peak. It seems that there is a problem. Therefore, the present inventors have found that the above problem can be avoided by designing a probe whose Tm value and extension reaction temperature satisfy the above relationship. This is due to the following reasons.
  • the probe In polymorphism analysis using a probe, the probe is usually designed to specifically hybridize to a target sequence in order to improve analysis accuracy. In order to specifically hybridize the probe in this way, generally, a method of relatively increasing the length of the probe is taken. However, the longer the probe, the higher its Tm value (ie, the Tm value of a double-stranded nucleic acid consisting of a sequence completely complementary to the probe, for example). Is formed, the probe is difficult to dissociate from the template unless the temperature is higher.
  • the present inventors have found that the conventional problem that it is difficult to detect a peak is that a probe designed to specifically hybridize to a target nucleic acid for polymorphism Tm analysis after nucleic acid amplification is used for nucleic acid amplification. At that time, it was found that it hybridized with the template nucleic acid and inhibited the primer annealing and the extension reaction from the annealed primer.
  • the base sequence of the probe is changed to its Tm value, that is, the complementary strand to the probe (for example, a complete strand)
  • the present invention has been conceived by setting the base sequence in which the Tm value of a double-stranded nucleic acid (complementary strand) is equal to or lower than the extension reaction temperature. According to the present invention, even when the target sequence is amplified in the presence of the probe, the probe is difficult to hybridize to the template nucleic acid at the reaction temperature of the extension reaction. For this reason, the nucleic acid amplification of the target sequence is hardly inhibited by the probe.
  • the annealing of the primer to the template nucleic acid or the extension reaction from the primer is difficult to inhibit. As a result, the amplification of the target sequence is prevented. Can be sufficiently performed.
  • the Tm value of a complementary strand that is completely complementary to the probe and the Tm value of a complementary strand that differs from the probe only by one base are higher in the former, and thus, conventionally, only one base is used. It is considered that target sequences that are completely complementary are more susceptible to the influence of the probe than target sequences that differ.
  • the probe of the present invention such a problem can be avoided. For example, as described above, even with a heterozygous template nucleic acid, the same amplification efficiency can be realized.
  • the peak in the Tm analysis can be detected. Therefore, according to the present invention, for example, in Tm analysis, the presence or absence of a peak can be determined with higher reliability than in the past. Therefore, the present invention can be said to be a very useful technique particularly in the field of gene analysis.
  • the problems given to Tm analysis when nucleic acid amplification is performed in the presence of a probe and the cause thereof are findings obtained by the present inventors for the first time.
  • the probe in order to specifically hybridize the probe to the target sequence, the probe may be set to a relatively high Tm value, but the probe gives nucleic acid amplification as in the present invention.
  • the present invention is the first to design a probe from the temperature relationship between the Tm value and the extension reaction.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of Tm analysis in a comparative example.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of Tm analysis in the example of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of Tm analysis in the example of the present invention.
  • the amplification method of the present invention is a method of amplifying a target nucleic acid sequence in a template nucleic acid in the presence of a probe, wherein the target nucleic acid sequence is amplified by an extension reaction from a primer in the presence of the probe.
  • the probe of the present invention that is, a probe whose melting temperature of a double-stranded nucleic acid formed from the probe and a complementary strand to the probe is lower than the reaction temperature of the extension reaction, is used. To do.
  • the probe used in the present invention is hereinafter referred to as the probe of the present invention.
  • the probe is preferably a probe whose melting temperature of a double-stranded nucleic acid formed from the probe and a completely complementary strand to the probe is equal to or lower than the reaction temperature of the extension reaction. .
  • the amplification method of the present invention is characterized by using a probe that satisfies the above conditions, and the type and conditions of the nucleic acid amplification method are not limited at all.
  • the probe and the above-mentioned The melting temperature of the double-stranded nucleic acid formed from the perfect complementary strand to the probe is equal to or lower than the reaction temperature of the extension reaction ”. That is, the “completely complementary strand” is a condition for specifying the nature of the probe to be used, and the probe forms a double-stranded nucleic acid with the completely complementary strand in use. Is not a condition.
  • the present invention does not require, for example, a step of forming a double-stranded nucleic acid from the probe and a completely complementary strand to the primer.
  • the target to which the probe hybridizes is a complete complementary strand to the probe.
  • the probe may be hybridized to a complementary strand having a mismatch of one base or several bases.
  • perfect match means that the probe is perfectly complementary to the probe
  • perfect match complementary strand means a complementary strand that perfectly matches the probe, and the probe and the perfect match complementary strand.
  • Tm Per value The double-stranded nucleic acid formed from the “perfect match double-stranded nucleic acid” is referred to as “Tm Per value”.
  • mismatch means that the probe is completely complementary except for one base (or a plurality of bases)
  • mismatch complementary strand means a complementary strand mismatching with the probe, and the probe and the mismatch complementary strand.
  • the sequence amplified by the nucleic acid amplification method may be a target sequence and a sequence complementary thereto, or may be a sequence consisting of a region containing the target sequence and a sequence complementary thereto. .
  • the probe of the present invention may be any probe as long as the relationship between the Tm Per value of the perfect match and the extension reaction temperature satisfies “Tm Per value ⁇ extension reaction temperature (° C.)”.
  • the number is not limited at all.
  • Nucleic acid amplification usually includes three steps: melting of double-stranded nucleic acid (dissociation into single-stranded nucleic acid), annealing of primer to single-stranded nucleic acid, and extension of complementary strand from the annealed primer. It is.
  • the extension reaction is premised on annealing, and in nucleic acid amplification, for example, the annealing temperature and the extension reaction are generally set to the same temperature. In this case, the “elongation reaction temperature” in the present invention can be replaced with, for example, an annealing temperature.
  • the base sequence of the probe of the present invention can be designed so that the Tm value is equal to or lower than the extension reaction temperature.
  • the probe design method considering the Tm value is not particularly limited, and a conventionally known method can be adopted.
  • the sequence and Tm value of the probe can be determined by, for example, the conventionally known MELTCALC software (http://www.meltcalc.com/) or the nearest base method (Nearest Neighbor Method).
  • MELTCALC software http://www.meltcalc.com/
  • the nearest base method Nearest Neighbor Method
  • the probe of the present invention determines the base sequence according to the extension reaction temperature as described above, and sets the extension reaction temperature according to the Tm Per value of the probe. Conditions may be provided. That is, in the probe of the present invention, it is only necessary that the Tm Per value and the extension reaction temperature of the probe finally satisfy the equation “Tm Per value ⁇ the extension reaction temperature”. Either the base sequence of the probe or the extension reaction temperature may be adjusted.
  • the Tm Per value of the double-stranded nucleic acid formed from the probe and the perfect match complementary strand only needs to satisfy “Tm Per value ⁇ extension reaction temperature (° C.)”.
  • the difference between the Tm Per value and the extension reaction temperature is, for example, 0 ° C. or more (about 0 ° C. or more), and the upper limit is not particularly limited, but for example, preferably 0 to 30 ° C., more preferably 0 to 20 ° C, more preferably 0 to 10 ° C, particularly preferably 0 to 2 ° C.
  • the probe of the present invention comprises a Tm Per value of a double stranded nucleic acid formed from the probe and the perfect match complementary strand, and a Tm Mis value of a double stranded nucleic acid formed from the probe and the mismatch complementary strand. Is preferably 1 ° C. or higher (about 1 ° C. or higher), more preferably 3 ° C. or higher (about 3 ° C. or higher), and particularly preferably 5 ° C. or higher (about 5 ° C.
  • the length of the probe is not particularly limited.
  • the probe is preferably a relatively long sequence because it can specifically hybridize with a target sequence.
  • the length is, for example, 5 to 50 bases, preferably 10 to 30 bases.
  • the probe of the present invention may be, for example, an unlabeled probe or a labeled probe labeled with a labeling substance, and the labeled probe is particularly preferable.
  • the signal of the labeling substance is measured as a signal value indicating the melting state of the double-stranded nucleic acid between the amplification product and the probe. Can do.
  • the labeling substance examples include fluorescent substances such as fluorescent dyes and fluorophores.
  • a probe that is labeled with the fluorescent substance exhibits fluorescence alone, and decreases in fluorescence (for example, quenching) by hybridization is preferable.
  • a probe using such a fluorescence quenching phenomenon is generally called a fluorescence quenching probe.
  • the probe the 3 ′ end or 5 ′ end of the polynucleotide is preferably labeled with a fluorescent substance, and the base at the end to be labeled is preferably C.
  • the base that is paired with the terminal base C of the labeled probe or the base that is 1 to 3 bases away from the paired base is G. It is preferable to design the base sequence of the labeled probe.
  • a probe is generally called a guanine quenching probe and is known as a so-called QProbe (registered trademark).
  • QProbe registered trademark
  • the fluorescent substance is not particularly limited, and examples thereof include fluorescent dyes such as fluorescein, phosphor, rhodamine, and polymethine dye derivatives.
  • fluorescent dyes such as fluorescein, phosphor, rhodamine, and polymethine dye derivatives.
  • commercially available fluorescent substances include BODIPY FL (trademark, manufactured by Molecular Probe Co., Ltd.). ), FluorePrime (trade name, manufactured by Amersham Pharmacia), Fluoredite (trade name, manufactured by Millipore), FAM (manufactured by ABI), Cy3 and Cy5 (manufactured by Amersham Pharmacia), TAMRA (manufactured by Molecular Probes), etc. Pigments.
  • each probe When using two or more kinds of probes of the present invention in one reaction system, for example, it is preferable to label each probe with a different fluorescent substance (fluorescent substance detected at different wavelengths).
  • the combination of the fluorescent substances is not particularly limited as long as it can be detected under different conditions. For example, Pacific Blue (detection wavelength 450 to 480 nm), TAMRA (detection wavelength 585 to 700 nm) and BODIPY FL (detection wavelength 515 to 555 nm) ) And the like.
  • a labeled probe in which a fluorescent dye is labeled at the 5 ′ end may be added with a phosphate group at the 3 ′ end in order to prevent the probe itself from extending in an amplification reaction, for example. Good.
  • the nucleic acid amplification method is not particularly limited, and for example, PCR (Polymerase Chain Reaction) method, NASBA (Nucleic acid sequence based amplification) method, TMA (Transcription-mediated amplification) method, SDA (Strand Displacement Amplification).
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • NASBA Nucleic acid sequence based amplification
  • TMA Transcription-mediated amplification
  • SDA String Displacement Amplification
  • the PCR method is preferable.
  • the present invention will be described by taking the PCR method as an example, but the present invention is not limited thereto.
  • the sample to which the present invention is applied is not particularly limited as long as it contains a nucleic acid serving as a template, for example.
  • Specific examples include, for example, whole blood, oral cells (eg, oral mucosa), somatic cells such as nails and hair, germ cells, sputum, amniotic fluid, paraffin-embedded tissue, urine, gastric juice (eg, gastric lavage fluid), etc. And suspensions thereof.
  • the sample addition ratio in the reaction solution for nucleic acid amplification is not particularly limited.
  • the lower limit of the addition ratio in the reaction solution is preferably 0.01% by volume or more, and more preferably 0.05% by volume. % Or more, more preferably 0.1% by volume or more.
  • the upper limit of the addition ratio is not particularly limited, but is preferably 2% by volume or less, more preferably 1% by volume or less, and still more preferably 0.5% by volume or less.
  • the addition ratio of a biological sample such as a whole blood sample in the reaction solution is For example, it is preferably set to 0.1 to 0.5% by volume.
  • heat treatment is usually performed for nucleic acid denaturation (dissociation into single-stranded nucleic acid), but this heat treatment denatures sugars and proteins contained in the sample, resulting in insoluble precipitates and turbidity. Etc. may occur.
  • the occurrence of such a precipitate or turbidity may affect the measurement accuracy.
  • the addition ratio of the whole blood sample in the reaction solution is set within the above-mentioned range, the mechanism is unknown.
  • Measurement accuracy by the method can be improved.
  • the inhibition of PCR by contaminants in the whole blood sample is sufficiently suppressed, the amplification efficiency can be further improved.
  • the ratio of the whole blood sample in the reaction solution is expressed not by the volume ratio (for example, 0.1 to 0.5% by volume) as described above but by the weight ratio of hemoglobin (hereinafter referred to as “Hb”). You can also.
  • the ratio of the whole blood sample in the reaction solution is preferably, for example, in the range of 0.565 to 113 g / L, more preferably in the range of 2.825 to 56.5 g / L, in terms of Hb amount. More preferably, it is in the range of 5.65 to 28.25 g / L.
  • the addition ratio of the whole blood sample in the reaction solution may satisfy, for example, both the volume ratio and the Hb weight ratio, or may satisfy either one.
  • the whole blood may be any of hemolyzed whole blood, unhemolyzed whole blood, anticoagulated whole blood, whole blood containing a coagulated fraction, and the like.
  • the template nucleic acid contained in the sample is, for example, DNA.
  • the DNA may be DNA originally contained in a sample such as a biological sample, or may be amplification product DNA amplified by nucleic acid amplification. In the latter case, cDNA generated by reverse transcription reaction from RNA (total RNA, mRNA, etc.) originally contained in the sample can be mentioned.
  • albumin it is preferable to add albumin to the reaction solution prior to the start of nucleic acid amplification.
  • albumin for example, it is possible to further reduce the influence due to the occurrence of precipitates and turbidity as described above, and to further improve the amplification efficiency.
  • the addition ratio of albumin in the reaction solution is, for example, in the range of 0.01 to 2% by weight, preferably 0.1 to 1% by weight, more preferably 0.2 to 0.8% by weight.
  • the albumin is not particularly limited, and examples thereof include bovine serum albumin (BSA), human serum albumin, rat serum albumin, horse serum albumin and the like. Any one of these may be used, or two or more may be used in combination. May be.
  • the target nucleic acid is amplified by PCR using DNA as a template nucleic acid and a primer for amplifying the target nucleic acid in the presence of the probe of the whole blood sample.
  • PCR PCR
  • a primer for amplifying the target nucleic acid in the presence of the probe of the whole blood sample An example will be described.
  • the present invention is characterized by using the probe of the present invention, and other configurations and conditions are not limited at all.
  • a PCR reaction solution is prepared.
  • the addition ratio of the probe in the reaction solution is not particularly limited, but for example, it is preferably added to the reaction solution so as to be in the range of 10 to 400 nmol / L, more preferably 20 to 200 nmol / L.
  • a fluorescent substance is used as a probe label
  • an unlabeled probe having the same sequence as the labeled probe may be used in combination.
  • Phosphoric acid may be added to the 3 ′ end.
  • the molar ratio of labeled probe to unlabeled probe is preferably, for example, 1:10 to 10: 1.
  • the addition ratio of the primer in the reaction solution is not particularly limited, but for example, it is preferably added to be 0.1 to 2 ⁇ mol / L, more preferably 0.25 to 1.5 ⁇ mol / L, and particularly 0.5 to 1 ⁇ mol / L is preferred.
  • a primer a pair of primer set which consists of a forward primer and a reverse primer can be used, In this case, it is preferable to add both primers in the above-mentioned range.
  • the addition ratio (molar ratio F: R) of the forward primer (F) and the reverse primer (R) is not particularly limited, but is preferably 1: 0.25 to 1: 4, and more preferably 1: 0. 5 to 1: 2.
  • the primer and the primer set may be, for example, one type or two or more types.
  • the primer to be used can be appropriately used depending on the number of target sequences to be amplified in one reaction solution, for example.
  • the ratio of the whole blood sample in the reaction solution is not particularly limited, but the above-mentioned range is preferable.
  • the whole blood sample may be added to the reaction solution as it is, or may be diluted with a solvent such as water or a buffer solution in advance and then added to the reaction solution.
  • the dilution rate is not particularly limited.
  • the final whole blood addition ratio in the reaction solution can be set to fall within the above range, but is, for example, 100 to 2000 times. Preferably, it is 200 to 1000 times.
  • composition components in the reaction solution are not particularly limited, and examples thereof include conventionally known components, and their ratios are not particularly limited.
  • the composition component include DNA polymerase, nucleotide (nucleoside triphosphate (dNTP)), and solvent.
  • the reaction solution preferably further contains albumin.
  • the addition order of each composition component is not restrict
  • the DNA polymerase is not particularly limited, and for example, a conventionally known heat-resistant bacterium-derived polymerase can be used. Specific examples include DNA polymerase derived from Thermus aquaticus (US Pat. Nos. 4,889,818 and 5,079,352) (trade name Taq polymerase), Thermus thermophilus ( Thermus thermophilus ).
  • DNA polymerase (WO 91/09950) (rTth DNA polymerase), Pyrococcus furiosus DNA polymerase (WO 92/9689) (manufactured by Stratagene), Thermococcus litoralis ( Thermococcus ) DNA polymerase (EP-A 455 430) (Trademark: Vent: New England Biolabs), derived from Thermococcus kodakaraensis DNA polymerase (trade name KOD DNA polymerase) and the like are commercially available. Among them, thermostable DNA polymerase derived from Thermus aquaticus is preferable.
  • the addition rate of DNA polymerase in the reaction solution is not particularly limited, but is, for example, 1 to 100 U / mL, preferably 5 to 50 U / mL, and more preferably 20 to 30 U / mL.
  • the activity unit (U) of DNA polymerase is generally an activity that incorporates 10 nmol of all nucleotides into an acid-insoluble precipitate in an activity measurement reaction solution at 74 ° C. for 30 minutes using activated salmon sperm DNA as a template primer. Is 1U.
