CN102076849A - 核酸扩增的对照的检测方法及其用途 - Google Patents

核酸扩增的对照的检测方法及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN102076849A
CN102076849A CN200980124610XA CN200980124610A CN102076849A CN 102076849 A CN102076849 A CN 102076849A CN 200980124610X A CN200980124610X A CN 200980124610XA CN 200980124610 A CN200980124610 A CN 200980124610A CN 102076849 A CN102076849 A CN 102076849A
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
mentioned
nucleic acid
contrast
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN200980124610XA
Other languages
English (en)
Inventor
平井光春
间嶋智史
中嶋真也
镰田达夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Arkray Inc
Original Assignee
Arkray Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Arkray Inc filed Critical Arkray Inc
Publication of CN102076849A publication Critical patent/CN102076849A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/107—Temperature of melting, i.e. Tm
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明的目的在于提供一种在一个反应体系中简便地同时检测阳性对照和阴性对照的对照检测方法。在对照检测用的反应体系中添加对照用模板核酸进行扩增反应。上述模板核酸能够通过能够扩增目的标的序列的引物进行扩增，在利用上述引物扩增的上述对照用模板核酸的扩增区域中，能够与上述标的序列杂交的检测用探针能够进行杂交，利用上述引物扩增的上述对照用模板核酸的扩增区域和上述检测用探针的Tm值(TmC)设定为与上述标的序列和上述检测用探针的Tm值(TmA)不同的值。由此，通过在上述TmC有无峰能够确认反应体系中扩增的进行，并且通过在TmC以外有无峰能够确认反应体系中不需要的核酸的混入。

Description

核酸扩增的对照的检测方法及其用途
技术领域
本发明涉及检测对检测体核酸的标的序列进行扩增时显示反应体系的扩增性能的对照的方法及其用途。具体而言，涉及使用上述对照的检测方法的核酸扩增方法和解链曲线分析方法，以及使用这些方法的对照检测用试剂。
背景技术
近年来，在基因分析中，分析由标的序列和探针形成的双链核酸的解链温度(Tm：melting temperature)的方法正在被实用化。由于该方法通过例如Tm分析或者上述双链的解链曲线分析而进行，因此也称为解链曲线分析。根据该方法，能够检测例如标的序列的扩增的有无、上述标的序列内的目的多态性。
上述扩增的有无，例如，能够如下操作而检测。首先，在能够与上述标的序列杂交的引物的存在下，对检测体核酸中的上述标的序列进行扩增，之后，使上述标的序列的扩增产物与上述引物杂交。然后，对上述杂交形成体实施加热处理，将伴随温度上升的杂交的解离(解链)作为吸光度等信号值检出，测定显示较大的信号变动的Tm值(测定值)。另外，对上述标的序列和上述引物的杂交形成体，预先求出Tm值(评价基准值)。这样，如果测定值与评价基准值为同等程度，则能够判断上述标的序列发生了扩增，不能测定Tm值时，能够判断上述标的序列没有进行扩增。另外，多态性能够例如如下操作而检测。首先，在能够与目的标的部位为突变型的标的序列杂交的探针的存在下，对检测体核酸中的标的序列进行扩增，与上述同样地操作，由信号变动的检测而测定Tm值。Tm值随着杂交形成体的互补性的增高而增高，随着互补性的降低而降低。因此，对上述标的部位为突变型的标的序列和上述引物的杂交形成体预先求出Tm值(评价基准值)，与上述测定的Tm值进行比较。如果该测定值与评价基准值为同等程度，则匹配，即检测体核酸的标的部位能够判断为突变型，如果测定值低于评价基准值，则不匹配，即检测体核酸的标的部位能够判断为野生型。
在利用这样的解链曲线分析进行基因分析时，在检测体核酸的扩增的检测之外，另外进行阳性对照和阴性对照的检测(参照专利文献1)。上述阳性对照一般是显示反应体系中是否发生扩增反应的对照。上述阴性对照是显示反应体系中是否混入不需要的核酸的对照。首先，从以下理由出发，阳性对照是需要的。在核酸扩增中，当无法检测标的序列的扩增时，不清楚是由于上述检测体核酸中不存在上述标的序列，还是由于反应体系中扩增反应本身没有发生。因此，在用于对检测体核酸进行扩增的检测体用反应体系之外，另外使用阳性对照用的反应体系，同样地进行核酸的扩增和Tm值的分析。上述阳性对照用的反应体系中，除了不添加检测体核酸而添加含有上述标的序列的模板核酸(阳性对照用模板核酸)以外，与上述检测体用反应体系条件相同。其结果，在上述阳性对照用的反应体系中，如果能够确认与评价基准同等程度的Tm值，则为阳性对照(+)，能够判断扩增反应发生。因此，在上述检测体用反应体系中没有检测出扩增时，能够判断在上述检测体核酸中不存在标的序列。另外，在上述阳性对照用反应体系中，如果不能确认Tm值，则为阳性对照(-)，能够判断扩增反应自身没有发生。接着，从以下理由出发，阴性对照是需要的。在反应体系中，例如，例如由于实验者的细胞等混入，混入检测体核酸以外的核酸，其结果，有时存在由上述混入的不需要的核酸发生扩增的情况。这样，则即使以评价基准的Tm值确认信号变动，也不清楚是来自检测体核酸的扩增，还是来自混入的核酸的扩增。因此，在检测体用反应体系和阳性对照用的反应体系外，另外还使用阴性对照用的反应体系，同样地进行核酸的扩增和Tm值的分析。上述阴性对照用的反应液除了不添加检测体核酸以外，与上述检测体用反应体系条件相同。其结果，在阴性对照用的反应体系中，不能确认Tm值时，为阴性对照(+)，判断没有不需要的核酸混入，确认Tm值时，为阴性对照(-)，判断由不需要的核酸的混入而发生了扩增，需要重新再次进行分析。
这样，进行检测体核酸的分析时，在检测体用反应体系之外，必须分别准备一个阳性对照用反应体系和一个阴性对照用的反应体系。但是，分析仪器等中，测定部的个数受限，例如，当上述测定部为4个时，能够同时分析的反应体系的个数为四个，因此，在一次分析中，一半被对照所占据。另外，每次分析需要阳性对照用的反应体系和阴性对照用的反应体系。而且，即使只能进行一个检测体的分析，也必须使用两种对照用的反应体系。这样，对照用的反应体系的数量越多，试剂等的费用也越多。
专利文献1：日本专利第3331178号公报
发明内容
本发明目的在于提供一种在一个反应体系中简便地同时检测显示扩增反应发生的阳性对照和显示不需要的核酸混入反应体系中的阴性对照的对照检测方法。
为了达成上述目的，本发明提供一种对照检测方法，检测反应体系中对检测体核酸的标的序列进行扩增时显示上述反应体系的扩增性能的对照，其特征在于：
上述对照含有显示反应体系中发生扩增反应的阳性对照和显示反应体系中混入不需要的核酸的阴性对照，
上述反应体系中含有引物、检测用探针和对照用模板核酸，
上述引物是能够对上述标的序列进行扩增的引物，
上述检测用探针是能够与上述标的序列杂交的探针，
上述对照用模板核酸能够利用上述引物进行扩增，
利用上述引物扩增的上述对照用模板核酸的扩增区域中，上述检测用探针能够进行杂交，
上述对照用模板核酸的扩增区域和上述检测用探针的Tm值(TmC)是与上述标的序列和上述检测用探针的Tm值(TmA)不同的值，
包括下述(a1)～(a3)工序，在一个反应体系中检测上述阳性对照和上述阴性对照：
(a1)扩增工序，在上述反应体系中，使用上述引物，进行上述对照用模板核酸的扩增，
(a2)分析工序，使用上述(a1)工序的上述反应体系，在上述检测用探针的存在下，进行解链曲线分析，
(a3)判断工序，通过上述解链曲线中的峰，判断上述阳性对照和上述阴性对照分别为阳性还是阴性。
本发明的核酸扩增方法是对反应体系中检测体核酸的标的序列进行扩增的方法，其特征在于，包括下述(A)工序和下述(B)工序：
(A)检测工序，利用上述本发明的对照检测方法，检测在含有上述对照用模板核酸、上述引物和上述检测用探针的反应体系中显示扩增性能的对照，
(B)扩增工序，包括下述(b1)工序，对上述检测体核酸的标的序列进行扩增，
(b1)扩增工序，在含有上述检测体核酸、上述引物和上述检测用探针的反应体系中，使用上述引物，对上述检测体核酸的标的序列进行扩增。
本发明的解链曲线分析方法，是含有检测体核酸的反应体系的解链曲线分析方法，其特征在于，包括下述(A)工序和(C)工序：
(A)检测工序，利用上述本发明的对照检测方法，检测在含有上述对照用模板核酸、上述引物和上述检测用探针的反应体系中显示扩增性能的对照，
(C)分析工序，包括下述(c1)和(c2)工序，进行解链曲线分析，
(c1)扩增工序，在含有上述检测体核酸、上述引物和上述检测用探针的反应体系中，使用上述引物，对上述检测体核酸的标的序列进行扩增，
(c2)分析工序，使用上述(c1)工序的上述反应体系，在上述检测用探针的存在下，进行解链曲线分析。
本发明的试剂，是用于在本发明的对照检测方法中使用的对照检测用试剂，其特征在于：
含有对照用模板核酸，
上述对照用模板核酸能够通过能够扩增目的标的序列的引物进行扩增，
在利用上述引物扩增的上述对照用模板核酸的扩增区域中，能够与上述标的序列杂交的检测用探针能够进行杂交，
上述对照用模板核酸的扩增区域和上述检测用探针的Tm值(TmC)是与上述标的序列和上述检测用探针的Tm值(TmA)不同的值。
发明的效果
根据本发明，能够通过使用如上所述的对照用模板核酸而在一个反应体系中进行以往需要分别进行的阳性对照和阴性对照的检测，由此，通过在一个反应体系中检测阳性对照和阴性对照，例如，能够使操作简便，也降低试剂等的成本。
附图说明
图1是表示本发明的一个实施方式中的探针与标的序列和对照用模板核酸的杂交的模式图。
图2是表示本发明的其它实施方式中的解链曲线的模式图。
图3是表示本发明的其它实施方式中的探针与标的序列和对照用模板核酸的杂交的模式图。
图4是表示本发明的其它实施方式中的探针与标的序列和对照用模板核酸的杂交的模式图。
图5是表示本发明的其它实施方式中的探针与标的序列和对照用模板核酸的杂交的模式图。
图6是表示本发明的实施例A1中的Tm分析结果的图。
图7是表示本发明的实施例A2中的Tm分析结果的图。
图8是表示本发明的实施例A2中的Tm分析结果的图。
图9是表示本发明的实施例A3中的Tm分析结果的图。
图10是表示本发明的实施例A3中的Tm分析结果的图。
图11是表示本发明的实施例A4中的Tm分析结果的图。
图12是表示本发明的实施例A4中的Tm分析结果的图。
图13是表示本发明的实施例B1中的Tm分析结果的图。
图14是表示本发明的实施例B1中的Tm分析结果的图。
图15是表示本发明的实施例B1中的Tm分析结果的图。
图16是表示本发明的实施例B2中的Tm分析结果的图。
图17是表示本发明的实施例B2中的Tm分析结果的图。
图18是表示本发明的实施例B2中的Tm分析结果的图。
具体实施方式
本发明中，“标的序列”是指检测体核酸中的扩增目的区域，是指通过上述引物进行扩增的序列。本发明中，“标的部位”是指上述检测体核酸的上述标的序列中发生目的多态性的碱基部位，多态性为突变型时，称为“突变型的标的部位”，多态性为野生型时，称为“野生型的标的部位”。上述野生型也能够称为正常型。具有野生型的标的部位的标的序列也称为“野生型标的序列”，具有突变型的标的部位的标的序列也称为“突变型标的序列”。利用引物进行扩增的上述对照用模板核酸的区域称为“上述对照用模板核酸的扩增区域”。以下，分别将上述检测体核酸的标的序列和上述对照用模板核酸的扩增区域中，上述检测用探针能够杂交的区域称为“杂交区域”。本发明中，杂交区域是指例如整体形成双链的区域。上述杂交区域，例如，可以为上述区域内的全部碱基通过氢键形成碱基对，也可以为在上述区域的内部含有不形成碱基对的错配的碱基。上述错配可以是指例如腺嘌呤和胞嘧啶的组合这种对应的碱基不形成氢键的形式，也可以是序列之间缺失对应部位的碱基的形式。另外，本发明中，上述杂交区域之外的区域例如也称为“非杂交区域”。本发明中，将用于扩增对照用模板核酸的反应体系也称为“对照用反应体系”，将用于扩增检测体核酸的标的序列的反应体系称为“检测体用反应体系”。本发明中，以下，用于检测阳性对照和阴性对照的“对照用模板核酸”也称为“对照用模板”。
本发明中，“阳性对照”是显示反应体系中发生扩增反应的对照，因此也称为“扩增对照”。阳性对照为阳性(+)是指发生了扩增反应，阳性对照为阴性(-)是指没有发生扩增反应。本发明中，“阴性对照”是显示不需要的核酸混入反应体系中而生成了上述不需要的核酸的扩增产物的对照，因此，也称为“混入对照”。阴性对照为阳性(+)是指混入上述不需要的核酸而生成了上述不需要的核酸的扩增产物，阴性对照为阴性(-)是指没有混入上述不需要的核酸，或者即使混入了上述不需要的核酸，也没有由上述混入的核酸生成形成问题的扩增产物。
<对照检测方法>
本发明的对照检测方法，如上所述，是检测显示反应体系中对检测体核酸的标的序列进行扩增时上述反应体系的扩增性能的对照的方法，
上述对照是显示反应体系中发生扩增反应的阳性对照和显示反应体系中混入不需要的核酸的阴性对照，
上述反应体系中含有引物、检测用探针和对照用模板核酸，
上述引物是能够对上述标的序列进行扩增的引物，
上述检测用探针是能够与上述标的序列杂交的探针，
上述对照用模板核酸能够利用上述引物进行扩增，
利用上述引物扩增的上述对照用模板核酸的扩增区域中，上述检测用探针能够进行杂交，
上述对照用模板核酸的扩增区域和上述检测用探针的Tm值(TmC)是与上述标的序列和上述检测用探针的Tm值(TmA)不同的值，
包括下述(a1)～(a3)工序，在一个反应体系中检测上述阳性对照和上述阴性对照：
(a1)扩增工序，在上述反应体系中，使用上述引物，进行上述对照用模板核酸的扩增，
(a2)分析工序，使用上述(a1)工序的上述反应体系，在上述检测用探针的存在下，进行解链曲线分析，
(a3)判断工序，通过上述解链曲线的峰，判断上述阳性对照和上述阴性对照分别为阳性还是阴性。
根据本发明的对照检测方法，如上所述，进行目的检测体核酸的扩增时，通过与用于对上述检测体进行扩增的反应体系不同的对照用反应体系，能够判断扩增反应是否正常发生，或者是否是由于不需要的核酸的混入而发生扩增。使用的反应体系的扩增性能的判断，如上所述，在用于以更优异的精度判断使目的检测体进行扩增时扩增的有无是重要的。因此，本发明的对照检测方法中，使上述对照用模板扩增的上述(a1)工序，优选在上述使用检测体用反应体系的检测体核酸扩增工序之前、同时或者之后，在同一条件下进行。其中，例如，由于能够使扩增反应的时间、温度等条件大致相同，因此优选使上述对照用模板扩增的上述(a1)工序与上述检测体核酸的扩增工序同时进行。具体而言，优选使用具备多个测定部的机器(例如扩增装置)，在各测定部，对上述对照用反应体系和上述检测体用反应体系同时进行各自的扩增。其中，这一点在本发明的扩增方法中进行详细的说明。
上述(a1)工序中的对照用反应体系是用于检测阳性对照和阴性对照的反应体系。上述对照用反应体系中，作为扩增模板，不含检测体核酸，而含有对照用模板。上述对照用模板的扩增中使用的上述对照用反应体系和上述检测体核酸的扩增中使用的上述检测体用反应体系，优选除了前者含有上述对照用模板，后者含有检测体核酸以外，为相同的条件。其中，上述对照用模板和上述检测体核酸中，上述对照用反应体系含有上述对照用模板而不含检测体核酸，但是对于上述检测体用反应体系而言，例如，含有上述检测体核酸，并且可以含有上述对照用模板，也可以不含有上述对照用模板。
上述对照用模板，例如，可以是单链，也可以是双链。上述对照用模板为双链时，例如，可以将构成上述双链的两条单链中的任一条作为核酸扩增的模板，但是，从扩增效率的观点出发，优选将双方均作为模板。构成上述双链的两条单链可以均为同义链或者为反义链。
本发明的对照检测方法中，上述引物和检测用探针，使用与用于扩增检测体核酸的检测体用反应体系中使用的检测用探针和引物相同的探针和引物。因此，上述对照用模板必须能够利用能够对上述检测体核酸的标的序列进行扩增的引物进行扩增，并且能够与上述检测用探针杂交，该检测用探针能够与上述检测体核酸的标的序列杂交。这些条件，例如，能够通过将上述对照用模板设计为具有如下的碱基序列而实现，即，该碱基序列在3’侧具有与上述引物互补的序列并且在比上述序列靠近5’侧具有能够与上述检测用探针杂交的序列。“与引物互补的序列”，例如，只要上述引物退火能够使延伸反应开始即可，例如互补性的程度没有特别限制，例如为50％以上，优选为80％以上，更优选为100％。“能够与检测用探针杂交的序列”，例如，如后所述，可以是与上述检测用探针的整体互补的序列，也可以是与上述检测用探针的部分区域互补的序列，能够根据与后述的Tm值关系进行适当设定。
