JP2012249630A - Egfrエクソン19多型検出試験用オリゴヌクレオチド及びその用途 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】下記(P1)又は(P1’)であるEGFRエクソン19遺伝子多型検出試験用オリゴヌクレオチド:(P1)3’末端側が伸長阻害処理され、特定の塩基配列の少なくとも115番目〜123番目の塩基を含む塩基長9〜80の塩基配列に対して少なくとも80%以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド;(P1’)3’末端側が伸長阻害処理され、特定の塩基配列の少なくとも115番目〜123番目の塩基を含む塩基長9〜80の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド;及び、その用途。
【選択図】なし
Description
このため、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤を使用するに際して、その効果を予測するために予測因子の探索が試みられ、EGFR遺伝子変異が重要な因子であることが見出されてきた(非特許文献1、2)。
また、簡便に且つ、感度と信頼性に優れた多型検出方法としては、変異型プライマーと野生型(正常型)プライマーとを同一の反応系で用いて、変異型塩基を有する核酸配列を優先的に増幅させることを含む多型検出方法が知られている(特許文献2参照)。
従って本発明は、EGFRエクソン19遺伝子の多型を検出する検出試験において当該多型を簡便で感度よく検出するために有用な多型検出試験用オリゴヌクレオチド及びその用途を提供することを目的とする。
[1] 下記(P1)及び(P’)からなる群より選択された少なくとも1種であるEGFRエクソン19遺伝子多型検出試験用オリゴヌクレオチド:
(P1)3’末端側が伸長阻害処理され、配列番号1で示される塩基配列の少なくとも115番目〜123番目の塩基を含む塩基長9〜80の塩基配列に対して少なくとも80%以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド;
(P1’)3’末端側が伸長阻害処理され、配列番号1で示される塩基配列の少なくとも115番目〜123番目の塩基を含む塩基長9〜80の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
[2] EGFRエクソン19遺伝子の塩基配列にハイブリダイズ可能な下記(P2)及び(P2’)からなる群より選択された少なくとも1種である[1]に記載の多型検出試験用オリゴヌクレオチド:
(P2)3’末端側が伸長阻害処理され、配列番号1で示す塩基配列の少なくとも104番目〜123番目の塩基を含む塩基長20〜80の塩基配列に対して少なくとも80%以上の同一性を有する多型検出用試験用オリゴヌクレオチド;
(P2’)3’末端側が伸長阻害処理され、配列番号1で示す塩基配列の少なくとも104番目〜123番目の塩基を含む塩基長20〜80の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
[3]前記(P2)又は(P2’)のオリゴヌクレオチドは、前記104番目の塩基に対応する塩基を5’末端から数えて1〜3番目の位置に有する[2]に記載の多型検出用試験用オリゴヌクレオチド。
[4] 前記(P2)又は(P2’)のオリゴヌクレオチドは、前記104番目の塩基に対応する塩基を5’末端に有する[2]記載の多型検出用試験用オリゴヌクレオチド。
[5] 前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドの塩基長が25〜50である[1]〜[4]のいずれかに記載の多型検出用試験用オリゴヌクレオチド。
[6] 前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドの塩基長が26〜42である[1]〜[4]のいずれかに記載の多型検出用試験用オリゴヌクレオチド。
[7] 前記3’末端側の伸長阻害処理がリン酸基の付加である[1]〜[6]のいずれかに記載の多型検出試験用オリゴヌクレオチド。
[8] 前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドの塩基配列上の塩基が、蛍光色素により標識されている[1]〜[7]のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
[9] [1]〜[8]のいずれかに記載の多型検出試験用オリゴヌクレオチドを少なくとも1種用いてEGFRエクソン19遺伝子の多型を検出することを含むEGFRエクソン19遺伝子の多型を検出する多型検出方法。
[10] 配列番号1で示される塩基配列を有する一本鎖核酸を含み得る核酸試料を用意すること、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドと前記一本鎖核酸とを接触させて、該多型検出試験用オリゴヌクレオチド及び該一本鎖核酸を含み且つ該一本鎖核酸の核酸増幅が抑制されるハイブリッドを得ること、該多型検出試験用オリゴヌクレオチドと該一本核酸との接触時又は接触後の前記核酸試料に対して核酸増幅を行うこと、を含む[9]に記載の多型検出方法。
[11] 前記核酸増幅を、標的とするEGFRエクソン19遺伝子の多型部位を含む核酸にハイブリダイズ可能なプローブの存在下で行う[10]に記載の多型検出方法。