  • the composition of the reaction liquid for activity measurement is, for example, 25 mmol / L TAPS buffer (pH 9.3, 25 ° C.), 50 mmol / L KCl, 2 mmol / L MgCl 2 , 1 mmol / L mercaptoethanol, 200 ⁇ mol / L dATP, 200 ⁇ mol / L dGTP, 200 ⁇ mol / L dTTP, 100 ⁇ mol / L [ ⁇ - 32 P] dCTP, 0.25 mg / mL activated salmon sperm DNA.
  • nucleoside triphosphate usually include dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, and / or dUTP).
  • dNTP dATP, dCTP, dGTP, dTTP, and / or dUTP.
  • the addition rate of dNTP in the reaction solution is not particularly limited, but is, for example, 0.01 to 1 mmol / L, preferably 0.05 to 0.5 mmol / L, more preferably 0.1 to 0. .3 mmol / L.
  • solvent examples include buffer solutions such as Tris-HCl, Tricine, MES, MOPS, HEPES, and CAPS, and commercially available buffer solutions for PCR and commercially available PCR kits can be used.
  • the PCR reaction solution may further contain glycerol, heparin, betaine, KCl, MgCl 2 , MgSO 4 , DMSO, etc., and the addition ratio thereof may be set within a range that does not inhibit the PCR reaction, for example. That's fine.
  • the total volume of the reaction solution is not particularly limited and can be appropriately determined depending on, for example, the equipment (thermal cycler) to be used, a container such as a tube or a chip, and is usually 1 to 500 ⁇ L, preferably 10 ⁇ 100 ⁇ L.
  • PCR is performed.
  • PCR usually involves three steps: (1) dissociation of double-stranded nucleic acid into single-stranded nucleic acid, (2) annealing of primer to single-stranded nucleic acid, and (3) extension of annealed primer (polymerase reaction).
  • the temperature condition in each step is not particularly limited as long as the extension reaction temperature in (3) is equal to or higher than the Tm Per value of the probe as described above.
  • the dissociation step (1) is, for example, 1 to 120 seconds at 90 to 99 ° C., preferably 1 to 60 seconds at 92 to 95 ° C.
  • the annealing step (2) is, for example, 1 at 40 to 70 ° C. -300 seconds, preferably 50-70 ° C. for 5-60 seconds
  • the extension step (3) is, for example, conditions of 50-80 ° C., 1-300 seconds, preferably 50-75 ° C., 5-60 seconds However, it is not limited to this.
  • the number of PCR cycles is not particularly limited, but is preferably, for example, 30 cycles or more, and the upper limit is not particularly limited.
  • the total number is 100 cycles or less, preferably 70 cycles or less, and more preferably 50 cycles or less.
  • the target sequence can be amplified in the presence of the probe of the present invention.
  • the target sequence since the annealing of the primer to the template nucleic acid and the extension from the annealed primer are difficult to be inhibited by the probe, the target sequence has a complementary strand of a perfect match and a complementary complement of the probe. Even if it contains any of the strands, it is possible to amplify with higher efficiency than before.
  • the amplification method of the present invention can also be said to be a method for producing an amplified product of a target sequence.
  • the amplification method of the present invention may further include a step of detecting an amplification product of the target sequence obtained by the amplification reaction described above. Thereby, the presence or absence of the amplification product and the polymorphism in the target sequence can also be detected.
  • the one form is demonstrated below as a target sequence analysis method of the present invention.
  • the target sequence analysis method of the present invention is a method for analyzing a target nucleic acid sequence using a probe capable of hybridizing to the target nucleic acid sequence, and includes the following steps (A) and (B): It is characterized by.
  • the target sequence analysis method of the present invention for example, presence / absence of amplification of the target sequence, discrimination of polymorphism in the target sequence, and the like can be performed.
  • the analysis method of the present invention is characterized in that the target sequence is amplified by the amplification method of the present invention, that is, the target sequence is amplified in the presence of the probe of the present invention. Etc. are not limited at all.
  • the target sequence analysis method of the present invention preferably further includes the following step (C).
  • step (C) A step of analyzing the target sequence from a change in the signal value accompanying a temperature change
  • the step (C) is preferably a melting curve analysis using a melting curve representing a change in signal value accompanying a temperature change.
  • the melting curve is generally a graph showing the relationship between each temperature and a signal value indicating the melting state of the sample or a differential value of the signal value (hereinafter referred to as “signal differential value”).
  • signal differential value a signal value indicating the melting state of the sample or a differential value of the signal value.
  • the melting curve is preferably a graph showing the relationship between the temperature and the signal differential value because the amount of change in signal is easy to judge.
  • the signal differential value may be represented by “dF / dT” or “ ⁇ dF / dT”, for example.
  • dF represents the amount of change in signal value
  • dT represents the amount of change in temperature.
  • the melting curve in which the signal differential value is represented by “dF / dT” has a valley-shaped peak, and the signal differential value is represented by “ ⁇ dF / dT”. In the curve, the peak has a mountain shape.
  • the peak is a mountain shape, and the melting curve in which the signal differential value is represented by “ ⁇ dF / dT”.
  • the peak is valley-shaped.
  • the signal may be generated by, for example, non-melting of the sample, and may be suppressed by melting of the sample. Conversely, the signal may be suppressed by non-melting of the sample and generated by melting of the sample. There may be. Whether the signal is generated by melting or non-melting of the sample, and when the signal differential value is expressed by any of the above formulas, the peak size is evaluated by the absolute value of the signal differential value. Is possible.
  • the target sequence is a sequence having a detection target site that causes the polymorphism
  • the probe of the present invention is complementary to this. It becomes an array.
  • part of the said target sequence can be analyzed from the fluctuation
  • the probe is a mutant probe, if a peak is detected in the vicinity of the Tm Per value (that is, the Tm mut value), the polymorphism is a mutant type, and the peak is in the vicinity of the Tm Mis value (that is, the Tm wild value).
  • the polymorphism can be determined as a wild type. Further, if a peak is detected only in one Tm value, it can be determined as a homozygous polymorphism, and if a peak is detected in both Tm values, it can be determined as a heterozygous polymorphism.
  • polymorphisms in the detection target site are referred to as a mutant type and a wild type, but this is for convenience and does not limit the present invention.
  • the signal value indicating the melting state of the double-stranded nucleic acid between the amplification product and the probe may be measured by measuring the absorbance at 260 nm as described above, or by measuring the signal of the labeling substance.
  • the former is preferably employed, for example, when the probe of the present invention is an unlabeled probe.
  • the latter is preferably employed, for example, when the probe of the present invention is a labeled probe labeled with a labeling substance.
  • the labeled probe include a labeled probe that shows a signal alone and does not show a signal by hybridization, or a labeled probe that does not show a signal alone and shows a signal by hybridization.
  • two or more target sequences can be analyzed in the same reaction solution, or polymorphisms of two or more detection target sites in one target sequence can be analyzed.
  • two or more kinds of probes of the present invention may be added to the nucleic acid amplification reaction solution in the step (A) according to the target sequence to be analyzed and the site to be detected.
  • each is labeled with a different labeling substance that can be detected under different conditions.
  • a PCR reaction solution containing a labeled probe and a primer for amplifying the target sequence is prepared, PCR is performed, and the target sequence is amplified.
  • the reaction solution includes, for example, a sample containing the probe, primer, DNA polymerase, dNTP and template nucleic acid of the present invention.
  • the reaction solution may contain various additives that can be used for nucleic acid amplification.
  • dissociation of the obtained amplification product for example, dissociation into single-stranded nucleic acid such as double-stranded DNA
  • dissociated single-stranded nucleic acid and the labeled probe Hybridize with This can be performed, for example, by changing the temperature of the reaction solution.
  • the heating temperature in the dissociation step is not particularly limited as long as the amplification product can be dissociated, and is, for example, 85 to 95 ° C.
  • the heating time is not particularly limited, but is usually 1 second to 10 minutes, preferably 1 second to 5 minutes.
  • Hybridization of the dissociated single-stranded nucleic acid and the labeled probe can be performed, for example, by lowering the heating temperature in the dissociation step after the dissociation step.
  • the temperature condition is not particularly limited, but it is preferably lower than the Tm Per value of the labeled probe when confirming whether the target sequence is a perfect match for the probe. Moreover, when confirming whether a target sequence is a mismatch with respect to the said probe, and also confirming whether it is a perfect match or a mismatch, it is preferable that it is lower than Tm Mis value.
  • the hybridization temperature is not particularly limited, but is generally 40 to 50 ° C., for example.
  • the temperature of the reaction solution is changed, and a signal value indicating the melting state of the hybridized product of the amplification product and the labeled probe is measured.
  • the reaction solution hybridized body of the single-stranded DNA and the labeled probe
  • a change in signal value accompanying a temperature rise is measured.
  • the fluorescence decreases (or quenches) in the hybridized state with the single-stranded DNA, and in the dissociated state. Emits fluorescence. Therefore, for example, the hybrid formed body in which the fluorescence is decreased (or quenched) may be gradually heated, and the increase in the fluorescence intensity accompanying the temperature increase may be measured.
  • the temperature range for measuring the fluctuation of the fluorescence intensity is not particularly limited.
  • the start temperature is room temperature to 85 ° C., preferably 25 to 70 ° C.
  • the end temperature is 40 to 105 ° C., for example. is there.
  • the rate of temperature increase is not particularly limited, but is, for example, 0.1 to 20 ° C./second, preferably 0.3 to 5 ° C./second.
  • the target sequence is analyzed from the fluctuation of the signal.
  • the Tm Per value and the Tm Mis value are determined in advance.
  • the amount of change in fluorescence intensity per unit time at each temperature is calculated from the obtained fluorescence intensity, and it is confirmed whether any of the Tm Per value and Tm Mis value shows the largest absolute value. .
  • a melting curve in which the temperature and “ ⁇ d fluorescence intensity increase / dT” are plotted is created, and a valley type that shows the lowest value in either of the Tm Per value and the Tm Mis value is prepared. Check if a peak exists.
  • either of the Tm Per value and the Tm Mis value has a mountain-shaped peak indicating the highest value. Check if it exists. As a result, if a peak is confirmed near the Tm Per value, it can be determined that the target sequence is a perfect match with the probe, and if a peak is confirmed near the Tm Mis value, the target sequence is It can be determined that there is a mismatch with the probe.
  • the perfect match is a variant for the polymorphism
  • the mismatch is the wild type for the polymorphism
  • the perfect match is A polymorphism can be determined to be a wild type, and a mismatch can be determined to be a mutant type.
  • fluorescence is emitted when hybridized with single-stranded DNA, and fluorescence is emitted when dissociated with a probe that reduces (or quenches) fluorescence. What is necessary is just to heat a hybrid body gradually and to measure the reduction
  • the present invention instead of the method of measuring the signal fluctuation accompanying the temperature rise by raising the temperature of the reaction solution containing the probe, for example, measuring the signal fluctuation at the time of hybridization. You may go. That is, when the hybrid is formed by lowering the temperature of the reaction solution containing the probe, the signal fluctuation accompanying the temperature drop may be measured.
  • a labeled probe for example, a guanine quenching probe
  • a labeled probe that shows a signal alone and does not show a signal by hybridization
  • the temperature of the reaction solution may be gradually decreased to measure the decrease in fluorescence intensity accompanying the temperature decrease.
  • a labeled probe that does not show a signal alone and shows a signal by hybridization it does not emit fluorescence when the single-stranded DNA and the probe are dissociated, but the hybrid is not released due to a decrease in temperature. Once formed, it will fluoresce. Therefore, for example, the temperature of the reaction solution may be gradually lowered and the increase in fluorescence intensity accompanying the temperature drop may be measured.
  • the method for suppressing amplification inhibition according to the present invention is a method for suppressing amplification inhibition that suppresses the inhibition of amplification of the target sequence in the amplification of the target sequence in the presence of a probe.
  • the method is the amplification method of the present invention.
  • the present invention is characterized in that in the amplification of a target sequence in the presence of a probe, the amplification method of the present invention is performed, that is, the target sequence is amplified in the presence of the probe of the present invention. There are no restrictions.
  • the present invention can be performed in the same manner as the amplification method of the present invention.
  • the probe of the present invention is a probe for use in the amplification method of the present invention or the amplification inhibition suppression method of the present invention, and is formed by two probes formed from the probe and a complementary strand to the probe.
  • the probe is characterized in that the melting temperature of the strand nucleic acid is a probe showing a temperature equal to or lower than the reaction temperature of the extension reaction. It is preferable that the probe has a melting temperature of a double-stranded nucleic acid formed from the probe and a completely complementary strand to the probe that is equal to or lower than the reaction temperature of the extension reaction. Specifically, it is as described in the amplification method of the present invention.
  • the probe of the present invention can be used in the suppression method, amplification method and analysis method of the present invention.
  • the amplification reagent of the present invention is a reagent for use in the amplification method, suppression method or analysis method of the present invention, and is characterized by including the probe of the present invention.
  • the amplification reagent of the present invention is not limited as long as it contains the probe of the present invention.
  • the amplification reagent of the present invention may further contain, for example, a primer for amplifying the target sequence, a polymerase such as DNA polymerase, dNTP and the like.
  • the form of the amplification reagent of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, a liquid reagent or a dry reagent suspended in a solvent before use. Further, the content of the probe of the present invention and other components such as the primer is not particularly limited.
  • the amplification reagent of the present invention may be, for example, an amplification kit. For example, each reagent may be contained in the same container or a separate container. The amplification kit preferably further includes instructions for use.
  • the probe designing method of the present invention is a method for designing a probe for use in a method for amplifying a target nucleic acid sequence in a template nucleic acid in the presence of a probe, the probe comprising the probe and a complementary strand to the probe.
  • the melting temperature of the double-stranded nucleic acid formed from is designed so as to be lower than the reaction temperature of the extension reaction.
  • the probe is preferably designed so that the melting temperature of the double-stranded nucleic acid formed from the probe and a completely complementary strand to the probe is lower than the reaction temperature of the extension reaction.
  • the design method of the present invention can be performed in the same manner as the method described in the amplification method of the present invention.
  • the present invention can also be referred to as a probe manufacturing method, and includes a step of designing a probe as described above.
  • the genome was purified from the blood of a subject exhibiting heterozygous polymorphism CYP2C9 * 3 using a kit (trade name: QIAamp DNA Mini kit; manufactured by QIAGEN).
  • the purified genome was diluted 1/10 (volume) with TE (10 mmol / L Tris-HCl, 1 mmol / L EDTA). 1 ⁇ L of this diluted purified genome was added to 49 ⁇ L of PCR reagent having the following composition, and PCR was performed using a thermal cycler. As PCR conditions, after treatment at 95 ° C. for 60 seconds, a double-strand dissociation treatment of 1 second and an extension reaction treatment of 15 seconds were repeated for 50 cycles.
  • the temperature of the dissociation treatment was 95 ° C.
  • the temperature of the extension reaction treatment (including annealing treatment) was a predetermined temperature (52 ° C., 58 ° C. or 60 ° C.).
  • the reaction solution is further treated at 95 ° C. for 1 second and at 40 ° C. for 60 seconds, followed by heating from 40 ° C. to 95 ° C. with a temperature increase rate of 1 ° C./3 seconds.
  • the change in fluorescence intensity over time was measured.
  • the measurement wavelength was 515 to 555 nm (detection of fluorescent dye BODIPY FL).
  • CYP2C9 * 3 F primer (SEQ ID NO: 1) 5'-gagcccctgcatgcaa-3 ' CYP2C9 * 3 R primer (SEQ ID NO: 2) 5'-gatactatgaatttggggacttcgaa-3 ' (Mutant detection probe) CYP2C9 * 3 probe (SEQ ID NO: 3) 5'-gggagaagGtcaAGgTatc- (BODIPY FL) -3 '
  • the Tm Per value of a hybrid (perfect match double strand) of a CYP2C9 * 3 probe for detecting a mutant type and a complementary strand perfectly complementary to the probe is 58 ° C.
  • the Tm Mis value of a hybrid (mismatched duplex) of the CYP2C9 * 3 probe and a complementary strand that is completely complementary to the probe except for one base of the detection target site is 53 ° C.
  • FIGS. These results are shown in FIGS. These graphs are graphs of melting curves showing changes in fluorescence intensity with increasing temperature, the differential value on the vertical axis indicates “ ⁇ d fluorescence intensity increase / dT” ( ⁇ dF / dT), and the horizontal axis on the horizontal axis. Indicates temperature.
  • FIG. 1 is a graph showing a melting curve when the PCR extension reaction temperature is set to 52 ° C.
  • FIG. 2 is a graph showing a melting curve when the extension reaction temperature is set to 58 ° C.
  • FIG. It is a graph which shows a melting curve at the time of setting the said extension reaction temperature to 60 degreeC.
  • the extension reaction temperature is 58 ° C.
  • the extension reaction temperature is In the case of 60 ° C.
  • the relationship between the Tm value of the perfect match duplex and the extension reaction temperature is “Tm Per value ⁇ extension reaction temperature”, which satisfies the conditions of the present invention.
  • the present invention even when the target sequence is amplified in the presence of the probe, the probe is difficult to hybridize to the template nucleic acid at the reaction temperature of the extension reaction. For this reason, the annealing of the primer to the template nucleic acid and the extension reaction from the primer are hardly inhibited by the probe, and as a result, the target sequence can be sufficiently amplified. Therefore, according to the present invention, for example, in Tm analysis, the presence or absence of a peak can be determined with higher reliability than in the past. Therefore, the present invention can be said to be a very useful technique particularly in the field of gene analysis.

