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Stand der Technik/Hintergrund
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Hybridisierungstechniken
sind auf dem Gebiet der Molekularbiologie gut bekannt. Sie erlauben die
Detektion von spezifischen Sequenzen im Fall, dass eine spezifische
Hybridisierungssonde vorhanden ist. Üblicherweise ist die Hybridisierungssonde mit
einer detektierbaren Gruppe, beispielsweise einem radioaktiven oder
fluoreszierenden Marker, markiert.
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Ferner
ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eine leistungsstarke und
weit verbreitete Technologie für
die Analyse von Nukleotidsäuren
geworden. Die Prinzipien der PCR sind in U.S. 4,683,195 und U.S.
4,683,102 (Mullis et al.) offenbart. Eine große Verbesserung der PCR leitet
sich von der Möglichkeit,
ab die Kinetiken einer PCR-Reaktion online messen zu können. Dies
wurde durch Detektion des Amplicons mittels Fluoreszenzbestimmung
möglich.
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Alternativ
können
geeignete fluoreszierend-markierte Hybridisierungssonden, die bereits während der
Amplifikationsreaktion vorhanden sind, anschließend in einem homogenen Assay
ohne Öffnen
des Reaktionsgefässes
eingesetzt werden, um eine Temperaturabhängige Schmelzkurven-Analyse durchzuführen. Für eine solche
Analyse wird die Temperatur der Probe kontinuierlich erhöht und die genaue
Schmelztemperatur bestimmt, bei der der zuvor gebildete Hybrid-Komplex
aus (amplifizierter) Zielnukleotidsäure und Hybridisierungssonde
getrennt ist: Dieser Ansatz kann verwendet werden, um Unterschiede
in den Schmelztemperaturen der Zielmoleküle zu bestimmen, die sich nur
durch einen einzelnen Nukleotid-Polymorphismus unterscheiden. In anderen
Worten, die Schmelzkurven-Analyse kann sogar zur Detektion oder
Identifizierung von Punktmutationen eingesetzt werden.
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Beispiele
an solchen Techniken sind detailliert in WO 97/46707, WO 97/46712
und WO 97/46714 (Wittwer et al.) offenbart.
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Es
sind verschiedene Detektionsformate, basierend auf zielabhängiger Fluoreszenzsignalisierung
beschrieben worden, die eine kontinuierliche Überwachung der Bildung der
PCR-Amplifikationsprodukte oder eine Identifizierung von Mutationen während einer
anschließenden
Schmelzkurven-Analyse (einen Überblick
gebend: Wittwer et al., Biotechniques, Vol. 22, Nr. 1, 130–138, 1997)
ermöglicht. Diese
Detektionsformate, umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein:
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a) Erhöhter Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer durch
Hybridisierung
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Für dieses
Detektionsformat werden zwei Oligonukleotid-Hybridisierungssonden, die jeweils mit
einer fluoreszierenden Gruppe markiert sind, eingesetzt, die in
der Lage sind, mit angrenzenden, aber nicht überlappenden Regionen eines
Strangs des Amplifikationsproduktes zu hybridisieren. Vorzugsweise
ist ein Oligonukleotid am 5'-Ende
und das zweite Oligonukleotid am 3'-Ende markiert. Nach Hybridisierung
mit der Ziel-DNA werden die beiden fluoreszierenden Marker in engen
Kontakt gebracht, so dass ein Fluoreszenzresonanzenergietransfer
zwischen den zwei fluoreszierenden Gruppen stattfinden kann. Als
Ergebnis kann die Hybridisierung durch Anregung der Donor-Gruppe
und anschließender
Messung der Fluoreszenzemission der zweiten Akzpetor-Gruppe verfolgt
werden (WO 97/46714).
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In
einer ähnlichen
Ausführungsform
wird nur eine fluoreszierend-markierte Sonde verwendet, welche zusammen
mit einem geeignet markierten Primer auch als spezifisches FRET-Paar
(Bernard et al., Analytical Biochemistry 235, S. 101–107 (1998))
fungieren kann.
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b) Molekulares Beacon
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Ein
molekulares Beacon-Oligonukleotid wird mit einer fluoreszierenden
Verbindung und einer Quencher-Verbindung markiert, welche aufgrund
der sekundären
Struktur des Moleküls
in enger Nachbarschaft zueinander sind. Bei Bindung an die Ziel-DNA wird
die intramolekulare Wasserstoffbrücken-Bindung gebrochen und die fluoreszierende
Verbindung, die an einem Ende der Sonde befestigt ist, wird von der
Quencher-Verbindung separiert, die am entgegengesetzten Ende der
Sonde befestigt ist (Lizardi et al.,
US
5,118,801 ).
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Jedoch
in der Zeit bevor die Erfindung gemacht wurde, war kein homogenes
Detektionsformat vorhanden, welches die Quantifizierung der Anzahl an
Sequenzwiederholungen in repetitiven Sequenzen erlaubte. Solch eine
Analyse ist aber von hoher Wichtigkeit, zum Beispiel auf dem Gebiet
der Mikrosatelliten-Analyse.