[12] 前記プローブが、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドの塩基配列に対して45%以上の同一性を有する[11]記載の多型検出方法。
[13] 前記プローブが、標的配列にハイブリダイズしていないときに蛍光を発し、該標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するプローブである[11]又は[12]記載の多型検出方法。
[14] [9]〜[13]のいずれかに記載の多型検出方法によりEGFRエクソン19遺伝子における多型を検出すること、及び、前記検出結果に基づいてEGFRチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性又はEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の薬効を判定すること、を含むEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の薬効判定方法。
[15] 少なくとも1種の[1]〜[8]のいずれかに記載の多型検出試験用オリゴヌクレオチド、を含むEGFR多型検出試験用試薬キット。
[16] 更に、標的とするEGFRエクソン19遺伝子の多型部位を含む核酸配列にハイブリダイズ可能なプローブを含む[15]に記載のEGFR多型検出試験用試薬キット。
[17] 前記プローブが、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドの塩基配列に対して45%以上の同一性を有する[16]に記載のEGFR多型検出試験用試薬キット。
[18] 更に、前記標的とするECGRエクソン19遺伝子多型部位を含む核酸配列を増幅可能なプライマーセットを含む[15]〜[17]のいずれか記載のEGFR多型検出試験用試薬キット。
(P1)3’末端側が伸長阻害処理され、配列番号1で示される塩基配列の少なくとも115番目〜123番目の塩基を含む塩基長9〜80の塩基配列に対して少なくとも80%以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド;
(P1’)3’末端側が伸長阻害処理され、配列番号1で示される塩基配列の少なくとも115番目〜123番目の塩基を含む塩基長9〜80の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
本発明にかかる多型検出試験用試薬セットは、前記EGFRエクソン19遺伝子多型検出試験用オリゴヌクレオチドを含むものである。
本発明にかかるEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の薬効判定方法は、前記EGFRエクソン19遺伝子多型検出方法によりEGFR遺伝子における多型を検出すること、及び前記検出結果に基づいてEGFRチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性又はEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の薬効を判定することを含む方法である。
本明細書では、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドがハイブリダイズし得る野生型EGFR遺伝子の塩基配列の領域を、特に「増幅抑制標的領域」という。
本明細書において「鋳型核酸配列」とは、核酸増幅を行う際にプライマーが鋳型として認識してアニーリングする塩基配列を意味する。
本発明において、オリゴヌクレオチドの配列に関して「3’末端から数えて1〜3番目」という場合は、オリゴヌクレオチド鎖の3’末端を1番目として数える。同様に「5’末端から数えて1〜3番目」という場合は、オリゴヌクレオチド鎖の5’末端を1番目として数える。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドは、下記(P1)及び(P’)からなる群より選択された少なくとも1種であるEGFR遺伝子多型検出試験用オリゴヌクレオチド:
(P1)3’末端側が伸長阻害処理され、配列番号1で示される塩基配列の少なくとも115番目〜123番目の塩基を含む塩基長9〜80の塩基配列に対して少なくとも80%以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド;
(P1’)3’末端側が伸長阻害処理され、配列番号1で示される塩基配列の少なくとも115番目〜123番目の塩基を含む塩基長9〜80の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Molecular Cloning 3rd(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001) に記載の方法等に従って行うことができる。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
当該塩基が挿入、欠失又は置換した多型検出試験用オリゴヌクレオチドは、前記P1又は前記P1’オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、1個又は2個以上の塩基が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、特に限定されない。挿入、欠失又は置換した塩基の数としては1塩基又は2塩基以上が挙げられ、蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば1塩基〜10塩基、1塩基〜5塩基、又は1塩基〜3塩基とすることができる。