Abstract

　プローブ存在下での核酸増幅において、増幅反応の阻害を抑制して標的配列を増幅する方法を提供する。標的配列の増幅の際、共存させるプローブとして、前記プローブと前記プローブに対する相補鎖との二本鎖核酸を形成させた際に、前記二本鎖核酸の融解温度が前記伸長反応の反応温度以下を示す塩基配列であるプローブを使用する。このようなプローブの存在下であれば、例えば、プライマーのアニーリングや伸長反応が、プローブの存在によって阻害され難く、標的配列の増幅を十分に行うことができる。このため、Ｔｍ解析等により標的配列における検出目的部位の多型を解析する際、高い信頼性を実現できる。

Description

標的核酸配列の増幅方法およびそれに用いるプローブ
　本発明は、プローブ存在下で標的核酸配列を増幅する方法およびそれに用いるプローブに関する。また、本発明は、プローブ存在下での標的核酸配列の増幅阻害の抑制方法、ならびに、標的核酸配列の解析方法に関する。
　近年、遺伝子の多型や変異を検出する方法として、標的核酸配列と検出用プローブとから形成される二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ：melting　temperature）を解析する方法が実用化されている。このような方法は、例えば、前記二本鎖の融解曲線の解析により行われることから融解曲線解析、または、Ｔｍ解析と呼ばれている。Ｔｍは、一般的に、以下のように定義されている。二本鎖ＤＮＡ等の二本鎖核酸を含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖核酸における両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖核酸に解離（核酸の融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖核酸が解離して一本鎖核酸になると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖核酸のみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍ（℃）とは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
　一塩基多型は、検出対象部位における一塩基の置換（点突然変異）によって生じている。このため、前記検出対象部位がどのような多型であるかを解析するには、一塩基の違いを判別することが必要となる。そこで、前述のＴｍ解析においては、この一塩基の違いをＴｍ値の違いによって分析している。以下に、具体的に説明する。なお、検出対象部位における多型を、便宜上、変異型および野生型と呼ぶ。
　Ｔｍ値は、二本鎖核酸の相同性が高い程高く、相同性が低い程低くなる。このため、例えば、変異型の検出対象部位を含む標的核酸配列に完全に相補的な検出用プローブ（以下、「変異型プローブ」という）を設計した場合、前記変異型プローブと検出対象部位が変異型である標的配列との二本鎖核酸のＴｍｍｕｔ値は、前記変異型プローブと検出対象部位が野生型である標的配列との二本鎖核酸のＴｍｗｉｌｄ値よりも高い値を示すこととなる。この性質を利用したＴｍ解析によれば、以下のようにして、多型を解析できる。まず、予め、評価基準として、前記変異型プローブを使用した場合の前記Ｔｍｍｕｔ値とＴｍｗｉｌｄ値とを決定しておく。続いて、検出対象部位の塩基が不明である分析対象の標的核酸配列と前記変異型プローブとの二本鎖核酸を形成させ、形成された二本鎖核酸に加熱処理を施し、温度上昇に伴う二本鎖核酸の解離を示す吸光度等のシグナル値を測定する。そして、温度変化に伴うシグナル値の変動を示す融解曲線を作成し、予め決定したＴｍｍｕｔ値およびＴｍｗｉｌｄ値のいずれにピークが存在するかを確認する。その結果、Ｔｍｍｕｔ値付近にピークが存在する場合、前記変異型プローブと１００％マッチしているため、標的核酸配列における検出対象部位は、変異型の多型であると判断できる。他方、Ｔｍｗｉｌｄ値付近にピークが存在する場合、前記変異型プローブと１塩基ミスマッチしているため、標的核酸配列における検出対象部位は、野生型の多型であると判断できる。また、多型が、ホモ接合性であるか、ヘテロ接合性であるかについても判断することができる。すなわち、一対の対立遺伝子における多型の分析の場合、Ｔｍｍｕｔ値付近とＴｍｗｉｌｄ値付近の両方にピークが存在する場合、ヘテロ接合性と判断でき、他方、Ｔｍｍｕｔ値付近にのみピークが存在する場合は、変異型のホモ接合性であり、Ｔｍｗｉｌｄ値付近にのみピークが存在する場合は、野生型のホモ接合性であると判断することができる。また、野生型の検出対象部位を含む標的核酸配列に完全に相補的な検出用プローブ（以下、「野生型プローブ」という）を使用する場合も、評価基準として、前記野生型プローブと検出対象部位が野生型である標的配列との二本鎖核酸のＴｍｗｉｌｄ値ならびに前記野生型プローブと検出対象部位が変異型である標的配列との二本鎖核酸のＴｍｍｕｔ値とを設定しておけば、同様に判断することができる。なお、野生型プローブの場合、前記野生型プローブと検出対象部位が野生型である標的配列との二本鎖核酸のＴｍｗｉｌｄ値は、前記野生型プローブと検出対象部位が変異型である標的配列との二本鎖核酸のＴｍｍｕｔ値よりも高い値を示すこととなる。
　そして、このようなＴｍ解析を利用した多型の解析方法においては、さらなる簡略化を図るべく、前記検出用プローブの存在下で前記標的核酸配列の増幅反応を行い、前記増幅反応後の反応液をそのまま用いて、シグナル値の測定が行われている。このような方法によれば、増幅反応の後に、前記反応液に前記検出用プローブを別途添加する工程を省略できるため、簡略化が可能となる。また、前記反応液に予め検出用プローブを添加しておけば、例えば、前記反応液の密閉状態を維持できるため、コンタミネーションの防止が可能である。
特開２００５－５８１０７号公報
　しかしながら、プローブの非存在下で増幅反応を行った後に、その反応液にプローブを添加してＴｍ解析を行う方法と、プローブの存在下で増幅反応を行い、その反応液を用いてＴｍ解析を行う方法とでは、例えば、鋳型核酸やプローブが同じであっても、後者の方法には、以下のような問題が生じるケースが見られることがわかった。すなわち、多型が既知の標的核酸配列、つまり、Ｔｍｗｉｌｄ値およびＴｍｍｕｔ値のいずれにピークが見られるかが既知である標的核酸配列を使用した場合でも、ピークが小さいために判別し難い、または、ピークが見られないという問題である。特に、ヘテロ接合性であることが既知のサンプルの場合、理論的には、Ｔｍｗｉｌｄ値およびＴｍｍｕｔ値のいずれにも同程度のピークが見られると考えられるが、実際には、前記プローブに完全に相補的な標的配列についてのピーク（例えば、変異型プローブを使用した場合、Ｔｍｍｕｔ値のピーク）が判断し難いというケースが見られる。
　そこで、本発明は、プローブの存在下であっても標的核酸配列を増幅できる増幅方法、前記プローブによる増幅阻害を抑制する方法ならびに標的核酸配列の解析方法、および、それに用いるプローブの提供を目的とする。
　前記目的を達成するために、本発明の増幅方法は、プローブ存在下で鋳型核酸における標的核酸配列を増幅する方法であって、
　前記標的核酸配列にハイブリダイズ可能なプローブの存在下、プライマーからの伸長反応により前記標的核酸配列を増幅する工程を含み、
　前記プローブとして、前記プローブと前記プローブに対する相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すプローブを使用することを特徴とする。本発明において、以下、標的核酸配列を標的配列ともいう。
　本発明の増幅阻害の抑制方法は、プローブ存在下での鋳型核酸における標的核酸配列の増幅において、前記標的核酸配列の増幅の阻害を抑制する増幅阻害の抑制方法であって、前記標的核酸配列の増幅方法が、本発明の増幅方法であることを特徴とする。
　本発明の解析方法は、標的核酸配列にハイブリダイズ可能なプローブを用いた前記標的核酸配列の解析方法であって、下記（Ａ）および（Ｂ）工程を有することを特徴とする。
（Ａ）本発明の増幅方法により、前記プローブの存在下、鋳型核酸における前記標的核酸配列の増幅を行う工程
（Ｂ）前記（Ａ）工程の後、前記（Ａ）工程の反応液の温度を変化させ、得られた増幅産物と前記プローブとの二本鎖核酸の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
　また、本発明のプローブは、前記本発明の増幅方法に使用するためのプローブであって、前記プローブと前記プローブに対する相補鎖との二本鎖核酸を形成させた際に、前記二本鎖核酸の融解温度が前記伸長反応の反応温度以下を示すプローブであることを特徴とする。
　本発明者らは、プローブの存在下で増幅反応を行い、その反応液を用いてＴｍ解析を行う場合に、前述のような問題が生じる原因を解明すべく、鋭意研究を行った。その結果、前記増幅反応前に予め反応液に添加しておいたプローブが、増幅反応時において、鋳型核酸にハイブリダイズしてしまい、例えば、プライマーのアニーリングやアニーリングしたプライマーからの伸長を阻害しているという可能性を見出すに到った。このように鋳型核酸へのプライマーのアニーリングやプライマーからの伸長が阻害されると、標的配列が存在するにもかかわらず、その増幅が十分に起こらないため、結果的に、ピークが検出し難いという問題が起こっていると考えられる。そこで、本発明者らは、そのＴｍ値と伸長反応温度とが前述の関係を満たすプローブを設計することで、前述の問題を回避できることを見出した。これは、以下のような理由による。
　プローブを用いた多型解析においては、解析精度を向上させるため、通常、標的配列に特異的にハイブリダイズするようにプローブが設計される。このようにプローブを特異的にハイブリダイズさせるためには、一般に、プローブの長さを相対的に長くするという手法がとられる。しかしながら、前記プローブが相対的に長いほど、そのＴｍ値（すなわち、例えば、前記プローブと完全に相補的な配列とからなる二本鎖核酸のＴｍ値）は相対的に高くなるため、二本鎖が形成されると、より高い温度でなければ鋳型からプローブが解離し難いこととなる。そこで、本発明者らは、ピークが検出し難いという従来の問題は、核酸増幅後の多型のＴｍ解析のために、標的核酸に特異的にハイブリダイズさせるべく設計したプローブが、核酸増幅の際に、鋳型核酸にハイブリダイズしてしまい、プライマーのアニーリングやアニーリングしたプライマーからの伸長反応を阻害していることを見出した。そこで、少なくとも核酸増幅における伸長反応の際に、プローブが鋳型核酸にハイブリダイズし難くなるように、プローブの塩基配列を、そのＴｍ値、すなわち、前記プローブと前記プローブに対する相補鎖（例えば、完全な相補鎖）との二本鎖核酸のＴｍ値が前記伸長反応温度以下を示す塩基配列とすることで、本発明に想到した。本発明によれば、プローブの存在下で標的配列の増幅を行っても、前記伸長反応の反応温度において、前記プローブが鋳型核酸にハイブリダイズし難い。このため、プローブによって、標的配列の核酸増幅が阻害され難く、具体的には、例えば、プライマーの鋳型核酸へのアニーリングや前記プライマーからの伸長反応が阻害され難く、結果として、前記標的配列の増幅を十分に行うことが可能となる。特に、前記プローブに完全に相補的な相補鎖とのＴｍ値と、前記プローブと一塩基のみが異なる相補鎖とのＴｍ値では、前者の方が高い値であるため、従来では、一塩基のみが異なる標的配列よりも完全に相補的な標的配列の方が、プローブによる影響を受け易いと考えられる。しかしながら、本発明のプローブによれば、そのような問題も回避されるため、例えば、前述のように、ヘテロ接合性の鋳型核酸であっても、同様の増幅効率を実現することが可能になり、Ｔｍ解析でのピークも同様に検出可能となる。したがって、本発明によれば、例えば、Ｔｍ解析において、従来よりもピークの有無を高い信頼性で判別することができる。このため、本発明は、特に、遺伝子解析の分野において、極めて有用な技術といえる。
　なお、プローブ存在下で核酸増幅を行った場合のＴｍ解析に与える問題やその原因は、本発明者らが初めて得た知見である。また、前述のように、プローブを標的配列に特異的にハイブリダイズさせるために、プローブのＴｍ値を相対的に高く設定することはあっても、本発明のように、プローブが核酸増幅に与える影響を回避するために、そのＴｍ値と伸長反応との温度関係からプローブを設計したのは、本発明が初めてである。
図１は、比較例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。 図２は、本発明の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。 図３は、本発明の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
＜増幅方法＞
　本発明の増幅方法は、前述のように、プローブ存在下で鋳型核酸における標的核酸配列を増幅する方法であって、前記プローブの存在下、プライマーからの伸長反応により前記標的核酸配列を増幅する工程を含み、
　前記プローブとして、本発明のプローブ、すなわち、前記プローブと前記プローブに対する相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すプローブを使用することを特徴とする。本発明において使用する前記プローブを、以下、本発明のプローブという。本発明の増幅方法において、前記プローブは、前記プローブと前記プローブに対する完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すプローブであることが好ましい。
　このように、本発明のプローブの存在下で核酸増幅反応を行うことによって、前述のように、例えば、鋳型核酸に対するプライマーのアニーリングや、アニーリングしたプライマーからの伸長の阻害を抑制して、標的配列の増幅を行うことができる。なお、本発明の増幅方法においては、前述の条件を満たすプローブを使用することが特徴であって、核酸増幅方法の種類や条件等は何ら制限されない。