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Mikrosatelliten
(MIS) sind kurze Tandem-Repeat, die über das gesamte menschliche
Genom verteilt vorkommen. Statistisch treten Mikrosatelliten etwa
einmal in 100.000 Basenpaaren auf. Bisher sind fünf Klassen von MIS beschrieben,
die sich nach der Länge
ihrer kleinsten repetitiven Einheiten als Mono-, Di-, Tri-, Tetra-
oder Pentanukleotid-Repeat voneinander unterscheiden. In der Regel
treten diese repetitiven Einheiten 10 bis 40 mal in Tandemanordnung wiederholt
auf. Mikrosatelliteninstabilität
(MIN) in Form kleiner Deletionen oder Insertionen kann bei vielen
Tumorpatienten nachgewiesen werden, wenn man DNA aus Tumormaterial
mit normaler DNA des gleichen Individuums vergleicht (Thibodeau
et al., (1993), Science, 260, 816–819) (WO 94/19492). Dies geschieht
durch Amplifikation der DNA mit Hilfe von PCR und anschließender gelelektrophoretischer
Auftrennung der Amplifikationsprodukte. Als Ursache für MIN wird
ein dauerhafter Replikationsdefekt der Tumorzellen angesehen (Parsons
et al., (1993), Cell, 75, 1227–1236;
Shibata et al., (1994) Nat. Genet. 6, 273–281). Solche Tumoren werden
als "Replikation-Error-Positive" (RER+) klassifiziert.
Ein RER+ Phänotyp
ist charakteristisch für
Colorectaltumoren in Familien mit HNPCC (hereditary non-polyposis
colon cancer) (Aaltonen et al., (1993), Science, 260, 812–816).
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Die
Analyse von Mikrosatelliten ist eine äußerst attraktive Methode sowohl
für diagnostische Anwendungen
als auch für
die Untersuchung der Tumorgenese von RER+ Tumoren. Aufgrund ihrer
einfach Durchführbarkeit
ist die Bestimmung von MIN vor der Sequenzierung der Mismatch Repair
Gene von HNPCC Familien ein geeignetes Hilfsmittel zur Identifizierung
potentieller RER+ Patienten. Ebenfalls von großer Bedeutung ist die MIN Analyse
als prognostische Diagnose bei sporadischen Colorectal-Karzinom,
weil das Auftreten von MIN mit einer besseren Prognose korreliert
(Lothe et al. (1993) Cancer Res., 53, 5849–5852; Thibodeau et al. (1993),
Science, 260, 816–819;
Bubb et al. (1996) Oncogene, 12, 2641–2649). MIN kann in mehr als 90%
aller HNPCC Tumoren nachgewiesen werden (Liu et al., (1996) Nature
Med., 2, 169–174),
wohingegen MIN in sporadischen Colorectaltumoren nur mit einer Häufigkeit
von 10–20
% auftritt (Thibodeau et al. (1993) Science, 260, 816–819; Ionov
et al. (1993), Nature, 363, 558–561;
Aaltonen et al. (1993) Science, 260, 812–816; Lothe et al. (1993) Cancer
Res., 53, 5849–5852).
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MIN
ist jedoch nicht auf Colorectaltumoren beschränkt, sondern wurde auch in
anderen Tumoren nachgewiesen. Dazu zählen unter anderem Pankreaskarzinome
(Han et al. (1993) Cancer Res., 53, 5087–5089), gastritische Karzinome
(Han et al. (1993) Cancer Res., 53, 5087–5089; Peltomaki et al. (1993)
Cancer Res., 53, 5853–5855;
Mironov et al. (1994) Cancer Res., 54, 41–44; Rhyu et al. (1994) Oncogene,
9, 29–32;
Chong et al. (1994) Cancer Res., 54, 4595–4597), Prostata-Karzinome
(Gao et al. (1994) Oncogene, 9, 2999–3003), Karzinome des Endometriums
(Risinger et al. (1993) Cancer Res., 53, 5100–5103; Peltomaki et al. (1993)
Cancer Res., 53, 5853–5855)
und Mammakarzinome (Patel et al. (1994) Oncogene, 9, 3695–3700).
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Vor
der Erfindung benötigte
die Analyse von Mikrosatelliten auf jeden Fall eine zeitaufwendige Fragmentseparation
mittels Gelelektrophorese, um die Größe des Amplifikationsproduktes
zu bestimmen, um dadurch Informationen über die Länge der Repeat-Struktur zu
bekommen.
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Es
bestand deshalb ein Bedarf, ein Verfahren zur Analyse der Länge von
repetitiven Strukturen ohne Fragment-Separation bereit zu stellen.
Solch ein Verfahren muss schnell und einfach durchzuführen sein.
Zusätzlich
ist es vorteilhaft, wenn ein solches Verfahren im Prinzip automatisiert
werden kann.
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Kurze Beschreibung
der Erfindung
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Die
neue Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem die Anzahl an Repeat-Sequenzen, die in
der Probe vorhanden sind, mittels Schmelztemperatur-Analyse bestimmt
wird.