(P2)3’末端側が伸長阻害処理され、配列番号1で示す塩基配列の少なくとも第104〜123番目の塩基を含む塩基長20〜80の塩基配列に対して少なくとも80%以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド;
(P2’)3’末端側が伸長阻害処理され、配列番号1で示す塩基配列の少なくとも、104番目〜123番目の塩基を含む塩基長20〜80の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
前記P2又は前記P2’のオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して、挿入、欠失又は置換される1個又は2個以上の塩基については、前記P1及びP1’オリゴヌクレオチドの塩基配列に対して挿入、欠失又は置換される1個又は2個以上の塩基として記述した事項をそのまま適用する。
多型検出試験用オリゴヌクレオチドに付される標識化物質としては、一般に蛍光色素及び蛍光団等を挙げることができる。標識化物質は、一般に、オリゴヌクレオチドの塩基に付されるが、これに限定されない。前記標識化物質が付された塩基は、多型検出試験用オリゴヌクレオチドのいずれかの塩基であればよく、いずれの位置であってよい。多型検出試験用オリゴヌクレオチドのいずれかの位置の塩基が蛍光色素により標識化された塩基とすることにより、多型検出試験用オリゴヌクレオチドがハイブリダイズした核酸の有無を有意に検出可能とするなどの利点を有する。
前記蛍光色素としては、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等が挙げられ、市販の蛍光色素としては、例えば、BODIPY FL、Pacific Blue、FluorePrime、Fluoredite、FAM、Cy3およびCy5、TAMRA等が挙げられる。
後述するEGFR遺伝子多型検出方法では、検出対象となるEGFR遺伝子多型を検出するためのEGFR遺伝子多型検出プローブ(以下、単に多型検出プローブという)が用いられる。
前記多型検出プローブとしては、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドの増幅抑制標的部位に対応する位置に変異を有する多型を検出可能な多型検出プローブであればよく、また、当該増幅抑制標的部位に対応する位置に欠失を有する多型を検出可能な多型検出プローブであればよい。
プローブの長さとしては、特に制限はないが、5mer〜50merとしてもよく、10mer〜30merとしてもよい。プローブの長さがこのような範囲であれば、例えば検出感度を高めることができる。
また、多型検出プローブとしては、配列番号1で示される塩基配列又はその相補的な配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであってもよく、1個又は2個以上の塩基が挿入、欠失又は置換したオリゴヌクレオチドであってもよい。
なお、ストリンジェントな条件については、多型検出用試験用オリゴヌクレオチドの項に記載した条件と同様の条件を適用することができる。また、同一性や、挿入、欠失又は置換の範囲についても、多型検出用試験用オリゴヌクレオチドの項に記載したものと同様の範囲を適用することができる。
標識化プローブにおける標識物質の具体例としては、例えば、蛍光色素および蛍光団が挙げられる。
このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
蛍光標識オリゴヌクレオチドの検出条件は特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できる。例えば、Pacific Blueは、検出波長445nm〜480nm、TAMRAは、検出波長585nm〜700nm、BODIPY FLは、検出波長520nm〜555nmで検出できる。このような蛍光色素を有するプローブを使用すれば、それぞれの蛍光シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合は、通常の方法、例えば特開2002−119291号公報等に記載の方法に従って行うことができる。
後述するEGFR遺伝子多型検出方法では、検出対象となるEGFR遺伝子多型を含む配列を増幅する場合には、プライマーが用いられる。
核酸増幅に適用するプライマーは、目的とする検出対象となるEGFR遺伝子多型の部位(例えば、欠失した塩基の領域に対応する配列番号1で示される配列)を含む核酸を増幅可能であれば特に制限されない。
このようなプライマーの設計については、配列番号1で示される塩基配列から、当業者であれば適宜設計することができる。
また、プライマーセットの各プライマーの長さは同一でなくてもよい。一方、両プライマーのTm値はほぼ同一(又は、Tm値の両プライマーでの差が5℃以内)であってもよい。
本発明にかかるEGFR遺伝子多型検出方法は、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドを少なくとも1種用いてEGFR遺伝子の多型を検出することを含むEGFR遺伝子多型検出方法である。
本検出方法によれば、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドを少なくとも1種が野生型のEGFR遺伝子に優先的にハイブリダイズするので、野生型のEGFR遺伝子と、変異型のEGFR遺伝子とを簡便に区別し、感度よく変異型のEGFR遺伝子を検出可能にする。