　なお、本発明においては、使用するプローブを特定するために、前記プローブの性質として、前記プローブと前記プローブに対する完全な相補鎖との二本鎖核酸を形成させた場合に、「前記プローブと前記プローブに対する完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が前記伸長反応の反応温度以下を示す」と規定している。つまり、前記「完全な相補鎖」とは、あくまでも、使用するプローブの性質を特定するための条件であって、使用時において、前記プローブが、完全な相補鎖と二本鎖核酸を形成することを条件とするものではない。このように、本発明は、例えば、前記プローブと前記プライマーに対する完全相補鎖とから二本鎖核酸を形成させる工程を必須とするものではない。また、例えば、後述する標的核酸配列の解析方法等において、増幅反応後の増幅産物と前記プローブとの二本鎖を形成させる際、前記プローブがハイブリダイズする対象は、前記プローブに対する完全な相補鎖には制限されず、前記プローブは、１塩基または数塩基のミスマッチを有する相補鎖にハイブリダイズしてもよい。
　本発明においては、以下、前記プローブに対して完全に相補的であることを「パーフェクトマッチ」、前記プローブにパーフェクトマッチする相補鎖を「パーフェクトマッチ相補鎖」、前記プローブと前記パーフェクトマッチ相補鎖とから形成される二本鎖核酸を「パーフェクトマッチの二本鎖核酸」、前記パーフェクトマッチの二本鎖核酸のＴｍ値を「ＴｍＰｅｒ値」という。また、前記プローブに対して一塩基（または複数の塩基）を除き完全に相補的であることを「ミスマッチ」、前記プローブにミスマッチする相補鎖を「ミスマッチ相補鎖」、前記プローブと前記ミスマッチ相補鎖とから形成される二本鎖核酸を「ミスマッチの二本鎖核酸」、前記ミスマッチの二本鎖核酸のＴｍ値を「ＴｍＭｉｓ値」という。また、本発明において、核酸増幅方法により増幅させる配列は、標的配列およびそれに相補的な配列であってもよいし、前記標的配列を含む領域からなる配列およびそれに相補的な配列であってもよい。
　本発明のプローブは、例えば、前記パーフェクトマッチのＴｍＰｅｒ値と前記伸長反応温度との関係が、「ＴｍＰｅｒ値≦伸長反応温度（℃）」を満たすプローブであればよく、その塩基配列や塩基数は何ら制限されない。核酸増幅には、通常、二本鎖核酸の融解（一本鎖核酸への解離）、一本鎖核酸へのプライマーのアニーリング、および、アニーリングしたプライマーからの相補鎖の伸長反応という３ステップが含まれる。前記伸長反応は、アニーリングが前提であり、核酸増幅においては、例えば、アニーリング温度と伸長反応とは、同じ温度に設定されることが一般的である。この場合、本発明における「伸長反応温度」は、例えば、アニーリング温度に置き換えることも可能である。
　本発明のプローブは、例えば、伸長反応の反応温度が設定されている場合、Ｔｍ値が前記伸長反応温度以下となるように、その塩基配列を設計することができる。Ｔｍ値を考慮したプローブの設計方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。プローブの配列やＴｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（http://www.meltcalc.com/）や最近接塩基対法（Nearest　Neighbor　Method）等で決定することができる。このようなソフトウエア等を用いて設計したプローブについては、例えば、実際に行う核酸増幅の条件下で、ＴｍＰｅｒ値を確認することが好ましい。また、本発明のプローブは、例えば、前述のように伸長反応温度に応じて塩基配列を決定する他に、前記プローブのＴｍＰｅｒ値に応じて前記伸長反応温度を設定することで、本発明の条件を具備させてもよい。つまり、本発明のプローブは、最終的に、プローブのＴｍＰｅｒ値と伸長反応温度とが式「ＴｍＰｅｒ値≦伸長反応温度」を満たしていればよく、前記式を満たすための手法は、例えば、前記プローブの塩基配列の調整でも、伸長反応温度の調整のいずれであってもよい。
　前記プローブと前記パーフェクトマッチ相補鎖とから形成される二本鎖核酸のＴｍＰｅｒ値は、「ＴｍＰｅｒ値≦伸長反応温度（℃）」を満たしていればよい。ＴｍＰｅｒ値と伸長反応温度との差は、例えば、０℃以上（約０℃以上）であり、上限は特に制限されないが、例えば、好ましくは０～３０℃であり、より好ましくは０～２０℃であり、さらに好ましくは０～１０℃、特に好ましくは０～２℃である。
　前記プローブに対する前記ミスマッチ相補鎖の相同性は、前記パーフェクトマッチ相補鎖の相同性よりも低くなることから、ＴｍＭｉｓ値は、ＴｍＰｅｒ値よりも低くなる（ＴｍＭｉｓ値＜ＴｍＰｅｒ値≦伸長反応温度（℃））。本発明のプローブは、前記プローブと前記パーフェクトマッチ相補鎖とから形成される二本鎖核酸のＴｍＰｅｒ値と、前記プローブと前記ミスマッチ相補鎖とから形成される二本鎖核酸のＴｍＭｉｓ値との差は、例えば、１℃以上（約１℃以上）であることが好ましく、より好ましくは３℃以上（約３℃以上）であり、特に好ましくは５℃以上（約５℃以上）である。このように、ＴｍＰｅｒ値とＴｍＭｉｓ値との差を十分に設けることで、例えば、後述するような融解曲線を作成した際に、ＴｍＰｅｒ値のピークとＴｍＭｉｓ値のピークの判断が容易となり、解析精度もさらに向上する。
　前記プローブのＴｍＰｅｒ値と伸長反応温度とが前述の関係を満たしている限りにおいて、前記プローブの長さは、特に制限されない。前記プローブは、例えば、標的配列により特異的にハイブリダイズできることから、相対的に長い配列であることが好ましい。前記長さとしては、例えば、５～５０塩基であり、好ましくは１０～３０塩基である。
　本発明のプローブは、例えば、未標識のプローブでもよいし、標識物質で標識化された標識化プローブでもよく、特に、前記標識化プローブが好ましい。このような標識化プローブによれば、例えば、後述する標的配列の解析方法において、前記増幅産物と前記プローブとの二本鎖核酸の融解状態を示すシグナル値として、標識物質のシグナルを測定することができる。
　前記標識物質としては、例えば、蛍光色素、蛍光団等の蛍光物質があげられる。前記標識化プローブの具体例としては、例えば、前記蛍光物質で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような蛍光消光現象（Quenching　phenomenon）を利用したプローブは、一般に、蛍光消光プローブと呼ばれる。中でも、前記プローブとしては、ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端が蛍光物質で標識化されていることが好ましく、標識化される前記末端の塩基は、Ｃであることが好ましい。この場合、前記標識化プローブがハイブリダイズする塩基配列において、前記標識化プローブの末端塩基Ｃと対をなす塩基もしくは前記対をなす塩基から１塩基～３塩基離れた塩基がＧとなるように、前記標識化プローブの塩基配列を設計することが好ましい。このようなプローブは、一般的にグアニン消光プローブと呼ばれ、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。このようなグアニン消光プローブが塩基配列にハイブリダイズすると、蛍光物質で標識化された末端のＣが、前記塩基配列におけるＧに近づくことによって、前記蛍光物質の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
　前記蛍光物質としては、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等の蛍光色素があげられ、市販の蛍光物質としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ　ＦＬ（商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(モレキュラープローブ社製)等の蛍光色素があげられる。
　本発明のプローブを１つの反応系において２種類以上使用する際には、例えば、各プローブを、異なる蛍光物質（異なる波長で検出される蛍光物質）で標識化することが好ましい。前記蛍光物質の組み合わせは、例えば、異なる条件で検出できればよく、特に制限されないが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｌｕｅ（検出波長４５０～４８０ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ（検出波長５８５～７００ｎｍ）およびＢＯＤＩＰＹ　ＦＬ（検出波長５１５～５５５ｎｍ）の組み合わせ等があげられる。
　また、５’末端に蛍光色素を標識化した標識化プローブは、例えば、増幅反応において、プローブ自体が伸長することを予防するために、その３’末端に、さらにリン酸基が付加されてもよい。
　本発明において、前記核酸増幅方法としては、特に制限されず、例えば、ＰＣＲ（Polymerase　Chain　Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic　acid　sequence　based　amplification）法、ＴＭＡ（Transcription－mediated　amplification）法、ＳＤＡ（Strand　Displacement　Amplification）法等があげられ、中でも、ＰＣＲ法が好ましい。以下、ＰＣＲ法を例にあげて、本発明を説明するが、これには制限されない。
　本発明を適用する試料としては、例えば、鋳型となる核酸を含んでいればよく、特に制限されない。具体例としては、例えば、全血、口腔内細胞（例えば、口腔粘膜）、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液（例えば、胃洗浄液）等や、それらの懸濁液等があげられる。
　核酸増幅の反応液における試料の添加割合は、特に制限されない。具体例として、前記試料が生体試料（例えば、全血試料）の場合、前記反応液における添加割合の下限が、例えば、０．０１体積％以上であることが好ましく、より好ましくは０．０５体積％以上、さらに好ましくは０．１体積％以上である。また、前記添加割合の上限も、特に制限されないが、例えば、２体積％以下が好ましく、より好ましくは１体積％以下、さらに好ましくは０．５体積％以下である。
　また、後述するように、核酸増幅の反応液について光学的検出を行う場合、特に、標識化プローブを用いた光学的検出を行う場合、前記反応液における全血試料等の生体試料の添加割合は、例えば、０．１～０．５体積％に設定することが好ましい。ＰＣＲ反応においては、通常、核酸変性（一本鎖核酸への解離）のために熱処理が施されるが、この熱処理によって、試料に含まれる糖やタンパク質等が変性し、不溶性の沈殿物や濁り等が発生するおそれがある。このため、増幅産物の有無や多型を光学的手法により確認する場合、このような沈殿物や濁りの発生が、測定精度に影響を及ぼす可能性がある。しかしながら、反応液における全血試料の添加割合を前述の範囲に設定すれば、メカニズムは不明であるが、例えば、変性による沈殿物等の発生による影響を十分に防止することができるため、光学的手法による測定精度を向上できる。また、全血試料中の夾雑物によるＰＣＲの阻害も十分に抑制されるため、増幅効率をより一層向上することができる。
　また、前記反応液中の全血試料の割合は、前述のような体積割合（例えば、０．１～０．５体積％）ではなく、ヘモグロビン（以下、「Ｈｂ」という）の重量割合で表すこともできる。この場合、前記反応液における全血試料の割合は、Ｈｂ量に換算して、例えば、０．５６５～１１３ｇ／Ｌの範囲が好ましく、より好ましくは２．８２５～５６．５ｇ／Ｌの範囲、さらに好ましくは５．６５～２８．２５ｇ／Ｌの範囲である。なお、前記反応液中における全血試料の添加割合は、例えば、前記体積割合とＨｂ重量割合の両方を満たしてもよいし、いずれか一方を満たしてもよい。
　全血としては、例えば、溶血した全血、未溶血の全血、抗凝固全血、凝固画分を含む全血等のいずれであってもよい。
　本発明において、試料に含まれる鋳型核酸は、例えば、ＤＮＡである。前記ＤＮＡは、例えば、生体試料等の試料に元来含まれるＤＮＡでもよいし、核酸増幅により増幅させた増幅産物ＤＮＡであってもよい。後者の場合、前記試料に元来含まれているＲＮＡ（トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）から逆転写反応により生成させたｃＤＮＡがあげられる。
　本発明の増幅産物の製造方法において、例えば、核酸増幅の開始に先立ち、前記反応液にさらにアルブミンを添加することが好ましい。このようなアルブミンの添加によって、例えば、前述のような沈殿物や濁りの発生による影響をより一層低減することができ、且つ、増幅効率もさらに向上することができる。
　前記反応液におけるアルブミンの添加割合は、例えば、０．０１～２重量％の範囲であり、好ましくは０．１～１重量％であり、より好ましくは０．２～０．８重量％である。前記アルブミンとしては、特に制限されず、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等があげられ、これらはいずれか１種類でもよいし２種類以上を併用してもよい。
　つぎに、本発明の増幅産物の製造方法に関し、全血試料について、ＤＮＡを鋳型核酸とし、本発明のプローブの存在下、標的核酸を増幅するためのプライマーを用いたＰＣＲにより、標的核酸を増幅する例をあげて説明する。なお、本発明は、本発明のプローブを使用することが特徴であり、他の構成ならびに条件は何ら制限されない。