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Aus
diesem Grund betrifft ein Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur
Analyse einer Zielnukleotidsäure,
bestehend aus repetitiven und nichtrepetitiven Sequenzen, wobei
die repetitiven Sequenzen höchstens
n Wiederholungen enthalten, umfassend:
- a) Hybridisierung
von mindestens einer Polynukleotidhybridisierungssonde, die dadurch
gekennzeichnet ist, dass die Länge
der Sonde 100 Nukleotide nicht überschreitet,
enthaltend ein erstes Segment, welches komplementär zu einem
nichtrepetitiven Bereich der Zielnukleotidsäure ist, und ein zweites Segment,
welches komplementär
zu einem benachbarten repetitiven Bereich der Zielnukleotidsäure ist,
wobei das zweite Segment aus einer definierten Anzahl an n Wiederholungen
besteht,
- b) Bestimmung der Schmelzpunkttemperatur des Hybrids, welches
sich zwischen der Zielnukleotidsäure
und der mindestens einen Hybridisierungssonde gebildet hat,
wobei
die Schmelzpunkttemperatur mit der Anzahl der in der Zielnukleotidsäure vorhandenen
Wiederholungen korreliert wird.
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Üblicherweise
ist es vorteilhaft, den bestimmten Schmelztemperaturwert mit dem
Schmelztemperaturwert zu vergleichen, der für eine Vergleichsnukleotidsäure erhalten
wurde. Aus diesem Grund betrifft die Erfindung ein Verfahren zur
Analyse einer Zielnukleotidsäure,
in einer Probe, wobei die genannte Zielnukleotidsäure aus
repetitiven und nichtrepetitiven Sequenzen, wobei die repetitiven
Sequenzen höchstens
n Wiederholungen enthalten, umfassend:
- a) Hybridisierung
von mindestens einer Polynukleotidhybridisierungssonde, die dadurch
gekennzeichnet ist, dass die Länge
der Sonde 100 Nukleotide nicht überschreitet,
enthaltend ein erstes Segment, welches komplementär zu einem
nichtrepetitiven Bereich der Zielnukleotidsäure ist, und ein zweites Segment,
welches komplementär
zu einem benachbarten repetitiven Bereich der Zielnukleotidsäure ist,
wobei das zweite Segment aus einer definierten Anzahl an n Wiederholungen
besteht,
- b) Hybridisierung derselben Polynukleotidhybridisierungssonde
wie in Schritt a) mit einer Zielnukleotidsäure in einer Referenzprobe,
wobei die Zielnukleotidsäure
in der Referenzprobe aus repetitiven und nichtrepetitiven Sequenzen
besteht und die repetitiven Sequenzen höchstens n Wiederholungen enthalten,
- c) Bestimmung der Schmelzpunkttemperatur der Hybride, welche
sich zwischen der Zielnukleotidsäure
und der mindestens einen Hybridisierungssonde in der Referenzprobe
gebildet haben,
- d) Bestimmung des Unterschiedes zwischen den zwei Schmelzpunkttemperaturen
als ein Maß für den Unterschied
der Anzahl an Wiederholungen zwischen der Zielnukleotidsäuren in
der Probe und in der Referenzprobe.
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Um
eine erhöhte
Sensibilität
zu erzielen, hat es sich als vorteilhaft rausgestellt, wenn die
Zielnukleotidsäure
vor der Hybridisierung amplifiziert wird. Eine Amplifikation kann
einfach beispielsweise mittels einer Polymerase-Kettenreaktion erzielt werden.
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Üblicherweise
wird die wenigstens eine Hybridisierungssonde markiert und der Marker
ist vorzugsweise ein Fluorophor. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform
wird die Detektion mittels des FRET/Hybsonden-Prinzips durchgeführt. In
diesem Fall wird die Hybridisierung mit zwei benachbart hybridisierenden
Sonden, welche jeweils mit einem unterschiedlichen Fluorophor markiert
sind, derart durchgeführt,
dass Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
stattfinden kann, wenn die beiden Sonden mit der Zielnukleotidsäure hybridisiert
sind.
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Dieses
neue Verfahren ist bei einer Vielzahl an verschiedenen experimentellen
Setups anwendbar, bei denen die Anzahl an Repeat-Strukturen in einer repetitiven Sequenz
bestimmt werden muss.
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Aus
diesem Grund betrifft ein spezifischer Aspekt der Erfindung die
Anwendung des neuen Verfahrens zur Analyse von Mikrosatelliten und
insbesondere von Mikrosatellit-Instabilität. Solch eine Analyse ist gut
anwendbar, um erbliche Tumore, insbesondere Colorectaltumore, welche
durch Defekte in den HNPCC Mismatch Repair Genen verursacht werden,
zu detektieren.
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Entsprechend
fokussiert ein weiterer Aspekt der Erfindung auf die Verwendung
des neuen Verfahrens zur Identifizierung eines Individuums in einer Population,
beispielsweise um forensische Probleme zu lösen.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung entsprechende Polynukleotidhybridisierungssonde,
enthaltend ein erstes Segment, welches komplementär zu einem
nichtrepetitiven Bereich ist, und ein zweites Segment, welches komplementär zu einem
benachbarten repetitiven Bereich ist, wobei das bekannte zweite
Segment aus einer definierten Anzahl an Wiederholungen besteht,
wobei die Polynukleotidhybridisierungssonde aus einer Sequenz gemäß SEQ ID
No. 4 zur Analyse von BAT 26 und SEQ ID No. 7 zur Analyse von BAT
25 besteht.
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Die
folgenden Beispiele, Literaturverweise, Sequenzlisten und Figuren
werden bereitgestellt, um beim Verstehen der vorliegenden Erfindung
zu helfen. Der wahre Schutzumfang wird in den beigefügten Ansprüchen bekannt
gemacht.