このような方法としては、例えば、核酸増幅を利用する方法が挙げられる。核酸増幅を利用した方法であれば、前記多型検出プローブの塩基配列が野生型EGFR遺伝子核酸に優先的にハイブリダイズした結果、野生型EGFR遺伝子核酸の増幅が抑制され、変異型EGFR遺伝子核酸を優先的に増幅させることができる。
例えば、全血を試料とする場合、全血からのゲノムDNAの単離は、従来公知の方法によって行うことができる。例えば、市販のゲノムDNA単離キット(商品名GFX Genomic Blood DNA Purification kit;GEヘルスケアバイオサイエンス社製)等が使用できる。
試料中の核酸は、例えば、生体試料中に元来含まれている核酸でもよいが、例えば、多型検出の精度を向上できることから、前記生体試料中の核酸を鋳型として核酸増幅法により増幅させた増幅産物等が挙げられる。具体例としては、例えば、前記生体試料に元来含まれているDNAを鋳型として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物や、前記生体試料に元来含まれているRNAから逆転写−PCR反応(RT−PCR:Reverse Transcription PCR)により生成させたcDNAを鋳型として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物が挙げられる。これらの増幅産物を、本発明における鋳型核酸配列としてもよい。前記増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、50〜1000塩基であり、好ましくは80〜200塩基である。
第一のハイブリダイゼーション工程におけるハイブリダイズ可能な条件とは、一本鎖核酸同士をハイブリダイズするために通常適用される条件をそのまま適用すればよく、後述するプライマーと一本鎖核酸とのハイブリダイズする際に適用される条件をそのまま採用すればよい。これにより、多型検出試験用オリゴヌクレオチドと配列番号1で示される塩基配列を有する一本鎖核酸とにより、ハイブリッドが得られる。このハイブリッドは、試料中の一本鎖核酸が多型検出試験用オリゴヌクレオチドにより二本鎖核酸となっているため、ハイブリッドを構成する核酸配列に対する核酸増幅が抑制される。
また、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドと試料中の検査対象となる一本鎖核酸との接触には、特に制限はなく、所定の量比となるように、例えば、所定量の核酸を含む試料中に多型検出試験用オリゴヌクレオチドを添加すればよい。
ここで、試料中の核酸とは、例えば、検出目的の多型が発生している検出対象核酸と前記多型が発生していない非検出対象核酸との合計でもよいし、検出目的の多型が発生している検出対象配列を含む増幅産物と前記多型が発生していない非検出対象配列を含む増幅産物との合計でもよい。
なお、前記核酸に対する前記多型検出プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
前記反応系におけるアルブミンの添加割合は、例えば、0.01質量%〜2質量%としてよく、0.1質量%〜1質量%としてよく、0.2質量%〜0.8質量%としてもよい。前記アルブミンとしては、特に制限されず、例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等が挙げられ、これらはいずれか1種類でもよいし2種類以上を併用してもよい。
増幅工程における増幅について、PCR法を例に挙げて説明するが、本発明は、これに限定されない。PCRの条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
(I)前記多型検出プローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記多型検出プローブと前記一本鎖核酸とをハイブリダイズさせたハイブリッドを得ること(第二のハイブリダイゼーション工程という)。
(II)前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させるにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定すること(測定工程という)。
(III)前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるTm値を測定すること(Tm値測定工程)。
(IV)前記Tm値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、EGFR遺伝子における多型の存在を検出すること(多型検出工程)。
(V)前記多型の存在に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、多型を有する一本鎖核酸の存在比を検出すること(多型存在比検出工程)。
このような多型検出方法とすることにより、EGFR遺伝子多型を簡便に且つ感度よく検出し、評価することができる。
例えば、解離における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、85℃〜95℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、1秒〜10分であり、1秒〜5分としてもよい。また、解離した一本鎖核酸配列と多型検出プローブとのハイブリダイズは、例えば、解離後、解離における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、40℃〜50℃である。