　まず、ＰＣＲ反応液を調製する。前記反応液におけるプローブの添加割合は、特に制限されないが、例えば、前記反応液に１０～４００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、より好ましくは２０～２００ｎｍｏｌ／Ｌである。また、プローブの標識として蛍光物質を用いている場合、例えば、検出する蛍光強度を調整するために、標識化プローブと同じ配列である未標識プローブを併用してもよく、この未標識プローブは、その３’末端にリン酸が付加されてもよい。この場合、標識化プローブと未標識プローブのモル比は、例えば、１：１０～１０：１が好ましい。
　前記反応液におけるプライマーの添加割合は、特に制限されないが、例えば、０．１～２μｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが好ましく、より好ましくは０．２５～１．５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．５～１μｍｏｌ／Ｌである。また、プライマーとしては、フォワードプライマーとリバースプライマーとからなる一対のプライマーセットを使用することができ、この場合、両プライマーを前述の範囲で添加することが好ましい。フォワードプライマー（Ｆ）とリバースプライマー（Ｒ）との添加割合（モル比Ｆ：Ｒ）は、特に制限されないが、例えば、１：０．２５～１：４が好ましく、より好ましくは１：０．５～１：２である。なお、プライマーやプライマーセットは、例えば、１種類でもよいし２種類以上でもよい。本発明において、使用するプライマーは、例えば、１つの反応液において増幅させたい標的配列の数に応じて、適宜使用できる。
　前記反応液における全血試料の割合は、特に制限されないが、前述の範囲が好ましい。全血試料は、そのまま反応液に添加してもよいし、予め、水や緩衝液等の溶媒で希釈してから反応液に添加してもよい。全血試料を予め希釈する場合、その希釈率は特に制限されず、例えば、反応液での最終的な全血添加割合が前記範囲となるように設定できるが、例えば、１００～２０００倍であり、好ましくは２００～１０００倍である。
　前記反応液における他の組成成分は、特に制限されず、従来公知の成分があげられ、その割合も特に制限されない。前記組成成分としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド（ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ））および溶媒があげられる。また、前述のように前記反応液はさらにアルブミンを含有することが好ましい。なお、前記反応液において、各組成成分の添加順序は何ら制限されない。
　前記ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限されず、例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス・アクアティカス（Thermus　aquaticus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４，８８９，８１８号および同第５，０７９，３５２号）（商品名Ｔａｑポリメラーゼ）、テルムス・テルモフィラス（Thermus　thermophilus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ　９１／０９９５０）（ｒＴｔｈ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus　furiosus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ　９２／９６８９）（Ｐｆｕ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、テルモコッカス・リトラリス（Thermococcus　litoralis）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＰ－Ａ　４５５　４３０）（商標Ｖｅｎｔ：Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、サーモコッカス・コダカラエンシス（Thermococcus　kodakaraensis）由来ＤＮＡポリメラーゼ（商品名ＫＯＤ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）等が商業的に入手可能であり、中でも、テルムス・アクアティカス（Thermus　aquaticus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
　前記反応液中のＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、特に制限されないが、例えば、１～１００Ｕ／ｍＬであり、好ましくは５～５０Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは２０～３０Ｕ／ｍＬである。なお、ＤＮＡポリメラーゼの活性単位（Ｕ）は、一般に、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型プライマーとして、活性測定用反応液中、７４℃で、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性が１Ｕである。前記活性測定用反応液の組成は、例えば、２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＴＡＰＳ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／Ｌメルカプトエタノール、２００μｍｏｌ／Ｌ　ｄＡＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ　ｄＧＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ　ｄＴＴＰ、１００μｍｏｌ／Ｌ［α－３２Ｐ］ｄＣＴＰ、０．２５ｍｇ／ｍＬ活性化サケ精子ＤＮＡである。
　前記ヌクレオシド三リン酸としては、通常、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、および／またはｄＵＴＰ）があげられる。前記反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、特に制限されないが、例えば、０．０１～１ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０５～０．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．１～０．３ｍｍｏｌ／Ｌである。
　前記溶媒としては、例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＣＡＰＳ等の緩衝液があげられ、市販のＰＣＲ用緩衝液や市販のＰＣＲキットの緩衝液等が使用できる。
　また、前記ＰＣＲ反応液は、さらに、グリセロ－ル、ヘパリン、ベタイン、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＤＭＳＯ等を含んでもよく、これらの添加割合は、例えば、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で設定すればよい。
　前記反応液の全体積は、特に制限されず、例えば、使用する機器（サーマルサイクラー）や、チューブまたはチップ等の容器等に応じて適宜決定できるが、通常、１～５００μＬであり、好ましくは１０～１００μＬである。
　つぎに、ＰＣＲを行う。ＰＣＲは、通常、（１）二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離、（２）一本鎖核酸へのプライマーのアニーリング、（３）アニーリングしたプライマーの伸長（ポリメラーゼ反応）の３ステップが１サイクルとなる。各ステップにおける温度条件は、特に制限されず、前述のように、前記（３）の伸長反応温度が、前記プローブのＴｍＰｅｒ値以上であればよい。前記（１）の解離ステップは、例えば、９０～９９℃で１～１２０秒、好ましくは９２～９５℃で１～６０秒、前記（２）のアニーリングステップは、例えば、４０～７０℃で１～３００秒、好ましくは５０～７０℃で５～６０秒、前記（３）の伸長ステップは、例えば、５０～８０℃で１～３００秒、好ましくは５０～７５℃で５～６０秒の条件が例示できるが、これには制限されない。
　ＰＣＲのサイクル数は、特に制限されないが、例えば、３０サイクル以上が好ましく、上限は特に制限されないが、例えば、合計１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、さらに好ましくは５０サイクル以下である。
　以上のようにして、本発明のプローブの存在下で、標的配列を増幅できる。この方法によれば、前述のように、プライマーの鋳型核酸に対するアニーリングやアニーリングしたプライマーからの伸長が、プローブによって阻害され難いため、前記標的配列が、前記プローブに対するパーフェクトマッチの相補鎖およびミスマッチの相補鎖のいずれを含む場合であっても、従来より優れた効率で増幅させることが可能である。なお、本発明の増幅方法は、標的配列の増幅物の製造方法ともいえる。
　本発明の増幅方法は、さらに、前述の増幅反応によって得られた標的配列の増幅産物を検出する工程を含んでもよい。これによって、増幅産物の有無や、標的配列における多型を検出することもできる。この実施形態については、本発明の標的配列の解析方法として、その一形態を以下に説明する。
＜標的配列の解析方法＞
　本発明の標的配列の解析方法は、前述のように、標的核酸配列にハイブリダイズ可能なプローブを用いた前記標的核酸配列の解析方法であって、下記（Ａ）および（Ｂ）工程を有することを特徴とする。
（Ａ）本発明の増幅方法により、前記プローブの存在下、前記標的核酸配列の増幅を行う工程
（Ｂ）前記（Ａ）工程の後、前記（Ａ）工程の反応液の温度を変化させ、得られた増幅産物と前記プローブとの二本鎖核酸の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
　本発明の標的配列の解析方法によれば、例えば、前記標的配列の増幅の有無や、前記標的配列における多型の判別等を行うことができる。なお、本発明の解析方法においては、本発明の増幅方法で標的配列を増幅すること、すなわち、本発明のプローブ存在下で標的配列を増幅することが特徴であり、例えば、その他の構成や条件等は何ら制限されない。
　本発明の標的配列解析方法は、例えば、さらに、下記（Ｃ）工程を有することが好ましい。このように、前記反応液の温度変化に伴うシグナル値の変動を確認することで、前述のような前記標的配列の増幅の有無や多型の判別が可能である。
（Ｃ）温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記標的配列の解析を行う工程
　本発明において、前記（Ｃ）工程は、温度変化に伴うシグナル値の変動を表す融解曲線を用いた融解曲線解析であることが好ましい。融解曲線は、一般に、各温度と、サンプルの融解状態を示すシグナル値またはシグナル値の微分値（以下、「シグナル微分値」という）との関係を示すグラフである。このような融解曲線を用いれば、例えば、ＴｍＰｅｒ値およびＴｍＭｉｓ値におけるピークの有無を、例えば、目視により容易に判断できる。
　前記融解曲線は、シグナルの変化量が判断し易いことから、前記温度とシグナル微分値との関係を示すグラフであることが好ましい。前記シグナル微分値は、例えば、「ｄＦ／ｄＴ」で表してもよいし、「－ｄＦ／ｄＴ」で表してもよい。ｄＦは、シグナル値の変化量、ｄＴは、温度の変化量を示す。シグナルの発生が、サンプルの融解によって抑制される場合、シグナル微分値を「ｄＦ／ｄＴ」で表した融解曲線において、ピークは谷型となり、シグナル微分値を「－ｄＦ／ｄＴ」で表した融解曲線において、ピークは山型となる。また、シグナルが、サンプルの融解によって発生する場合、シグナル微分値を「ｄＦ／ｄＴ」で表した融解曲線において、ピークは山型となり、シグナル微分値を「－ｄＦ／ｄＴ」で表した融解曲線において、ピークは谷型となる。前記シグナルは、例えば、サンプルの非融解によって発生し、サンプルの融解によって発生が抑制されるものでもよいし、反対に、サンプルの非融解によって発生が抑制され、前記サンプルの融解によって発生するものであってもよい。シグナルがサンプルの融解・非融解のいずれで発生しても、また、シグナル微分値を前述のいずれの式で表した場合も、ピークの大きさは、シグナル微分値の絶対値の大きさで評価可能である。
　本発明の解析方法により、前記標的配列の多型を解析する場合、例えば、前記標的配列とは、多型を生じる検出対象部位を有する配列であり、本発明のプローブは、これに相補的な配列となる。そして、前記（Ｃ）工程において、前記シグナル値の変動から、前記標的配列の検出対象部位における多型を解析することができる。前述のように、プローブが変異型プローブの場合、ＴｍＰｅｒ値（すなわちＴｍｍｕｔ値）付近にピークが検出されれば、多型は変異型、ＴｍＭｉｓ値（すなわちＴｍｗｉｌｄ値）付近にピークが検出されれば、多型は野生型と判断できる。また、一方のＴｍ値のみにピークが検出されれば、ホモ接合性の多型、両方のＴｍ値にピークが検出されれば、ヘテロ接合性の多型と判断することができる。なお、本発明において、検出対象部位における多型を、変異型および野生型と呼んでいるが、これは便宜上であって、本発明を制限するものではない。