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Kurze Beschreibung der
Figuren:
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1:
schematische Zeichnungen der Hybridisierungssonden gemäß der Erfindung.
Wiederholungen sind als Pfeile gekennzeichnet.
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2:
schematische Zeichnungen der FRET-Hybridisierungssonden gemäß der Erfindung. Wiederholungen
sind als Pfeile gekennzeichnet.
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3:
Mikrosatelliten-Analyse von Mononukleotid Repeat-Locus BAT 26 gemäß der Erfindung.
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4:
Mikrosatelliten-Analyse von Mononukleotid Repeat-Locus BAT 25 gemäß der Erfindung.
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5:
Multiplex-Mikrosatelliten-Analyse der Mononukleotid Repeat-Loci
BAT 25 und BAT 26 gemäß der Erfindung.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Im
Zusammenhang mit der folgenden Erfindung müssen folgende Begriffe definiert
werden:
Ein Repeat ist im Zusammenhang dieser Erfindung eine
kurze Nukleotidsäuresequenz,
welche mehrmals in einem längeren
DNA-Fragment oder auch manchmal in einem RNA-Molekül mehrmals
vorkommt. Innerhalb eines Repeats sind die Nukleotidbasen immer
in derselben Reihenfolge vorhanden. Solche Repeats kommen häufig in „egoistischen" nichtkodierenden
Bereichen des Genoms vor. In den meisten Fällen werden diese Repeat-Strukturen
Mikrosatelliten genannt.
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Die
Anzahl an Nukleotiden, die einen Repeat bilden kann variieren. Mononukleotid-Repeats
bestehen aus einer einzelnen Nukleotidbase, nämlich A, G, C oder T und führen zu
einer Dehnung der Mononukleotide. Dinukleotid-Repeats bestehen aus zwei Arten an Nukleotidbasen,
wie zum Beispiel CA und führen
zu einer Dehnung mit alternierender Sequenz, wie (CA)n. Triple-,
Quadrupul- oder Pentanukleotid-Repeats wurden auch oft beobachtet
(...). Im Zusammenhang dieser Erfindung wird ein n-Nukleotid-Repeat
als eine repetitive Struktur, enthaltend Repeats mit einer Länge n, wobei
n eine Zahl zwischen 1 und 10, vorzugsweise zwischen 1 und 5 und
mehr bevorzugt zwischen 1 oder 2, Nukleotiden ist, verstanden.
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Eine
repetitive Sequenz ist eine Sequenz mit mehreren Repeats, welche
in einer aufeinander folgenden Anordnung oder in einer invertierten
Anordnung vorhanden sind. Manchmal können repetitive Sequenzen durch
einmalige, nichtrepetitive Sequenzen unterbrochen sein. Zusätzlich wurden
repetitive Sequenzen identifiziert, die mehrere Typen an Repeats,
insbesondere mehrere Typen an Mononukleotid-Repeats enthalten.
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Hybridisierungssonden
sind Polynukleotide mit Sequenzen, die vollständig identisch mit oder exakt
komplementär
zu der Sequenz der Zielnukleotidsäure sind. Es ist auch noch
innerhalb des Umfangs der Erfindung, wenn die Sonden ein oder mehrere Mismatches
enthalten, solange sie in der Lage sind, mit dem Analyten unter
angemessenen Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren. Auf jeden
Fall hat es sich als besonders vorteilhaft herausgestellt, wenn
die Sequenzidentität
oder -komplementarität bei
100% über
einen Bereich von mindestens 10 angrenzenden Resten ist. Es hat
sich auch als vorteilhaft herausgestellt, wenn die Länge einer
Sonde nicht mehr als 100 Nukleotide, vorzugsweise nicht mehr als
40 Nukleotide, beträgt.
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Jedoch
können
insbesondere im Zusammenhang mit dieser Erfindung die Hybridisierungssonden
5'- oder 3'-Überstände haben, welche nicht mit
der Zielnukleotidsäure
hybridisieren. Dies kommt daher, da die Erfindung Verfahren zur
Detektion der Anzahl an Wiederholungen, die in der Zielnukleotidsäure vorhanden
sind, betrifft und deshalb die Anzahl an Wiederholungen in der Sonde
identisch mit der maximalen Anzahl an Wiederholungen, die für das Zielmolekül erwartet
werden können,
sein muss.
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Hybridisierungssonden
können
an eine detektierbare Einheit, zum Beispiel eine fluoreszierende Verbindung,
so dass das Hybridisierungsereignis mit bekannten Verfahren detektiert
werden kann.
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Der
Begriff „FRET-Hybridisierungsonde" ist definiert als
ein Paar von Hybridisierungssonden, die jeweils eine fluoreszierende
Verbindung aufweisen, welche zusammen als FRET-Paar fungieren können und
so die Detektion einer Nukleotidsäure ermöglichen, wenn beide Sonden
benachbart mit einem Zielmolekül
hybridisiert sind.
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Der
Begriff „Polynukleotid" umfasst nicht nur (Desoxy)-Oligo-Ribonukleotide,
sondern auch alle bekannten DNA- oder RNA-Derivate, wie Methylphosphonate,
Phosphothioate, 2'-O-Alkylderivative genauso
wie Peptid-Nukleotidsäure
und Analoga, welche modifizierte Basen wie 7-Deaza-Purine enthalten.