なお、本明細書において、増幅産物における「一本鎖核酸配列」の用語には、試験対象となっている当初の核酸試料における一本鎖核酸配列も包含する。
前記増幅一本鎖核酸と多型検出プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値の測定は、260nmの吸光度測定でもよいが、前記多型検出用プローブに付加した標識のシグナルに基づくシグナルであって、一本鎖DNAと前記多型検出用プローブとのハイブリッド形成の状態に応じて変動するシグナルの測定であってもよい。標識物質のシグナル測定とすることによって、例えば検出感度を高めることができる。
また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド(例えば、二本鎖DNA)を形成することによって蛍光シグナルを示し、加熱によりプローブが解離するとシグナルが減少(消失)する。したがって、この標識に基づくシグナルの変化をシグナル特有の条件(吸収波長等)で検出することによって、前記260nmの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにTm値の決定等を行うことができる。
なお、ハイブリッドの解離温度を評価することだけでなく、ハイブリットの融解時に温度に応じて変動する蛍光シグナルの微分値の大きさを評価することを含む。微分値の大きさにより、多型を有する塩基配列(DNA)の存在比を評価することができる。
検量線の作成の一例について以下に説明する。
図1Aに、ある1つの核酸混合物の温度と吸光度または蛍光強度等の検出信号との関係で表された融解曲線、及び同図1Bに温度と検出信号の微分値との関係で表された融解曲線(微分融解曲線ともいう)を示す。この微分融解曲線からピークを検出することにより、核酸Wtの融解温度TmW及び核酸Mtの融解温度TmMを検出して、TmW及びTmMを含む温度範囲の各々を設定する。
なお、温度範囲ΔTW及び温度範囲ΔTMは、同一の幅(例えば、10℃)または異なる幅(例えば、温度範囲ΔTWが10℃、温度範囲ΔTMが7℃)となるように設定してもよい。また、温度範囲ΔTW及び温度範囲ΔTMは、それぞれの融解温度TmからプラスX℃、マイナスX℃の幅(X℃は例えば15℃以内、望ましくは10℃以内)というように設定してもよい。
+・・・+{f(Te−1)−B(Te−1)} ・・・(1)
ただし、Tsは各温度範囲における下限値、Teは上限値である。また、各温度Tにおけるベース値B(T)は、下記(2)式により求まる値であり、検出信号に含まれるバックグラウンドレベルを表すものである。このベース値を検出信号の微分値から減算することにより、検出信号に含まれるバックグラウンドの影響を除去する。
ただし、a={f(Te)−f(Ts)}/(Te−Ts) である。
実際の試料を用いて得られた融解曲線と微分融解曲線から面積比を算出し、上記のようにしてあらかじめ作成した検量線に基づいて、実際の試料中に含まれる多型を有する塩基配列の存在比を決定することができる。
本発明のEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の判定方法は、上述した多型検出方法によりEGFR遺伝子における多型を検出すること(遺伝子多型検出工程)、及び、前記検出結果に基づいてEGFRチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性又はEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の薬効を判定すること(薬効判定工程)、を含む。
上述した多型検出方法では、本発明における多型検出試験用オリゴヌクレオチドを用いて、感度よく且つ簡便にEGFRエクソン19遺伝子多型を検出するので、EGFRエクソン19におけるこの多型に基づいてEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の判定を感度よく且つ簡便に行うことができる。
EGFRチロシンキナーゼは、EGFRエクソン19における多型によって反応性が異なることが知られている。具体的には、EGFR遺伝子が変異型である場合には、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤による腫瘍縮小効果が期待できると判定することができる。
本発明のEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の判定方法により、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤の効果に対する予測を、信頼性高く且つ簡便に行うことができる。
EGFRエクソン19遺伝子多型の薬効判定の具体的な方法としては、既に知られており、例えば、Journal of Thoracic Oncology: March 2006 - Volume 1 - Issue 3 - pp 260-267(EGFR Mutation of Tumor and Serum in Gefitinib-Treated Patients with Chemotherapy-Naive Non-small Cell Lung Cancer)
に記載されている。
本発明のEGFR遺伝子における多型を検出するためのEGFR多型検出試験用試薬キットは、上述した多型検出試験用オリゴヌクレオチドを含む。