　前記（Ｂ）工程において、前記増幅産物と前記プローブとの二本鎖核酸の融解状態を示すシグナル値の測定は、前述のように、２６０ｎｍの吸光度の測定でもよいし、標識物質のシグナル測定であってもよい。前者は、例えば、本発明のプローブが未標識プローブの場合に採用することが好ましい。後者は、例えば、本発明のプローブが、標識物質で標識化された標識化プローブである場合に採用することが好ましい。前記標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、標的配列とのハイブリッド（二本鎖核酸）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、標的配列とのハイブリッド（二本鎖核酸）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識物質によるシグナルをシグナル特有の条件（吸収波長等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、ハイブリッドの融解の進行ならびにＴｍ値の決定等を行うことができる。
　本発明においては、前述のように、同一反応液で、２つ以上の標的配列の解析を行ったり、１つの標的配列における２つ以上の検出対象部位の多型の解析を行うこと等ができる。このような場合、前記（Ａ）工程の核酸増幅の反応液には、予め、解析する標的配列や検出対象部位に応じて、例えば、２種類以上の本発明のプローブを添加しておけばよい。このように２種類以上のプローブを使用する際には、それぞれが、異なる条件で検出可能な異なる標識物質によって標識化されていることが好ましい。このように異なる標識物質を使用することによって、同一反応液であっても、検出条件を変えることによって、各標的配列や各検出対象部位を別個に解析することが可能である。
　つぎに、本発明の解析方法について、本発明のプローブとして標識化プローブを使用した例をあげて説明するが、本発明は、これには制限されない。また、特に示さない限り、本発明の増幅方法と同様に行うことができる。
　まず、前述と同様に、標識化プローブおよび標的配列を増幅するためのプライマーを含むＰＣＲ反応液を準備して、ＰＣＲを行い、前記標的配列の増幅を行う。前記反応液は、例えば、本発明のプローブ、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび鋳型核酸を含有する試料等を含む。この他に、前記反応液は、核酸増幅に使用できる種々の添加剤を含んでもよい。
　次に、前記ＰＣＲ反応液をそのまま用いて、得られた増幅産物の解離（例えば、二本鎖ＤＮＡ等の一本鎖核酸への解離）、および、解離した一本鎖核酸と前記標識化プローブとのハイブリダイズを行う。これは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。
　前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５～９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒～１０分であり、好ましくは１秒～５分である。
　解離した一本鎖核酸と前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件は、特に制限されないが、前記標的配列が前記プローブに対してパーフェクトマッチであるか否かを確認する場合は、前記標識化プローブのＴｍＰｅｒ値よりも低いことが好ましい。また、標的配列が前記プローブに対してミスマッチであるか否かを確認する場合、さらに、パーフェクトマッチであるかミスマッチであるかを確認する場合は、ＴｍＭｉｓ値よりも低いことが好ましい。前記ハイブリダイズの温度は、特に制限されないが、一般的に、例えば、４０～５０℃である。
　そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとのハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
　蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温～８５℃であり、好ましくは２５～７０℃であり、終了温度は、例えば、４０～１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１～２０℃／秒であり、好ましくは０．３～５℃／秒である。
　次に、前記シグナルの変動から、標的配列の解析を行う。この際、本発明のプローブについては、予め、ＴｍＰｅｒ値およびＴｍＭｉｓ値を決定しておく。そして、得られた蛍光強度から、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量を算出し、前記ＴｍＰｅｒ値およびＴｍＭｉｓ値のいずれかにおいて、最も大きい絶対値を示しているか否かを確認する。具体的には、例えば、温度と「－ｄ蛍光強度増加量／ｄＴ」とをプロットした融解曲線を作成し、前記ＴｍＰｅｒ値およびＴｍＭｉｓ値のいずれかに、最も低い値を示す谷型のピークが存在するか否かを確認する。また、例えば、温度と「ｄ蛍光強度増加量／ｄＴ」とをプロットした融解曲線を作成した場合は、前記ＴｍＰｅｒ値およびＴｍＭｉｓ値のいずれかに、最も高い値を示す山型のピークが存在するか否かを確認する。その結果、前記ＴｍＰｅｒ値付近にピークが確認されれば、前記標的配列は、前記プローブとパーフェクトマッチであると判断でき、前記ＴｍＭｉｓ値付近にピークが確認されれば、前記標的配列は、前記プローブとミスマッチであると判断できる。さらに、前記プローブが変異型検出用であれば、パーフェクトマッチは、多型が変異型、ミスマッチは、多型が野生型、反対に、前記プローブが野生型検出用であれば、パーフェクトマッチは、多型が野生型、ミスマッチは、多型が変異型と判断することができる。
　また、グアニン消光プローブとは反対に、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光を発し、解離した状態では、蛍光が減少（または消光）するプローブを使用する場合は、蛍光を発しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。
　また、本発明においては、前述のように、前記プローブを含む反応液の温度を上昇させて、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
　具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
＜増幅阻害の抑制方法＞
　本発明の増幅阻害の抑制方法は、前述のように、プローブ存在下での標的配列の増幅において、前記標的配列の増幅の阻害を抑制する増幅阻害の抑制方法であって、前記標的配列の増幅方法が、本発明の増幅方法であることを特徴とする。本発明は、プローブ存在下での標的配列の増幅において、本発明の増幅方法を行うこと、すなわち、本発明のプローブ存在下で標的配列を増幅することが特徴であり、その他の構成や条件は何ら制限されない。なお、本発明は、前記本発明の増幅方法と同様にして行うことができる。
＜プローブ＞
　本発明のプローブは、前述のように、本発明の増幅方法または本発明の増幅阻害の抑制方法に使用するためのプローブであって、前記プローブと前記プローブに対する相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すプローブであることを特徴とする。前記プローブは、前記プローブと前記プローブに対する完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すことが好ましい。具体的には、本発明の増幅方法で記載した通りである。本発明のプローブは、本発明の抑制方法、増幅方法および解析方法に使用できる。
＜増幅用試薬＞
　本発明の増幅用試薬は、本発明の増幅方法、抑制方法または解析方法に使用するための試薬であって、本発明のプローブを含むことを特徴とする。本発明の増幅用試薬は、本発明のプローブを含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の増幅試薬は、例えば、さらに、標的配列を増幅するためのプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ、ｄＮＴＰ等を含んでもよい。
　本発明の増幅用試薬の形態は、特に制限されず、例えば、液体試薬でもよいし、使用前に溶媒で懸濁する乾燥試薬であってもよい。また、本発明のプローブや、前記プライマー等のその他の成分の含有量も、特に制限されない。本発明の増幅用試薬は、例えば、増幅用キットでもよく、例えば、各試薬は、同じ容器または別個の容器に収容されてもよい。また、前記増幅用キットは、さらに使用説明書を備えることが好ましい。
＜プローブの設計方法＞
　本発明のプローブの設計方法は、プローブ存在下で鋳型核酸における標的核酸配列を増幅する方法に使用するための前記プローブの設計方法であって、前記プローブを、前記プローブと前記プローブに対する相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すように設計することを特徴とする。本発明において、前記プローブは、前記プローブと前記プローブに対する完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すように設計することが好ましい。本発明の設計方法は、具体的には、前記本発明の増幅方法において説明した方法と同様に行うことができる。また、本発明は、プローブの製造法ともいうことができ、前述のようにプローブを設計する工程を含む。
　つぎに、本発明について、実施例をあげて説明するが、本発明は、これらには制限されない。
　ヘテロ接合性の多型ＣＹＰ２Ｃ９＊３を示す被検者の血液から、キット（商品名ＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ゲノムを精製した。精製ゲノムをＴＥ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ）で１／１０希釈（体積）した。この希釈した精製ゲノム１μＬを、下記組成のＰＣＲ試薬４９μＬに添加し、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９５℃で６０秒処理した後、二本鎖の解離処理１秒および伸長反応処理１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。前記解離処理の温度は、９５℃、伸長反応処理（アニーリング処理を含む）の温度は、所定温度（５２℃、５８℃または６０℃）とした。そして、ＰＣＲ反応後、さらに、前記反応液を９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から９５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、５１５～５５５ｎｍ（蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ　ＦＬの検出）とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（プライマーセット）
　ＣＹＰ２Ｃ９＊３　Ｆプライマー　（配列番号１）
　　　　　5'-gagcccctgcatgcaa-3'　
　ＣＹＰ２Ｃ９＊３　Ｒプライマー　（配列番号２）
　　　　　5'-gatactatgaatttggggacttcgaa-3'
（変異型検出用プローブ）
　ＣＹＰ２Ｃ９＊３　プローブ　（配列番号３）
　　　　　5'-gggagaagGtcaAGgTatc-(BODIPY　FL)-3'
　変異型検出用のＣＹＰ２Ｃ９＊３用プローブと前記プローブに対して完全に相補的な相補鎖とのハイブリッド（パーフェクトマッチ二本鎖）のＴｍＰｅｒ値は、５８℃である。また、前記ＣＹＰ２Ｃ９＊３用プローブと前記プローブに対して検出対象部位の１塩基を除いて完全に相補的な相補鎖とのハイブリッド（ミスマッチ二本鎖）のＴｍＭｉｓ値は、５３℃である。
　これらの結果を図１～図３に示す。これらの図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示す融解曲線のグラフであり、縦軸の微分値は「－ｄ蛍光強度増加量／ｄＴ」（－ｄＦ／ｄＴ）を示し、横軸は温度を示す。図１は、ＰＣＲの伸長反応温度を５２℃に設定した際の融解曲線を示すグラフであり、図２は、前記伸長反応温度を５８℃に設定した際の融解曲線を示すグラフ、図３は、前記伸長反応温度を６０℃に設定した際の融解曲線を示すグラフである。
　前記伸長反応温度が５２℃の場合、前記パーフェクトマッチ二本鎖のＴｍＰｅｒ値と伸長反応温度との関係は、「ＴｍＰｅｒ値＞伸長反応温度」となり、本発明における条件を満たしていない。このため、図１に示すように、５３℃におけるミスマッチ二本鎖のピークは十分に確認できるものの、５８℃におけるパーフェクトマッチ二本鎖のピークは極めて小さく、判断し難いという結果であった。これに対して、前記伸長反応温度が５８℃の場合、前記パーフェクトマッチ二本鎖のＴｍＰｅｒ値と伸長反応温度との関係は、「ＴｍＰｅｒ値＝伸長反応温度」となり、前記伸長反応温度が６０℃の場合、前記パーフェクトマッチ二本鎖のＴｍ値と伸長反応温度との関係は、「ＴｍＰｅｒ値＜伸長反応温度」となり、本発明の条件を満たしている。その結果、図２および図３に示すように、５３℃におけるミスマッチのピークはもちろんのこと、５８℃におけるパーフェクトマッチのピークも同様に検出することが可能であった。
　以上のように、本発明によれば、プローブの存在下で標的配列の増幅を行っても、前記伸長反応の反応温度において、前記プローブが鋳型核酸にハイブリダイズし難い。このため、プライマーの鋳型核酸へのアニーリングや前記プライマーからの伸長反応がプローブによって阻害され難く、結果として、前記標的配列の増幅を十分に行うことが可能となる。したがって、本発明によれば、例えば、Ｔｍ解析において、従来よりもピークの有無を高い信頼性で判別することができる。このため、本発明は、特に、遺伝子解析の分野において、極めて有用な技術といえる。