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Nach
der Hybridisierung einer Hybridisierungssonde mit einer Zielnukleotidsäure gemäß der Erfindung
wird eine Bestimmung der Schmelzpunkttemperatur durchgeführt. Die
Schmelzpunkttemperatur hängt
hauptsächlich
von der Größe des Doppelstrang-Bereichs
des Ziel/Sonden-Hybrids
ab. Im Fall, dass eine Hybridisierungssonde mit repetitiven Bereichen
eingesetzt wird, hängt
die Hybridisierungstemperatur dann ab von und kann korreliert werden mit
der Anzahl an in der Ziel-DNA vorhandenen Wiederholungen.
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Zusätzlich ist
im Stand der Technik bekannt und sollte nicht vernachlässigt werden,
dass die Schmelztemperatur auch abhängt von:
- – dem GC-Gehalt
der Doppelstrang-Bereiche
- – der
Gegenwart oder der Abwesenheit von Mismatches innerhalb des Doppelstrang-Bereichs
- – und
anderen Faktoren von niederer Bedeutung, wie Salzkonzentration der
Probe.
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Die
Schmelzpunkttemperatur wird üblicherweise
experimentell dadurch bestimmt, dass die Probe einem konstitutiven
Anstieg der Temperatur und einer kontinuierlicher Bestimmung der
Dissoziation des Hybridisierungskomplexes in Einzelstränge unterworfen
wird. Die Dissoziation kann durch eine Vielzahl verschiedenster
Verfahren, zum Beispiel durch eine Verschiebung der UV-Extinktion,
Oberflächen-Palmon-Resonanz
oder vorzugsweise mittels Fluoreszenz, detektiert werden. Im letzteren
Fall wird die Hybridisierungssonde üblicherweise mit einer fluoreszierenden
Einheit markiert und die Erzeugung eines Fluoreszenzsignals hängt irgendwie
von der Bildung des Hybridisierungskomplexes ab.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird der Assay in einem homogenen Detektionsformat durchgeführt: Die
Zielnukleotidsäure
kann zum Beispiel vor der Bestimmung der Schmelztemperatur in einer
typischen PCR-Reaktion mit geeigneten Amplifikationsprimeren amplifiziert
werden. Eine geeignete Hybridisierungssonde ist schon während der
Amplifikationsreaktion zugegen. Die Hybridisierungssonde weist vorzugsweise
eine fluoreszierende Markierung auf, welche nach geeigneter Anregung
detektierbar ist. Die Hybridisierungssonde kann beispielsweise entweder
ein molekulares Beacon (Lizardi et al.,
US 5,118,801 ) oder ein Paar aus fluoreszierend
markierten Oligonukleotiden, welche zusammen in der Lage sind, als
FRET-Hybsonden Format zu fungieren (WO 97/46714) sein. Nach Beendigung
der PCR-Reaktion wird
die Temperatur der Probe konstitutiv erhöht. Fluoreszenz kann solange
die Hybridisierungssonde an die Ziel-DNA gebunden ist, beobachtet
werden. Am Schmelzpunkt jedoch, ist die Hybridisierungssonde von
seinem Ziel abgelöst
und das Fluoreszenzsignal nimmt sofort bis zum Hintergrundsignal
ab. Diese Abnahme wird mit einem geeigneten Temperatur-Zeit-Plot
beobachtet, so dass ein exakter Temperaturwert, bei dem der Fluoreszenzabfall
beobachtet, bestimmt werden kann.
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Das
Design der Hybridisierungssonden gemäß der Erfindung benötigt mehrere
Vorbedingungen:
Erstens muss die Sonde ein nichtrepetitives
Hybridisierungssegment aufweisen, welches entweder am 5'-Ende oder am 3'-Ende der Sonde angebracht
ist. Die Länge
des nichtrepetitiven Segments kann in Abhängigkeit der speziellen Assay-Bedingungen
variieren. Es hat sich herausgestellt, dass üblicherweise ein Segment von
mindestens 3 Nukleotiden, die mit der Zielsequenz hybridisieren,
ausreichend ist. Die Gegenwart einer solchen nichtrepetitiven Hybridisierungssequenz
hat den Vorteil, dass unabhängig
von der Anzahl an identischen Wiederholungen in der Zielsequenz,
die Sonde immer exakt an einer bestimmten Position der Zielnukleotidsäure hybridisiert, welche
der Übergang
zwischen dem nichtrepetitiven Bereich und dem Bereich, der aus repetitiven
Sequenzen besteht, ist.
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Zweitens
ist die Anzahl an Wiederholung in der Sonde entscheidend für bis zu
welchem Ausmaß Wiederholungen,
die in der Sequenz der Zielnukleotidsäure vorhanden sind, detektiert
werden. Genauer, eine Hybridisierungssonde, die n Wiederholungen enthält und in
einem Verfahren gemäß der Erfindung eingesetzt
wird, ist in der Lage zwischen verschiedenen Zielnukleotidsäuren mit
einer Anzahl an Wiederholungen zwischen 0 und n, zu unterscheiden.
Im Gegenteil wird die Schmelzpunkttemperatur für alle Zielnukleotidsäuren, die
n Wiederholungen oder mehr als n Wiederholungen enthalten, gleich
sein.
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Drittens
ist die Anzahl an Wiederholungen, die in der Hybridisierungssonde
aufgrund der Tatsache, dass die Länge der Hybridisierungssonden,
welche noch zur Schmelzpunkttemperatur-Analyse eingesetzt werden
kann, limitiert ist, begrenzt. In diesem Zusammenhang hat es sich
als vorteilhaft herausgestellt, wenn die Gesamtlänge der Hybridisierungssonde
100 Nukleotide, vorzugsweise 80 Nukleotide und insbesondere bevorzugt
60 Nukleotide nicht überschreitet.
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1 zeigt
zwei alternative Designs für
Sonden, welche im Fall, dass eine Hybridisierungssonde eingesetzt
wird, verwendet werden können.
Dies kann der Fall bei jedem heterogenen Assay-Format sein oder
alternativ bei Einsatz des homogenen molekularen Beacon-Formats,
bei dem eine fluoreszierende Einheit an das oder in der Nähe des 5'-Ende(s) oder des
3'-Ende(s) der Sonde
gebunden ist und eine Quencher-Einheit an das oder in die Nähe des entgegengesetzten
Ende(s) der Sonde gebunden ist.
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In
einigen Fällen
kann eine Sonde sogar aus zwei nichtrepetitiven Segmenten an dem
5'-Ende und dem
3'-Ende, die über ein
internes repetitives Segment verbunden sind, bestehen.
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Die
Sonde enthält
einen nichtrepetitiven Bereich, welcher komplementär zu dem
einen einzigartigen Bereich der Zielsequenz ist, der in direkter Nachbarschaft
zu dem Repeat-Bereich an ihrem 5'-Ende
oder ihrem 3'-Ende
angeordnet ist. Im Fall eines Hybridisierungsereignisses mit einem
Zielmolekül,
welches weniger Wiederholungen als die Hybridisierungssonde enthält, wird
ein Einzelstrang-Überhang
der Sonde erzeugt und die Schmelztemperatur wird verglichen mit
einer Situation, in der die Anzahl an Wiederholungen in der Hybridisierungssonde
und der Zielsequenz gleich ist, reduziert. Allgemeiner, die Schmelztemperatur
hängt direkt
von der Anzahl der Wiederholungen, die in dem Ziel vorhanden sind,
da je mehr Wiederholungen in der Probe vorhanden sind, desto höher ist
die Schmelztemperatur.
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2 zeigt
drei alternative Designs für FRET-Hybsonden,
welche jedoch den Schutzbereich der beigefügten Ansprüche nicht beschränken. Für solch
ein Sonden-Design ist es notwendig, dass die zweite Sonde, die den
repetitiven Bereich enthält, eine
Schmelztemperatur aufweist, welche höher ist, als die Schmelztemperatur
der Sonde, die keine repetitiven Bereiche enthält, da das FRET-Verfahren unterbrochen
wird, sobald eine Sonde vom Zielmolekül dissoziiert ist.
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2A offenbart ein Paar Hybridisierungssonden,
bei denen die erste Hybridisierungssonde ausschließlich aus
nichtrepetitiven Sequenzen besteht, die komplementär zu einem
Bereich in enger Nachbarschaft des zu analysierenden, repetitiven Upstream-Bereichs
sind. Der fluoreszierende Marker ist an das 3'-Ende der Sonde angebracht. Die zweite Sonde
ist gemäß der beigefügten Ansprüche ausgeführt und
weist deshalb eine Sequenz auf, welche komplementär zu einer
nichtrepetitiven Sequenz ist, und eine zweite Sequenz, welche komplementär zu der
der Repeat-Sequenz der Zielnukleotidsäure ist. Diese Sonde trägt einen
fluoreszierenden Marker an ihrem 5'-Ende, welcher in enge Nachbarschaft
mit dem Marker der ersten Sonde gebracht wird, wenn beide Sonden
mit dem Zielmolekül
hybridisiert werden.
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Alternativ
ist auch eine Ausführungsform
im Schutzbereich der beigefügten
Ansprüche,
bei der die Sonde ausschließlich
aus nichtrepetitiven Sequenzen besteht, an ihrem 5'-Ende einen Marker
aufweist und mit den repetitiven Downstream-Bereich hybridisiert
ist, während
die zweite Sonde am 3'-Ende
markiert ist.
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2B illustriert einen alternativen Ansatz des
Sondendesigns. In diesem Fall ist der Fluoreszierende Marker der
Sonde, die sowohl repetitive und nichtrepetitive Sequenzen enthält, am repetitiven
Bereich der Sonde angebracht. Im Fall der Hybridisierung mit einem
Zielmolekül,
welches weniger Wiederholungen als die komplementäre Hybridisierungssonde
aufweist, werden Loops innerhalb der Sonde erzeugt, so dass die
Schmelztemperatur verringert wird.
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Es
ist auch möglich
2 Paare an Hybridisierungssonden einzusetzen, welche beide gemäß den beigefügten Ansprüchen ausgeführt sind.
Während einer
Schmelztemperatur-Analyse, die auf ein Hybridisierungsereignis folgt,
werden zwei signifikante Schmelztemperaturen beobachtet und die
Anzahl an Wiederholungen, die in dem Ziel vorhanden sind, kann dann
unter Berücksichtigung
der beiden bestimmten Schmelztemperaturen berechnet werden.
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2C zeigt noch eine weitere Alternative: beide
Sonden enthalten ein erstes Segment, welches komplementär zu einem
nichtrepetitiven Bereich ist, und ein zweites Segment, welches komplementär zu einem
benachbarten repetitiven Bereich ist. Das genannte zweite Segment
besteht aus einer definierten Anzahl an Wiederholungen. Die beiden
fluoreszierenden Marker werden dann innerhalb der repetitiven Bereiche
der beiden Sonden angebracht. In diesem besonderen Fall korrespondiert
die Anzahl an Wiederholungen, die in beiden Sonden zusammen vorhanden
sind, mit der maximalen Anzahl an Wiederholungen, die in der zu
analysierenden Zielnukleotidsäure
erwartet werden. Wieder werden, wenn weniger Wiederholungen in der
Zielnukleotidsäure
vorhanden sind, Loop-Strukturen innerhalb der Hybridisierungssonden
ausgebildet und die Schmelztemperaturen werden gesenkt.
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Da
zwei Sonden, die mit den Repeat-Strukturen hybridisieren, eingesetzt
werden und außerdem weil
die maximale Länge
einer Oligonukleotid-Hybridisierungssonde
durch die Kapazitäten
der konventionellen Oligonukleotid-Synthesechemie limitiert ist, ist
diese Ausführungsform
besonders für
die Analyse von sehr langen Repeat-Strukturen, geeignet. Allerdings
kann ein solches Sondendesign zu einer verringerten Spezifität führen, da
diese Sonden auch zusammen an genomische Loci, die von den interessierenden
Repeat-Loci verschieden sind, binden können, im Fall, dass diese Loci
aus den selben Typen an Wiederholungen bestehen.
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Die
Erfindung ist für
eine Vielzahl an verschiedenen Anwendungen zur Analyse von repetitiven
Sequenzen und insbesondere zur Analyse von Mikrosatelliten-Repeats
geeignet. Zum Beispiel kann die Mikrosatelliten-Repeat-Analyse gemäß der Erfindung angewandt werden,
um die Verluste an Heterozygotie als Indikator für genomisches Ungleichgewicht
der Tumorsuppressorgene zu bestimmen, um so ein Indikator für mehrere
Tumortypen zu sein (Knudson, Proc. Natl. Acad. Sci.
US 90 , S. 10914–10921, 1993).
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Insbesondere
ist die neue Erfindung für
die Analyse von Mikrosatelliten-Instabilität geeignet,
die als ein Indikator für
Mutationen in Mismatch Repair Genen bekannt ist und deshalb auch
bekannt ist, ein Indikator für
erblichen nicht-polyposen Colorectal-Krebs zu sein (HNPCC) (Peltomaki
et al., Science 260, S. 810–812,
1993). Zusätzlich
können
andere Arten an Krebs, wie zum Beispiel kleinzelliger Lungenkrebs,
prädiagnostiziert
werden.
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Schließlich ist
die Erfindung allgemein einsetzbar in allen Typen an Population-Studien
und forensischen Anwendungen, einschließlich Personenidentifizierung,
Gewebe-Typisierung und genetische Analyse einer Population (Koeth
et al.,). of Path. 178, 5. 239–248,
1996).
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Die
folgenden Beispiele erklären
die Erfindung weiter:
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Beispiel 1 Probenmaterial
und Herstellung
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70
Mikrosatelliten-stabile (MSS) Tumore und acht Mikrosatelliten-instabile
MSI-H Tumore (>= 20% instabile
Marker, hohe MSI) wurden in einer LightCycler-Mikrosatelliten-Schmelzpunkt-Analyse
mit Mononukleotid-Repeat loci BAT25 und BAT26 eingesetzt. Diese
Marker sind als die sensibilsten Marker für die MSI-Detektion beschrieben
(Hoang et al., 1997, Cancer Res.; Dietmaier et al., 1997, Cancer Res.;
Cravo et al., 1999, J Pathol). Tumor- und normale Gewebebereiche wurden für die LightCycler-Analyse
aus 5 μm-Bereichen an Formalin-fixierten,
Paraffin-eingelagerten Gewebesegmente mittels Laser-unterstützter (PALM,
Bernried, Germany) oder manueller Mikrosezierung mikroseziert. DNA
von mikrosezierten Geweben wurde mittels High Pure PCR Präparation
Kit (Roche) hergestellt.
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Beispiel 2 Echtzeit-PCR
von BAT 26
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2μl DNA (50–200ng)
wurde mit 13μl
Amplifikationsmischung gemischt, was zu einer endgültigen Konzentration
an 3mM MgCl2, 0.5 μM BAT26-Upstream-(SEQ. ID. Nr: 1:
TGA CTA CTT TTG ACT TCA GCC) und BAT26-Downstream-(SEQ. ID. Nr: 2:
AAC CAT TCA ACA TTT TTA ACC) Amplifikationsprimeren, 0.15 μM BAT26-Donor-Hybridisierungssonde
(SEQ: ID. Nr: 3: GCA GCA GTC AGA GCC CTT AAC CT), welche mit Fluorescein
an ihrem 3'-Ende
markiert ist, 0,15 μM
BAT26-Akeptor-Hybridisierungssonde (SEQ. ID. Nr: 4: TCA GGT AAA
AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AA) welche an ihrem 5'-Ende mit LightCycler-Fluorosezenzfarbstoff LC-Red-640
(Roche Molecular Biochemicals) und 1x LightCycler® DNA
Master Hybridization Probes-Mix (Roche Molecular Biochemicals) führte.