上述对照用模板还必须使其扩增区域和上述检测用探针的Tm值(TmC)为与上述标的序列和上述检测用探针的Tm值(TmA)不同的值。该条件，例如，能够通过使上述对照用模板中上述检测用探针的杂交区域与上述标的序列中上述检测用探针的杂交区域为不同条件而实现。具体而言，例如，能够通过改变上述两者的杂交区域的长度或者改变上述两者的杂交区域的相同性等而实现。另外，上述对照用模板的扩增区域和上述标的序列，例如，优选除了上述检测用探针的杂交区域的一部分以外，为相同序列。
首先，说明前者的改变杂交区域长度的方法。例如，杂交区域相对越长，Tm值越高，杂交区域相对越短，Tm值越低。因此，使用相同的检测用探针时，例如，通过改变上述标的序列中杂交区域的长度和上述对照用模板中杂交区域的长度，能够将两者的Tm值设定为不同的值。也就是说，该方式中，上述对照用模板中，上述对照用模板中上述检测用探针的杂交区域的长度是与上述标的序列中上述检测用探针的杂交区域的长度不同的长度。此时，例如，可以是上述标的序列中的上述杂交区域长于上述对照用模板中的杂交区域，也可以是上述对照用模板中的杂交区域长于上述标的序列中的上述杂交区域。针对上述对照用模板的杂交区域与上述标的序列的杂交区域的关系，在以下列举具体例子进行说明。
首先，作为第一方式，对上述标的序列中的上述杂交区域长于上述对照用模板中的杂交区域的方式进行示例。此时，作为上述检测用探针，例如，优选使用由与上述标的序列的规定区域互补的碱基序列构成的探针，具体而言，优选是100％互补的碱基序列。这样，上述对照用模板，例如，优选在其扩增区域具有能够与上述检测用探针部分杂交的碱基序列。根据该方式，例如，上述检测用探针整体能够与上述标的序列杂交，与此相对，上述检测用核酸能够部分与上述对照用模板杂交。因此，上述标的序列中的杂交区域长于上述对照用模板中的杂交区域。其中，将上述标的序列中的杂交区域和上述对照用模板中的杂交区域中的上述检测用探针能够杂交的共同区域，也称为共同区域或者共同碱基序列。
上述对照用模板，例如，优选在其扩增区域中具有与上述标的序列中上述检测用探针的杂交区域在5’侧和3’侧的至少一方不同的碱基序列。另外，上述对照用模板，例如，能够优选在其扩增区域中具有与上述标的序列中上述检测用探针的杂交区域在5’侧和3’侧的至少一方不同的碱基序列互补的碱基序列。通过这样设计上述对照用模板，例如，能够形成上述探针的5’区域和3’区域的一方与上述对照用模板杂交，另一方与上述对照用模板不杂交的状态。
使用图1说明上述第一方式的具体例子。另外，本发明不受该方式的限制。图1中，左图是表示上述检测用探针与上述标的序列杂交的状态的模式图，右图是表示上述检测用探针与上述对照用模板的扩增区域杂交的状态的模式图。如左图所示，上述检测用探针其整体与上述标的序列的规定区域杂交。另一方面，如右图所示，上述对照用模板在其扩增区域中具有上述检测用探针的碱基序列中3’区域不同的序列互补的碱基序列。也就是说，右图的上述对照用模板与左图的标的序列中上述检测用探针的杂交区域相比具有5’区域不同的碱基序列(图中×标志)。因此，对上述对照用模板，形成上述检测用探针的3’区域不杂交的状态。即，上述检测用探针的3’区域成为非杂交区域。这样，即使使用相同的检测用探针，上述检测用探针的整体杂交的双链和上述检测用探针的部分区域杂交的双链中，前者的Tm值高于后者(TmA＞TmC)。
图1中，示例了对上述对照用模板，上述检测用探针的3’区域不杂交的例子，但是，不受此限制，也可以是上述检测用探针的5’区域不杂交的方式。
上述检测用探针的长度不受特别限制，例如为5～50碱基长度，优选为10～30碱基长度。上述检测用探针中，与上述对照用模板杂交的碱基序列的长度例如优选为5～40碱基长度，更优选为10～30碱基长度，进一步优选为15～25碱基长度。该长度，例如，相当于上述对照用模板的扩增区域中上述检测用探针能够部分杂交的碱基序列长度，也就是与上述标的序列中的杂交区域的共同序列的长度。另外，上述检测用探针中，与上述对照用模板不杂交的非杂交区域的碱基序列长度，例如，优选为1～40碱基长度，更优选为3～20碱基长度，进一步优选为5～10碱基长度。该长度，例如，相当于上述对照用模板的扩增区域中，与上述标的序列中上述检测用探针的杂交区域不同的5’侧和3’侧的至少一方的序列长度，也就是上述标的序列中的杂交区域内与上述对照用模板核酸中杂交区域的共同序列以外的序列(非共同序列)的长度。图1的右图中，例如，相当于上述检测用探针不杂交的非杂交区域(图中×标志的区域)的长度。另外，使上述标的序列中杂交区域的长度为100％时，上述对照用模板中的杂交区域的长度，例如优选为其50～95％，更优选为75～90％。
接着，作为第二方式，示例上述对照用模板中的杂交区域长于上述标的序列中的上述杂交区域的方式。此时，作为上述检测用探针，例如，使用由与上述标的序列部分互补的碱基序列构成的探针。也就是说，作为上述检测用探针，使用具有对上述标的序列的杂交区域和非杂交区域。这样，上述对照用模板，例如，优选在其扩增区域内具有与上述标的序列中上述检测用探针杂交的区域相同的碱基序列，并且，与其相邻，具有与上述标的序列中的上述杂交区域的5’侧和3’侧的至少一方邻接的区域不同的碱基序列。具体而言，上述不同的碱基序列，优选与上述相同碱基序列的5’侧和3’侧的至少一方邻接，更具体而言，优选与5’末端和3’末端的至少一方邻接。另外，与上述标的序列中的上述杂交区域的5’侧和3’侧的至少一方邻接的区域是指，例如，对上述标的序列和上述检测用探针进行比对时，与上述检测用探针对应的区域，上述检测用探针的部分区域不杂交的区域，即非杂交区域。根据该方式，例如，上述检测用探针其整体能够与上述对照用模板杂交，与此相对，上述检测用核酸能够部分与上述标的序列杂交。因此，上述对照用模板中的杂交区域长于上述标的序列中杂交区域。其中，将上述标的序列中的杂交区域和上述对照用模板中的杂交区域中的上述检测用探针能够杂交的共同区域，也称为共同区域或者共同碱基序列。
使用图3说明该第二方式的具体例子。另外，本发明不受此限制。图3中，左图是表示上述检测用探针与上述标的序列杂交的状态的模式图，右图是表示上述检测用探针与上述对照用模板的扩增区域杂交的状态的模式图。如左图所示，上述检测用探针形成为除了其3’区域外，与上述标的序列的规定区域互补的碱基序列。因此，对上述标的序列，上述检测用探针的3’区域形成不杂交状态。即，上述检测用探针的3’区域是非杂交区域。另一方面，右图的上述对照用模板与左图的标的序列中的上述检测用探针的杂交区域相比具有5’区域不同的碱基序列(图中×标志)。也就是说，上述对照用模板具有与上述检测用探针整体互补的碱基序列。因此，对上述对照用模板，上述检测用探针的整体形成杂交的状态，对上述标的序列，上述检测用探针的3’区域形成不杂交区域。这样，即使使用相同的检测用探针进行杂交，上述检测用探针的整体杂交的双链和上述检测用探针的部分区域杂交的双链中，前者的Tm值高于后者(TmC＞TmA)。
图3中，示例了对上述标的序列，上述检测用探针的3’区域不杂交的例子，但是，不受此限制，也可以是上述检测用探针的5’区域不杂交的方式。
上述检测用探针，如上所述，优选由与上述标的序列部分互补的碱基序列构成。上述检测用探针中，与上述标的序列杂交的碱基序列的长度，例如，优选为5～40碱基长度，更优选为10～30碱基长度，进一步优选为15～25碱基长度。该长度，例如，相当于上述对照用模板中的杂交区域中，与上述标的序列中的杂交区域共同的碱基序列长度，也就是上述对照用模板中的杂交区域与上述标的序列中的杂交区域的共同序列的长度。另外，上述检测用探针中，与上述标的序列不杂交的非杂交区域的碱基序列长度，例如，优选为1～40碱基长度，更优选为3～20碱基长度，进一步优选为5～10碱基长度。该长度，例如，相当于上述对照用模板中的扩增区域中与上述标的序列中的上述检测用探针的杂交区域不同的碱基序列的长度，也就是上述对照用模板中的杂交区域内，与上述标的序列中的杂交区域的共同序列以外的序列(非共同序列)的长度。图3的右图中，例如，相当于对上述对照用模板，上述检测用探针与上述共同序列以外进行杂交的区域(图中×标志的区域)的长度。另外，使上述对照用模板中杂交区域的长度为100％时，上述标的序列中的杂交区域的长度例如优选为其50～95％，更优选为75～90％。
接着，说明上述的后者的改变杂交区域的相同性的方法。例如，与检测用探针杂的交区域中，对上述检测用探针的互补性相对越高，则Tm值越高，对上述检测用探针的互补性相对越低，则Tm值越低。因此，使用相同的检测用探针时，例如，使上述对照用模板的上述杂交区域与上述标的序列中的上述杂交区域的碱基序列的相同性不足100％。由此，能够将上述对照用模板中的上述杂交区域对上述检测用探针的互补性与上述标的序列中的上述杂交区域对上述检测用探针的互补性设定为不同的值，结果就能够将两者的Tm值设定为不同的值。此时，例如，可以设定上述标的序列对上述检测用探针的互补性高于上述对照用模板对上述检测用探针的互补性，也可以设定上述对照用模板对上述检测用探针的互补性高于上述标的序列对上述检测用探针的互补性。该方式中，杂交区域的长度，例如，在上述标的序列和上述对照用模板中可以相同。对于上述对照用模板的杂交区域与上述标的序列的杂交区域的关系，在以下列举具体例子进行说明。
上述杂交区域的相同性，例如，优选不足100％，更优选不足95％，进一步优选不足90％。上述对照用模板中的杂交区域和上述标的序列中的杂交区域中，不同的碱基数量没有特别限制，例如，优选为1～20碱基，更优选为1～10碱基，进一步优选为1～5碱基。上述不同的碱基，例如，在杂交区域内可以连续也可以不连续。另外，上述对照用模板的上述杂交区域对上述检测用探针的互补性和上述标的序列中上述杂交区域对上述检测用探针的互补性，例如，只要一方的互补性高于另一方的互补性即可。具体而言，相对高的互补性，例如为90～100％，优选为100％，相对低的互补性，优选相对于上述相对高的互补性，例如，降低5～10％左右。
首先，作为第一方式，对上述标的序列相对于上述检测用探针的互补性高于上述对照用模板相对于上述检测用探针的互补性的方式，使用图4进行说明。另外，本发明不受其限制。
图4是使用由与所述标的序列的规定区域100％互补的碱基序列构成的检测用探针，将上述对照用探针中杂交区域的碱基序列设定为与上述检测用探针的互补性低于100％的序列的例子。图4中，左图是表示上述检测用探针与上述标的序列杂交的状态的模式图，右图是表示上述检测用探针与上述对照用模板的扩增区域杂交的状态的模式图。如上所述，上述检测用探针是与上述标的序列的规定区域100％互补的序列。因此，如左图所示，上述检测用探针其整体与上述标的序列的规定区域杂交，并且，其杂交区域中，全部碱基形成碱基对。另一方面，上述对照用模板是与上述检测用探针的互补性低于100％而构成的序列，具体而言，具有与上述检测用探针在右图的×标记中不互补的错配碱基。即，上述对照用模板与上述标的核酸的规定区域(杂交区域)相比具有不同的相同性的序列。因此，如右图所示，上述检测用探针其整体与上述对照用模板杂交，但是在该杂交区域的内部，产生不形成碱基对的错配(图中×标记)。因此，上述对照用模板相对于上述检测用探针的互补性低于上述标的序列相对于上述检测用探针的互补性。因此，即使使用相同的检测用探针，上述杂交区域的整体形成碱基对的双链和上述杂交区域的内部具有不形成碱基对的错配的双链中，前者的Tm值高于后者(TmA＞TmC)。另外，图4中，是使上述探针为与上述标的序列的规定区域100％互补的序列，但是也可以是与上述规定区域具有错配的序列。此时，例如，只要相对于上述对照用模板的错配数多于相对于上述标的序列的错配数，则也能得到相同的效果。
接着，作为第二方式，对上述对照用模板相对于上述检测用探针的互补性高于上述标的序列相对于上述检测用探针的互补性的方式，使用图5进行说明。另外，本发明不受其限制。
图5是使用由与上述对照用模板的规定区域100％互补的碱基序列构成的检测用探针，将上述标的序列中的杂交区域的碱基序列设定为与上述检测用探针的互补性低于100％的序列的例子。图5中，左图是表示上述检测用探针与上述标的序列杂交的状态的模式图，右图是表示上述检测用探针与上述对照用模板的扩增区域杂交的状态的模式图。如上所述，上述检测用探针是与上述对照用模板的规定区域100％互补的序列。因此，如右图所示，上述检测用探针其整体与上述对照用模板的规定区域杂交，并且在该杂交区域中，全部碱基形成碱基对。另一方面，上述标的序列是与上述检测用探针的互补性低于100％的序列，具体而言，具有与上述检测用探针在左图的×标记中不互补的错配碱基。即，上述标的序列与上述对照用模板的规定区域(杂交区域)相比具有不同的相同性的序列。因此，如左图所示，上述检测用探针其整体与上述标的序列杂交，但是，在其杂交区域的内部，产生不形成碱基对的错配(图中×标记)。因此，上述标的序列相对于上述检测用探针的互补性低于上述对照用模板相对于上述检测用探针的互补性。因此，即使使用相同的检测用探针，上述杂交区域的整体形成碱基对的双链和上述杂交区域的内部具有不形成碱基对的错配的双链中，前者的Tm值高于后者(TmC＞TmA)。另外，图5中，是使上述探针为与上述对照用模板的规定区域100％互补的序列，但是也可以是与上述规定区域具有错配的序列。此时，例如，只要相对于上述标的序列的错配数多于相对于上述对照用模板的错配数，则也能得到相同的效果。
作为将上述对照用模板的扩增区域和上述检测用探针的Tm值(TmC)设定为与上述标的序列和上述检测用探针的Tm值(TmA)不同的值的方法，不限制于以上方法。例如，通过使用作为RNA类似物的LNA、作为肽核酸的PNA，作为交联化核酸的BNA等人工核酸，能够调整Tm值。作为具体例子，例如，在上述对照用模板的上述杂交区域、上述检测用探针中与上述标的序列和对照用模板的仅任一方的杂交部位中含有上述人工核酸等，由此能够调整Tm值。
上述对照用模板的扩增区域和上述检测用探针的Tm值(TmC)与上述标的序列和上述检测用探针的Tm值(TmA)之差没有特别限制，优选为1～50℃，更优选为3～30℃，特别优选为5～10℃。
上述对照用模板的长度没有特别限制，例如能够根据上述标的序列适当地确定。上述对照用模板的长度，例如，优选比标的序列长0～1000000碱基的序列，更优选长100～100000碱基的序列，进一步优选长1000～10000碱基的序列。作为具体例子，例如，优选100～1000000碱基，更优选500～100000碱基，进一步优选1000～10000碱基。另外，上述对照用模板的扩增区域没有特别限制，例如，优选为20～100000碱基，更优选为50～10000碱基，进一步优选为100～1000碱基。
本发明中，上述引物的种类没有特别限制，例如，也能够使用仅对同义链和反义链中的任一方进行扩增的引物，从扩增效率的观点出发，优选使用对同义链和反义链两者进行扩增的两种类以上的引物。
上述引物的长度没有特别限制，一般而言，例如为10～50碱基，优选15～40碱基，进一步优选16～35碱基。
本发明中，上述检测用探针例如可以设计为与同义链杂交，也可以设计为与反义链杂交。本发明中，所谓“能够与标的序列杂交”，可以是指能够与标的序列杂交，也可以是指能够与标的序列的互补链杂交。
上述检测用探针只要能够与上述标的序列杂交即可，可以设计为能够与上述标的序列的任意区域杂交。另外，如后所述，本发明在利用解链曲线分析进行的多态性检测中也能够有效利用。此时，上述检测用探针优选设计为能够与上述标的序列中产生目的多态性的碱基部位的区域杂交。另外，对多态性的检测如后所述。
上述检测用探针的长度没有特别限制，一般而言，例如为5～50碱基，优选为10～30碱基。
上述检测用探针，例如，可以是不含标记物质的未标记探针，也可以是含有标记物质的标记探针。上述标记探针，例如，优选将能够与上述标的序列杂交的寡核苷酸以上述标记物质进行标记化(修饰)。上述寡核苷酸中，利用上述标记物质标记的部位没有特别限制，例如，优选5’末端区域或者3’末端区域，更优选5’末端或3’末端。另外，如后所述，上述寡核苷酸中利用上述标记物质标记的碱基，例如，优选为胞嘧啶(c)或者鸟嘌呤(g)。另外，上述标记物质，例如，可以直接标记碱基，也可以通过标记含有上述碱基的核苷酸残基的任一部位而间接标记上述碱基。上述标记物质，例如，可以结合在上述检测用探针的3’侧或者5’侧的任一侧。另外，上述检测用探针，例如，为了预防核酸扩增反应中探针自身的延伸，可以在其3’末端进一步添加磷酸或者如上所述的标记物质。
上述标记物质没有特别限定，例如，可以是标记探针单独发出信号，但是优选通过形成杂交发出信号。上述信号的种类没有特别限制，例如，可以列举荧光、显色或者发色等。上述信号为荧光的情况下，作为信号值，例如可以列举荧光强度。上述信号为显色或者发色的情况下，作为信号值，例如，可以列举反射率、吸光度、透过率等。另外，上述信号例如可以从上述标记物质直接发出，也可以间接发出。
上述标记物质没有特别限制，例如，可以列举荧光基团等荧光物质。作为上述荧光物质，例如，可以列举荧光素、磷光体、罗丹明、多甲川染料衍生物等，作为市售的荧光物质，例如，可以列举PacificBlue(商标名，Molecular Probe公司生产)、BODIPY FL(商标名，Molecular Probe公司生产)、FluorePrime(商品名，Amersham Pharmacia公司生产)、Fluoredite(商品名，MilliPore公司生产)、FAM(商标名，ABI公司生产)、Cy3和Cy5(商品名，Amersham Pharmacia公司生产)、TAMRA(商标名，Molecular Probe公司生产)等。上述荧光物质的检测条件没有特别限制，例如，能够根据使用的荧光物质的种类适当确定，例如，Pacific Blue能够通过检测波长450～480nm来检测，TAMRA能够通过检测波长585～700nm来检测，BODIPY FL能够通过检测波长515～555nm来检测。如果使用这样的检测探针，例如，通过检测作为信号的荧光，测定作为信号值的荧光强度，能够从荧光强度的变动容易地确认杂交和解离。