Claims (22)

  1. プローブ存在下で鋳型核酸における標的核酸配列を増幅する方法であって、
    前記標的核酸配列にハイブリダイズ可能なプローブの存在下、プライマーからの伸長反応により前記標的核酸配列を増幅する工程を含み、
    前記プローブとして、前記プローブと前記プローブに対する相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すプローブを使用することを特徴とする増幅方法。
  2. 前記プローブとして、前記プローブと前記プローブに対する完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すプローブを使用する、請求の範囲１記載の増幅方法。
  3. 前記プローブと前記プローブに対する完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度と、前記伸長反応の反応温度との差が、約０℃以上である、請求の範囲２記載の増幅方法。
  4. 前記プローブが、
    前記プローブと前記プローブに対する完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度と、前記プローブと前記プローブに対して１塩基を除いて完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度との差が、約１℃以上を示すプローブである、請求の範囲２記載の増幅方法。
  5. 前記プローブが、標識物質で標識化された標識化プローブである、請求の範囲１記載の増幅方法。
  6. 前記標識物質が、蛍光物質である、請求の範囲４記載の増幅方法。
  7. プローブ存在下での鋳型核酸における標的核酸配列の増幅において、前記標的核酸配列の増幅の阻害を抑制する増幅阻害の抑制方法であって、
    前記標的核酸配列の増幅方法が、請求の範囲１記載の増幅方法であることを特徴とする抑制方法。
  8. 標的核酸配列にハイブリダイズ可能なプローブを用いた前記標的核酸配列の解析方法であって、
    下記（Ａ）および（Ｂ）工程を有することを特徴とする標的核酸配列の解析方法。
    （Ａ）請求の範囲１記載の増幅方法により、前記プローブの存在下、鋳型核酸における前記標的核酸配列の増幅を行う工程
    （Ｂ）前記（Ａ）工程の後、前記（Ａ）工程の反応液の温度を変化させ、得られた増幅産物と前記プローブとの二本鎖核酸の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
  9. さらに、下記（Ｃ）工程を有する、請求の範囲８記載の解析方法。
    （Ｃ）温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記標的配列の解析を行う工程
  10. 前記（Ｃ）工程が、温度変化に伴うシグナル値の変動を表す融解曲線を用いた融解曲線解析である、請求の範囲９記載の解析方法。
  11. 前記標的核酸配列が、多型を生じる検出対象部位を有する配列であり、
    前記（Ｃ）工程において、前記シグナル値の変動から、前記標的核酸配列の検出対象部位における多型を解析する、請求の範囲９記載の解析方法。
  12. 前記（Ｃ）工程において、前記シグナル値の変動から、前記標的核酸配列の増幅の有無を解析する、請求の範囲９記載の解析方法。
  13. 前記プローブが、標識物質で標識化された標識化プローブである、請求の範囲８記載の解析方法。
  14. 前記標識物質が蛍光物質であり、前記（Ｂ）工程におけるシグナル値が、蛍光強度である、請求の範囲１３記載の解析方法。
  15. 請求の範囲１記載の増幅方法に使用するためのプローブであって、
    前記プローブが、
    前記プローブと前記プローブに対する相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すプローブであることを特徴とするプローブ。
  16. 前記プローブが、
    前記プローブと前記プローブに対する完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すプローブである、請求の範囲１５記載のプローブ。
  17. 前記プローブと前記プローブに対する完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度と、前記伸長反応の反応温度との差が、約０℃以上である、請求の範囲１６記載のプローブ。
  18. 前記プローブと前記プローブに対して完全に相補的な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度と、前記プローブと前記プローブに対して１塩基を除いて完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度との差が、約１℃以上を示すプローブである、請求の範囲１６記載のプローブ。
  19. 前記プローブが、標識物質で標識化された標識化プローブである、請求の範囲１５記載のプローブ。
  20. 前記標識物質が、蛍光物質である、請求の範囲１９記載のプローブ。
  21. プローブ存在下で鋳型核酸における標的核酸配列を増幅する方法に使用するための前記プローブの設計方法であって、
    前記プローブを、前記プローブと前記プローブに対する相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すように設計することを特徴とするプローブ設計方法。
  22. 前記プローブを、前記プローブと前記プローブに対する完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すように設計する、請求の範囲２１記載のプローブ設計方法。
     