この試薬キットには、EGFRエクソン19における多型を簡便にかつ感度よく検出するために使用可能な上述した増幅抑制標的領域に対してハイブリダイズ可能な既述の多型検出試験用オリゴヌクレオチドが含まれるので、EGFR遺伝子における多型の検出をより簡便に行うことができる。
サーマルサイクラー(商品名Mastercycler ep gradient S、eppendorf社製)と全自動SNPs検査装置(商品名i−densy(商標)、アークレイ社製)と、下記表3〜5に記載した処方の検査用試薬を用いて、PCRおよびTm解析を行った。なお、使用したポリラーゼは、Taqポリメラーゼである。
PCRは、95℃で60秒処理した後、95℃で1秒及び54℃で15秒を1サイクルとして、50サイクル繰り返した。
またTm解析は、PCRの後、95℃で1秒、40℃で60秒処理し、続けて温度の上昇速度1℃/3秒で、40℃から75℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。励起波長を420nm〜485nmとし、測定波長を520〜555nmとして、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。野生型の遺伝子の場合には66℃付近、変異型の遺伝子の場合には、51℃付近及び66℃付近にそれぞれピークが認められることがわかっている。
野生型のEGFRエクソン19遺伝子の配列は配列番号1のとおりである。
変異型のEGFRエクソン19遺伝子としてはE746_A750delを使用した(表2、No.2)。
なお、各配列は表6に記載の通りである。
結果を図2〜図4に示す。なお、図2(A),図3(A)及び図4(A)、並びに図2(C)、3(C)及び図4(C)はゲノムDNAのみを鋳型核酸配列として用いた場合(野生型100%)を示し、図2(B),図3(B)及び図4(B)、並びに図2(D)、3(D)及び図4(D)は野生型の遺伝子配列と変異型の遺伝子配列を所定割合で混合したプラスミドDNAを鋳型核酸配列として用いた場合を示す。また、各図において、図2(A),図3(A)及び図4(A)、並びに図2(B),図3(B)及び図4(B)はWI核酸濃度0.2μMの場合を示し、図2(C)、3(C)及び図4(C)、並びに図2(D)、3(D)及び図4(D)は、WI核酸濃度0.4μMの場合を示す。図中、横軸が温度(℃)、縦軸が蛍光値の変化量を示す。
比較例1では、WI核酸配列として、配列番号1の123番目〜151番目と同一の配列を有するCmp−C1(配列番号32、表6参照)を用いた以外は、実施例1と同様にして多型検出を行った。結果を図5に示す。
比較例2では、WI核酸配列及びプローブを含まない反応液を使用し、PCR反応後にプローブを1μMの終濃度となるように各試料に添加した以外は、実施例1と同様にして多型検出を行った。PCR反応用試薬の各成分を表7に示す。結果を図6に示す。
比較例4では、DNAポリメラーゼを0.16Uで使用した以外は、比較例2と同様にして多型検出を行った。結果を図8に示す。
このような傾向は、DNAポリメラーゼの量を減らした場合でも同様であった(図7及び図8参照)。
全自動SNPs検査装置(商品名i−densy(商標)、アークレイ社製)を使用してPCR反応及びTm解析を行うと共に、鋳型核酸配列の種類を表8に示すように変更した試料A〜J(変異型プラスミドの配列は表8参照、野生型プラスミドの配列は配列番号1)を使用し、PCR反応液の各成分を表9に示すように変更した以外は、実施例1と同様にして、多型検出を行った。なお、使用したポリラーゼは、Taqポリメラーゼである。
なお、各試料中の鋳型核酸配列は、野生型の遺伝子配列(配列番号1)と表8に示す変異型の各遺伝子配列を、表8に示す混合比となるように混合した1×103copy/μLのプラスミド(Genescript社製)を使用した。表8に記載の変異種類については、No.2及びNo.3はE746_A750del、No.4はL747_E749del,A750P、No.6はL747_S752del,P753Sを示す(表2参照)。
結果を図9及び図10に示す。
また、図10に示されるように、変異の混合比を0.1%、1%、5%、10%及び50%と変更しても、混合比に応じた大きさのピークとして、変異型を混合比依存的に検出できることがわかった(図10(A)〜図10(E)参照)。
全自動SNPs検査装置(商品名i−densy(商標)、アークレイ社製)を使用してPCR反応及びTm解析を行うと共に、WI核酸の濃度を0.03μM、0.06μM、0.12μM又は0.18μMに変更したPCR反応液(試料5−1〜5−4、実施例5)又は、WI核酸を含まないPCR反応液(試料5−5、比較例5)を使用し、PCR反応後にプローブを試料あたり1μMの終濃度となるように添加した以外は、実施例1と同様にして多型検出を行った。なお、試料核酸としては、変異型(No.2)と野生型を、1%の変異型混合率として含むプラスミドDNAを用いた。各試料の処方は、表10に示す。
結果を図11に示す。図11(A)はWI核酸の濃度が0.03μMの試料5−1、図11(B)はWI核酸の濃度が0.06μMの試料5−2、図11(C)はWI核酸の濃度が0.12μMの試料5−3、図11(D)はWI核酸の濃度が0.18μMの試料5−4、図11(E)はWI核酸の濃度が0の試料5−5の結果を示す。
これに対して、図11(E)に示されるように、WI核酸を含まない試料5−5では、変異型を示す51℃付近のピークは明瞭でなかった。
Claims (18)