上述标记探针，例如，优选是单独显示信号，且通过杂交形成而不显示信号的标记探针，或者是单独不显示信号，且通过杂交形成而显示信号的标记探针。上述标记物质为荧光物质时，优选上述标记探针例如是以上述荧光物质标记，单独显示荧光，并且通过杂交形成而荧光减少(例如消失)的探针。这样的现象一般称为荧光淬灭现象(Quenching phenomenon)。利用该现象的探针，一般称为荧光淬灭探针。其中，作为上述荧光淬灭探针，例如，优选寡核苷酸的3’末端或5’末端以上述荧光物质标记，标记的上述末端碱基优选为胞嘧啶(c)或鸟嘌呤(g)。上述末端的碱基为胞嘧啶(c)时，优选设计上述荧光淬灭探针的碱基序列，使得上述荧光淬灭探针例如在与上述对照用模板或者检测体核酸形成杂交时，与上述对照用模板或者检测体核酸中标记的末端胞嘧啶(c)形成碱基对的碱基或者距离形成上述碱基对的碱基1～3碱基位置的碱基为鸟嘌呤(g)。距离形成上述碱基对一碱基的位置的碱基，是指与形成上述碱基对的碱基相邻的碱基。这样的探针一般称为鸟嘌呤淬灭探针，作为所谓的Qprobe(注册商标)已知。若这样的鸟嘌呤淬灭探针与上述检测体核酸杂交，则，例如，以上述荧光物质标记的末端胞嘧啶(c)通过接近上述对照用模板或者检测体核酸的鸟嘌呤(g)，显示上述荧光物质的发光减弱(荧光强度降低)的现象。如果使用这样的探针，能够通过荧光物质的变动容易地确认杂交和解离。
上述检测用探针，例如，可以在3’末端添加磷酸基。如后所述，上述对照用模板和检测体核酸例如能够通过PCR等核酸扩增法制备，此时，能够使上述检测用探针在扩增反应的反应体系中共存。在这样的情况下，如果在上述检测用探针的3’末端添加磷酸基，则能够充分地防止上述探针自身通过上述扩增反应进行延伸。另外，通过在3’末端添加如上所述的标记物质，也能得到同样的效果。
上述引物、检测用探针和上述对照用模板，例如，可以由脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸等的核苷酸构成，也可以含有作为RNA类似物的LNA、作为肽核酸的PNA，作为交联化核酸的BNA等。
上述(a1)工序中，作为核酸的扩增方法，没有特别限制，例如，可以列举PCR(Polymerase Chain Reaction)法、NASBA(Nucleic AcidSequence Based Amplification)法、TMA(Transcription-MediatedAmplification)法、SDA(Strand Displacement Amplification)法等，其中，优选PCR法。其中，上述核酸扩增法的条件没有特别限制，能够根据现有公知的方法进行。
上述(a2)工序是如上所述进行解链曲线分析的分析工序，例如，优选进行所谓的Tm分析。这里，对Tm分析中的Tm值进行说明。例如，随着加热含有双链DNA的溶液，260nm的吸光度上升。这是由于双链DNA中的双链之间的氢键通过加热被打开，解离为单链DNA(DNA的解链)。这样，如果全部双链DNA解离而形成单链DNA，则该吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅有双链DNA时的吸光度)的约1.5倍左右，由此能够判断解链完成。基于该现象，解链温度Tm一般定义为吸光度达到吸光度的总上升部分的50％时的温度。上述Tm值例如能够通过现有公知的MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com/)和最接近碱基对法(Nearest Neighbor Method)进行确定，也能够通过实际的测定进行确定。
上述(a2)工序中，上述解链曲线分析例如能够如下进行。即，上述(a2)工序，例如，是在上述检测用探针的存在下，使含有上述对照用模板的扩增产物的上述(a1)工序的上述反应体系的温度变化，测定显示上述扩增产物和上述检测用探针的杂交形成体的解链状态的信号值的工序。
上述(a2)工序中，显示上述扩增产物和上述检测用探针的杂交形成体的解链状态的信号的测定，如上所述，可以测定260nm的吸光度，但也可以测定标记物质的信号。具体而言，作为上述检测用探针，如上所述，优选使用以上述标记物质标记的标记探针，进行上述标记物质的信号测定。作为标记探针，例如，可以列举单独显示信号并且通过杂交形成而不显示信号的标记探针，或者单独不显示信号并且通过杂交形成而显示信号的标记探针。如果是前者这样的探针，则在与上述扩增产物形成杂交(双链DNA)时不显示信号，通过加热显示上述探针从上述扩增产物解离的信号。另外，如果是后者的探针，则与上述扩增产物形成杂交(双链DNA)时显示信号，通过加热如果上述探针从上述扩增产物游离，则信号减弱(消失)。因此，通过检测上述标记物质的信号，与上述260nm的吸光度测定同样，能够边进行杂交形成体的解链边进行Tm值的确定。上述标记物质的信号检测，例如，可以在上述标记物质的信号所特有条件下进行检测，作为上述条件，例如，可以列举激发波长、检测波长等。另外，关于上述标记探针和上述标记物质如上所述。
上述检测用探针的添加时机没有特别限制，例如，能够在上述(a2)工序之前添加，也能够在上述(a1)的扩增工序之前、途中或者之后添加。其中，例如，为了添加时不需要使上述反应体系暴露于外部环境中，或者能够连续进行上述(a1)工序的扩增反应和上述(a2)工序的解链曲线分析，优选在上述(a1)工序的扩增反应之前在上述反应体系中添加。此时，上述检测用探针优选如上所述其3’末端以标记物质或者磷酸基修饰。
上述(a3)工序中，上述阳性对照和上述阴性对照分别为阳性还是阴性，例如，能够如下进行判断。即，上述(a3)工序中，例如，在上述解链曲线中，
当上述对照用模板核酸的扩增区域和上述检测用探针的Tm值(TmC)存在峰时，判断阳性对照为阳性(+)，
当上述对照用模板核酸的扩增区域和上述检测用探针的Tm值(TmC)不存在峰时，判断阳性对照为阴性(-)，
当上述对照用模板核酸的扩增区域和上述检测用探针的Tm值(TmC)以外不存在峰时，判断阴性对照为阴性(-)，
当上述对照用模板核酸的扩增区域和上述检测用探针的Tm值(TmC)以外存在峰时，判断阴性对照为阳性(+)。
接下来，对本发明的对照检测方法，以使用图1所示的对照用模板和检测用探针，利用PCR法进行核酸扩增为例进行说明。另外，本发明不受此限制，另外，PCR的条件没有特别限制，能够使用现有公知的方法进行。
首先，准备含有上述对照用模板、引物和检测用探针的反应液。
上述反应液中的上述对照用模板的添加比例没有特别限制，例如，优选为10-12～10-7μmol/L，更优选为10-11～10-8μmol/L，特别优选为10-10～10-9μmol/L。
上述反应液中的引物的添加比例没有特别限制，例如，优选为0.01～10μmol/L，更优选为0.05～5μmol/L，特别优选为0.1～1μmol/L。另外，引物的种类没有特别限制，优选如上所述使用两种以上，优选各自以上述的范围添加。
上述反应体系中的检测用探针的添加比例没有特别限制，例如，优选为10～400nmol/L，更优选为20～200nmol/L。
上述反应液中的其它成分没有特别限制，可以列举现有公知的成分，其比例也没有特别限制。作为上述成分，例如，可以列举DNA聚合酶等的聚合酶、核苷酸(三磷酸核苷)和溶剂等。
作为上述DNA聚合酶，没有特别限制，例如，能够使用现有公知的来自耐热细菌的聚合酶。作为具体例子，能够商业购入来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶(美国专利第4889818号和美国专利第5079352号)(商品名Taq聚合酶)、来自极端嗜热菌(Thermus thermophilus)的DNA聚合酶(WO 91/09950)(rTth DNApolymerase)、来自超嗜热菌(Pyrococcus furiosus)的DNA聚合酶(WO92/9689(Pfu DNA polymerase：Stratagenes公司生产)、来自嗜热球菌(Thermococcus litoralis)的DNA聚合酶(EP-A 455430)(商标Vent：New England Biolabs公司生产)，其中，优选来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶。
上述反应液中的DNA聚合酶添加比例没有特别限制，例如为1～100U/mL，优选为5～50U/mL，更优选为20～30U/mL。其中，DNA聚合酶的活性单位(U)，一般而言，以活化鲑鱼精子DNA为模板引物，在活性测定用反应液中，以74℃在30分钟内向酸不溶性沉淀物中摄入10nmol总核苷酸的活性为1U。上述活性测定用反应液的组成例如为25mmol/L TAPS buffer(pH9.3，25℃)、50mM KCl、2mmol/L MgCl2、1mM巯基乙醇、200μmol/L dATP、200μmol/L dGTP、200μmol/L dTTP、100μmol/L[α-32P]dCTP、0.25mg/mL活化鲑鱼精子DNA。
作为上述三磷酸核苷，通常可以列举dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP或dUTP)。上述反应液中的dNTP的添加比例没有特别限制，例如为0.01～1mmol/L，优选为0.05～0.5mmol/L，更优选为0.1～0.3mmol/L。
作为上述溶剂，例如，可以列举Tris-HCl、Tricine、MES、MOPS、HEPES、CAPS等，能够使用市售的PCR用缓冲液和市售的PCR试剂盒的缓冲液等。
另外，上述反应液可以进一步含有肝素、甜菜碱、KCl、MgCl2、MgSO4、甘油等，它们的添加比例，例如，设定为不抑制PCR反应的范围即可。
上述反应液的整体体积没有特别限制，例如，能够根据使用的仪器(热循环仪)等适当确定，通常为1～500μL，优选为10～100μL。
接着，使用上述反应液，利用PCR进行上述对照用模板的扩增。PCR例如包括(1)双链核酸向单链核酸的解离、(2)引物的退火、(3)引物的延伸(聚合酶反应)的三个工序。各工序的条件没有特别限制，上述(1)工序例如优选90～99℃、1～120秒，更优选92～95℃、1～60秒，上述(2)工序例如优选40～70℃、1～300秒，更优选50～70℃、5～60秒，上述(3)工序例如优选50～80℃、1～300秒，更优选50～75℃、5～60秒。另外，循环数也没有特别限制，上述(1)～(3)的3个工序作为1个循环，例如，优选30循环以上。上限没有特别限制，例如合计100循环以下，优选70循环以下，更优选50循环以下。各步骤的温度变换，例如，可以使用热循环仪等自动地控制。
接着，使用上述扩增反应后的反应体系，进行解链曲线分析。
上述解链曲线分析，例如，使上述扩增工序后的上述反应体系的温度变化，测定显示上述扩增工序中得到的上述扩增产物与上述检测用探针的杂交形成体的解链状态的信号值，分析伴随温度变化的上述信号值的变动。其结果，显示较大信号值变动的温度为上述扩增产物与上述检测用探针的杂交形成体的Tm值，能够判断在该温度中存在信号值变动的峰。另外，显示较大的信号值变动的温度不存在时，能够判断不存在信号值变动的峰。基于该峰的有无和显示峰的温度(Tm值)的结果，在后述的上述(a3)的判断工序中进行对照的判断。
上述扩增产物和上述检测用探针的杂交形成体，例如，在上述检测用探针的存在下，通过使上述反应液的温度变化而进行。此时，如上所述，优选对预先添加有上述检测用探针的上述反应液进行扩增反应之后，使上述反应液的温度变化。
上述杂交形成，例如，首先将作为双链DNA的上述扩增产物解离为单链DNA，接着进行上述单链DNA和上述检测用探针的杂交。
上述扩增产物的解离，例如，可以通过加热上述反应液而进行。加热温度只要是能够解离上述扩增产物的温度即可，没有特别限制，例如为85～95℃。加热时间也没有特别限制，通常为1秒钟～10分钟，优选为1秒钟～5分钟。
解离的单链DNA与上述检测用探针的杂交，例如，能够在用于上述解离的加热处理之后，使其加热温度下降，也就是说，使上述反应液的温度下降而进行。作为温度条件，例如为40～50℃。另外，上述温度下的处理时间没有特别限制，例如为1～600秒。
接着，如上所述，使上述反应液的温度变化，测定显示上述扩增产物和上述检测用探针的杂交形成体的解链状态的信号值。具体而言，例如，加热上述反应液(上述杂交形成体)，测定伴随温度上升的信号值的变动。
信号值的测定，如上所述，可以使用上述未标记探针而测定260nm的吸光度，优选使用标记探针而测定各标记物质的信号。作为上述标记探针，如上所述，例如，可以列举单独显示信号且通过杂交形成而不显示信号的标记探针或者单独不显示信号且通过杂交形成而显示信号的标记探针。如果是前者的探针，则形成杂交(双链DNA)时不显示信号，通过加热使上述探针从上述扩增产物游离时显示信号。因此，使用这样的探针时，例如，可以缓慢加热荧光减弱(或者淬灭)的杂交形成体，测定伴随温度上升的荧光强度的增加。作为前者的探针，可以列举上述的鸟嘌呤淬灭探针等。另外，如果是后者的探针，则形成杂交(双链DNA)时显示信号，通过加热使探针游离时信号减弱(消失)。因此，使用这样的探针时，相反地，可以缓慢加热杂交形成体，测定伴随温度上升的荧光强度的减少。
测定信号值的变动时的温度范围没有特别限定，例如，开始温度为室温～85℃，优选为25～70℃，结束温度例如为40～105℃。另外，温度的上升速度没有特别限制，例如为0.1～20℃/秒，优选为0.3～5℃/秒。
接着，从测定的信号值分析伴随温度变化的信号值变动，确定显示较大变动(峰)的Tm值。信号值的变动，例如，能够通过算出每单位时间(t)的信号值(F)的变化量而进行分析。当由于杂交形成体的解链(单链化)而信号值增加时，例如能够从得到的信号值算出各温度中每单位时间(t)的信号值(F)的增加量或者其负的微分值(-dF增加量/dt)，将显示最低值的温度确定为Tm值。另外，也能够将每单位时间(t)的信号值(F)的增加量或者其微分值(dF增加量/dt)显示最高值的温度确定为Tm值。另一方面，当由于杂交形成体的解链(单链化)而信号值减少时，例如，相反地，能够算出每单位时间(t)的信号值(F)的减少量，由此确定Tm值。
另外，例如，也可以测定杂交形成时的信号值，分析其变动，以代替如上所述使上述反应液的温度上升而测定伴随温度上升的信号变动的方法。即，可以在使上述反应体系的温度下降而形成杂交形成体时，分析伴随温度下降的信号值的变动。
上述信号值变动的分析，例如，能够标绘温度与信号值的变动关系而做成图表进行分析，但是，上述解链曲线分析工序中，上述图表的制作不是必须的。
接着，基于上述解链曲线分析的结果，进行阳性对照和阴性对照的判断。
以上述解链曲线分析得到的峰的温度为上述对照用模板的扩增区域和上述检测用探针的Tm值(TmC)时，可知反应液中发生核酸扩增。即，能够判断阳性对照为阳性(+)。另一方面，当上述解链曲线分析中不能检测到峰时，可知反应体系中没有发生核酸扩增。即，能够判断阳性对照为阴性(-)。另外，上述解链曲线分析中，当上述对照用模板核酸的扩增区域和上述检测用探针的Tm值(TmC)以外检测出峰时，可知反应体系中混入不需要的核酸，发生以其为模板的扩增反应。即，能够判断阴性对照为阳性(+)。另一方面，上述解链曲线分析中，当上述对照用模板核酸的扩增区域和上述检测用探针的Tm值(TmC)以外检测不出峰时，可知反应体系中没有混入不需要的核酸。即，能够判断阴性对照为阴性(-)。根据这些结果，例如，判断阳性对照为阳性(+)且阴性对照为阴性(-)时，对另外使用检测体核酸进行扩增反应的反应液进行扩增的有无等目的分析。另一方面，判断阳性对照为阴性(-)或阳性对照为阳性(+)时，判断检测体核酸的反应体系不能进行分析，可以进行再测定。
图2中表示使用图1所示的对照用模板和检测用探针的解链曲线分析中，标绘了上述信号值的变动(-dF/dt)与温度的关系的图表的一例。其中，该图表是用于示例，本发明不受其任何限制。作为上述检测用探针，可以列举双链形成时信号受抑制、通过解离而发出信号的探针。图2中，横轴表示温度(℃)，纵轴表示信号值的变动，单位为作为信号变化量的微分值的“-d信号变化量/dt”(-dF/dt)。该图(A)中，由于仅在上述对照用模板的扩增区域和上述检测用探针的Tm值(TmC)检测到峰，因此能够判断发生扩增反应，即阳性对照为阳性(+)。另外，除了上述峰以外，没有检测到峰，因此能够判断在反应体系中没有混入不需要的核酸，即，阴性对照为阴性(-)。该图(B)中，由于在所有温度中均没有检测到峰，因此能够判断没有发生扩增，即阳性对照为阴性(-)。该图(C)中，由于不仅在上述对照用模板的扩增区域和上述检测用探针的Tm值(TmC)中检测到峰，而且在上述标的序列和上述检测用探针的Tm值(TmA)中也检测到峰，因此能够判断反应体系中混入不需要的核酸，即阴性对照为阳性(+)。
另外，如图2(C)所示，阴性对照(+)时，在与阳性对照(+)不同的温度出现峰。因此，从以下理由出发，优选将反应体系中对照用模板的添加比例抑制为最小。以该条件进行分析时，例如，如果显示阴性对照(+)的TmA的峰小于显示阳性对照(+)的TmC的峰，则使不需要的核酸的混入对分析不产生影响，能够省略阴性对照(+)所致的再测定。此时，上述反应体系中上述对照用模板的添加比例，例如，优选为10-12～10-7μmol/L，更优选为10-11～10-8μmol/L，特别优选为10-10～10-9μmol/L。
另外，本发明中，上述(a2)工序中，例如，可以在上述检测用探针、对照用寡核苷酸和由与上述对照用寡核苷酸互补的碱基序列构成的上述对照用探针的存在下，进行上述解链曲线分析。上述对照用寡核苷酸和上述对照用探针，例如，Tm值是已知的，另外，反应体系中的信号强度是已知的。