PCT/JP2008/073537 2007-12-26 2008-12-25 標的核酸配列の増幅方法およびそれに用いるプローブ WO2009081967A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP08865229A EP2224017A4 (en) 2007-12-26 2008-12-25 PROCESS FOR INCREASING THE NUCLEIC ACID TARGET SEQUENCE AND PROBE USED THEREFOR
US12/810,266 US20100273173A1 (en) 2007-12-26 2008-12-25 Method for amplifying target nucleic acid sequence and probe used for the same
JP2009522264A JPWO2009081967A1 (ja) 2007-12-26 2008-12-25 標的核酸配列の増幅方法およびそれに用いるプローブ

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2007334360 2007-12-26
JP2007-334360 2007-12-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009081967A1 true WO2009081967A1 (ja) 2009-07-02

Family

ID=40801267

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2008/073537 WO2009081967A1 (ja) 2007-12-26 2008-12-25 標的核酸配列の増幅方法およびそれに用いるプローブ

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20100273173A1 (ja)
EP (1) EP2224017A4 (ja)
JP (1) JPWO2009081967A1 (ja)
KR (1) KR20090127893A (ja)
CN (1) CN101646786A (ja)
WO (1) WO2009081967A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2520666A1 (en) * 2011-05-06 2012-11-07 ARKRAY, Inc. Oligonucleotide for detection test of polymorphism of EGFR exon 19 and use thereof
JP2013017395A (ja) * 2011-07-07 2013-01-31 Toyobo Co Ltd 骨髄増殖性疾患に関する遺伝子変異を検出するためのプローブおよび該プローブを用いた遺伝子変異の検出方法

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7968287B2 (en) 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
EP2047910B1 (en) 2006-05-11 2012-01-11 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic device and method
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
US8772046B2 (en) 2007-02-06 2014-07-08 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
WO2008130623A1 (en) 2007-04-19 2008-10-30 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
WO2010009365A1 (en) 2008-07-18 2010-01-21 Raindance Technologies, Inc. Droplet libraries
EP2534267B1 (en) * 2010-02-12 2018-04-11 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US10351905B2 (en) 2010-02-12 2019-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
WO2012045012A2 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Raindance Technologies, Inc. Sandwich assays in droplets
EP2673614B1 (en) 2011-02-11 2018-08-01 Raindance Technologies, Inc. Method for forming mixed droplets
EP2675819B1 (en) 2011-02-18 2020-04-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
JP5757908B2 (ja) * 2011-05-02 2015-08-05 アークレイ株式会社 多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効評価方法、疾患予測方法及び多型検出用試薬キット
DE202012013668U1 (de) 2011-06-02 2019-04-18 Raindance Technologies, Inc. Enzymquantifizierung
US20130178378A1 (en) * 2011-06-09 2013-07-11 Andrew C. Hatch Multiplex digital pcr
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
WO2013055789A1 (en) * 2011-10-14 2013-04-18 Accugenomics, Inc. Nucleic acid amplification and use thereof
JP2013153709A (ja) * 2012-01-31 2013-08-15 Fujirebio Inc 等温核酸増幅反応における検出シグナルの補正方法
EP4361609A2 (en) 2012-02-03 2024-05-01 California Institute of Technology Signal encoding and decoding in multiplexed biochemical assays
CA2874972C (en) * 2012-05-25 2023-06-20 Accugenomics, Inc. Nucleic acid amplification and use thereof
IN2015DN01609A (ja) 2012-08-03 2015-07-03 California Inst Of Techn
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
US10647981B1 (en) 2015-09-08 2020-05-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid library generation methods and compositions
CN109601008B (zh) * 2016-04-01 2023-02-28 克罗玛科德公司 用于工程化信号产生的竞争性探针
EP3472354A4 (en) 2016-06-17 2020-01-01 California Institute of Technology NUCLEIC ACID ACTIONS AND RELATED PROCEDURES AND COMPOSITIONS
CN106119363B (zh) * 2016-07-01 2019-12-03 中国人民解放军第三〇九医院 用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的snp组合、检测方法和试剂盒

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
WO1991009950A1 (en) 1989-12-22 1991-07-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant expression vectors and purification methods for thermus thermophilus dna polymerase
EP0455430A2 (en) 1990-04-26 1991-11-06 New England Biolabs, Inc. Purified thermostable DNA polymerase obtainable from Thermococcus litoralis
US5079352A (en) 1986-08-22 1992-01-07 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
WO1992009689A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Stratagene PURIFIED THERMOSTABLE $i(PYROCOCCUS FURIOSUS)
JP2005204515A (ja) * 2004-01-20 2005-08-04 Arkray Inc Ｃｙｐ２ｃ９の変異の検出法ならびにそのための核酸プローブおよびキット
WO2008066163A1 (fr) * 2006-11-30 2008-06-05 Arkray, Inc. Ensemble d'amorces utilisé dans l'amplification du gène cyp2c9, réactif utilisé dans l'amplification du gène cyp2c9, et son utilisation

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7205105B2 (en) * 1999-12-08 2007-04-17 Epoch Biosciences, Inc. Real-time linear detection probes: sensitive 5′-minor groove binder-containing probes for PCR analysis
AU4263401A (en) * 2000-03-29 2001-10-08 Lgc Teddington Ltd Hybridisation beacon and method of rapid sequence detection and discrimination
CA2424614A1 (en) * 2001-03-27 2003-04-02 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Novel nucleic acid probe and novel method of assaying nucleic acids using the same
JP2008527999A (ja) * 2005-01-21 2008-07-31 ユニバーシティー オブ ロチェスター 長い１本鎖核酸および２本鎖核酸から短い１本鎖核酸を分離するための方法、ならびに関連した生体分子アッセイ法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US5079352A (en) 1986-08-22 1992-01-07 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
WO1991009950A1 (en) 1989-12-22 1991-07-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant expression vectors and purification methods for thermus thermophilus dna polymerase
EP0455430A2 (en) 1990-04-26 1991-11-06 New England Biolabs, Inc. Purified thermostable DNA polymerase obtainable from Thermococcus litoralis
WO1992009689A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Stratagene PURIFIED THERMOSTABLE $i(PYROCOCCUS FURIOSUS)
JP2005204515A (ja) * 2004-01-20 2005-08-04 Arkray Inc Ｃｙｐ２ｃ９の変異の検出法ならびにそのための核酸プローブおよびキット
WO2008066163A1 (fr) * 2006-11-30 2008-06-05 Arkray, Inc. Ensemble d'amorces utilisé dans l'amplification du gène cyp2c9, réactif utilisé dans l'amplification du gène cyp2c9, et son utilisation

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HYOJUN GIJUTSUSHU: "Kakusan no Zofuku Oyobi Kenshutsu", HEISEI 11 NENDO, TOKKYOCHO HAKKO, pages 9 - 10 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2520666A1 (en) * 2011-05-06 2012-11-07 ARKRAY, Inc. Oligonucleotide for detection test of polymorphism of EGFR exon 19 and use thereof
JP2012249630A (ja) * 2011-05-06 2012-12-20 Arkray Inc Ｅｇｆｒエクソン１９多型検出試験用オリゴヌクレオチド及びその用途
JP2013017395A (ja) * 2011-07-07 2013-01-31 Toyobo Co Ltd 骨髄増殖性疾患に関する遺伝子変異を検出するためのプローブおよび該プローブを用いた遺伝子変異の検出方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20090127893A (ko) 2009-12-14
US20100273173A1 (en) 2010-10-28
EP2224017A1 (en) 2010-09-01
EP2224017A4 (en) 2011-05-04
JPWO2009081967A1 (ja) 2011-05-06
CN101646786A (zh) 2010-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2009081967A1 (ja) 標的核酸配列の増幅方法およびそれに用いるプローブ
JP5307538B2 (ja) Ｕｇｔ１ａ１遺伝子増幅用プライマーセット、それを含むｕｇｔ１ａ１遺伝子増幅用試薬およびその用途
JP5637850B2 (ja) 標的核酸配列の増幅方法、それを用いた変異の検出方法、および、それに用いる試薬
JP5509075B2 (ja) 核酸増幅のコントロールの検出方法およびその用途
JP5224526B2 (ja) 遺伝子増幅用プライマーセット、それを含む遺伝子増幅用試薬およびその用途
JPWO2008066162A1 (ja) Ｃｙｐ２ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセット、それを含むｃｙｐ２ｃ１９遺伝子増幅用試薬およびその用途
WO2011062258A1 (ja) Ｍｔｈｆｒ遺伝子増幅用プライマーセット、それを含むｍｔｈｆｒ遺伝子増幅用試薬およびその用途
KR101372876B1 (ko) 질환 관련 유전자의 다형 검출용 프로브 및 그 용도
JP5684737B2 (ja) 標的配列の増幅方法、多型検出方法およびそれに用いる試薬
WO2011052755A1 (ja) Ｍｐｌ遺伝子多型検出用プローブおよびその用途
JPWO2008066163A1 (ja) Ｃｙｐ２ｃ９遺伝子増幅用プライマーセット、それを含むｃｙｐ２ｃ９遺伝子増幅用試薬およびその用途
KR101119417B1 (ko) 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트, 그것을 포함하는 비만 유전자 증폭용 시약 및 그 용도
JP5367365B2 (ja) Ｓｕｌｔ１ａ１遺伝子増幅用プライマーセット、それを含むｓｕｌｔ１ａ１遺伝子増幅用試薬およびその用途
JP2011062143A (ja) ピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子増幅用プライマー試薬およびその用途
WO2011077990A1 (ja) ｃ－ｋｉｔ遺伝子の多型検出用プローブおよびその用途
KR101110425B1 (ko) Ｎａｔ2 유전자 증폭용 프라이머 셋트, 그것을 포함하는 ｎａｔ2 유전자 증폭용 시약 및 그 용도
JP5635496B2 (ja) Ｅｇｆｒ遺伝子多型検出用プローブおよびその用途
JP2017163889A (ja) Ｋ−ｒａｓ遺伝子増幅用フォワードプライマーセット、Ｋ−ｒａｓ遺伝子増幅用キット、Ｋ−ｒａｓ遺伝子増幅方法、多型解析方法、及び薬効判定方法

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200880010650.7

Country of ref document: CN

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2009522264

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08865229

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020097020264

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008865229

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12810266

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE