CN102776276B

CN102776276B - Egfr外显子19多态性检测试验用寡核苷酸及其用途

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Publication number: CN102776276B
Application number: CN201210137005.XA
Authority: CN
Inventors: 井口亚希
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2011-05-06
Filing date: 2012-05-02
Publication date: 2016-09-28
Anticipated expiration: 2032-05-02
Also published as: EP2520666A1; US8748590B2; US20120282610A1; JP5930825B2; EP2520666B1; JP2012249630A; KR101669089B1; KR20120125164A; CN102776276A

Abstract

本发明提供EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸及其用途，所述EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸能够简便且高灵敏度地检测EGFR外显子19的多态性。一种作为下述(P1)或(P1’)的EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸及其用途：(P1)寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且其相对于含有序列编号1所示的碱基序列的至少第115位～第123位碱基的碱基长9～80的碱基序列具有至少80％以上的同一性；(P1’)寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且其与含有序列编号1所示的碱基序列的至少第115位～第123位碱基的碱基长9～80的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交。

Description

EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸及其用途

技术领域

本发明涉及EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸及其用途。

背景技术

表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor：EGFR)被认为在肺癌中起重要的作用，并且在肺癌治疗领域中使用着以抑制EGFR的功能为目的的药剂。作为这样的药剂，已知非小细胞肺癌患者的治疗中使用的吉非替尼或厄洛替尼等EGFR酪氨酸激酶抑制剂，除肺癌之外正尝试将这些药剂应用于腺癌。但是，在某些范围的患者中，有时不能充分获得EGFR酪氨酸激酶抑制剂的效果。另外，在另一范围的患者中，有时虽然对EGFR酪氨酸激酶抑制剂初期具有反应，但是随后药剂不能达到所期待的或者更好的效果。

因此，在使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂时，为了预测其效果而尝试探索了预测因素，并发现了EGFR基因突变是重要的因素(非专利文献1、2)。

作为与药剂的感受性相关的突变，例如，已知EGFR的第790位和第858位的取代突变、EGFR基因的外显子19中的缺失突变等(非专利文献1、2)。尤其是，所述EGFR基因的外显子19中的缺失突变已知有在所述外显子19中缺失连续数个碱基～十几个碱基的多个突变型。

另一方面，近年来，作为检测基因多态性的检测试验，进行着利用熔解曲线分析(Tm分析)的检测。在该方法中，在通过PCR法扩增含有突变的区域之后，使用被荧光染料标记了的核酸探针进行熔解曲线分析，并基于熔解曲线分析的结果来分析碱基序列的突变(例如，参见专利文献1)。

另外，作为简便且灵敏度和可靠性优良的多态性检测方法，已知一种多态性检测方法，包括：在同一反应体系中使用突变型引物和野生型(正常型)引物来优先扩增含有突变型碱基的核酸序列(参见专利文献2)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利特开2002-119291号公报

专利文献2：国际公开第2010/001969号小册子

非专利文献

非专利文献1：PLoS Medicine，2005年，Vol.2，No.3，p.225-235

非专利文献2：Journal of Clinical Oncology，2005年，Vol.23，No.11，p.2513-2520

发明内容

发明要解决的问题

但是，EGFR外显子19的突变中如上所述存在各种突变。因此，在使用针对每个突变的引物的检测试验中，需要在反应液中含有许多对突变型特异的引物。制作许多引物存在设计变复杂的可能性，另外，同时使用多个引物有可能导致PCR反应本身不能进行。另外，在存在多个突变的情况下，若没有含有充分比率的突变则有时无法检测。

因此，本发明的目的在于提供一种为了在检测EGFR外显子19的多态性的检测试验中简便且灵敏度良好地检测相应多态性而有用的多态性检测试验用寡核苷酸及其用途。

解决问题的手段

本发明为如下所述。

[1]一种EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸，其为从包括下述(P1)和(P’)的组中选择的至少一种寡核苷酸：

(P1)寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且其相对于含有序列编号1所示的碱基序列的至少第115位～第123位碱基的碱基长9～80的碱基序列具有至少80％以上的同一性；以及

(P1’)寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且其与含有序列编号1所示的碱基序列的至少第115位～第123位碱基的碱基长9～80的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交。

[2]根据[1]所述的多态性检测试验用寡核苷酸，所述多态性检测试验用寡核苷酸为从包括能够与EGFR外显子19的碱基序列杂交的下述(P2)和(P2’)的组中选择的至少一种寡核苷酸：

(P2)寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且其相对于含有序列编号1所示的碱基序列的至少第104～123位碱基的碱基长20～80的碱基序列具有至少80％以上的同一性；以及

(P2’)寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且其与含有序列编号1所示的碱基序列的至少第104位～第123位碱基的碱基长20～80的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交。

[3]根据[2]所述的多态性检测试验用寡核苷酸，其中，所述(P2)或(P2’)的寡核苷酸在从5’末端起数第1～3位的位置具有与所述第104位的碱基对应的碱基。

[4]根据[2]所述的多态性检测试验用寡核苷酸，其中，所述(P2)或(P2’)寡核苷酸在5’末端具有与所述第104位的碱基对应的碱基。

[5]根据[1]～[4]中任一项所述的多态性检测试验用寡核苷酸，其中，所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基长为25～50。

[6]根据[1]～[4]中任一项所述的多态性检测试验用寡核苷酸，其中，所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基长为26～42。

[7]根据[1]～[6]中任一项所述的多态性检测试验用寡核苷酸，其中，所述3’末端侧的延长抑制处理为磷酸基的添加。

[8]根据[1]～[7]中任一项所述的寡核苷酸，其中，所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基序列上的碱基用荧光染料标记。

[9]一种多态性检测方法，用于检测EGFR外显子基因的多态性，包括：使用至少一种[1]～[8]中任一项所述的多态性检测试验用寡核苷酸来检测EGFR外显子19的多态性。

[10]根据[9]所述的多态性检测方法，包括：准备可含有具有序列编号1所示的碱基序列的单链核酸的核酸试样；使所述多态性检测试验用寡核苷酸和所述单链核酸接触，来获得含有该多态性检测试验用寡核苷酸和该单链核酸并且该单链核酸的核酸扩增被抑制的杂交体；以及对该多态性检测试验用寡核苷酸和该单链核酸接触时或者接触后的所述核酸试样进行核酸扩增。

[11]根据[10]所述的多态性检测方法，其中，在能够与含有作为靶标的EGFR外显子19的多态性位点的核酸杂交的探针的存在下进行所述核酸扩增。

[12]根据[11]所述的多态性检测方法，其中，所述探针相对于所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基序列具有45％以上的同一性。

[13]根据[11]或12所述的多态性检测方法，其中，所述探针是在未与靶标序列杂交时发出荧光而与该靶标序列杂交时荧光强度减少的探针。

[14]一种EGFR酪氨酸激酶抑制剂的药效判定方法，包括：通过[9]～[13]中任一项所述的多态性检测方法来检测EGFR外显子19中的多态性；以及基于所述检测结果来判定对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的耐受性或EGFR酪氨酸激酶抑制剂的药效。

[15]一种EGFR多态性检测试验用试剂盒，包含至少一种[1]～[8]中任一项所述的多态性检测试验用寡核苷酸。

[16]根据[15]所述的EGFR多态性检测试验用试剂盒，还包含：能够与含有作为靶标的EGFR外显子19的多态性位点的核酸序列杂交的探针。

[17]根据[16]所述的EGFR多态性检测试验用试剂盒，其中，所述探针相对于所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基序列具有45％以上的同一性。

[18]根据[15]～[17]中任一项所述的EGFR多态性检测试验用试剂盒，还包含：能够扩增含有作为所述靶标的EGFR外显子19多态性位点的核酸序列的引物对。

发明效果

通过本发明，能够提供为了在检测EGFR外显子19的多态性的检测试验中简便且灵敏度良好地检测相应多态性而有用的多态性检测试验用寡核苷酸及其用途。

附图说明

图1的(A)为核酸混合物的熔解曲线的示例，图1的(B)为微分熔解曲线的示例；

图2的(A)～(D)为本发明实施例1涉及的试样的熔解曲线；

图3的(A)～(D)为本发明实施例2涉及的试样的熔解曲线；

图4的(A)～(D)为本发明实施例3涉及的试样的熔解曲线；

图5的(A)～(D)为本发明比较例1涉及的试样的熔解曲线；

图6的(A)和(B)为本发明比较例2涉及的试样的熔解曲线；

图7的(A)～(D)为本发明比较例3涉及的试样的熔解曲线；

图8的(A)和(B)为本发明比较例4涉及的试样的熔解曲线；

图9的(A)～(E)为本发明实施例4涉及的试样A～E的熔解曲线；

图10的(A)～(E)为本发明实施例4涉及的试样F～J的熔解曲线；

图11的(A)～(E)为本发明的实施例5和比较例5涉及的试样5-1～5-5的熔解曲线。

具体实施方式

本发明涉及的EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸(以下有时仅称为“多态性检测试验用寡核苷酸”)是一种寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且是相对于含有序列编号1所示的碱基序列的至少第115位～第123位碱基的碱基长9～80的碱基序列具有相同的碱基长并且同源的序列，即是从包括下述(P1)和(P’)的组中选择的至少一种EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸。

(P1)寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且相对于含有序列编号1所示的碱基序列的至少第115位～第123位碱基的碱基长9～80的碱基序列具有至少80％以上的同一性；

(P1’)寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且与含有序列编号1所示的碱基序列的至少第115位～第123位碱基的碱基长9～80的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交。

本发明涉及的多态性检测试验用试剂盒包含所述EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸。

本发明涉及的EGFR基因多态性检测方法包括：使用至少一种所述EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸来检测EGFR外显子19的多态性。

本发明涉及的EGFR酪氨酸激酶抑制剂的药效判定方法包括：通过所述EGFR外显子19多态性检测方法来检测EGFR基因中的多态性；以及基于所述检测结果来判定对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的耐受性或EGFR酪氨酸激酶抑制剂的药效。

通过本发明，具有相对于序列编号1所示的EGFR基因的特定的一部分具有相同的碱基长并且同源的碱基序列、即具有至少80％以上的同一性和/或可与该特定的一部分碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的序列、并且3’末端侧被进行了延长抑制处理的寡核苷酸，由于与可含有多态性的野生型EGFR外显子19的碱基序列的该一部分具有高亲和性，因此比突变型EGFR外显子19的核酸更优先并且牢固地与野生型EGFR外显子19的核酸杂交。另外，所述多态性检测试验用寡核苷酸由于3’末端侧进行了延长抑制处理，因此在与野生型EGFR基因的核酸杂交之后，即使应用DNA聚合酶也不延长。

所述多态性检测试验用寡核苷酸为优选用于EGFR外显子19多态性检测试验的寡核苷酸。在将所述多态性检测试验用寡核苷酸用于EGFR基因多态性检测试验的情况下，所述多态性检测试验用寡核苷酸由于与其类似性高而与野生型EGFR基因核酸杂交。当在杂交了的野生型EGFR基因核酸和与该杂交了的区域对应的区域内含有缺失或单核苷酸多态性的突变型(多态性)EGFR基因核酸混合存在的环境下进行了核酸扩增等处理时，野生型基因的核酸序列的扩增由于多态性检测试验用寡核苷酸的存在而被抑制。另一方面，由于多态性检测试验用寡核苷酸不与突变型EGFR基因的核酸序列杂交，因此突变型EGFR基因的核酸扩增不被抑制，突变型EGFR基因的核酸序列优先扩增。结果，试样中比起野生型EGFR基因的核酸序列存在更多的突变型EGFR基因的核酸序列，从而能够高灵敏度地检测EGFR外显子19的多态性。可与所述多态性检测试验用寡核苷酸杂交的野生型EGFR基因核酸是具有序列编号1所示的碱基序列的互补序列的核酸。

另外，通过本发明，由于如此能够简便且高灵敏度地检测EGFR外显子19的多态性，因此能够简便且高灵敏度地判定基于EGFR外显子19多态性的、对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的耐受性或EGFR酪氨酸激酶抑制剂的药效。

本发明的“EGFR基因”具体是指EGFR外显子19。本发明中的EGFR外显子19是已公知的，其碱基序列是指NCBI登录号No.NT_033968(版本：NT_033968.6)的4831717～4832003的序列。序列编号1的碱基序列相应于EGFR外显子19的核酸的碱基序列的一部分。

在本说明书中，特别将可与所述多态性检测试验用寡核苷酸杂交的野生型EGFR基因的碱基序列的区域称为“扩增抑制靶标区域”。

在本说明书中，作为检测对象的EGFR基因的多态性中，包括在野生型EGFR基因的对应序列中缺失了由多个连续的碱基构成的区域的多态性，只要可以检测，也可以包括缺失一个碱基的多态性、碱基连续一个或者两个以上被其他的碱基取代的多态性。此外，本发明中的作为检测对象的EGFR基因的多态性只要其一部分中含有扩增抑制靶标区域，也可以同时含有两个以上的多态性。

在本发明中，“多态性检测试验”是指为了检测特定的基因多态性而被使用的试验，不拘泥于试验、测定、检测方法、评价方法、判定方法等表述，意指判定核酸试样中的核酸中是否含有具有多态性的突变型的一切行为。

在本发明中，关于作为检测对象的试样中的试样核酸、多态性检测试验用寡核苷酸、引物或者探针的每个的序列，基于它们的相互互补的关系所描述的事项，只要不特别指出，也适用于各个序列和相对于各序列互补的序列。在将本发明的事项适用于相对于各序列互补的该序列时，在本领域技术人员的技术常识的范围内，由该互补的序列识别的序列，视为将说明书全体替换为与对应的本说明书中记载的序列互补的序列。

在本说明书中，“模板核酸序列”意指在进行核酸扩增时被引物识别为模板并退火的碱基序列。

在本发明中，“Tm值”是指双链核酸解离的温度(解离温度：Tm)，一般定义为260nm处的吸光度达到吸光度总上升量的50％时的温度。即，当加热含有双链核酸(例如双链核酸DNA)的溶液时，260nm处的吸光度上升。这是因为双链核酸DNA中的两条双链之间的氢键由于加热而断裂，解离成单链DNA(DNA的熔解)。并且，全部双链核酸DNA解离成单链DNA时，其吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅双链核酸DNA的吸光度)的约1.5倍左右，由此可以判断熔解完成。Tm值基于该现象而设定。本发明中的Tm值只要不特别指出，均是指吸光度达到吸光度总上升量的50％时的温度。

在本发明中，关于寡核苷酸的序列，当称为“从3’末端起数第1～3位”时是以寡核苷酸链的3’末端为第1位起数的。同样地，当称为“从5’末端起数第1～3位”时是以寡核苷酸链的5’末端为第1位数的。

本说明书中“步骤”一词，不仅包含独立的步骤，而且例如在不能与其他的步骤明确区别的情况下，只要达到了本步骤预期的效果，则包含在本术语之内。

另外，在本说明书中，使用“～”表示的数值范围表示分别包含“～”的前后记载的数值作为最小值和最大值的范围。

另外，在本发明中，组成物中的各成分的量，在所述组成物中存在多种相当于各成分的物质的情况下，只要不特别指出，是指组成物中存在的该多种物质的合计量。

下面说明本发明。

<多态性检测试验用寡核苷酸>

所述多态性检测试验用寡核苷酸是一种EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸，其为从包括下述(P1)和(P’)的组中选择的至少一种寡核苷酸：

(P1)寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且其相对于含有序列编号1所示的碱基序列的至少第115位～第123位碱基的碱基长9～80的碱基序列具有至少80％以上的同一性；

所述多态性检测试验用寡核苷酸需要是：与含有序列编号1所示的碱基序列的至少第115～123位碱基的预定区域的碱基序列具有至少80％以上的同一性、或者与该预定区域的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的序列。通过含有第115位～第123位的碱基，例如能够高灵敏度地检测具有在序列编号1所示的碱基序列的第115位或其之后缺失一个或多个碱基的多态性。此外，序列编号1所示的第115位的碱基对应于EGFR外显子19的第744位的密码子的3’侧的碱基。

所述P1寡核苷酸的相对于所述预定区域的碱基序列的同一性需要是至少80％以上。另外，从检测灵敏度的观点来说，可以为85％以上、可以为90％以上、可以为95％以上、另外可以为96％以上、可以为97％以上、可以为98％以上、可以为99％以上。

所述P1’寡核苷酸为与所述序列编号1所示的碱基序列中的所述预定区域的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的序列。

杂交可以根据公知的方法或者基于公知方法的方法，例如Molecular Cloning3rd(J.Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab.Press，2001)中记载的方法等来进行。该文献通过参考被并入本说明书中。

严谨条件是指形成特异性杂交体但不形成非特异性杂交体的条件。典型的严谨条件例如可以举出在钾浓度约25mM～约50mM以及镁浓度约1.0mM～约5.0mM中进行杂交的条件。作为本发明的条件的示例，可以举出在Tris-HCl(pH8.6)、25mM的KCl以及1.5mM的MgCl₂下进行杂交的条件，但不限于此。此外，严谨条件被记载在Molecular Cloning 3rd(J.Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab.Press，2001)中。该文献通过参考被并入本说明书中。本领域技术人员可以通过改变杂交反应、杂交反应液的盐浓度等来容易地选择上述条件。

另外，本发明中的所述P1或所述P1’寡核苷酸还包括在所述P1或所述P1’寡核苷酸被插入、缺失或者取代了1个或2个以上的碱基的寡核苷酸。

所述被插入、缺失或者取代了碱基的多态性检测试验用寡核苷酸只要显示出与所述P1或所述P1’寡核苷酸同等程度的作用即可，在插入、缺失或取代了1个或2个以上的碱基的情况下，该插入、缺失或取代的位置无特别限定。作为插入、缺失或者取代的碱基的数量可以举出1个碱基或2个碱基以上，所述碱基的数量根据多态性检测试验用寡核苷酸总体的长度而不同，例如可以为1个碱基～10个碱基、或者1个碱基～5个碱基、或者1个碱基～3个碱基。

所述多态性检测试验用寡核苷酸所具有的碱基序列的第1位碱基的位置不限于序列编号1的第115位的位置，例如既可以是序列编号1所示的碱基序列的第60位～第115位的任何碱基，也可以是第100位～第110位的任何碱基，也可以是第102位～第106位的任何碱基。

所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基长需要为与含有所述序列编号1所示的碱基序列的至少第115位～第123位碱基的碱基长9mer～80mer的碱基序列相同的9mer～80mer。在所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基长为8mer以下或81mer以上时，不能期待目标的检测灵敏度。多态性检测试验用寡核苷酸的碱基长可以设为20mer～80mer，也可以设为10mer～70mer，也可设为25mer～50mer，也可以设为26mer～42mer。碱基长较短的多态性检测试验用寡核苷酸例如具有更可靠地抑制野生型核酸的核酸扩增从而检测灵敏度变高的倾向。

作为这样的多态性检测试验用寡核苷酸，例如可以为：以序列编号1所示的碱基序列的第60～115位的任一碱基为第1位碱基的10mer～80mer的寡核苷酸，也可以为以第100～第110位的任一碱基为第1位碱基的25mer～50mer的寡核苷酸，也可以为以第102～第106位的任一碱基为第1位碱基的26mer～42mer的寡核苷酸。这种寡核苷酸例如具有更可靠地抑制野生型核酸的核酸扩增从而检测灵敏度变高的倾向。

作为这种多态性检测试验用寡核苷酸，例如可以举出从包括下述(P2)和(P2’)的组中选择的至少一种寡核苷酸。

(P2)寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且其相对于含有序列编号1所示的碱基序列的至少第104～123位碱基的碱基长20～80的碱基序列具有至少80％以上的同一性；

如果所述P2或P2’寡核苷酸为含有序列编号1所示的碱基序列的第104位～第123位碱基的碱基长20mer～80mer的碱基序列，则P2或P2’寡核苷酸的第1位的碱基可以是与序列编号1所示的碱基序列的任何碱基对应的碱基。例如，P2或P2’寡核苷酸可以在从P2或P2’寡核苷酸的5’末端起数第1～3位的位置具有所述第104位的碱基，也可以是5’末端侧、即P2或P2’寡核苷酸的第1位的碱基为所述第104位的碱基。在从3’末端起第1～3位、尤其是在3’末端侧具有所述第104位碱基的寡核苷酸例如具有能够更可靠地抑制野生型核酸的核酸扩增的倾向。

所述P2’寡核苷酸中的严谨条件与所述P1’寡核苷酸中的严谨条件相同。

另外，本发明中的所述P2或所述P2’寡核苷酸中还包含所述P2或所述P2’寡核苷酸被插入、缺失或者取代了1个或多个碱基的寡核苷酸。

所述P2或所述P2’寡核苷酸的碱基序列中插入、缺失或取代的1个或2个以上的碱基与所述P1和P1’寡核苷酸的碱基序列中插入、缺失或取代的1个或2个以上的碱基相同。

所述多态性检测试验用寡核苷酸还可以以检测多态性检测试验用寡核苷酸或其互补链等为目的而被标记。

作为多态性检测试验用寡核苷酸上附加的标记物质一般可以举出荧光染料和荧光团等。标记物质一般被附加在寡核苷酸的碱基上，但不限于此。附加了所述标记物质的碱基只要是多态性检测试验用寡核苷酸的任意碱基即可，可以是任何位置。通过将多态性检测试验用寡核苷酸的任何位置的碱基作为用荧光染料标记的碱基，具有可以有效地检测有没有与多态性检测试验用寡核苷酸杂交的核酸等的优点。

所述多态性检测试验用寡核苷酸的3’末端侧需要被进行延长抑制处理。这里，“延长”是指由使用了DNA聚合酶或RNA聚合酶等酶的核酸扩增处理引起的核苷酸链的延长。延长抑制处理只要是抑制了从寡核苷酸链的5’末端向3’末端的延长的处理则无特别限制，例如可以举出对寡核苷酸链的3’末端侧的核酸添加取代基或化合物。

作为这种为抑制延长而添加的取代基的例子，可以举出磷酸基、ddNTP基等，作为为抑制延长而添加的化合物的例子，可以举出荧光染料、2’，3’ddA、2’，3’ddC、2’，3’ddG、2’，3’ddT等。作为寡核苷酸链的延长抑制处理，例如从可靠地抑制延长等观点来说，可以是对3’末端侧的核酸添加磷酸基的处理。被添加所述取代基或化合物的核酸的位置根据核酸的延长中所用的手段而不同，在使用DNA聚合酶或RNA聚合酶的情况下，可以为(脱氧)核糖的3位，但不限于此。

另外，所述多态性检测试验用寡核苷酸也可以含有用荧光染料标记的碱基作为碱基序列上的碱基。

作为所述荧光染料无特别限制，例如可以举出荧光素、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等，作为市售的荧光染料例如可举出Pacific Blue、BODIPY FL、FluorePrime、Fluoredite、FAM、Cy3和Cy5、TAMRA等。

本发明涉及的多态性检测试验用寡核苷酸的示例如下所示。表中的“(P)”表示磷酸基。在序列编号1所示的碱基序列中，Cmp-1为从第104位碱基起40mer的寡核苷酸，Cmp-2为从第104位碱基起29mer的寡核苷酸，Cmp-3为从第115位碱基起28mer的寡核苷酸，Cmp-4为第89位碱基起49mer的寡核苷酸，Cmp-5为第79位碱基起47mer的寡核苷酸，Cmp-6为从第107位碱基起36mer的寡核苷酸，Cmp-7为第104位碱基起20mer的寡核苷酸，Cmp-8为从第104位碱基起80mer的寡核苷酸，Cmp-9为从第63位碱基起80mer的寡核苷酸，Cmp-10为从第105位碱基起39mer的寡核苷酸，Cmp-11为从第106位碱基起38mer长的寡核苷酸，Cmp-12为从第111位碱基起33mer的寡核苷酸，Cmp-13为从第115位碱基起29mer的寡核苷酸，Cmp-14第115位碱基起10mer的寡核苷酸，Cmp-15为第106位碱基起78mer长的寡核苷酸。

表1

使用上述的多态性检测试验用寡核苷酸可检测的EGFR基因的突变(多态性)，可以举出序列编号1所示的碱基序列的第115位～第123位碱基的区域中缺失了1个或多个碱基的多态性。作为此类突变型EGFR基因，例如可以举出以下基因，但不限于此。此外，在表2中，“-”表示缺失部，小写字母表示突变部，“WT”表示野生型EGFR外显子19(序列编号1的第104位～第151位)，野生型基因的粗体字带下划线的“G”表示取代部。

表2

No.			序列编号
				WT	野生型	CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAAC	17
2	E746_A750del	GCCGTCGCTATCAA---------------AACATCTCCGAAAGCCAAC	18
				3	E746_A750del	GCCGTCGCTATCAAG---------------ACATCTCCGAAAGCCAAC	19
4	L747_E749del，A750P	GCCGTCGCTATCAAGGAA----------CAACATCTCCGAAAGCCAAC	20
				5	L747-T751del	GCCGTCGCTATCAAGGAAT---------------CTCCGAAAGCCAAC	21
6	L747_S752del，P753S	GCCGTCGCTATCAAGGAAT------------------CGAAAGCCAAC	22
				7	L747-A750del P ins	GCCGTCGCTATCAAGGAA------------cCATCTCCGAAAGCCAAC	23
8	L747-S752 del S ins	GCCGTCGCTATCAAGGAA------------------CCGAAAGCCAAC	24
				9	E746-T751 del V ins	GCCGTCGCTATCAAGG------------------tTCCGAAAGCCAAC	25
10	L747-A750del	GCCGTCGCTATCAAGGAAT------------CATCTCCGAAAGCCAAC	26
				12	L747-S752 del Q ins	GCCGTCGCTATCAAGGAA------------------CaGAAAGCCAAC	27
13	E747-S752 del V ins	GCCGTCGCTATCAAGG---------------tATCTCCGAAAGCCAAC	28
				14	L747_S752 del，E746V	GCCGTCGCTATCAAGGt------------------TCCGAAAGCCAAC	29
15	E746-A750 del V ins	GCCGTCGCTATCAA------------------AatTCCGAAAGCCAAC	30
				17	L747-E749，T751-S752 de	GCCGTCGCTATCAAGGAA----------CAA-----CCGAAAGCCAAC	31

<EGFR多态性检测探针>

在后述的EGFR基因多态性检测方法中，使用用于检测作为检测对象的EGFR基因多态性的EGFR基因多态性检测探针(以下仅称为“多态性检测探针”)。

作为所述多态性检测探针，可以是可检测在与所述多态性检测试验用寡核苷酸的扩增抑制靶标位点对应的位置具有突变的多态性的多态性检测探针，另外可以是可检测在与该扩增抑制靶标位点对应的位置具有缺失的多态性的多态性检测探针。

这样的多态性检测探针具体可以是可与和含有序列编号1所示的碱基序列的第115位～第123位碱基的碱基序列互补的核酸杂交的序列即可。有时将与含有序列编号1所示的碱基序列的第115位～第123位碱基的碱基序列互补、并且可与多态性检测探针杂交的碱基序列称为“靶标序列”。

探针的长度无特别制限，可以为5mer～50mer，也可以为10mer～30mer。若探针的长度在这样的范围内，例如能够提高检测灵敏度。

所述多态性检测探针也可以具有相对于所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基序列具有45％以上的同一性的碱基序列。如此通过将所述多态性检测探针设为相对于所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基序列具有45％以上的同一性的探针，例如能够提高对含有突变型的EGFR基因的试样核酸的灵敏度。所述多态性检测探针相对于所述多态性检测试验用寡核苷酸的同一性可以设为55％以上，也可以设为65％以上，也可以设为80％以上。

另外，只要多态性检测探针的序列中含有与作为检测对象的突变(例如缺失)位点的5’末端侧的碱基对应的碱基则无特别限制。多态性检测探针的碱基序列中，与作为检测对象的突变(缺失)位点对应的碱基可以位于从探针的5’末端起数第5位或其以后，也可以位于第10位或其以后。若相对于突变位点的碱基在多态性检测探针中的位置为这样的位置，例如能够提高检测灵敏度。

另外，作为多态性检测探针的序列，可以为与野生型的序列对应的碱基序列，也可以进一步含有突变。作为多态性检测探针，可以为相对于序列编号1所示的碱基序列或其互补的序列具有70％～100％的同一性的寡核苷酸，也可以为具有80％～100％的同一性的寡核苷酸。通过将多态性检测探针的序列设为野生型的对应的碱基，例如能够提高检测灵敏度。

另外，作为多态性检测探针，可以为与序列编号1所示的碱基序列或其互补的序列在严谨条件下杂交的寡核苷酸，也可以为插入、缺失或取代了1个或2个以上碱基的寡核苷酸。

关于严谨条件，可以适用与多态性检测试验用寡核苷酸的部分中记载的条件相同的条件。另外，关于同一性、插入、缺失或取代的范围，也可以适用与多态性检测试验用寡核苷酸的部分中记载的范围相同的范围。

另外，在使多态性检测探针在扩增步骤中与引物共存并使用的情况下，为了防止探针自身成为DNA聚合酶的反应对象而延长，多态性检测探针可以在3’末端侧添加后述的荧光标记，也可以在探针的3’末端还添加磷酸基。

从检测效率的观点来看，多态性检测探针可以为带标记的标记探针。

作为标记探针的标记物质的具体例，例如可以举出荧光染料和荧光团。

所述多态性检测探针例如可以为与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度减少(淬灭)或增加的荧光标记探针。其中，可以为与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度减少的荧光标记寡核苷酸。

利用了这种荧光淬灭现象(Quenching phenomenon)的探针一般称为鸟嘌呤淬灭探针，已知为所谓Q Probe(注册商标)。其中可以举出一种寡核苷酸，其被设计成3’末端或5’末端为胞嘧啶(C)，并且被荧光染料标记以使该末端的C靠近鸟嘌呤(G)时发光变弱。

若使用这种探针，例如可以根据信号变动容易地确认杂交和解离。

除了使用Q Probe的检测方法之外，也可以应用公知的检测方式。作为这种检测方式，可举出Taq-man探针法、杂交探针(Hybridization Probe)法、分子信标(MolecularBeacon)法或MGB探针法等。

作为所述荧光染料无特别限制，例如可以举出荧光素、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等。这些荧光染料的市售产品例如可举出Pacific Blue、BODIPY FL、FluorePrime、Fluoredite、FAM、Cy3和Cy5、TAMRA等。

所述荧光标记寡核苷酸的检测条件无特别限制，可以根据使用的所述荧光染料适当确定。例如Pacific Blue能够在检测波长445～480nm下检测，TAMRA能够在波长585～700nm下检测，BODIPY FL能够在波长520～555nm下检测。如果使用具有这样的荧光染料的探针，则能够根据各个荧光信号的变动来容易地确认杂交和解离。可以按照通常的方法，例如日本专利文献特开2002-119291号公报等中记载的方法，来将所述荧光染料结合至寡核苷酸。

另外，在所述探针为用荧光染料等标记物质标记的标记化探针的情况下，例如为了调节要检测的荧光强度等的信号强度，也可以并用与所述标记化探针相同序列的未标记探针。该未标记探针例如可以在其3’末端添加有磷酸基。

<引物>

在后述的EGFR基因多态性检测方法中，在扩增含有作为检测对象的EGFR基因多态性的序列的情况下使用引物。

应用于核酸扩增的引物只要能够扩增含有作为目标检测对象的EGFR基因多态性的位点(例如，与缺失的碱基的区域对应的序列编号1所示的序列)的核酸则无特别限制。

关于这样的引物的设计，本领域技术人员基于根据序列编号1所示的碱基序列而适当设计。

引物的长度和Tm值可以为12～40mer和40℃～70℃，或者16mer～30mer和55℃～60℃。

另外，引物对的各引物的长度可以不同。另一方面，两个引物的Tm值可以大致相同(或者，两个引物的Tm值之差为5℃以内)。

<EGFR基因多态性检测方法>

本发明涉及的EGFR基因多态性检测方法包括：使用至少一种所述多态性检测试验用寡核苷酸来检测EGFR基因的多态性。

通过本检测方法，由于至少一种所述多态性检测试验用寡核苷酸与野生型的EGFR基因优先杂交，因此可以简便地区别野生型的EGFR基因和突变型的EGFR基因来高灵敏度地检测突变型的EGFR基因。

所述EGFR基因多态性检测方法只要是利用了所述多态性检测试验用寡核苷酸比起突变型EGFR基因核酸更优先与野生型EGFR基因核酸杂交的方法，则无特别限制。

作为这样的方法，例如可以举出利用核酸扩增的方法。若是利用了核酸扩增的方法，所述多态性检测探针的碱基序列与野生型EGFR基因核酸优先杂交的结果，野生型EGFR基因核酸的扩增被抑制，从而能够优先扩增突变型EGFR基因核酸。

具体地，所述EGFR基因多态性检测方法可以是包括以下步骤的多态性检测方法：准备具有可含有序列编号1所示的碱基序列的单链核酸的核酸试样(核酸试样准备步骤)；使所述多态性检测试验用寡核苷酸和所述单链核酸接触，来获得含有该多态性检测试验用寡核苷酸和该单链核酸且该单链核酸的核酸扩增被抑制的杂交体(第一杂交步骤)；对该多态性检测试验用寡核苷酸和该单链核酸接触时或者接触后的所述核酸试样进行核酸扩增(核酸扩增步骤)。通过采用这样的多态性检测方法，例如具有简便且灵敏度良好地检测EGFR基因多态性等优点。

所述核酸试样准备步骤中准备的核酸试样无特别限制，例如可以举出含有源自生物试样的核酸的试样。作为所述生物试样，例如可以举出大肠或肺等的组织、白血球细胞等血球、全血、血浆、吐出的痰、口腔粘膜等口腔内细胞、指甲和毛发等体细胞、生殖细胞、乳汁、腹水液、石蜡包埋组织、胃液、洗胃液、尿、腹膜液、羊水、细胞培养等任意的源自或者可以源自生物学起源的物质。此外，试样的采集方法、含有核酸的试样的制备方法等无特别限制，均可采用现有的公知方法。另外，作为模板的核酸可以从该起源得到后直接使用，或者为了改变所述样品的特性而经前处理之后使用。另外，可以将以源自生物试样的核酸为模板进行核酸扩增法的反应液作为本发明的核酸试样，将所述反应液中包含的扩增产物作为模板核酸序列。

例如，在将全血作为试样的情况下，可以通过现有的公知方法来从全血中分离基因组DNA。例如，可以使用市售的基因组DNA分离盒(商品名GFX Genomic Blood DNAPurification kit；GE Healthcare Bioscience公司制造)等。

试样例如可以是以下任意试样：含有不清楚目标碱基位点显示突变型还是正常型的核酸的试样、含有具有突变型的核酸和具有正常型的核酸的试样、可能含有具有突变型的核酸或具有正常型的核酸的试样。试样中的核酸、例如DNA、RNA等核酸的来源是不受限制的，例如可以举出各种癌细胞等细胞、病毒、线粒体等。本多态性检测方法特别优选应用于具有显示突变型的核酸和显示正常型的核酸的试样，例如优选应用于肺癌等各种癌细胞等生物试样，作为具体例优选应用于游离于血液中的细胞等。血液中包含的癌化的细胞中包括具有产生了突变型的核酸的细胞以及具有显示正常型的核酸的细胞，因此将本多态性检测方法应用于源自这样的细胞的核酸试样，从能够实现所需要的灵敏度的方面来说是优选的。在本发明中，试样的采集方法、核酸的制备方法等无特别限制，可以采用现有的公知方法。

试样中的核酸可以是单链也可以是双链。作为试样中的核酸序列，例如可以举出DNA以及总RNA、mRNA等RNA。另外，所述核酸序列例如可以举出生物试样等试样中包含的核酸。

试样中的核酸例如可以是生物试样中原本含有的核酸，例如从能够提高多态性检测的精度的角度来说，可以举出以所述生物试样中的核酸为模板通过核酸扩增法扩增的扩增产物。作为具体例，例如可以举出以所述生物试样中原本含有的DNA为模板通过核酸扩增法扩增而得的扩增产物、或以从所述生物试样原本含有的RNA通过逆转录-PCR反应(RT-PCR：Reverse Transcription PCR)而生成的cDNA为模板，通过核酸扩增法扩增而得的扩增产物。也可以将这些扩增产物作为本发明的模板核酸序列。所述扩增产物的长度无特别限制，例如50～1000碱基，优选80～200碱基。

第一杂交步骤通过使所述多态性检测试验用寡核苷酸和所述单链核酸接触，来获得含有该多态性检测试验用寡核苷酸和该单链核酸并且该单链核酸的核酸扩增被抑制的杂交体。所述杂交体可通过在所述多态性检测试验用寡核苷酸和单链核酸可杂交的条件下进行杂交而获得。

第一杂交步骤中的可杂交的条件可以直接应用为了使单链核酸彼此杂交而通常应用的条件，可以直接采用在后述的引物和单链核酸杂交时应用的条件。由此，通过多态性检测试验用寡核苷酸和具有序列编号1所示的碱基序列的单链核酸而获得杂交体。该杂交体是由试样中的单链核酸与多态性检测试验用寡核苷酸形成的双链核酸，因此对构成杂交体的核酸序列的核酸扩增被抑制。

所述多态性检测试验用寡核苷酸可以添加到核酸试样、例如含有分离出的基因组DNA的液体试样中，也可以在适当的溶剂中与基因组DNA混合。所述溶剂无特别限制，例如可以举出Tris-HCl等缓冲液、含有KCl、MgCl₂、MgSO₄、甘油等的溶剂、PCR反应液等目前公知的溶剂。

另外，所述多态性检测试验用寡核苷酸与试样中的作为检查对象的单链核酸的接触无特别限制，例如可以向含有预定量核酸的试样中添加多态性检测试验用寡核苷酸使之达到预定的量比。

在第一杂交步骤中，作为检查对象的试样优选含有所述多态性检测试验用寡核苷酸和所述多态性检测探针。由此，具有简便且灵敏度良好地检测EGFR基因多态性等优点。

在本发明中，试样中的核酸中的所述多态性检测探针的添加比例(摩尔比)相对于检测对象核酸(含有检测对象序列的扩增产物)，可以为10倍以下，也可以为5倍以下，也可以为3倍以下。另外，其下限无特别限制，例如可以为0.0001倍以上，也可以为0.001倍以上，也可以为0.01倍以上。

这里，试样中的核酸例如可以是发生了检测目标多态性的检测对象核酸和未发生所述多态性的非检测对象核酸的合计，也可以是含有发生了检测目标多态性的检测对象序列的扩增产物和含有未发生所述多态性的非检测对象序列的扩增产物的合计。

此外，所述多态性检测探针相对于所述核酸的添加比例例如可以为相对于双链核酸的摩尔比，也可以为相对于单链核酸的摩尔比。

反应体系中的多态性检测探针的添加比例无特别限制，例如，可以将所述探针设为10nmol/L～400nmol/L，也可以设为20nmol/L～200nmol/L。

核酸扩增步骤中的核酸扩增对与多态性检测试验用寡核苷酸接触时或者接触后的核酸试样进行。如果是在试样中所述杂交体形成基本完成之后，则核酸扩增处理可以在第一杂交步骤之后，也可以与其几乎同时进行。由此，可以对没有通过第一杂交步骤构成杂交体的核酸试样中的单链核酸进行核酸扩增。

在扩增步骤中，使核酸试样和引物对接触，以核酸试样中的核酸序列为模板核酸序列进行核酸的扩增。此时，各引物在相同的试样(相同的反应液)中分别与模板核酸序列退火，从而核酸开始被扩增。此外，本发明的模板核酸序列中包含含有所述扩增抑制靶标位点的野生型的模板核酸序列。

在扩增步骤中，扩增反应的反应体系(例如，反应液)中的所述核酸试样的添加比例无特别限制。作为具体例，所述核酸试样为生物试样(例如，全血试样)时，所述反应体系中的添加比例的下限例如可以为0.01体积％以上，也可以为0.05体积％以上，也可以为0.1体积％以上。另外，所述添加比例的上限无特别限制，例如可以为2体积％以下，也可以为1体积％以下，也可以为0.5体积％以下。

另外，在后述的突变检测中，例如在进行使用标记化探针的光学检测的情况下，所述反应体系中的全血试样等生物试样的添加比例例如也可以为0.1～0.5体积％。若为该范围，例如能够充分防止变性引起的沉淀物等的产生所造成的影响，能够提高光学方法的测定精度。另外，由于全血试样中的杂质对核酸扩增PCR的阻碍也被充分抑制，因此还可期待能够进一步提高扩增效率。

另外，在扩增反应开始之前，优选向反应体系还添加白蛋白。通过添加这样的白蛋白，例如能够进一步降低产生沉积物或浑浊造成的影响，并且能够进一步提高扩增效率。

反应体系中的白蛋白的添加比例例如可以为0.01质量％～2质量％，可以为0.1质量％～1质量％，也可以为0.2质量％～0.8质量％。作为所述白蛋白无特别限制，例如可举出牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白、大鼠血清白蛋白和马血清白蛋白。这些白蛋白可使用一种也可以并用两种以上。

作为扩增步骤中的核酸扩增法，例如可以举出使用聚合酶的方法等。作为其示例，例如可举出PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction)法、ICAN法、LAMP法、NASBA(基于核酸序列的扩增，Nucleic Acid Sequence Based Amplification)法、TMA(转录介导的扩增，Transcription Mediated Amplification)法、SDA(链置换扩增，StrandDisplacement Amplification)法等。此外，核酸扩增法的条件无特别限制，可以使用现有的公知方法进行操作。

关于扩增步骤中的扩增，以PCR法为例进行说明，但本发明不限于此。PCR的条件无特别限制，能够通过现有的公知方法来进行。

所述反应液中的其他组成成分无特别限制，可以举出现有的公知成分，其比例也无特别限制。作为所述组成成分，例如可以举出DNA聚合酶、三磷酸核苷(dNTP)等核苷酸和溶剂等。向反应溶液添加每种组分的顺序无任何限制。

作为PCR法中使用的DNA聚合酶，能够无特别限制地使用通常所用的DNA聚合酶。例如，能够举出GeneTaq(NIPPON GENE公司制)、PrimeSTAR Max DNA聚合酶(Takara Bio公司制)、Taq聚合酶等。

作为聚合酶的使用量，只要是本领域通常使用的浓度则无特别限制。例如，在使用Taq聚合酶的情况下，例如可以相对于反应溶液量10μL设为0.01U～10U的浓度，也可以相对于反应溶液量10μL设为0.05U～1U。由此，具有能够提高所述多态性检测试验用寡核苷酸的野生型核酸亲和性的倾向。

PCR的方法使用一般的步骤，温度和循环数等条件无特别限制。各步骤的温度变化例如可以使用热循环仪等来自动控制。

本发明的多态性检测方法可以还包括多态性评价步骤，多态性评价步骤可以包括下述(I)～(IV)的各步骤，另外也可以包括下述步骤(V)。

(I)使所述多态性检测探针和试样中的单链核酸接触，来获得由所述多态性检测探针和所述单链核酸杂交的杂交体(称为第二杂交步骤)。

(II)通过改变含有所述杂交体的试样的温度来使所述杂交体解离，并测定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动(称为测定步骤)。

(III)基于所述荧光信号的变动来测定杂交体的解离温度、即Tm值(Tm值测定步骤)。

(IV)基于所述Tm值来检测所述试样中的单链核酸中的、EGFR基因中的多态性的存在(多态性检测步骤)。

(V)基于所述多态性的存在来检测所述试样中的单链核酸中的、具有多态性的单链核酸的丰度比(多态性丰度比检测步骤)。

通过这样的多态性检测方法，能够简便且灵敏度良好地检测并评价EGFR基因多态性。

作为应用于第二杂交步骤中的杂交的方法和条件无特别限制，可以直接应用以使双链核酸序列变性形成单链核酸序列、以及使单链核酸序列彼此杂交为目的的在本领域中已知的条件。

例如，解离中的加热温度只要是所述扩增产物能够解离的温度则无特别限制，例如85℃～95℃。加热时间无特别限制，通常为1秒～10分钟，也可以是1秒～5分钟。另外，解离的单链核酸序列与多态性检测探针之间的杂交例如在解离后可通过降低解离时的加热温度来进行。温度条件例如为40℃～50℃。

另外，在本说明书中，扩增产物中的“单链核酸序列”这一术语也包括作为试验对象的最初的核酸试样中的单链核酸序列。

在测定步骤中，改变含有杂交体的试样的温度来使所述杂交体解离，并测定基于所述杂交体的解离的信号的变动。

显示所述单链核酸和多态性检测探针间的杂交体的熔解状态的信号值的测定可以测定260nm的吸光度，也可以测定如下信号：所述信号是基于添加于所述多态性检测用探针的标记的信号的信号，并且该信号根据单链DNA和所述多态性检测用探针的杂交体形成的状态而变动。通过测定标记物质的信号，例如能够提高检测灵敏度。

作为标记探针，例如可以举出与靶标序列(互补序列)杂交时的荧光强度比未靶标序列杂交时的荧光强度减少(淬灭)的荧光标记寡核苷酸、或者与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度增加的荧光标记寡核苷酸。

如果是前者那样的探针，则在与检测对象序列形成了杂交体(例如双链DNA)时，不显示荧光信号或荧光信号弱，但通过加热而探针解离时就会显示荧光信号或者荧光信号增加。

另外，如果是后者的探针，则通过与检测对象序列形成杂交体(例如双链DNA)而显示荧光信号，通过加热而探针解离时荧光信号减少(消失)。因此，通过在信号特有的条件(吸收波长等)下检测基于该标记的信号的变化，能够与所述260nm的吸光度测定同样地，确定熔解的发生以及Tm值。

基于杂交体的解离的信号的变动通过改变反应液的温度来进行。例如，加热所述反应液，即慢慢加热所述单链DNA和所述标记化探针的杂交体，测定伴随温度上升的信号的变动。例如，在使用了Q Probe时，在与单链DNA杂交了的状态下，与解离的状态相比荧光强度减少(或淬灭)。因此，例如将荧光减少(或淬灭)的杂交体慢慢加热并测定随温度上升的荧光强度的增加即可。另外，在使用所述标记探针时，例如能够在与所述标记探针的标记物质相对应的条件下测定所述信号值。

对荧光强度的变动进行测定时的温度范围无特别限制，例如起始温度可以为室温～85℃，或25～70℃。结束温度例如可以为40～105℃。另外，温度的上升速度无特别限制，例如可以为0.1℃/秒～20℃/秒，或0.3℃/秒～5℃/秒。

在Tm值测定步骤中，分析所述测定步骤中获得的信号的变动来确定Tm值。具体地，基于所得的荧光强度计算各温度下的微分值(-d荧光强度/dt)，将显示最低值的温度确定为Tm值。或者，例如在计算各温度下每单位时间的荧光强度变化量、并将该变化量作为(-d荧光强度增加量/dt)的情况下，例如可以将显示最低值的温度确定为Tm值。另外，在将变化量作为(d荧光强度增加量/dt)的情况下，例如也可以将最高点确定为Tm值。在作为标记探针采用单独不显示信号且由于杂交体形成而显示信号的探针而不采用淬灭探针的情况下，相反地测定荧光强度的减少量即可。

Tm值例如能够通过现有公知的MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com/)等计算，另外也能够通过最邻近碱基对法(Nearest Neighbor Method)来确定。

在多态性检测步骤中，基于确定的Tm值来检测EGFR外显子19的多态性的存在。另外，在任意的多态性丰度比检测步骤中，基于确定的Tm值来检测具有EGFR外显子19的多态性的单链核酸的丰度比。

不仅评价杂交体的解离温度，而且还包括评价在杂交体熔解时根据温度而变动的荧光信号的微分值的大小。通过微分值的大小，能够评价具有多态性的碱基序列(DNA)的丰度比。

在本发明中，如前所述，对杂交体进行加热，并测定伴随温度上升的信号变动(优选荧光强度的增加)，但替代该方法，例如也可以测定杂交体形成时的信号变动。即，可以测定在降低含有所述探针的反应液的温度来形成杂交体时随所述温度下降的荧光信号变动。

作为具体例，在使用了单独显示信号且通过杂交体形成而不显示信号的标记探针(例如，Q Probe)的情况下，在单链核酸序列和标记化探针解离的状态下发出荧光，但当由于温度下降而形成杂交体时，所述荧光减少(或淬灭)。因此，例如慢慢降低所述反应液的温度并测定伴随温度下降的荧光强度的减少即可。另一方面，在使用了单独不显示信号且通过杂交体形成而显示信号的标记探针的情况下，在单链核酸序列和标记化探针解离的状态下不发出荧光，但当由于温度下降而形成杂交体时，发出荧光。因此，例如慢慢降低所述反应液的温度并测定伴随温度下降的荧光强度的增加即可。

在定量测定EGFR外显子19的突变型和野生型的核酸序列的丰度比时，优选预先创建制作突变型和野生型各自的核酸序列而获得的校准曲线，并基于此检测每个的丰度比。

下面说明创建校准曲线的示例。

首先，例如制备野生型核酸Wt和突变型核酸Mt这两种类型的核酸的丰度比互不相同的多个核酸混合物，针对多个核酸混合物中的每一个，使用熔解曲线分析装置获得熔解曲线。

图1A示出以某一个核酸混合物的温度与吸光度或荧光强度等检测信号之间的关系表示出的熔解曲线；以及图1B示出以温度与检测信号的微分值之间的关系表示出的熔解曲线(也称微分熔解曲线)。通过从微分熔解曲线检测峰来检测核酸Wt的熔解温度Tm_W和核酸Mt的熔解温度Tm_M，分别设定含有Tm_W和Tm_M的各个温度范围。

作为包含Tm_W的温度范围ΔT_W，例如可以设定以在Tm_W和Tm_M之间检测信号的微分值为最小时的温度作为下限、并以与检测信号的峰的尾部(裾野)对应的温度作为上限的温度范围。另外，作为包含Tm_M的温度范围的ΔT_M，例如可以设定以在Tm_W和Tm_M之间检测信号的微分值为最小时的温度作为上限、并将与检测信号的峰的尾部对应的温度作为下限的温度范围。

温度范围ΔT_W及温度范围ΔT_M可以被设定为二者具有相同幅度(例如，10℃)或不同幅度(例如，温度范围ΔT_W为10℃，温度范围ΔT_M为7℃)。另外，温度范围ΔT_W及温度范围ΔT_M也可以被设定为具有从各自的熔解温度Tm加X℃、减X℃的范围(X℃例如为15℃以下，优选为10℃以下)。

接着，针对温度范围ΔT_W及温度范围ΔT_M的每一个，计算由经过与微分熔解曲线的温度范围的下限对应的点及与上限对应的点的直线和微分熔解曲线所包围的面积(图1(B)的斜线部分)。作为计算面积的方法的示例，具体而言，可以如下计算。将温度T中的荧光强度的微分值设为f(T)，将温度T中的基准值设为B(T)，通过下述(1)式求出。

面积S＝{f(T_s+1)-B(T_s+1)}+{f(T_s+2)-B(T_s+2)}+…+{f(T_e-1)-B(T_e-1)}…(1)

其中，T_s为各温度范围中的下限值、T_e为上限值。另外，各温度T的基值B(T)为通过下述(2)式求得的值，表示检测信号中所含的本底水平。通过从荧光强度的微分值中减去该基值，来去除荧光强度的检测信号中所含的本底的影响。

B(T)＝a×(T-T_s)+f(T_s)…(2)

其中，a＝{f(T_e)-f(T_s)}/(T_e-T_s)。

根据上述(1)式和(2)式，针对各核酸混合物，计算温度范围ΔT_W中的面积S_W和温度范围ΔT_W中的面积S_M，创建表示面积比与各核酸混合物的丰度比之间的关系的校准曲线。例如，可以是取丰度比(核酸Mt相对于核酸混合物总量的比例)为横轴，取面积比(S_M/S_W)为纵轴的校准曲线。此外，面积比也可定义为S_W/S_M。

能够基于使用实际试样而获得的熔解曲线和微分熔解曲线来计算面积比，并基于如上述那样预先绘制的校准曲线来确定实际样品中包含的具有多态性的碱基序列的丰度比。

另外，能够根据野生型和突变型的各个峰的存在来计算丰度比，也可以通过单纯确认峰的存在来检测EGFR基因中多态性的存在(有无)。

<EGFR酪氨酸激酶抑制剂的判定方法>

本发明的EGFR酪氨酸激酶抑制剂的判定方法包括：通过上述的多态性检测方法来检测EGFR基因的多态性(基因多态性检测步骤)；以及基于所述检测结果来判定对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的耐受性或EGFR酪氨酸激酶抑制剂的药效(药效判定步骤)。

在上述的多态性检测方法中，由于使用本发明的多态性检测试验用寡核苷酸来高灵敏度且简便地检测EGFR外显子19多态性，因此能够基于EGFR外显子19的该多态性来高灵敏度且简便地进行EGFR酪氨酸激酶抑制剂的判定。

EGFR酪氨酸激酶抑制剂的判定方法中的基因多态性检测步骤，可以与上述的EGFR基因的多态性检测方法中描述的内容相同。

EGFR酪氨酸激酶已知根据EGFR外显子19的多态性而反应性不同。具体地，在EGFR基因为突变型时，能够判定可期待EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生的肿瘤缩小的效果。

通过本发明的EGFR酪氨酸激酶抑制剂的判定方法，能够高可靠性且简便地对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的效果进行预测。

作为可成为药效判定对象的EGFR酪氨酸激酶抑制药，只要特异性抑制EGFR酪氨酸激酶即可，例如可举出吉非替尼、厄洛替尼等。

作为EGFR外显子19多态性的药效判定的具体方法是已知的，例如记载在Journalof Thoracic Oncology：March 2006-Volume 1-Issue 3-pp260-267(EGFR Mutation ofTumor and Serum in Gefitinib-Treated Patients with Chemotherapy-Naive Non-small Cell Lung Cancer)中。

<试剂盒>

用于检测本发明的EGFR基因的多态性的EGFR多态性检测试验用试剂盒包含上述的多态性检测试验用寡核苷酸。

该试剂盒中含有可用于简便且灵敏度良好地检测EGFR外显子19的多态性并可与上述扩增抑制靶标区域杂交的上述多态性检测试验用寡核苷酸，因此该试剂盒能够更简便地进行EGFR基因的多态性的检测。

另外，本试剂盒中还可以包含可与含有作为靶标的EGFR基因的多态性位点的区域杂交的所述探针，而且还可以包含可扩增含有作为所述靶标的EGFR基因多态性位点的核酸的所述引物对。由此，本发明的多态性检测试验用试剂盒能够更简便且精度良好地进行EGFR基因的多态性的检测。关于本试剂盒中可包含的探针和引物，可以直接适用前述的内容。

所述试剂盒中包含的各个试剂可以包含在不同的容器中，也可以包含在相同的容器中。此外，本说明书中的“不同的容器”是指只要各试剂被分开以维持非接触状态即可，不一定非要容纳在可独立处理的单独的容器中。

本试剂盒，除上述之外，还可以包含扩增所需的聚合酶等试剂或缓冲液、杂交所需的试剂或缓冲液、用于稀释待测试样的稀释剂等。另外，本试剂盒中优选包含记载了前述的多态性检测方法的说明书、关于试剂盒中可包含或者添加包含的各种试剂的使用说明书等。

实施例

下面通过实施例详细说明本发明。但本发明不限于此。此外，只要不特别指出，“部”或“％”为质量基准。

[实施例1～3]

使用热循环仪(商品名Mastercycler ep gradient S、eppendorf公司制)和全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)，爱科来公司制)、以及下述表3～5中记载的处方的检查用试剂，进行了PCR和Tm分析。此外，使用的聚合酶为Taq聚合酶。

在PCR中，在95℃下处理60秒之后，以95℃、1秒以及54℃、15秒为一个循环，反复进行了50个循环。

另外，Tm分析在PCR之后，在95℃下处理1秒，在40℃下处理60秒，接着以温度上升速度1℃/3秒将温度从40℃升高到75℃，并测定了其间荧光强度随时间的变化。将激发波长设为420nm～485nm、测定波长设为520～555nm，分别测定了源自荧光标记探针的荧光强度的变化。已知在野生型基因的情况下在66℃附近确认到峰，在突变型基因的情况下在51℃附近和66℃附近确认到峰。

为了抑制试样中的单链核酸的核酸扩增而使用的本发明涉及的多态性检测试验用寡核苷酸(以下称为WI核酸)，设为具有与序列编号1的第104位～第143位相同的序列的Cmp-1(序列编号2、实施例1)、具有与序列编号1的第104位～第132位相同的序列的Cmp-2(序列编号3、实施例2)、或者具有与序列编号1的第115位～第142位相同的序列的Cmp-3(序列编号4、实施例3)，并分别使用了0.2μM或0.4μM。

野生型的EGFR外显子19的序列如序列编号1所示。

作为突变型的EGFR外显子19使用了E746_A750del(表2，No.2)。

探针采用了识别序列编号1的第104～136位的序列、并在5’末端具有标记的5FP-EGFR-EX19-WT-FW-3(5’-(FL)-CCCGTCGCTATCAAGTAATTAAGAGAAGCAACA：序列编号35)。F引物(正向引物)采用了与序列编号1的第54～73位的序列对应的EGFR-EX19-F2(TCTCTCTGTCATAGGGACTC：序列编号33)，R引物(反向引物)采用了序列编号1的第155～175位的碱基对应的EGFR-EX19-R1(GAAACTCACATCGAGGATTTC：序列编号34)。模板核酸序列采用了1×10³拷贝/μL的精制人类基因组(Roche公司制)以及1×10³拷贝/μL的质粒(Genescript公司制)，其中该质粒通过以10∶990的比例(突变型混合比1％)混合野生型的基因序列(序列编号1)和突变型的基因序列(相应于序列编号36、表2的No.2)而获得。

此外，各序列如表6所示。

通过Tm分析，获得了显示探针的荧光值的变化量的图。

结果示于图2～图4。此外，图2的(A)、图3的(A)和图4的(A)、以及图2的(C)、图3的(C)和图4的(C)示出了仅将基因组DNA用作模板核酸序列的情况(野生型100％)，图2的(B)、图3的(B)和图4的(B)、以及图2的(D)、图3的(D)和图4的(D)示出了将以预定比例混合了野生型的基因序列和突变型的基因序列而得的质粒DNA用作模板核酸序列的情况。另外，在各图中，图2的(A)、图3的(A)和图4的(A)、以及图2的(B)、图3的(B)和图4的(B)示出了WI核酸浓度为0.2μM的情况，图2的(C)、图3的(C)和图4的(C)以及图2的(D)、图3的(D)和图的4(D)示出了WI核酸浓度为0.4μM的情况。图中，横轴表示温度(℃)，纵轴表示荧光值的变化量。

表3

实施例1

(反应液量10μl)	试样1-0.2	试样1-0.4
			1×PCR缓冲液
dNTP	0.2mM	0.2mM
			MgCl2	1.5mM	1.5mM
Taq聚合酶	0.376U	0.376U
			探针	0.1μM	0.1μM
F引物	1μM	1μM
			R引物	4μM	4μM
Cmp-1	0.2μM	0.4μM

表4

实施例2

(反应液量10μl)	试样2-0.2	试样2-0.4
			1×PCR缓冲液
dNTP	0.2mM	0.2mM
			MgCl2	1.5mM	1.5mM
Taq聚合酶	0.376U	0.376U
			探针	0.1μM	0.1μM
F引物	1μM	1μM
			R引物	4μM	4μM
Cmp-2	0.2μM	0.4μM

表5

实施例3

(反应液量10μl)	试样3-0.2	试样3-0.4
			1×PCR缓冲液
dNTP	0.2mM	0.2mM
			MgCl2	1.5mM	1.5mM
Taq聚合酶	0.16U	0.16U
			探针	0.1μM	0.1μM
F引物	1μM	1μM
			R引物	4μM	4μM
Cmp-3	0.2μM	0.4μM

表6

	(5’→3’)	mer	序列编号
				WI核酸
Cmp-1	CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGA-(P)	40	2
				Cmp-2	CCCGTCGCTATCAAGTAATTAAGAGAAGC-(P)	29	3
Cmp-3	CAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCG-(P)	28	4
				Cmp-C1	TAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAAC-(P)	29	32
引物
				F引物	TCTCTCTGTCATAGGGACTC	20	33
R引物	GAAACTCACATCGAGGATTTC	21	34
				探针
探针	CCCGTCGCTATCAAGTAATTAAGAGAAGCAACA	33	35

如图2和图3所示，在仅基因组DNA的核酸试样(野生型100％)的情况下只在66℃附近确认到峰，在包含质粒DNA的核酸试样(突变型1％)的情况下能够清楚确认到51℃附近的峰。该倾向即使改变WI核酸的浓度也一样，由此得知通过增加WI核酸的浓度能够更灵敏地检测突变型核酸序列。