解链曲线分析一般使用具备温度控制单元和信号检测单元的装置进行。但是，上述装置中，上述温度控制单元有时候不能正确地控制温度，或者上述信号检测单元不能正确地检测信号。因此，在前者的情况下，有可能在与实际温度不同的温度下检测信号峰，在后者的情况下，有可能检测出与实际的大小不同的峰。从这样的理由出发，确认装置中的温度控制单元和信号检测单元是否正确地发挥功能是重要的。由此，上述(a2)工序中，如果使上述对照用寡核苷酸和对照用探针共存，则上述对照用寡核苷酸和对照用探针形成杂交，因此，能够对其使用相同的反应体系进行解链曲线分析。这样，上述对照用寡核苷酸和上述对照用探针的Tm值如上所述是已知的，因此，上述反应体系中，能够通过上述已知的Tm值中是否存在信号峰来判断温度控制单元是否正确地发挥功能。即，例如，已知Tm值为60℃时，如果装置在60℃附近确认峰，则能够判断上述温度控制单元正常地发挥功能，如果装置在60℃附近没有确认峰，而在其它温度确认峰，则能够判断上述温度控制装置没有正常地的发挥功能。另外，通过进行对照用寡核苷酸和对照用探针的解链曲线分析，例如，能够判断信号检测单元是否正常地发挥功能。即，例如，在上述对照用寡核苷酸和对照用探针的解链曲线分析中，通过确认有无噪声，能够判断目的的峰是否是由信号检测异常所引起的，因此，能够防止误判断。本发明中，以下，将上述对照用寡核苷酸称为“Tm对照用寡核苷酸”，将上述对照用探针称为“Tm对照用探针”。
上述Tm对照用探针，例如，优选是具有标记物质的标记探针。另外，上述反应体系中，为了使上述检测用探针和上述Tm对照用探针共存，优选将上述检测用探针和上述Tm对照用探针以不同的标记物质标记。作为上述标记物质，例如，可以列举如上所述的物质。
上述Tm对照用寡核苷酸和Tm对照用探针的添加时机没有特别限制，例如，优选与上述检测用探针同样，例如在上述(a1)工序开始之前在上述反应体系中添加。
在上述Tm对照用寡核苷酸和Tm对照用探针的存在下，进行上述(a1)工序的扩增反应时，为了防止上述Tm对照用寡核苷酸和上述Tm对照用探针自身的延伸，可以在其3′末端进一步添加磷酸基。另外，上述Tm对照用探针可以在其3′末端具有标记物质。由此，能够防止上述Tm对照用探针自身的延伸。
上述Tm对照用寡核苷酸和上述Tm对照用探针的互补性，例如，优选为90％以上，更有选为100％。上述Tm对照用寡核苷酸和上述Tm对照用探针的全长优选为相同的，例如，优选为5～40碱基长度，更优选为10～30碱基长度，进一步优选为15～25碱基长度。
为了使上述Tm对照用探针与上述Tm对照用寡核苷酸杂交，例如，优选其对上述Tm对照用寡核苷酸的互补性高于对反应体系中存在的其它核苷酸序列的互补性。另外，为了使上述Tm对照用寡核苷酸与上述Tm对照用探针杂交，例如，优选其对上述Tm对照用探针的互补性高于对反应体系中存在的其它核苷酸序列的互补性。上述Tm对照用探针和上述Tm对照用寡核苷酸分别优选难以与例如上述其它的核酸序列杂交，进一步优选不与上述其它的核酸序列杂交。作为上述其它的核酸序列，例如，可以列举上述检测用探针、上述检测体核酸及其标的序列、上述对照用模板核酸及其扩增区域、上述引物等。这样的Tm对照用探针和Tm对照用寡核苷酸，例如优选分别对上述其它核酸序列的互补性例如为30％以下，更优选为20％以下。
上述Tm对照用寡核苷酸和上述Tm对照用探针的Tm值(Tmt)，例如，优选为与上述对照用模板的扩增区域和上述检测用探针的Tm值(TmC)不同的值。另外，上述Tm对照用寡核苷酸和上述Tm对照用探针的Tm值(Tmt)优选为与上述标的序列和上述检测用探针的Tm值(TmA)不同的值。
并用上述Tm对照用寡核苷酸和上述Tm对照用探针时，优选在上述(a3)工序中，还能够通过上述解链曲线中的峰判断上述(a2)工序中的温度控制是否正确。
<扩增方法>
本发明的扩增方法，如上所述，是对反应体系中的检测体核酸的标的序列进行扩增的方法，其特征在于，包括下述(A)工序和下述(B)工序，
(A)检测工序，利用本发明的对照检测方法，检测在含有上述对照用模板核酸、上述引物和上述检测用探针的反应体系中显示扩增性能的对照，
(B)扩增工序，包括下述(b1)工序，对上述检测体核酸的标的序列进行扩增，
(b1)扩增工序，在含有上述检测体核酸、上述引物和上述检测用探针的反应体系中，使用上述引物，对上述检测体核酸的标的序列进行扩增。
本发明的扩增方法的特征在于利用本发明的对照检测方法确认对照，除此以外的工序和条件等没有特别限制。另外，只要没有特别说明，本发明的对照检测方法，如上所述，能够适用于本发明的扩增方法。上述(A)工序，例如，包括本发明的对照检测方法中的上述(a1)～(a3)工序。
上述(b1)工序中使用的检测体用反应体系，除了含有目的检测体核酸以外，没有特别限制，优选为与上述对照用反应体系相同的条件。上述检测体用反应体系，例如，可以含有上述对照用模板，也可以不含上述对照用模板。另外，上述(b1)工序，如上所述，优选与上述(a1)工序同样进行。
上述(B)工序优选进一步包括下述(b2)工序和(b3)工序。下述(b2)工序能够与上述(a2)工序同样进行。
(b2)分析工序，使用上述(b1)工序的上述反应体系，在上述检测用探针的存在下，进行解链曲线分析，
(b3)判断工序，通过上述解链曲线的峰，判断上述检测体核酸的标的序列有无扩增。
上述(b3)工序，例如优选在上述(A)工序的上述(a3)工序中判断阳性对照(+)且阴性对照(-)时进行。当上述(a3)工序中判断阳性对照(-)或阴性对照(+)时，优选省略而进行再测定。
上述(b3)工序中，在上述标的序列和上述检测用探针的Tm值(TmA)存在峰时，判断上述标的序列发生了扩增，在上述标的序列和上述检测用探针的Tm值(TmA)不存在峰时，判断上述标的序列未扩增。
上述对照用反应体系中的上述(A)工序和上述检测体用反应体系中的上述(B)工序，优选以相同条件同时进行。具体而言，优选使(a1)工序和(b1)工序、(a2)工序和(b2)工序以相同条件同时进行。
作为上述检测体核酸，没有特别限制，可以是单链，也可以是双链。作为上述检测体核酸，例如，可以列举DNA和总RNA、mRNA等RNA等。另外，上述检测体核酸，例如，可以列举机体试样等试样中含有的核酸。上述试样中的检测体核酸，例如可以是机体试样中原本含有的核酸，也可以是例如以上述机体试样中的核酸为模板通过核酸扩增法使其扩增而得到的扩增产物等。作为具体例子，例如，以上述机体试样中原本含有的DNA为模板，利用核酸扩增法使其扩增的扩增产物，和从上述机体试样中原本含有的RNA通过逆转录反应(RT-PCR：Reverse Transcription PCR)生成的cDNA，以上述cDNA为模板，利用核酸扩增法使其扩增而得到的扩增产物。上述扩增产物的长度没有特别限制，例如为50～1000碱基，优选为80～200碱基。
作为含有上述检测体核酸的试样，没有特别限制，例如，可以列举全血、血细胞、血浆、血清、口腔黏膜等的口腔内细胞、指甲或头发等的体细胞、生殖细胞、痰、羊水、石蜡包埋组织、尿、胃液、洗胃液等以及它们的悬浊液等。
上述反应体系中的检测体核酸的添加比例没有特别限制，例如，优选为1～1000000μg/L，更优选为10～100000μg/L，特别优选为100～10000μg/L。
另外，本发明可以在上述(b2)工序中使用用于对检测体核酸进行扩增的上述反应体系，例如，在上述检测用探针、上述Tm对照用寡核苷酸和由与上述Tm对照用寡核苷酸互补的碱基序列构成的上述Tm对照用探针的存在下，进行上述解链曲线分析。上述Tm对照用寡核苷酸和上述Tm对照用探针如上所述。通过利用它们进行解链曲线分析，例如，如上所述，能够判断温度调节是否正常。
<解链曲线分析方法>
本发明的解链曲线分析方法，如上所述，是含有检测体核酸的反应体系的解链曲线分析方法，其特征在于，包括下述(A)工序和(C)工序，
(A)检测工序，利用本发明的对照检测方法，检测在含有上述对照用模板核酸、上述引物和上述检测用探针的反应体系中显示扩增性能的对照，
(C)分析工序，包括下述(c1)和(c2)工序，进行解链曲线分析，
(c1)扩增工序，在含有上述引物和上述检测用探针的反应体系中，使用上述引物，对上述检测体核酸的标的序列进行扩增，
(c2)分析工序，使用上述(c1)工序的上述反应体系，在上述检测用探针的存在下，进行解链曲线分析。
本发明的解链曲线分析方法的特征在于利用本发明的对照检测方法确认对照，除此以外的工序和条件等没有特别限制。上述(A)工序，例如，包括本发明的对照检测方法中的上述(a1)～(a3)工序。
本发明的解链曲线分析方法，例如优选在多态性检测方法中利用。因此，本发明的解链曲线分析方法，例如，也能够称为多态性检测方法。将本发明的解链曲线分析方法例如作为上述多态性检测方法时，上述检测体核酸的标的序列含有显示多态性的目的的标的部位，上述检测用探针是能够与上述标的序列中含有上述标的部位的区域杂交的探针，优选上述(C)工序还包括下述(c3)工序。
(c3)检测工序，通过上述解链曲线的峰，检测上述多态性。
上述对照用反应体系中的上述(A)工序和上述检测用反应体系中的上述(C)工序优选同时进行，具体而言，优选使(a1)工序和(c1)工序、(a2)工序和(c2)工序同时进行。上述(C)工序中，上述(c1)工序与本发明的扩增方法中的上述(b1)工序相同，上述(c2)工序与本发明的扩增方法中的上述(b2)工序相同。
本发明中，上述检测用探针例如可以将上述标的部位的多态性作为野生型(正常型)进行设计，也可以作为突变型进行设计。即，上述检测用探针，例如，可以将其与上述标的部位对应的碱基设计与野生型的碱基互补的碱基，也可以设计为与突变型的碱基互补的碱基。在前者的情况下，与上述野生型的标的部位匹配，与上述突变型的标的部位错配。另外，在后者的情况下，与上述野生型的标的部位错配，与上述突变型的标的部位匹配。由此，根据上述标的部位为野生型或者突变型，在上述标的部位中，上述标的部位与上述检测用探针之间的碱基产生差异，因此能够检测区分上述标的部位的多态性。上述检测用探针中对上述标的序列的杂交区域、和上述标的序列中上述检测用探针的杂交区域，除了上述标的序列，优选为90～100％的互补性，更优选为100％。
在解链曲线分析中，例如，得到如下结果，完全互补的杂交(完全匹配)比一碱基或者二碱基以上不同的杂交(错配)显示解离的Tm值更高。因此，通过对上述检测用探针预先确定完全互补的杂交的Tm值和一碱基或者二碱基不同的杂交的Tm值，能够确定上述标的部位的多态性。
上述检测用探针，例如，是与上述标的序列中含有突变型的上述碱基部位的区域互补的探针，例如，在上述(c3)工序中，能够如下判断多态性。即，例如，在上述碱基部位为突变型的标的序列和上述检测用探针的Tm值(TmMT)存在峰时，能够判断上述检测体核酸的上述碱基部位为突变型；当上述碱基部位为野生型的标的序列和上述检测用探针的Tm值(TmWT)存在峰时，能够判断上述检测体核酸的上述碱基部位为野生型。此时，TmMT为高于TmWT的温度。
另外，当上述检测用探针是与上述标的序列中含有野生型的上述标的部位的区域互补的探针时，在上述(c3)工序中，能够如下判断多态性。即，例如，当上述碱基部位为野生型的标的序列和上述检测用探针的Tm值(TmWT)存在峰时，能够判断上述检测体核酸的上述标的部位为野生型，当上述碱基部位为突变型的标的序列和上述检测用探针的Tm值(TmMT)存在峰时，能够判断上述检测体核酸的上述标的部位为突变型。此时，TmWT为高于TmMT的温度。
另外，本发明可以在上述(c2)工序中使用用于扩增检测体核酸的上述反应体系，例如，在上述检测用探针、上述对照用寡核苷酸和由与上述对照用寡核苷酸互补的碱基序列构成的上述对照用探针的存在下，进行上述解链曲线分析。上述对照用寡核苷酸和上述对照用探针如上所述。通过对它们进行解链曲线分析，例如，如上所述能够判断温度调节是否正常。
<对照检测用试剂>
本发明的对照检测用试剂用于在本发明的对照检测方法中使用，其特征在于：
含有对照用模板核酸，
上述对照用模板核酸能够利用能够扩增目的标的序列的引物进行扩增，
在利用上述引物扩增的上述对照用模板核酸的扩增区域中，能够与上述标的序列杂交的检测用探针能够进行杂交，
上述对照用模板核酸的扩增区域和上述检测用探针的Tm值(TmC)是与上述标的序列和上述检测用探针的Tm值(TmA)不同的值。
本发明的对照用试剂的特征在于，含有上述对照用模板，对其它构成没有任何限制。
本发明的对照检测用试剂，例如，除了上述对照用模板以外，例如还含有引物和检测用探针。当本发明的对照检测用试剂含有上述引物和上述检测用探针时，上述对照检测用试剂由于含有上述引物和上述检测用探针，例如，能够在上述检测体核酸的扩增以及上述检测体核酸的解链曲线分析中使用。此时，含有上述检测体核酸的检测体用反应体系，例如，结果可以含有上述对照用模板。即使上述检测体用反应体系中含有上述对照用模板，由于如上所述，上述检测体核酸的标的序列和上述检测用探针的Tm值(TmA)与上述对照用模板的扩增区域和上述检测用探针的Tm值(TmC)不同，因此上述检测体用反应体系的扩增和解链曲线分析能够与上述检测体用反应体系中不含上述对照用模板的情况同样地进行。
本发明的对照检测用试剂还可以适当含有聚合酶、dNTP等上述各种成分。另外，本发明的对照检测用试剂，例如可以是将各成分分别收纳于各自的容器的、用于在本发明的对照检测方法中使用的试剂盒。上述试剂盒优选含有使用说明书。
<分析用试剂>
本发明的分析用试剂是用于在本发明的解链曲线分析方法中使用的分析用试剂，其特征在于，具备上述本发明的对照检测用试剂、和含有上述引物和上述检测用探针的检测体核酸用的扩增反应用试剂。本发明的分析用试剂，例如，可以是将各成分分别收纳于各自的容器中的、用于在本发明的解链曲线分析方法中使用的试剂盒。此外，可以是将上述对照检测用试剂和上述扩增反应用试剂分别收纳于各自的容器中的试剂盒。上述试剂盒优选含有使用说明书。
<设计方法>
此外，本发明提供一种对照用模板核酸的设计方法，该对照用模板核酸用于检测对检测体核酸的标的序列进行扩增时显示反应体系的扩增性能的对照，其特征在于：
上述对照用模板核酸是能够检测显示在反应体系中发生扩增反应的阳性对照和显示反应体系中混入不需要的核酸的阴性对照两者的模板核酸，
能够利用能够对上述标的序列进行扩增的引物扩增上述对照用模板核酸的碱基序列，
利用上述引物扩增的区域能够与检测用探针杂交，该检测用探针能够与上述标的序列杂交，并且
设定为上述扩增区域和上述检测用探针的Tm值(TmC)与上述标的序列和上述检测用探针的Tm值(TmA)显示不同值的碱基序列。
<使用>
本发明提供一种对照用模板核酸的使用方法，该对照用模板核酸用于检测对检测体核酸的目的序列进行扩增时显示反应体系的扩增性能的对照，其特征在于：
上述对照用模板核酸能够利用能够对上述标的序列进行扩增的引物进行扩增，
利用上述引物扩增的区域能够与检测用探针杂交，该检测用探针杂交能够与上述标的序列杂交，并且
由上述扩增区域和上述检测用探针的Tm值(TmC)与上述标的序列和上述检测用探针的Tm值(TmA)显示不同值的碱基序列构成，
作为用于在一个反应体系中并行检测显示在反应体系中发生扩增反应的阳性对照和显示反应体系中混入不需要的核酸的阴性对照的对照用模板核酸使用。
<解链曲线分析方法>
本发明的解链曲线分析方法，是含有检测体核酸的反应体系的解链曲线分析方法，其特征在于：
包括分析工序，对于上述含有检测体核酸的反应体系，在检测用探针、对照用寡核苷酸和对照用探针的存在下，进行解链曲线分析，
上述检测用探针是能够与上述检测体核酸的标的序列杂交的探针，
上述对照用探针是与上述对照用寡核苷酸互补的序列。
根据本发明，如上所述，在同一反应体系中，不仅能够进行上述检测体核酸和上述检测用探针的分析，还能够判断温度控制和信号检测是否正常。另外，只要没有特别说明，上述检测用探针、上述对照用寡核苷酸和上述对照用探针例如与上述同样，解链曲线分析等也相同。
本发明在上述分析工序之前，例如，可以具有对上述检测体核酸的标的序列进行扩增的扩增工序。上述检测体核酸的扩增工序，例如，与上述同样进行。
接着，对本发明的实施例进行说明。但是本发明不受以下实施例的限制。
实施例
[实施例A1]
通过使用核酸纯化试剂盒(商品名QIAamp)以TE液溶出，对HPV阳性固定样本血浆进行纯化。进一步将纯化溶液稀释至2000倍，作为来自血浆的核酸试样。另一方面，将序列编号1所示的多核苷酸作为插入序列插入pT7质粒载体中，制作了重组质粒。上述重组质粒以TE液稀释，将其作为质粒溶液。
插入序列(序列编号1)
5’-tcacctctgcctaatcatctcattttcatgtcctatgttcaatcttccaagctgtgccttgggtggctttgTT gcatTgacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgacttctttcc-3’
接着，在49μL下述反应液中添加上述来自血浆的核酸试样1μL，使用热循环仪(商品名Mastercycler ep gradient S，eppendorf公司生产)进行PCR。PCR以50℃2分钟、95℃2分钟处理之后，以95℃10秒、54℃10秒和72℃30秒为一个循环，进行50个循环。接着将装有PCR反应液的管移至iCycler(商品名，Bio-Rad Laboratories公司生产)，以95℃1秒、40℃60秒处理之后，以升温速度1℃/1秒从40℃升温至80℃。在升温期间，测定各温度下的荧光强度变化，进行了Tm分析。其中，检测对象为下述探针1，激发光为370～415nm，检测445～480nm。另外，代替上述核酸试样，在49μL下述反应液中添加1μL蒸馏水，同样操作进行PCR以及Tm分析。下述反应液中，F引物为正向引物，R引物为反向引物(以下相同)。
[表1]
(PCR反应液：单位μL)
蒸馏水                                 34.025
40w/v％     甘油                       3.125
10×GeneTaq Universal Buffer*1         5
100mmol/L MgCl2                        0.75
10mmol/L dNTP                          1
2U/μL尿嘧啶-N-转葡糖基酶              0.1
100μmol/L  F引物1                  0.5
100μmol/L  R引物3                  0.25
100μmol/L  F引物3                  0.5
100μmol/L  R引物2                  0.25
5μmol/L  探针                      10.5
5μmol/L  探针                      20.5
5μmol/L  探针                      30.25
5U/μL  GeneTaq FP*1                0.25
质粒溶液                             1
5μmol/L  高级结构抑制用寡核苷酸     1
合计                                 49μL
*1：Nippon Gene公司生产
F引物1(序列编号2)
5’-cataagaggactcttggact-3’
R引物3(序列编号3)
5’-atttatgcctacagcctcc-3’
F引物3(序列编号4)
5’-tcacctctgcctaatcatctc-3’
R引物2(序列编号5)
5’-ggaaagaagtcagaaggcaa-3’
探针1(序列编号6)
5’-atgtccatgccccaaagccacc-(Pacific Blue)-3’
探针2(序列编号7)
5’-atgtccatgTccTaaagccacc-(BODIPY FL)-3’
探针3(序列编号8)
5’-aTcAttaacctaatctcctccc-(TAMRA)-3’
抑制用寡核苷酸(序列编号9)
5’-aggcttgaacagtaggacatgaacaAgagatga-P-3’
上述来自血浆的核酸试样具有以序列编号10(ggtggctttgGGgcatGgacat)表示的序列，上述PCR中，使含有该序列的区域进行扩增。上述序列与上述探针1完全互补(完全匹配)，另一方面，上述重组质粒具有以序列编号1的下划线部分表示的序列，即序列编号45(ggtggctttgTTgcatTgacat)表示的序列，在上述PCR中，使含有该序列的区域进行扩增。上述序列中，以大写字母表示的三个碱基(T)是与上述序列编号10的碱基序列不同的碱基，上述序列与探针1部分不互补。
在图6中表示它们的结果。图6是表示伴随温度上升的荧光强度的变化的Tm分析图表，该图(A)是添加有质粒溶液和来自血浆的核酸试样两者的反应液的结果，该图(B)是仅添加有质粒溶液的反应液的结果。该图中，横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化，单位是荧光强度变化量的微分值“d荧光强度变化量/dt”(dF/dt)。另外，预先设定的各Tm值如下所示。
该图(A)中，在添加有来自血浆核酸样品的反应液的情况下，在73℃附近和48℃附近出现峰，该图(B)中，在仅添加有质粒溶液的反应液的情况下，在48℃附近出现峰。由此可知，即使使用相同的探针1，通过改变相对于探针的互补性，能够在不同的Tm值设定峰。
[实施例A2]
(实施例A2-1)
对含有检测体核酸的反应体系和含有对照用模板的反应体系进行PCR和Tm分析，确认上述反应体系的扩增性能。本例中，如后所述，将上述探针和对照用模板设定为如上述的图5所示的方式(TmA＜TmC)。
[表2]
(检测体核酸)
5’-ttcccatgatgatctgtccctcacagcagggtcttctctgtttcagggcatgaactacttggaggaccgtcgcttggtgcaccgcgacctggcagcc
Figure BPA00001280343100371
agcatgtcaagatcacagattttgggcTggccaaactgctgggtgcggaagagaaa
Figure BPA00001280343100372
ggaggtggctttaggtcagccagcattttcctgacaccagggaccaggctgccttcccactagctgtattgtttaacacatgcaggggaggatg-3’(序列编号35)
(对照用模板)
5’-ttcccatgatgatctgtccctcacagcagggtcttctctgtttcagggcatgaactacttggaggaccgtcgcttggtgcaccgcgacctggcagcc
Figure BPA00001280343100373
agcatgtcaagatcacagattttgggcGggccaaactgctgggtgcggaagagaaaggaggtggctttaggtcagccagcattttcctgacaccagggaccaggctgccttcccactagctgtattgtttaacacatgcaggggaggatg-3’(序列编号36)
(探针)
5’-ttggccCgcccaaaatc-(TAMRA)-3’(序列编号37)
(F引物)
5’-aggaacgtactggtgaaaacaccgc-3’(序列编号38)
(R引物)
5’-ttactttgcctccttctgcatggtattc-3’(序列编号39)
上述检测体核酸和对照用模板的序列中，以正方形包围的序列是与F引物和R引物互补的序列，下划线部分表示与探针互补的序列。上述探针和对照用模板设定为上述图5所示的方式。即，上述探针是相对于上述对照用模板完全互补、相对于上述检测体核酸一部分不互补的序列。另外，预先求得的检测体核酸的扩增区域和探针的Tm值(TmA)为53℃，对照用模板和扩增区域和探针的Tm值(TmC)为64℃。
[表3]
(第一试剂：单位μL)
蒸馏水                          19.755
1mol/L Tris-HCl(pH8.6)           0.63
20w/v％BSA                       0.5
10w/v％NaN3                      0.115
0.94U/μL Taq聚合酶               2
合计                              23μL
(第二试剂：单位μL)
蒸馏水                           8.6225
10w/v％NaN3                      0.065
1mol/L Tris-HCl(pH8.6)           0.35
25mmol/L dNTP                    0.4
80v/v％甘油                      1.56
100mmol/L  MgCl2                 0.75
1mol/L KCl                       1.25
合计                             13μL
(第三试剂：单位μL)
蒸馏水                           8.83
1mol/L Tris-HCl(pH8.6)           0.27
10w/v％NaN3                      0.05
100μmol/L探针                   0.1
100μmol/L F引物                 0.5
100μmol/L R引物                 0.25
合计                             10μL
混合1μL上述检测体核酸或1μL对照模板核酸、23μL上述第一试剂、13μL上述第二试剂、10μL上述第三试剂和3μL蒸馏水，进一步添加30μL矿物油(商品名Mineral Oil，NAKALAI TESQUE公司生产)，制备了反应液。将含有上述检测体核酸的反应液作为检测体反应液，将含有上述对照模板核酸的反应液作为对照反应液。使用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy IS-5310，爱科来公司生产)对上述各反应液进行PCR。PCR以95℃处理60秒之后，以95℃1秒和58℃15秒为一个循环，进行了50个循环。在以95℃1秒、40℃60秒处理之后，以升温速度1℃/3秒从40℃升温至85℃。升温期间测定各温度的荧光强度的变化，进行Tm分析。另外，荧光强度检测波长585～700nm(荧光物质TAMRA)。
在图7中表示其结果。图7是表示伴随温度上升的荧光强度变化的Tm分析的图表。图7中，横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化，单位是荧光强度变化量的微分值“d荧光强度变化量/dt”(dF/dt)。图7中，(A)是含有对照用模板的反应液的结果，(B)是含有检测体核酸的反应液的结果。
如图7(A)所示，含有对照用模板的反应液仅在对照用模板和探针的Tm值(TmC)64℃附近确认峰，如图7(B)所示，含有检测体核酸的反应液仅在检测体核酸和探针的Tm值(TmA)53℃附近确认峰。由该结果可知以下事实。首先，对照用反应液中对照用模板和探针的Tm值(TmC)的峰的发生显示对照用模板正常地扩增。该图(A)中，在Tm值64℃附近产生峰，因此证明，含有对照用模板的反应液为阳性对照(+)，即，发生正常的扩增反应。这样，在对照用模板的扩增中使用的反应液中，除了含有检测体核酸代替对照用反应液以外，为相同组成，对照用反应液的反应条件与检测体反应液的反应条件也为相同条件。由此，能够间接证明检测体反应液的峰的发生是由正常的扩增得到的。另外，对照用反应液中，除了对照用模板和探针的Tm值(TmC)以外的峰的发生，表示反应液中混入对照用模板以外的不需要的核酸，从而发生不需要的核酸的扩增。该图(A)中，对照用模板和探针的Tm值(TmC)64℃以外不产生峰，因此可以证明，对照用反应液为阴性对照(-)，即，没有混入不需要的核酸而发生扩增。因此，检测体用反应液与对照用反应液同样地制备进行反应。由此，能够间接证明检测体反应液中，检测体核酸和探针的Tm值(TmA)53℃附近的峰不是由不需要的核酸混入所引起的扩增，而是由上述检测体核酸的扩增所引起的峰。
(实施例A2-2)
使用对照用模板，对混入有不需要的核酸的反应液进行阴性对照的确认。其中，只要没有特别说明，则与上述实施例A2-1同样进行。
混合0.1μL实施例A2-1的对照用模板、23μL上述第一试剂、13μL上述第二试剂、10μL上述第三试剂和3μL蒸馏水，混入0.9μL以下所示的混入核酸，进一步添加30μL上述矿物油，制备了对照用反应液。接着，与上述实施例A2-1同样进行PCR和Tm分析。下述混入核酸形成为能够与各引物退火、能够与上述实施例A2-1的探针杂交的序列。下述序列中，以方框包围的序列是与F引物和R引物互补的序列，下划线部分表示与探针互补的序列。另外，预先求得的对照用模板的扩增区域和探针的Tm值(TmC)为64℃，混入核酸的扩增区域和探针的Tm值为53℃。
[表4]
(混入核酸)
5’-ttcccatgatgatctgtccctcacagcagggtcttctctgtttcagggcatgaactacttggaggaccgtcgcttggtgcaccgcgacctggcagcc
Figure BPA00001280343100401
agcatgtcaagatcacagattttgggcTggccaaactgctgggtgcggaagagaaa
Figure BPA00001280343100402
ggaggtggctttaggtcagccagcattttcctgacaccagggaccaggctgccttcccactagctgtattgtttaacacatgcaggggaggatg-3’(序列编号35)
在图8(A)中表示该结果。图8(A)是表示对对照用反应液进行伴随温度上升的荧光强度变化的Tm分析的图表。图8(A)中，横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化，单位是荧光强度变化量的微分值“d荧光强度变化量/dt”(dF/dt)。
如图8(A)所示，对照用反应液在对照用模板和探针的Tm值(TmC)64℃附近与混入核酸和探针的Tm值53℃附近均确认峰。在前者的Tm值(TmC)64℃附近产生峰，因此证明，含有对照用模板的反应液为阳性对照(+)，即，发生正常的扩增反应，但是，在后者的Tm值53℃附近也产生峰，因此证明阴性对照(+)，即，发生不需要的核酸的混入及扩增。这样，对照用反应液中，通过有无对照用模板和探针的Tm值以外的峰，能够确认不需要的核酸的混入引起的扩增。
(实施例A2-3)
使用对照用模板，对添加有抑制扩增反应的SDS的反应液进行阳性对照的确认。另外，只要没有特别说明，则与上述实施例A2-2同样进行。
除了对实施例A2-2的对照用反应体系混合3μL10v/v％SDS代替3μL蒸馏水以外，与上述实施例A2-2同样操作，进行PCR和Tm分析。
在图8(B)中表示该结果。图8(B)是表示对对照用反应液进行伴随温度上升的荧光强度变化的Tm分析的图表。图8(B)中，横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化，单位是荧光强度变化量的微分值“d荧光强度变化量/dt”(dF/dt)。
如图8(B)所示，对照用反应液在任何温度均不能确认峰。由此证明没有发生正常的扩增反应。这样，对照用反应液中，通过有无对照用模板和探针的Tm值的峰，能够确认是否发生正常的扩增反应。
[实施例A3]
(实施例A3-1)
对含有检测体核酸的反应体系和含有对照用模板的反应体系进行PCR和Tm分析，确认上述反应体系的扩增性能。本例中，如后所述，将上述探针和对照用模板设定为如上述的图4所示的方式(TmA＞TmC)。
[表5]
(检测体核酸)
5’-ttcccatgatgatctgtccctcacagcagggtcttctctgtttcagggcatgaactacttggaggaccgtcgcttggtgcaccgcgacctggcagcc
Figure BPA00001280343100421
agcatgtcaagatcacagattttgggcGggccaaactgctgggtgcggaagagaaa
Figure BPA00001280343100422
ggaggtggctttaggtcagccagcattttcctgacaccagggaccaggctgccttcccactagctgtattgtttaacacatgcaggggaggatg-3’(序列编号36)
(对照用模板)
5’-ttcccatgatgatctgtccctcacagcagggtcttctctgtttcagggcatgaactacttggaggaccgtcgcttggtgcaccgcga
cctggcagcc
Figure BPA00001280343100423
agcatgtcaagatcacagattttgggcTggccaaactgctgggtgcggaagagaaa
Figure BPA00001280343100424
ggaggtggctttaggtcagccagcattttcctgacaccagggaccaggctgccttcccactagctgtattgtttaacacatgcaggggagg
atg-3’(序列编号35)
(探针)
5’-ttggccCgcccaaaatc-(TAMRA)-3’(序列编号37)
(F引物)
5’-aggaacgtactggtgaaaacaccgc-3’(序列编号38)
(R引物)
5’-ttactttgcctccttctgcatggtattc-3’(序列编号39)
上述检测体核酸和对照用模板的序列中，以方框包围的序列是与F引物和R引物互补的序列，下划线部分表示与探针互补的序列。上述探针和对照用模板设定为上述图4所示的方式。即，上述探针是相对于上述检测体核酸完全互补、相对于上述对照用模板一部分不互补的序列。另外，预先求得的检测体核酸的扩增区域和探针的Tm值(TmA)为64℃，对照用模板的扩增区域和探针的Tm值(TmC)为53℃。
除了使用1μL上述检测体核酸或1μL对照用模板核酸以外，与上述实施例A2-1同样操作，进行了PCR和Tm分析。
在图9中表示其结果。图9是表示伴随温度上升的荧光强度变化的Tm分析的图表。图9中，横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化，单位是荧光强度变化量的微分值“d荧光强度变化量/dt”(dF/dt)。图9中，(A)是含有对照用模板的反应液的结果，(B)是含有检测体核酸的反应液的结果。
如图9(A)所示，含有对照用模板的反应液仅在对照用模板和探针的Tm值(TmC)53℃附近确认峰，如图9(B)所示，含有检测体核酸的反应液仅在检测体核酸和探针的Tm值(TmA)64℃附近确认峰。这样，在对照用反应液中，由仅在对照用模板和探针的Tm值(TmC)53℃附近产生峰可知，与上述实施例A2-1同样，为阳性对照(+)和阴性对照(-)。因此，检测体用反应液的峰的发生是由正常的扩增得到的。并且，能够间接证明检测体核酸和探针的Tm值(TmA)64℃附近的峰不是不需要的核酸混入引起的扩增，而是上述检测体核酸的扩增引起的峰。
(实施例A3-2)
使用对照用模板，对混入不需要的核酸的反应液进行阴性对照的确认。另外，只要没有特别说明，则与上述实施例A3-1同样进行。
混合0.9μL实施例A3-1的对照用模板、23μL上述第一试剂、13μL上述第二试剂、10μL上述第三试剂和3μL蒸馏水，然后混入0.1μL如下所示的混入核酸，进一步添加30μL上述矿物油，制备对照用反应液。接着，与上述实施例A3-1同样了进行PCR和Tm分析。下述混入核酸形成为能够与各引物退火、能够与上述实施例A3-1的探针杂交的序列。下述序列中，以方框包围的序列是与F引物和R引物互补的序列，下划线部分表示与探针互补的序列。另外，预先求得的对照用模板的扩增区域和探针的Tm值(TmC)为53℃，混入核酸的扩增区域和探针的Tm值为64℃。
[表6]
(混入核酸)
5’-ttcccatgatgatctgtccctcacagcagggtcttctctgtttcagggcatgaactacttggaggaccgtcgcttggtgcaccgcga cctggcagcc
Figure BPA00001280343100441
agcatgtcaagatcacagattttgggcgggccaaactgctgggtgcggaagagaaa
Figure BPA00001280343100442
ggaggtggctttaggtcagccagcattttcctgacaccagggaccaggctgccttcccactagctgtattgtttaacacatgcaggggaggatg-3’(序列编号36)
在图10(A)中表示该结果。图10(A)是表示对对照用反应液进行显示伴随温度上升的荧光强度变化的Tm分析的图表。图10(A)中，横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化，单位是荧光强度变化量的微分值“d荧光强度变化量/dt”(dF/dt)。
如图10(A)所示，对照用反应液在对照用模板和探针的Tm值(TmC)53℃附近与混入核酸和探针的Tm值64℃附近均确认峰。在前者的Tm值53℃附近产生峰，所以证明含有对照用模板的反应液为阳性对照(+)，即，发生正常的扩增反应，但是，在后者的Tm值64℃附近也产生峰，所以证明阴性对照(+)，即，发生不需要的核酸的混入及扩增。这样，对照用反应液中，通过有无对照用模板和探针的Tm值以外的峰，能够确认不需要的核酸的混入所引起的扩增。
(实施例A2-3)
使用对照用模板，对添加有抑制扩增反应的SDS的反应液进行阳性对照的确认。另外，只要没有特别说明，则与上述实施例A3-2同样进行。
除了对实施例A3-2的对照用反应液混合3μL 10v/v％SDS代替3μL蒸馏水以外，与上述实施例A3-2同样操作，进行了PCR和Tm分析。
在图10(B)中表示该结果。图10(B)是表示对对照用反应液进行显示伴随温度上升的荧光强度变化的Tm分析的图表。图10(B)中，横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化，单位是荧光强度变化量的微分值“d荧光强度变化量/dt”(dF/dt)。
如图10(B)所示，对照用反应液在任何温度均不能确认峰。由此证明，没有发生正常的扩增反应。这样，对照用反应液中，通过有无在对照用模板和探针的Tm值的峰，能够确认是否发生正常的扩增反应。
[实施例A4]
(实施例A4-1)
对含有检测体核酸的反应体系和含有对照用模板的反应体系进行了PCR和Tm分析，确认了上述反应体系的扩增性能。本例中，如后所述，将上述探针和对照用模板设定为如上述的图5所示的方式(TmA＜TmC)。
[表7]
(检测体核酸)
人类基因组DNA(商品名Human Genomic DNA，Roche公司生产)
(对照用模板)
具有下述序列的质粒
5’-tgaaataatttttcatataaaggtgagtttgtattaaaaggtactggtggagtatttgatagtgtattaaccttatgtgtgacatgttctaatatagtcacagtttcattatttttattat
Figure BPA00001280343100451
Figure BPA00001280343100452
aatataaacttgtggtgcgtagccagcaagttggagctgGtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggtaaatcttgttttaata
Figure BPA00001280343100453
at-3’(序列编号40)
(探针)
5’-(TAMRA)-ctcttgcctacgccaccagctccaact-P-3’(序列编号41)
(F引物)
5’-aaggcctgctgaaaatgactg-3’(序列编号42)
(R引物)
5’-ggtcctgcaccagtaatatgca-3’(序列编号43)
上述检测体核酸和对照用模板的序列中，以方框包围的序列是与F引物和R引物互补的序列，下划线部分表示与探针互补的序列。上述探针和对照用模板设定为上述图5所示的方式。即，上述探针是相对于上述对照用模板完全互补、相对于上述检测体核酸一部分不互补的序列。另外，预先求得的检测体核酸的扩增区域和探针的Tm值(TmA)为71℃，对照用模板的扩增区域和探针的Tm值(TmC)为79℃。
[表8]
(第四试剂：单位单位μL)
蒸馏水                        5.93
1mol/L Tris-HCl(pH8.6)        0.27
10w/v％NaN3                   0.05
100μmol/L探针                2
100μmol/L F引物              0.5
100μmol/L R引物              0.25
合计                          9μL
混合1μL上述对照模板(106拷贝/μL)、23μL上述第一试剂、13μL上述第二试剂、9μL上述第四试剂和4μL蒸馏水，进一步添加30μL上述矿物油，制备了反应液。将含有上述对照用模板的反应液作为对照反应液。此外，混合1μL上述检测体核酸(30拷贝/μL)、23μL上述第一试剂、13μL上述第二试剂、9μL 上述第四试剂和4μL蒸馏水，进一步添加30μL上述矿物油，制备了反应液。将含有上述检测体核酸的反应液作为检测体反应液。使用全自动SNPs检查装置(商品名i-densyIS-5310，爱科来公司生产)对上述各反应液进行PCR。PCR以95℃处理60之后，以95℃1秒和60℃15秒为一个循环，进行了50个循环。在以95℃1秒、55℃60秒处理之后，以升温速度1℃/3秒从62℃升温至85℃。升温期间测定各温度的荧光强度的变化，进行Tm分析。另外，荧光强度检测波长585～700nm(荧光物质TAMRA)。
在图11中表示其结果。图11是表示伴随温度上升的荧光强度的Tm分析的图表。图11中，横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化，单位是荧光强度变化量的微分值“d荧光强度变化量/dt”(dF/dt)。图11中，(A)是含有对照用模板的反应液的结果，(B)是含有检测体核酸的反应液的结果。
如图11(A)所示，含有对照用模板的反应液仅在对照用模板和探针的Tm值(TmC)79℃附近确认峰，如图11(B)所示，含有检测体核酸的反应液仅在检测体核酸和探针的Tm值(TmA)71℃附近确认峰。这样，在对照用反应液中，由仅在对照用模板和探针的Tm值(TmC)79℃附近产生峰可知，与上述实施例A2-1同样，为阳性对照(+)和阴性对照(-)。因此，检测体反应液的峰的产生是由正常的扩增得到的。并且，能够间接证明检测体核酸和探针的Tm值(TmA)71℃附近的峰不是不需要的核酸混入引起的扩增，而是上述检测体核酸的扩增引起的峰。
(实施例A4-2)
使用对照用模板，对混入不需要的核酸的反应液进行阴性对照的确认。另外，只要没有特别说明，则与上述实施例A4-1同样进行。
混合1μL实施例A4-1的对照用模板、23μL上述第一试剂、13μL上述第二试剂、9μL上述第四试剂和3μL蒸馏水，然后混入1μL具有如下所示序列的质粒作为混入核酸，进一步添加30μL上述矿物油，制备了对照用反应液。接着，与上述实施例A4-1同样进行了PCR和Tm分析。下述混入核酸形成为能够与各引物退火、能够与上述实施例A4-1的探针杂交的序列。下述序列中，以方框包围的序列是与F引物和R引物互补的序列，下划线部分表示与探针互补的序列。另外，预先求得的对照用模板的扩增区域和探针的Tm值(TmC)为79℃，混入核酸的扩增区域和探针的Tm值为65℃。
[表9]
(混入核酸)
5’-tgaaataatttttcatataaaggtgagtttgtattaaaaggtactggtggagtatttgatagtgtattaaccttatgtgtgacatgtTctaatatagtcacagtttcattatttttattat
Figure BPA00001280343100471
Figure BPA00001280343100472
aatataaacttgtggtgcgtagccagcaagttggagctgAtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattt tgtggacgaatatgatccaacaatagaggtaaatcttgttttaata
Figure BPA00001280343100473
at-3’(序列编号44)
在图12(A)中表示该结果。图12(A)是表示对对照用反应液进行显示伴随温度上升的荧光强度变化的Tm分析的图表。图12(A)中，横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化，单位是荧光强度变化量的微分值“d荧光强度变化量/dt”(dF/dt)。
如图12(A)所示，对照用反应液在对照用模板和探针的Tm值(TmC)79℃附近与混入核酸和探针的Tm值65℃附近均确认峰。在前者的Tm值79℃附近产生峰，所以证明含有对照用模板的反应液为阳性对照(+)，即，发生正常的扩增反应，但是，在后者的Tm值65℃附近也产生峰，所以证明阴性对照(+)，即，发生不需要的核酸的混入及扩增。这样，对照用反应液中，通过有无对照用模板和探针的Tm值以外的峰，能够确认由不需要的核酸混入所引起的扩增。
(实施例A4-3)
使用对照用模板，对添加有抑制扩增反应的SDS的反应液进行阳性对照的确认。另外，只要没有特别说明，则与上述实施例A4-2同样进行。
混合实施例A4-1的1μL上述对照模板核酸、23μL上述第一试剂、13μL上述第三试剂、9μL上述第四试剂、4μL作为检测体核酸的人类基因组DNA(商品名Human Genomic DNA，Roche公司生产)和1μL10v/v％SDS而制备了反应液，除此以外，与上述实施例A4-2同样操作，进行了PCR和Tm分析。另外，反应液中的上述人类基因组DNA的最终浓度为103拷贝/μL。
在图12(B)中表示该结果。图12(B)是表示对对照用反应液进行伴随温度上升的荧光强度变化的Tm分析的图表。图12(B)中，横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化，单位是荧光强度变化量的微分值“d荧光强度变化量/dt”(dF/dt)。
如图12(B)所示，对照用反应液在任何温度均不能确认峰。由此证明，没有发生正常的扩增反应。这样，对照用反应液中，通过有无在对照用模板和探针的Tm值的峰，能够确认是否发生正常的扩增反应。
[实施例B1]
本例中，使用对照用寡核苷酸和对照用探针，确认温度控制和信号检测是否正常，同时对各种核酸试样通过Tm分析检测CYP2C19基因的标的部位的多态型(CYP2C19*2和CYP2C19*3)。CYP2C19*2是CYP2C19基因的外显子5的681位的多态型，野生型为鸟嘌呤，突变型为腺嘌呤。另外，CYP2C19*3是CYP2C19基因的外显子4的636位的多态型，野生型为鸟嘌呤，突变型为腺嘌呤。
[表10]
(PCR反应液的组成：单位μL)
蒸馏水                          32.4
80v/v％甘油                     5
1mol/L Tris-HCl(pH8.6)          1.25
1mol/L KCl                      1.25
10mmol/L dNTP                   1
1mol/L MgCl2                    0.225
20w/v％BSA                      0.5
10w/v％NaN3                     0.23
100μmol/L CYP2C19*2用F引物     0.25
100μmol/L CYP2C19*2用R引物     0.5
5μmol/L CYP2C19*2用探针        0.2
100μmol/L CYP2C19*3用F引物     0.25
100μmol/L CYP2C19*3用R引物     0.5
5μmol/L CYP2C19*3用探针        0.2
100μmol/L Tm对照用寡核苷酸     0.1
100μmol/L Tm对照用探针         0.1
0.94U/μL Taq聚合酶             2
合计                            46μL
(CYP2C19*2用)
F引物(序列编号11)
5′-taaattattgttttctcttagatatgcaataattttccca-3′
R引物(序列编号12)
5′-cccgagggttgttgatgtccatc-3′
探针(序列编号13)
5′-tcccaggaacccataac-(B ODIPY  FL)-3′
(CYP2C19*3用)
F引物(序列编号14)
5′-tgatggaaaaattgaatgaaaacatcaggattgta-3′
R引物(序列编号15)
5′-tcaaaaatgtacttcagggcttggtcaata-3′
探针(序列编号16)
5′-(TAMRA)-ccctgaatccaggtaag-P-3′
(Tm对照用试剂)
Tm对照用寡核苷酸(序列编号17)
5′-gcatggcttccattggg-P-3′
Tm对照用探针(序列编号18)
5′-(Pacific Blue)-cccaatggaagccatgc-P-3′
(稀释液1)
10mmol/L Tris-HCl(pH8)
0.1mmol/L EDTA
0.3v/v％SDS
0.05w/v％叠氮钠
(稀释液2)
10mmol/L Tris-HCl(pH8)
0.1mmol/L EDTA
0.05w/v％叠氮钠
(纯化人类基因组)
使用核酸纯化试剂盒(商品名Q1Aamp，Qiagen公司生产)制备纯化人类基因组试样。该纯化人类基因组试样的多态型预先确认为CYP2C19*2和CYP2C19*3以及野生型和突变型的杂合(Ht)。在46μL上述PCR反应液中添加1μL上述纯化人类基因组试样(0.3ng/μL)，使用热循环仪(商品名i-densy LS-5310，爱科来公司生产)进行PCR。PCR以90℃60秒进行处理之后，以95℃1秒和64℃15秒为一个循环进行50个循环。接着以95℃1秒、40℃60秒处理之后，以升温速度1℃/3秒从40℃升温至75℃。升温期间测定各温度的荧光强度的变化，进行Tm分析。其中，荧光强度检测波长450～480nm(荧光物质Pacific Blue)、波长515～555nm(荧光物质BODIPY FL)和波长585～700nm(荧光物质TAMRA)。
(质粒)
作为CYP2C19基因的部分质粒，制备了插入有野生型CYP2C19*2的寡核苷酸(序列编号27)的野生型质粒(WT*2)、插入有野生型CYP2C19*3的寡核苷酸(序列编号29)的野生型质粒(WT*3)、插入有突变型CYP2C19*2的寡核苷酸(序列编号28)的突变型质粒(mt*2)、插入有突变型CYP2C19*3的寡核苷酸(序列编号30)的突变型质粒(mt*3)。接着，混合野生型质粒(WT*2)和野生型质粒(WT*3)，使各质粒为400拷贝/μL，制备了质粒试样(WT)。另外，混合突变型质粒(mt*2)和突变型质粒(mt*3)，使各质粒为400拷贝/μL，制备了质粒试样(mt)。混合10μL上述质粒试样、70μL上述稀释液1，进一步将10μL该混合液与70μL上述稀释液2混合。接着，将17μL得到的混合液以95℃10分钟进行处理，添加在46μL上述PCR反应液中，与上述纯化人类基因组同样操作，进行PCR和Tm分析。
(血液)
利用EDTA采血管采集血液。该血液试样的多态型预先确认为CYP2C19*2和CYP2C19*3以及野生型和突变型的杂合(Ht)。混合10μL上述采集的血液、70μL上述稀释液1，将10μL该混合液进一步与70μL上述稀释液2混合。接着，将17μL得到的混合液以95℃10分钟进行处理，添加在46μL上述PCR反应液中，与上述纯化人类基因组同样操作，进行PCR和Tm分析。
(对照)
将17μL上述稀释液2以95℃10分钟进行处理，添加在46μL上述PCR反应液中，与上述纯化人类基因组同样操作，进行PCR和Tm分析。
上述Tm对照用寡核苷酸和Tm对照用探针的Tm值为62℃。因此，Tm分析中，在62℃出现峰时，能够判断Tm分析装置的温度控制单元和信号检测单元正常地发挥功能。另外，正常温度条件下的Tm值如下所述。
(1)Tm对照用寡核苷酸和Tm对照用探针的Tm值：62℃
(2)野生型CYP2C19*2和CYP2C19*2用探针的Tm值：51℃
(3)突变型CYP2C19*2和CYP2C19*2用探针的Tm值：59℃
(4)野生型CYP2C19*3和CYP2C19*3用探针的Tm值：50℃
(5)突变型CYP2C19*3和CYP2C19*3用探针的Tm值：59℃
在图13～15中表示其结果。图13～15分别是表示伴随温度上升的荧光强度的Tm分析的图表。各图中，横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化，单位是荧光强度变化量的微分值“d荧光强度变化量/dt”(dF/dt)。图13(A)是对照的结果，图13(B)是纯化人类基因组的结果，图14(A)是野生型质粒(WT)的结果，图14(B)是突变型质粒(mt)的结果，图15是血液的结果，各图中，上段是表示基于Tm对照用探针的荧光变化的图表(Tm对照)，中段是基于CYP2C19*2用探针的荧光变化的图表(CYP2C19*2)，下段是基于CYP2C19*3用探针的荧光变化的图表(CYP2C19*3)。
如图13(A)所示，对照中，Tm对照用探针仅在62℃附近确认峰，CYP2C19*2用探针和CYP2C19*3用探针确认没有峰。图13(B)中，Tm对照用探针在62℃附近、CYP2C19*2用探针在51℃和59℃附近、CYP2C19*3在50℃和59℃附近分别确认峰。图14(A)中，Tm对照用探针在62℃附近、CYP2C19*2用探针在51℃附近、CYP2C19*3在50℃附近分别确认峰。图14(B)中，Tm对照用探针在62℃附近、CYP2C19*2用探针在59℃附近、CYP2C19*3在59℃附近分别确认峰。图15中，Tm对照用探针在62℃附近、CYP2C19*2用探针在51℃和59℃附近、CYP2C19*3在50℃和59℃附近分别确认峰。这样，在各反应中，对于Tm对照用探针而言均在62℃附近出现峰，由此能够确认Tm分析装置的温度控制正常地进行。另外，在Tm对照用寡核苷酸和Tm对照用探针的共存下，进行PCR和Tm分析，但是，CYP2C19*2用探针和CYP2C19*3用探针没有出现上述Tm值以外的峰。由此可知，即使使Tm对照用寡核苷酸和Tm对照用探针共存，也不影响目的多态型的检测。根据上述结果，根据本发明，能够确认Tm检测装置的温度控制和信号检测是否正常进行，并且能够进行多态型的检测，所以能够以更优异的可靠性进行多态性分析。
[实施例B2]
本例中，使用对照用寡核苷酸和对照用探针，确认温度控制和信号检测是否正常，并且对各种核酸试样通过Tm分析检测了UGT1A1基因的标的部位的多态型(UGT1A1*6和UGT1A1*28)。UGT1A1*6是UGT1A1基因的外显子1的211位的多态型，野生型为鸟嘌呤、突变型为腺嘌呤。另外，UGT1A1*28是UGT1A1基因的启动子区域的多态型，为6个TA重复和7个TA重复。
[表11]
(PCR反应液的组成：单位μL)
蒸馏水                          27.2
80v/v％甘油                     9.375
1mol/L Tris-HCl(pH8.6)          1.25
1mol/L KCl                      2.5
10mmol/L  dNTP                  1
1mol/L MgCl2                    0.075
20w/v％BSA                      0.5
10w/v％NaN3                     0.23
100μmol/L UGT1A1*6用F引物      0.25
100μmol/L UGT1A1*6用R引物      0.5
100μmol/L UGT1A1*6用探针       0.1
100μmol/L UGT1A1*28用F引物     0.25
100μmol/L UGT1A1*28用R引物     0.5
100μmol/L UGT1A1*28用探针      0.1
100μmol/L Tm对照用寡核苷酸     0.1
100μmol/L Tm对照用探针         0.1
0.94U/μL Taq聚合酶             2
合计46μL
(UGT1A1*6用)
F引物(序列编号19)
5′-tgaaatagttgtcctagcacctgacgc-3′
R引物(序列编号20)
5′-caaaagactctttcacatcctccctttgg-3′
探针(序列编号21)
5′-gagacagagcattttacac-(TAMRA)-3′
(UGT1A1*28用)
F引物(序列编号22)
5′-agctttttatagtcacgtgacacagtcaaac-3′
R引物(序列编号23)
5′-cgcctttgctcctgccagag-3′
探针(序列编号24)
5′-(BODIPY FL)-ccatatatatatatatataagtaggagag-P-3′
(Tm对照用试剂)
Tm对照用寡核苷酸(序列编号25)
5′-gcatggcttccattggg-P-3′
Tm对照用探针(序列编号26)
5′-(Pacific Blue)-cccaatggaagccatgc-P-3′
(纯化人类基因组)
使用核酸纯化试剂盒与上述实施例B1同样地纯化人类基因组试样。该纯化人类基因组试样的多态型预先确认为UGT1A1*6和UGT1A1*28以及野生型和突变型的杂合(Ht)。除了使用该纯化试样和上述表11所示的PCR反应液以外，与上述实施例B1的纯化人类基因组同样操作，进行了PCR和Tm分析。
(质粒)
作为UGT1A1基因的部分质粒，制备了插入有野生型UGT1A1*28的寡核苷酸(序列编号31)的野生型质粒(WT*28)、插入有野生型UGT1A1*6的寡核苷酸(序列编号33)的野生型质粒(WT*6)、插入有突变型UGT1A1*28的寡核苷酸(序列编号32)的突变型质粒(mt*28)、插入有突变型UGT1A1*6的寡核苷酸(序列编号34)的突变型质粒(mt*6)。接着，混合野生型质粒(WT*28)和野生型质粒(WT*6)，使各质粒为400拷贝/μL，制备了质粒试样(WT)。另外，混合突变型质粒(mt*28)和突变型质粒(mt*6)，使各质粒为400拷贝/μL，制备了质粒试样(mt)。这样，除了使用上述质粒试样和上述表11所示的PCR反应液以外，与上述实施例B1的质粒同样操作，进行了PCR和Tm分析。
(血液)
利用EDTA采血管采集血液。该血液试样的多态型预先确认为UGT1A1*28和UGT1A1*6以及野生型和突变型的杂合(Ht)。除了使用上述采集的血液和上述表11所示的PCR反应液以外，与实施例B1的血液试样同样操作，进行了PCR和Tm分析。
(对照)
将17μL上述稀释液2以95℃10分钟进行处理，添加在46μL上述PCR反应液中，与上述实施例B1的对照同样操作，进行了PCR和Tm分析。
上述Tm对照用寡核苷酸和Tm对照用探针的Tm值为57℃。因此，Tm分析中，在57℃出现峰时，能够判断Tm分析装置的温度控制单元和信号检测单元正常地发挥功能。另外，正常温度条件下的Tm值如下所述。
(1)Tm对照用寡核苷酸和Tm对照用探针的Tm值：57℃
(2)野生型UGT1A1*6和UGT1A1*6用探针的Tm值：47℃
(3)突变型UGT1A1*6和UGT1A1*6用探针的Tm值：55℃
(4)野生型UGT1A1*28和UGT1A1*28用探针的Tm值：47℃
(5)突变型UGT1A1*28和UGT1A1*28用探针的Tm值：52℃
在图16～18中表示其结果。图16～18分别是表示伴随温度上升的荧光强度的Tm分析的图表。各图中，横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化，单位是荧光强度变化量的微分值“d荧光强度变化量/dt”(dF/dt)。图16(A)是对照的结果，图16(B)是纯化人类基因组的结果，图17(A)是野生型质粒(WT)的结果，图17(B)是突变型质粒(mt)的结果，图18是血液的结果，各图中，上段是表示基于Tm对照用探针的荧光变化的图表(Tm对照)，中段是基于UGT1A1*28用探针的荧光变化的图表(UGT1A1*28)，下段是基于UGT1A1*6用探针的荧光变化的图表(UGT1A1*6)。
如图16(A)所示，在对照中，Tm对照用探针仅在57℃附近确认峰，UGT1A1*28用探针和UGT1A1*6用探针确认没有峰。图16(B)中，Tm对照用探针在57℃附近、UGT1A1*28用探针在47℃附近和52℃附近、UGT1A1*6探针在47℃附近和55℃附近分别确认峰。图17(A)中，Tm对照用探针在57℃附近、UGT1A1*28用探针在47℃附近、UGT1A1*6探针在47℃附近分别确认峰。图17(B)中，Tm对照用探针在57℃附近、UGT1A1*28用探针在52℃附近、UGT1A1*6探针在55℃附近分别确认峰。图18中，Tm对照用探针在57℃附近、UGT1A1*28用探针在47℃附近和52℃附近、UGT1A1*6探针在47℃附近和55℃附近分别确认峰。这样，在各反应中，Tm对照用探针均在57℃附近出现峰，由此能够确认Tm分析装置的温度控制正常地进行。另外，在Tm对照用寡核苷酸和Tm对照用探针的共存下，进行了PCR和Tm分析，但是UGT1A1*28用探针和UGT1A1*6用探针没有出现上述Tm值以外的峰。由此可知，即使使Tm对照用寡核苷酸和Tm对照用探针共存，也不影响目的多态型的检测。根据上述结果，根据本发明，能够确认Tm检测装置的温度控制和信号检测是否正常进行，并且能够进行多态型的检测，所以能够以更优异的可靠性进行多态性分析。
产业上的可利用性
如上所述，根据本发明，通过使用如上所述的对照用模板，能够在一个反应体系中进行以往需要分别进行的阳性对照和阴性对照的检测。这样，通过在一个反应体系中进行阳性对照和阴性对照的检测，例如能够使操作变得简便，也能够降低试剂等的费用。
Figure IPA00001280342600011
Figure IPA00001280342600021
Figure IPA00001280342600031
Figure IPA00001280342600041
Figure IPA00001280342600051
Figure IPA00001280342600061
Figure IPA00001280342600071
Figure IPA00001280342600081
Figure IPA00001280342600091
Figure IPA00001280342600101
Figure IPA00001280342600111
Figure IPA00001280342600121

Claims (31)

1.一种对照检测方法，检测在反应体系中对检测体核酸的标的序列进行扩增时显示所述反应体系的扩增性能的对照，其特征在于：
所述对照是显示反应体系中发生扩增反应的阳性对照和显示反应体系中混入不需要的核酸的阴性对照，
所述反应体系中含有引物、检测用探针和对照用模板核酸，
所述引物是能够对所述标的序列进行扩增的引物，
所述检测用探针是能够与所述标的序列杂交的探针，
所述对照用模板核酸能够利用所述引物进行扩增，
利用所述引物扩增的所述对照用模板核酸的扩增区域中，所述检测用探针能够进行杂交，
所述对照用模板核酸的扩增区域和所述检测用探针的Tm值(TmC)是与所述标的序列和所述检测用探针的Tm值(TmA)不同的值，
所述对照检测方法包括下述(a1)～(a3)工序，在一个反应体系中检测所述阳性对照和所述阴性对照：
(a1)扩增工序，在所述反应体系中，使用所述引物，进行所述对照用模板核酸的扩增，
(a2)分析工序，使用所述(a1)工序的所述反应体系，在所述检测用探针的存在下，进行解链曲线分析，
(a3)判断工序，通过所述解链曲线中的峰，判断所述阳性对照和所述阴性对照分别为阳性还是阴性。
2.如权利要求1所述的对照检测方法，其特征在于：
所述(a3)工序为，
在所述解链曲线中，
当所述对照用模板核酸的扩增区域和所述检测用探针的Tm值(TmC)存在峰时，判断所述阳性对照为阳性，
当所述对照用模板核酸的扩增区域和所述检测用探针的Tm值(TmC)不存在峰时，判断所述阳性对照为阴性，
当所述对照用模板核酸的扩增区域和所述检测用探针的Tm值(TmC)以外不存在峰时，判断所述阴性对照为阴性，
当所述对照用模板核酸的扩增区域和所述检测用探针的Tm值(TmC)以外存在峰时，判断所述阴性对照为阳性。
3.如权利要求1所述的对照检测方法，其特征在于：
所述对照用模板核酸中，其扩增区域中所述检测用探针的杂交区域的长度是与所述标的序列中所述检测用探针的杂交区域的长度不同的长度。
4.如权利要求1所述的对照检测方法，其特征在于：
所述检测用探针是与所述标的序列的规定区域互补的碱基序列，
所述对照用模板核酸在其扩增区域中具有能够与所述检测用探针部分杂交的碱基序列。
5.如权利要求4所述的对照检测方法，其特征在于：
所述对照用模板核酸在其扩增区域中具有与所述标的序列中的所述检测用探针的杂交区域在5′侧和3′侧的至少一侧不同的碱基序列。
6.如权利要求1所述的对照检测方法，其特征在于：
所述检测用探针是与所述标的序列部分互补的碱基序列，
所述对照用模板核酸在其扩增区域具有与所述检测用探针互补的碱基序列。
7.如权利要求6所述的对照检测方法，其特征在于：
所述对照用模板核酸在其扩增区域具有与所述标的序列中的所述检测用探针的杂交区域相同的碱基序列，并且，与其相邻，具有与所述标的序列中的所述杂交区域的5′侧和3′侧的至少一侧邻接的区域不同的碱基序列。
8.如权利要求1所述的对照检测方法，其特征在于：
所述对照用模板核酸中，其扩增区域中所述检测用探针的杂交区域的碱基序列是与所述标的序列中所述检测用探针的杂交区域的碱基序列的相同性低于100％的序列。
9.如权利要求8所述的对照检测方法，其特征在于：
所述对照用模板核酸的所述杂交区域和所述检测用探针的互补性，与所述标的核酸的所述检测用探针的杂交区域和所述检测用探针的互补性不同。
10.如权利要求1所述的对照检测方法，其特征在于：
所述标的序列含有显示多态性的标的部位，
所述检测用探针含有与所述标的序列中含有所述标的部位的区域互补的碱基序列。
11.如权利要求10所述的对照检测方法，其特征在于：
所述检测用探针含有与所述标的序列中含有突变型的所述标的部位的区域互补的碱基序列，或者，含有与所述标的序列中含有野生型的所述标的部位的区域互补的碱基序列。
12.如权利要求1所述的对照检测方法，其特征在于：
所述对照用模板核酸的扩增区域和所述检测用探针的Tm值(TmC)，与所述标的序列和所述检测用探针的Tm值(TmA)的差为1～50℃。
13.如权利要求1所述的对照检测方法，其特征在于：
所述检测用探针是具有标记物质的标记探针。
14.如权利要求13所述的对照检测方法，其特征在于：
所述标记物质是荧光物质。
15.一种对反应体系中检测体核酸的标的序列进行扩增的方法，其特征在于：
包括下述(A)工序和(B)工序，
(A)检测工序，利用权利要求1所述的对照检测方法，检测在含有所述对照用模板核酸、所述引物和所述检测用探针的反应体系中显示扩增性能的对照，
(B)扩增工序，包括下述(b1)工序，对所述检测体核酸的标的序列进行扩增，
(b1)扩增工序，在含有所述检测体核酸、所述引物和所述检测用探针的反应体系中，使用所述引物，对所述检测体核酸的标的序列进行扩增。
16.如权利要求15所述的扩增方法，其特征在于：
同时进行所述(A)工序中的下述(a1)工序和所述(B)工序中的所述(b1)工序，
(a1)在所述反应体系中，使用所述引物，进行所述对照用模板核酸的扩增。
17.如权利要求15所述的扩增方法，其特征在于：
所述(B)工序还包括下述(b2)工序和(b3)工序，
(b2)分析工序，使用所述(b1)工序的所述反应体系，在所述检测用探针的存在下，进行解链曲线分析，
(b3)判断工序，通过所述解链曲线中的峰，判断所述检测体核酸的标的序列有无扩增。
18.如权利要求17所述的扩增方法，其特征在于：
所述(b3)工序中，
当所述标的序列和所述检测用探针的Tm值(TmA)存在峰时，判断所述标的序列发生了扩增，
当所述标的序列和所述检测用探针的Tm值(TmA)不存在峰时，判断所述标的序列未扩增。
19.如权利要求17所述的扩增方法，其特征在于：
同时进行所述(A)工序中的下述(a2)工序和所述(b2)工序，
(a2)分析工序，使用所述(a1)工序的所述反应体系，在所述检测用探针的存在下，进行解链曲线分析。
20.如权利要求19所述的扩增方法，其特征在于：
所述(A)工序的下述(a3)工序中，当判断阳性对照为阳性且阴性对照为阴性时，进行所述(b3)工序的判断，
(a3)判断工序，通过所述解链曲线中的峰，判断所述阳性对照和所述阴性对照分别为阳性还是阴性。
21.一种含有检测体核酸的反应体系的解链曲线分析方法，其特征在于：
包括下述(A)工序和(C)工序，
(A)检测工序，利用权利要求1所述的对照检测方法，检测在含有所述对照用模板核酸、所述引物和所述检测用探针的反应体系中显示扩增性能的对照，
(C)分析工序，包括下述(c1)和(c2)工序，进行解链曲线分析，
(c1)扩增工序，在含有所述检测体核酸、所述引物和所述检测用探针的反应体系中，使用所述引物，对所述检测体核酸的标的序列进行扩增，
(c2)分析工序，使用所述(c1)工序的所述反应体系，在所述检测用探针的存在下，进行解链曲线分析。
22.如权利要求21所述的解链曲线分析方法，其特征在于：
所述检测体核酸的标的序列含有显示多态性的标的部位，
所述检测用探针是能够与所述标的序列中含有所述标的部位的区域杂交的探针，
所述(C)工序还具有下述(c3)工序，
(c3)检测工序，通过所述解链曲线中的峰，检测所述多态性。
23.如权利要求22所述的解链曲线分析方法，其特征在于：
所述检测用探针含有与所述标的序列中含有突变型的所述标的部位的区域互补的碱基序列，
所述(c3)工序中，
当所述含有突变型的所述标的部位的标的序列和所述检测用探针的Tm值(Tmm)存在峰时，判断所述检测体核酸的所述标的部位为突变型，当所述含有野生型的所述标的部位的标的序列和所述检测用探针的Tm值(TmW)存在峰时，判断所述检测体核酸的所述标的部位为野生型。
24.如权利要求22所述的解链曲线分析方法，其特征在于：
所述检测用探针含有与所述标的序列中含有野生型的所述标的部位的区域互补的碱基序列，
所述(c3)工序中，
当所述含有野生型的所述标的部位的标的序列和所述检测用探针的Tm值(TmW)存在峰时，判断所述检测体核酸的所述标的部位为野生型，当所述含有突变型的所述标的部位的标的序列和所述检测用探针的Tm值(Tmm)存在峰时，判断所述检测体核酸的所述标的部位为突变型。
25.如权利要求21所述的解链曲线分析方法，其特征在于：
同时进行所述(A)工序中的下述(a1)工序和所述(c1)工序，同时进行所述(A)工序中的下述(a2)工序和所述(c2)工序，
(a1)扩增工序，在所述反应体系中，使用所述引物，进行所述对照用模板核酸的扩增，
(a2)分析工序，使用所述(a1)工序的所述反应体系，在所述检测用探针的存在下，进行解链曲线分析。
26.如权利要求22所述的解链曲线分析方法，其特征在于：
所述(A)工序中的下述(a3)工序中，当判断阳性对照为阳性且阴性对照为阴性时，进行所述(c3)工序的判断，
(a3)判断工序，通过所述解链曲线中的峰，判断所述阳性对照和所述阴性对照分别为阳性还是阴性。
27.一种对照检测用试剂，用于在权利要求1所述的对照检测方法中使用，其特征在于：
含有对照用模板核酸，
所述对照用模板核酸能够利用能够扩增目的标的序列的引物进行扩增，
在利用所述引物扩增的所述对照用模板核酸的扩增区域中，能够与所述标的序列杂交的检测用探针能够进行杂交，
所述对照用模板核酸的扩增区域和所述检测用探针的Tm值(TmC)是与所述标的序列和所述检测用探针的Tm值(TmA)不同的值。
28.如权利要求27所述的对照检测用试剂，其特征在于：
还含有所述引物和所述检测用探针。
29.一种分析用试剂，用于在权利要求21所述的解链曲线分析方法中使用，其特征在于，具备：
权利要求27所述的对照检测用试剂、和
含有所述引物和所述检测用探针的检测体核酸用的扩增反应用试剂。
30.一种对照用模板核酸的设计方法，该对照用模板核酸用于检测对检测体核酸的标的序列进行扩增时显示反应体系的扩增性能的对照，所述设计方法的特征在于：
所述对照用模板核酸是能够检测显示在反应体系中发生扩增反应的阳性对照和显示反应体系中混入不需要的核酸的阴性对照两者的模板核酸，
能够利用能够对所述标的序列进行扩增的引物扩增所述对照用模板核酸的碱基序列，
利用所述引物扩增的扩增区域能够与检测用探针杂交，该检测用探针能够与所述标的序列杂交，并且
设定为所述扩增区域和所述检测用探针的Tm值(TmC)与所述标的序列和所述检测用探针的Tm值(TmA)显示不同值的碱基序列。
31.一种对照用模板核酸的使用，该对照用模板核酸用于检测对检测体核酸的标的序列进行扩增时显示反应体系的扩增性能的对照，所述使用的特征在于：
所述对照用模板核酸能够利用能够对所述标的序列进行扩增的引物进行扩增，
利用所述引物扩增的扩增区域能够与检测用探针杂交，该检测用探针能够与所述标的序列杂交，并且
由所述扩增区域和所述检测用探针的Tm值(TmC)与所述标的序列和所述检测用探针的Tm值(TmA)显示不同值的碱基序列构成，
作为用于在一个反应体系中并行检测显示在反应体系中发生扩增反应的阳性对照和显示反应体系中混入不需要的核酸的阴性对照的对照用模板核酸使用。
CN200980124610XA 2008-12-16 2009-12-16 核酸扩增的对照的检测方法及其用途 Pending CN102076849A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008-320168 2008-12-16
JP2008320168 2008-12-16
PCT/JP2009/070967 WO2010071147A1 (ja) 2008-12-16 2009-12-16 核酸増幅のコントロールの検出方法およびその用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102076849A true CN102076849A (zh) 2011-05-25

Family

ID=42268818

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980124610XA Pending CN102076849A (zh) 2008-12-16 2009-12-16 核酸扩增的对照的检测方法及其用途

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20110244460A1 (zh)
EP (1) EP2354226A4 (zh)
JP (1) JP5509075B2 (zh)
KR (1) KR20100098570A (zh)
CN (1) CN102076849A (zh)
WO (1) WO2010071147A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104024433A (zh) * 2011-10-31 2014-09-03 爱科来株式会社 基因丰度的测定方法
US9121051B2 (en) 2011-10-31 2015-09-01 Arkray, Inc. Method of determining the abundance of a target nucleotide sequence of a gene of interest

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011071046A1 (ja) * 2009-12-07 2011-06-16 アークレイ株式会社 疾患関連遺伝子の多型検出用プローブおよびその用途
EP3219814B1 (en) * 2010-10-29 2023-02-15 ARKRAY, Inc. Probe for detection of polymorphism in egfr gene, amplification primer, and use thereof
CN102676652B (zh) * 2011-03-09 2015-12-02 爱科来株式会社 Cyp3a基因的多态性检测用探针、多态性检测方法、药效评价方法以及多态性检测用试剂盒
JP5917248B2 (ja) * 2011-05-09 2016-05-11 アークレイ株式会社 ＨＧＦ遺伝子のｐｏｌｙＡｒｅｐｅａｔ数変異多型検出用プローブおよびその用途
JP5982810B2 (ja) * 2011-12-20 2016-08-31 ニプロ株式会社 試験片を含むキット
JP6070246B2 (ja) * 2013-02-15 2017-02-01 ニプロ株式会社 試験片を含むキット
GB201319180D0 (en) * 2013-10-30 2013-12-11 Mast Group Ltd Nucleic acid probe
WO2015147370A1 (en) * 2014-03-28 2015-10-01 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequences using different detection temperatures
GB201411603D0 (en) * 2014-06-30 2014-08-13 Vela Operations Pte Ltd Compositions for quantitative and/or semiquantitative mutation detection methods
WO2016122198A1 (ko) * 2015-01-30 2016-08-04 주식회사 시선바이오머티리얼스 PNA 프로브를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응의 임계 사이클(Ct)에 따른 핵산 검출의 문제를 해결하는 방법
JP6490990B2 (ja) * 2015-03-05 2019-03-27 アークレイ株式会社 Ｃｙｐ２ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセット、ｃｙｐ２ｃ１９遺伝子増幅用キット、遺伝子増幅方法、多型解析方法、及び薬効判定方法
CN105441567B (zh) * 2016-01-05 2018-10-19 甘肃农业大学 一种牦牛foxo1基因单核苷酸多态性的检测方法及其试剂盒
CN105441569B (zh) * 2016-01-05 2018-10-19 甘肃农业大学 一种牦牛foxo3基因单核苷酸多态性的检测方法及试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1493822A1 (de) * 2003-07-02 2005-01-05 Labor Becker, Olgemoeller &amp; Kollegen GbR Detektionsverfahren für Nucleinsäuren mit interner Amplifikationskontrolle
WO2007071365A1 (en) * 2005-12-21 2007-06-28 Roche Diagnostics Gmbh Controls for nucleic acid testing

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5079352A (en) 1986-08-22 1992-01-07 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US5219727A (en) 1989-08-21 1993-06-15 Hoffmann-Laroche Inc. Quantitation of nucleic acids using the polymerase chain reaction
EP0506825B1 (en) 1989-12-22 1998-08-05 F. Hoffmann-La Roche Ag RECOMBINANT EXPRESSION VECTORS AND PURIFICATION METHODS FOR $i(THERMUS THERMOPHILUS) DNA POLYMERASE
US5322785A (en) 1990-04-26 1994-06-21 New England Biolabs, Inc. Purified thermostable DNA polymerase obtainable from thermococcus litoralis
WO1992009689A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Stratagene PURIFIED THERMOSTABLE $i(PYROCOCCUS FURIOSUS)
DE60113945T2 (de) * 2000-11-15 2006-06-29 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Analyse von Wiederkehrenden PCR-Podukten, das auf der Analyse von DNS-Schmelzkurven basiert
DE10215238C1 (de) * 2002-04-06 2003-08-14 Cytonet Gmbh & Co Kg Nachweis von Mykobakterien in klinischem Material

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1493822A1 (de) * 2003-07-02 2005-01-05 Labor Becker, Olgemoeller &amp; Kollegen GbR Detektionsverfahren für Nucleinsäuren mit interner Amplifikationskontrolle
WO2007071365A1 (en) * 2005-12-21 2007-06-28 Roche Diagnostics Gmbh Controls for nucleic acid testing

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104024433A (zh) * 2011-10-31 2014-09-03 爱科来株式会社 基因丰度的测定方法
US9121051B2 (en) 2011-10-31 2015-09-01 Arkray, Inc. Method of determining the abundance of a target nucleotide sequence of a gene of interest
CN104024433B (zh) * 2011-10-31 2016-11-16 爱科来株式会社 基因丰度的测定方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2354226A4 (en) 2012-11-07
WO2010071147A1 (ja) 2010-06-24
JPWO2010071147A1 (ja) 2012-05-31
US20110244460A1 (en) 2011-10-06
JP5509075B2 (ja) 2014-06-04
KR20100098570A (ko) 2010-09-07
EP2354226A1 (en) 2011-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102076849A (zh) 核酸扩增的对照的检测方法及其用途
CN102076850B (zh) 靶核酸序列的扩增方法、使用该方法的突变检测方法、以及用于该方法的试剂
CN101646786A (zh) 目标核酸序列的扩增方法和用于该方法的探针
EP2031074A1 (en) Method of detecting variation and kit to be used therein
EP3739064A1 (en) Comparative analysis of microsatellites by capillary electrophoresis (ce) dna profiles
CN102666852A (zh) Mthfr基因扩增用引物对、含有其的mthfr基因扩增用试剂及其用途
JP6490990B2 (ja) Ｃｙｐ２ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセット、ｃｙｐ２ｃ１９遺伝子増幅用キット、遺伝子増幅方法、多型解析方法、及び薬効判定方法
CN102471771B (zh) 靶序列的扩增方法、多态性检测方法以及其中使用的试剂
CN101443448A (zh) Cyp2c9基因扩增用引物对、含有其的cyp2c9基因扩增用试剂及其用途
CN102199662B (zh) Sult1a1基因扩增用引物对,含有其的sult1a1基因扩增用试剂及其用途
CN102766682B (zh) 多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒
US20120252024A1 (en) Probe for Detection of Polymorphism in C-Kit Gene and Use Thereof
EP2520666A1 (en) Oligonucleotide for detection test of polymorphism of EGFR exon 19 and use thereof
US10844441B2 (en) Penta e polymorphisms for human identification
CN102597271B (zh) Egfr基因多态性检测用探针及其用途
US20160053302A1 (en) Method for visual identification of pcr solutions for accurate reaction setup
JP5860667B2 (ja) Ｅｇｆｒエクソン２１ｌ８５８ｒ遺伝子多型検出用プライマーセット及びその用途
US20210180115A1 (en) Multiple analysis method for amplicon by using fluorescence-based multiple melting analysis
KR20230115786A (ko) 마록 유래 녹용을 판별하기 위한 단일염기다형성을 갖는 유전자 마커
JP6754202B2 (ja) Ｋ−ｒａｓ遺伝子増幅用フォワードプライマーセット、Ｋ−ｒａｓ遺伝子増幅用キット、Ｋ−ｒａｓ遺伝子増幅方法、多型解析方法、及び薬効判定方法
WO2023052622A1 (en) Method of examining a nucleic acid amplification product

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20110525