- 下記(P1)及び(P’)からなる群より選択された少なくとも1種であるEGFRエクソン19遺伝子多型検出試験用オリゴヌクレオチド:
(P1)3’末端側が伸長阻害処理され、配列番号1で示される塩基配列の少なくとも115番目〜123番目の塩基を含む塩基長9〜80の塩基配列に対して少なくとも80%以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド;
(P1’)3’末端側が伸長阻害処理され、配列番号1で示される塩基配列の少なくとも115番目〜123番目の塩基を含む塩基長9〜80の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。 - 下記(P2)及び(P2’)からなる群より選択された少なくとも1種である請求項1記載の多型検出試験用オリゴヌクレオチド:
(P2)3’末端側が伸長阻害処理され、配列番号1で示す塩基配列の少なくとも104番目〜123番目の塩基を含む塩基長20〜80の塩基配列に対して少なくとも80%以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド。
(P2’)3’末端側が伸長阻害処理され、配列番号1で示す塩基配列の少なくとも104番目〜123番目の塩基を含む塩基長20〜80の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。 - 前記(P2)又は(P2’)のオリゴヌクレオチドは、前記104番目の塩基に対応する塩基を5’末端から数えて1〜3番目の位置に有する、請求項2に記載の多型検出用試験用オリゴヌクレオチド
- 前記(P2)又は(P2’)のオリゴヌクレオチドは、前記104番目の塩基に対応する塩基を5’末端に有する請求項2に記載の多型検出用試験用オリゴヌクレオチド
- 前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドの塩基長が25〜50である請求項1〜4のいずれか一項記載の多型検出用試験用オリゴヌクレオチド。
- 前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドの塩基長が26〜42である請求項1〜4のいずれか一項記載の多型検出用試験用オリゴヌクレオチド。
- 前記3’末端側の伸長阻害処理がリン酸基の付加である請求項1〜請求項6のいずれか一項記載の多型検出試験用オリゴヌクレオチド。
- 前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドの塩基配列上の塩基が、蛍光色素により標識されている請求項1〜請求項7のいずれか一項記載の多型検出試験用オリゴヌクレオチド。
- 請求項1〜請求項8のいずれか一項記載の多型検出試験用オリゴヌクレオチドを少なくとも1種用いてEGFRエクソン19遺伝子の多型を検出すること
を含むEGFRエクソン19遺伝子の多型を検出する多型検出方法。 - 配列番号1で示される塩基配列を有する一本鎖核酸を含み得る試料核酸を用意すること、
前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドと前記一本鎖核酸とを接触させて、該多型検出試験用オリゴヌクレオチド及び該一本鎖核酸を含み且つ該一本鎖核酸の核酸増幅が抑制されるハイブリッドを得ること、
該多型検出試験用オリゴヌクレオチドと該一本鎖核酸との接触時又は接触後の前記核酸試料に対して核酸増幅を行うこと、
を含む請求項9記載の多型検出方法。 - 前記核酸増幅を、標的とするEGFRエクソン19遺伝子の多型部位を含む核酸にハイブリダイズ可能なプローブの存在下で行う請求項10記載の多型検出方法。
- 前記プローブが、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドの塩基配列に対して45%以上の同一性を有する請求項11記載の多型検出方法。
- 前記プローブが、標的配列にハイブリダイズしていないときに蛍光を発し、該標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するプローブである請求項11又は請求項12記載の多型検出方法。
- 請求項9〜請求項13のいずれか一項記載の多型検出方法によりEGFRエクソン19遺伝子における多型を検出すること、及び、
前記検出結果に基づいてEGFRチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性又はEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の薬効を判定すること、
を含むEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の薬効判定方法。 - 少なくとも1種の請求項1〜請求項8のいずれか一項記載の多型検出試験用オリゴヌクレオチド、
を含むEGFR多型検出試験用試薬キット。 - 更に、標的とするEGFRエクソン19遺伝子の多型部位を含む核酸配列にハイブリダイズ可能なプローブを含む請求項15記載のEGFR多型検出試験用試薬キット。
- 前記プローブが、前記多型検出試験用オリゴヌクレオチドの塩基配列に対して45%以上の同一性を有する請求項16記載のEGFR多型検出試験用試薬キット。
- 更に、前記標的とするECGRエクソン19遺伝子多型部位を含む核酸配列を増幅可能なプライマーセットを含む請求項15〜請求項17のいずれか一項記載のEGFR多型検出試験用試薬キット。
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