另外，如图4所示，在将DNA聚合酶的浓度设为相对于实施例1和2的一半以下的0.16U的实施例3中，突变型核酸的峰比起实施例1和实施例2时变得更为清楚。

在以上的实施例中，使用的探针与WI核酸序列间的重复碱基序列数分别为33mer(Cmp-1、100％)、29mer(Cmp-2、87.9％)、22mer(Cmp-2、66.7％)。由该结果可知，在探针与WI核酸序列间重复的碱基数的比例为66.7％(22mer/33mer)以上的情况下，能够高灵敏度地检测突变型核酸。

[比较例1～比较例4]

在比较例1中，除了使用具有与序列编号1的第123位～第151位相同的序列的Cmp-C1(序列编号32，参见表6)作为WI核酸序列之外，与实施例1同样地进行了多态性检测。结果示于图5。

在比较例2中，除了使用不含有WI核酸序列和探针的反应液、在PCR反应后向各试样中添加探针使其最终浓度为1μM之外，与实施例1同样地进行了多态性检测。PCR反应用试剂的各成分示于表7。结果示于图6。

在比较例3中，除了使用具有与序列编号1的第123位～第151位相同序列的Cmp-C1作为WI核酸序列、并将DNA聚合酶变更成0.16U之外，与实施例1同样地进行了多态性检测。结果示于图7。

在比较例4中，除了使用0.16U的DNA聚合酶之外，与比较例2同样地进行了多态性检测。结果示于图8。

在图5～图8中，图5的(A)、图6的(A)、图7的(A)和图8的(A)、以及图5的(C)、图6的(C)、图7的(C)以及图8的(C)示出了仅将基因组DNA用作模板核酸序列的情况(野生型100％)，图5的(B)、图6的(B)、图7的(B)和图8的(B)、以及图5的(D)、图6的(D)、图7的(D)和图8的(D)示出了将以预定比例混合野生型的基因序列和突变型的基因序列而得的质粒DNA用作模板核酸序列的情况。另外，各图中，图5的(A)、图6的(A)、图7的(A)和图8的(A)、以及图5的(B)、图6的(B)、图7的(B)和图8(B)示出了WI核酸浓度为0.2μM的情况，图5的(C)、图6的(C)、图7的(C)和图8的(C)、以及图5的(D)、图6的(D)、图7的(D)和图8(D)示出了WI核酸浓度为0.4μM的情况。图中，横轴表示温度(℃)，纵轴表示荧光值的变化量。

表7

比较例2

(反应液量10μl)	试样C1
		1×PCR缓冲液
dNTP	0.2mM
		MgCl2	1.5mM
Taq聚合酶	0.376U
		F引物	1μM
R引物	4μM

如图5所示，在使用了不含与序列编号1的第115位～第123位的扩增抑制靶标核酸对应的序列的WI核酸序列的情况下，在将基因组DNA作为模板核酸序列的情况和在质粒DNA作为模板序列的情况这两个情况下均确认到表示突变型的61℃的峰，因此不能进行判定。

另外，比较例1中使用的比较用WI核酸序列Cmp-C1和多态性检测探针的重复碱基序列数为14mer，多态性检测探针与WI核酸序列间重复的碱基数的比例为42.4％(14mer/33mer)。由该结果可知，在WI核酸序列与多态性检测探针的重复碱基序列数的比例为42.4％(14mer/33mer)的情况下，确认不到显示野生型的峰。

另外，如图6所示，在不存在WI核酸的情况下进行PCR反应时，确认不到显示突变型的峰，不能检测突变型。

这样的倾向在减少了DNA聚合酶的量的情况下也一样(参见图7和图8)。

[实施例4]

使用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)，爱科来公司制)进行PCR反应和Tm分析，并且使用如表8所示那样变更了模板核酸序列的种类的试样A～J(突变型质粒的序列参见表8，野生型质粒的序列为序列编号1)，并如表9所示那样变更了PCR反应液的各成分，除此之外与实施例1同样地进行了多态性检测。此外，使用的聚合酶为Taq聚合酶。

此外，各试样中的模板核酸序列使用了1×10³拷贝/μL的质粒(Genescript公司制)，该质粒通过将野生型的基因序列(序列编号1)和表8所示的突变型的各基因序列以达到表8所示的混合比的方式混合而获得。关于表8所记载的突变种类，No.2和No.3表示E746_A750del，No.4表示L747_E749del，A750P，No.6表示L747_S752del，P753S(参见表2)。

可见在野生型的基因的情况下，在66℃附近确认到峰，在突变型的基因的情况下，根据突变型的种类分别在51℃附近和66℃附近确认到峰。

结果示于图9和图10。

表8

		突变种类	混合比(％)	备注
					试样A	人基因组	-	0.0	-
试样B	质粒	No.2	0.3	序列编号36
					试样C	质粒	No.3	0.3	序列编号37
试样D	质粒	No.4	0.3	序列编号38
					试样E	质粒	No.6	0.3	序列编号39
试样F	质粒	No.2	0.1	序列编号36
					试样G	质粒	No.2	1.0	序列编号36
试样H	质粒	No.2	5.0	序列编号36
					试样I	质粒	No.2	10.0	序列编号36
试样J	质粒	No.2	50.0	序列编号36

表9

实施例4

(反应液量10μl)
		1×PCR缓冲液
dNTP	0.14mM
		MgCl2	1.07mM
Taq聚合酶	0.16U
		探针	0.07μM
F引物	0.71μM
		R引物	2.86μM
Cmp-1	0.14μM

如图9所示，关于仅含野生型的试样A，仅确认到66℃附近的峰(参见图9的(A))，另一方面，关于含有各突变型的试样B～E(图9的(B)～图9的(E))，除了66℃附近的峰之外还确认到表示各突变型的51～54℃的清楚的峰，由此可知不管突变型的种类如何，都能够使用WI核酸序列来检测突变型。

另外，如图10所示，可知即使将突变的混合比变更成0.1％、1％、5％、10％和50％，突变型也能够依赖于混合比地作为具有与混合比相对应的大小的峰被检测到(参见图10的(A)～图10的(E))。

[实施例5和比较例5]

在使用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)，爱科来公司制)进行PCR反应和Tm分析的同时，使用将WI核酸的浓度变更为0.03μM、0.06μM、0.12μM或0.18μM的PCR反应液(试样5-1～5-4、实施例5)或者不含WI核酸的PCR反应液(试样5-5、比较例5)，并在PCR反应后添加探针使其最终浓度为每试样1μM，除此之外与实施例1同样地进行了多态性检测。试样核酸采用了以％的突变型混合率含有突变型(No.2)和野生型的质粒DNA。各试样的处方如表10所示。

结果示于图11。图11的(A)示出了WI核酸的浓度为0.03μM的试样5-1的结果，图11(B)示出了WI核酸的浓度为0.06μM的试样5-2的结果、图11(C)示出了WI核酸的浓度为0.12μM的试样5-3的结果，图11(D)示出了WI核酸的浓度为0.18μM的试样5-4的结果，图11(E)示出了WI核酸的浓度为0的试样5-5的结果。

表10

实施例5

(反应液量10μl)	试样5-1	试样5-2	试样5-3	试样5-4
					1×PCR缓冲液
dNTP	0.2mM	0.2mM	0.2mM	0.2mM
					MgCl2	1.5mM	1.5mM	1.5mM	1.5mM
Taq聚合酶	0.21U	0.21U	0.21U	0.21U
					F引物	1μM	1μM	1μM	1μM
R引物	4μM	4μM	4μM	4μM
					Cmp-1	0.03μM	0.06μM	0.12μM	0.18μM

如图11的(A)～(D)所示，在含有不同浓度的WI核酸的试样5-1～5-4中，确认到野生型的66℃附近的峰和突变型的51℃附近的峰两者。能够看得出突变型的峰根据WI核酸的浓度而变大。

与此相对，如图11的(E)所示，在不含WI核酸的试样5-5中，显示突变型的51℃附近的峰不清楚。

如此，通过本发明，能够简便且高灵敏度地检测EGFR外显子19的多态性。

Claims

1.一种EGFR多态性检测试验用试剂盒，包含：具有从序列编号2至4的组中选择的碱基序列且3’末端侧被进行了延长抑制处理的多态性检测试验用寡核苷酸；能够与含有作为靶标的EGFR外显子19的多态性位点的核酸序列杂交且用荧光染料标记了的、具有序列编号35的碱基序列的探针；以及能够扩增含有作为所述靶标的EGFR外显子19多态性位点的核酸序列的引物对。

2.根据权利要求1所述的EGFR多态性检测试验用试剂盒，所述3’末端侧的延长抑制处理为磷酸基的添加。

3.根据权利要求1所述的EGFR多态性检测试验用试剂盒，所述寡核苷酸包含用荧光染料标记了的碱基。