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LightCycler
(Roche Molecular Biochemicals) wurde in der anschließenden Echtzeit-PCR-Amplifikationsüberwachung
eingesetzt. Das BAT26 PCR-Amplifikationsprogramm
begann mit einem einzelnen Denaturierungsschritt bei 95 °C für 90 Sekunden
und verlief weiter mit 50 Zyklen an 95 °C/0 Sekunden, 60 °C/10 Sekunden,
50 °C/3
Sekunden für die
Signaldetektion und 72°C/10
Sekunden. Danach wurde ein Schmelzprofil mittels Inkubation der
Amplicone bei 95 °C/0
Sekunden, 35 °C/30
Sekunden und steigender Temperatur auf 95°C mit 0.2°/Sekunden bei einer kontinuierlichen
Kanal-F2-Detektion
erstellt.
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Die
Amplifikation und Detektion von BAT 26 mittels Echtzeit-PCR und
Schmelzpunktanalyse war bei 125/153 (82 %) bzw. 26/31 (83 %) Formalin-fixierten, Paraffin-eingelagerten
Gewebe-Proben. Die Schmelzpunktanalyse von BAT 26 ergab eine Temperatur
Tm von 51–51,8 °C für normale
Gewebe, Blut oder MSS-Tumore (3A).
Im Gegensatz dazu zeigten jede der 7 MSIH-Tumore mit defekter hNSH2-
oder hMLH1-Proteinexpression und einer 100 % MSI-Rate eine veränderte Tm,
welche im Bereich von 43–46 °c liegt (3B).
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Beispiel 3 Echtzeit-PCR
von BAT 25
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Wenn
nicht anders angegeben wurden die Amplifikation und die Schmelzkurvenanalyse
wie in Beispiel 2 durchgeführt.
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0.5 μM BAT25-Upstream-(SEQ.
ID. Nr: 5: TCG CCT CCA AGA ATG TAA GT) und BAT25-Downstream-(SEQ.ID.
Nr: 6: TCT GCA TTT TAA CTA TGG CTC) Primere genauso wie 0.15 μM BAT25-Donor-Hybridisierungssonde
(SEQ. ID. Nr: 7: CAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAT CA) welche
mit Fluorescein an ihrem 3'-Ende
markiert war und 0,15 μM
BAT25-Akeptor-Hybridisierungssonde
(SEQ. ID. Nr: 8: AAC AAA ACA CAA AAC TCT TTA GAG AATC) welche an
ihrem 5'-Ende mit
LightCycler-Fluorosezenzfarbstoff LC-Red-705 (Roche Molecular Biochemicals)
markiert war, wurden für eine
BAT25-LightCycler-Amplifikation verwendet.
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Das
BAT25 Amplifikationsprogramm enthielt einen einzelnen Denaturierungsschritt
bei 95 °C
für 90
Sekunden und 50 Zyklen an 95 °C/0
Sekunden, 60 °C/10
Sekunden für
die Signaldetektion und 72 °C/10
Sekunden. Danach wurde ein Schmelzprofil mittels Inkubation der
Amplicone bei 95 °C/0
Sekunden, 30 °C/30
Sekunden und mit einem Temperaturanstieg auf 95°C mit 0.2°/Sekunden bei einer kontinuierlichen
F3-Detektion erstellt. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
Die Schmelzpunktanalyse von BAT 25 ergab eine Temperatur Tm von
44,5 °C
für normale
Gewebe und MSS-Tumore
(4A), während die Tm von BAT25 von
zwei MSI-H Tumoren signifikant niedriger bei 42 °C war (4B).
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Beispiel 4 Echtzeit-Duplex-PCR
von BAT 26 und BAT 25
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Für eine Duplex-PCR,
um BAT 25 und BAT 26 in einem Gefäß zu analysieren, wurden die
Primere und FRET-Hybridisierungssonden für BAT 25 und BAT 26 gemäß SEQ. ID.
Nr. 1–8
in den in Beispiel 2 und 3 angegebenen Konzentrationen gemischt.
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Das
LightCycler-Amplifikationsprogramm war wie folgt: einzelner Denaturierungsschritt
bei 95 °C
für 90
Sekunden und 50 Zyklen an 95 °C/0
Sekunden, 60 °C/10
Sekunden, 45 °C/2
Sekunden für
die Signaldetektion und 72 °C/10
Sekunden. Das Duplex-Schmelzkurvenprogramm war: 95 °C/0 Sekunden,
30 °C/30
Sekunden und ein Temperaturanstieg auf 95°C mit 0.2°/Sekunden bei einer kontinuierlichen
F2- und F3-Detektion.
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Nachdem
die Duplex-LightCycler-Amplifikation von BAT 25 und BAT 26 durchgeführt war,
wurden höhere
Tm-Werte verglichen mit den getrennten LightCycler-Anlysen von BAT
25 und 26 (5) erhalten. Für BAT 25
betrug der Unterschied bei Tm vier Grad (5A).
Die Tm-Werte für
BAT 26 waren ein Grad höher
(5B).
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