DE60319146T2 - Zusammensetzungen und verfahren für den nachweis von polynukleotiden - Google Patents

Zusammensetzungen und verfahren für den nachweis von polynukleotiden Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung bezieht sich auf eine Sonde zur Polynucleotidbestimmung unter Verwendung von Nicht-Target hybridisierenden Sonden und Fluoreszenz-Resonanzenergieübertragung.
  • STAND DER TECHNIK
  • Techniken zur Polynucleotiderfassung haben in der Grundlagenforschung, Diagnostik und Forensik breite Anwendung gefunden. Die Polynucleotiderfassung kann mit einer Reihe von Verfahren erreicht werden. Die meisten Verfahren beruhen auf der Verwendung von Polymerasekettenreaktion (PCR), um die Menge an Target-DNA zu amplifizieren.
  • TaqMan ist ein homogener Assay zur Erfassung von Polynucleotiden ( US-Patentschriften 5,723,591 ). In diesem Assay flankieren zwei PCR-Primer eine mittige Oligonucleotidsonde. Die Oligonucleotidsonde enthält zwei fluoreszierende Komponenten. Während des Polymerisationsschritts des PCR-Vorgangs spaltet die Polymerase die Oligonucleotidsonde. Die Spaltung führt dazu, dass sich die zwei fluoreszierenden Komponenten physikalisch trennen, was eine Veränderung der Wellenlänge der Fluoreszenzemission verursacht. Wenn mehr PCR- Produkt erzeugt wird, erhöht sich die Intensität der neuartigen Wellenlänge.
  • Molekulare Leuchtsignale sind eine Alternative zu TagMan ( US-Patentschriften Nr. 6,277,607 ; 6,150,097 ; 6,037,130 ) zur Erfassung von Polynucleotiden. Molekulare Leuchtsignale sind haarnadelförmige Oligonucleotide, die eine Konformationsänderung durchmachen, wenn sie an ein perfekt angepasstes Template binden. Die Konformationsänderung des Oligonucleotids vergrößert den physikalischen Abstand zwischen einer Fluorophorkomponente und einer Löscherkomponente, die auf dem Oligonucleotid vorhanden sind. Diese Vergrößerung des physikalischen Abstands führt dazu, dass die Wirkung des Löschers verringert wird, wodurch sich das Signal verstärkt, das von dem Fluorophor abgeleitet ist.
  • Die US-Patentschrift Nr. 6,174,670 B1 offenbart Verfahren zur Überwachung der Hybridisierung während einer Polymerasekettenreaktion, die mit einem schnellen Thermocycler und der Verwendung doppelsträngiger DNA-Farbstoffe oder spezifischer Hybridisierungssonden in Gegenwart eines Fluoreszenz-Resonanzenergieübertragungspaars – Fluorescein und Cy5.3 oder Cy5.5 – erreicht werden. Das Verfahren amplifiziert die Target-Sequenz durch Polymerasekettenreaktion in Gegenwart von zwei Nucleinsäuresonden, die to benachbarten Regionen der Target-Sequenz hybridisieren, wobei eine der Sonden mit einem Akzeptor-Fluorophor und die andere Sonde mit einem Donator-Fluorophor eines Fluoreszenzenergieübertragungspaars gelabelt ist, so dass bei der Hybridisierung der beiden Sonden mit der Target-Sequenz das Donator-Fluorophor mit dem Akzeptor-Fluorophor in Wechselwirkung steht, um ein erfassbares Signal zu erzeugen. Die Probe wird dann mit Licht bei einer Wellenlänge angeregt, die durch das Donator-Fluorophor absorbiert wird, und die Fluoreszenzemission des Fluoreszenzenergieübertragungspaars wird für die Bestimmung dieser Target-Menge erfasst.
  • Es gibt außerdem mehrere andere fluoreszierende und enzymatische PCR-Technologien zur Polynucleotiderfassung, wie etwa ScorpionsTM-, SunriseTM-Primer und DNAzymes, bei denen für jedes zu erfassende Polynucleotid verschiedene Oligonucleotidsonden und zwei verschiedene fluoreszierende Komponenten erforderlich sind. Diese Sonden werden üblicherweise maßgeschneidert synthetisiert und sind daher teuer.
  • KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • In einem Aspekt wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend (1) ein Polynucleotid-Target; (2) eine erste Target hybridisierende Sonde, die eine Target-Bindungssequenz (P1-DNA), die an einen Strang des Target-Polynucleotids hybridisiert, und eine Sondenbindungssequenz (P1-P) umfasst; und (3) eine zweite Target hybridisierende Sonde, die eine Target-Bindungssequenz (P2-DNA) umfasst, die in nächster Nähe an denselben Strang des Target-Polynucleotids hybridisiert und eine Sondenbindungssequenz (P2-DNA) umfasst.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung, die Gegenstand der Erfindung ist, des Weiteren eine universelle Nicht-Target hybridisierende Sonde 3, die mit dem Label A gelabelt ist, und eine universelle Nicht-Target hybridisierende Sonde 4, die mit dem Label B gelabelt ist, wobei die universelle Sonde 3 an die P1-P-Sequenz hybridisiert und die universelle Sonde 4 an die P2-P-Sequenz hybridisiert.
  • Außerdem wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend (1) ein Target-Polynucleotid; (2) eine erste Target hybridisierende Sonde, die eine Target-Bindungssequenz (P1-DNA), die zu einer ersten Sequenz auf einem Strang des Target-Polynucleotids komplementär ist, und eine Sondenbindungssequenz (P1-P) umfasst; (3) eine zweite Target hybridisierende Sonde, die eine Target-Bindungssequenz (P2-DNA) umfasst, die zu einer zweiten Sequenz auf dem selben Strang des Target-Polynucleotids komplementär ist, und eine Sondenbindungssequenz (P2-P) umfasst; (4) eine Nicht-Target hybridisierende Sonde 3, die mit dem Label A gelabelt ist; und (5) eine Nicht-Target hybridisierende Sonde 4, die mit dem Label B gelabelt ist, wobei die P1-P-Sequenz zur Sonde 3 komplementär ist und die P2-P-Sequenz zur Sonde 4 komplementär ist, und das Label A mit dem Label B in Wechselwirkung steht, um ein Signal zu erzeugen, das für die Menge des Target-Polynucleotids indikativ ist.
  • In einer Ausführungsform hybridisieren die erste Target hybridisierende Sonde und die zweite Target hybridisierende Sonde in nächster Nähe an denselben Strang des Target-Polynucleotids.
  • In einem anderen Aspekt wird ein Verfahren zum Erfassen der Menge des Target-Polynucleotids in einer Probe bereitgestellt, umfassend: (a) das Bereitstellen einer Target hybridisierenden Sonde 1, die eine Target-Bindungssequenz (P1-DNA), die an einen Strang des Target-Polynucleotids hybridisiert, und eine Sondenbindungssequenz (P1-P) umfasst, die nicht an das Target-Polynucleotid hybridisiert, und einer Target hybridisierende Sonde 2, die eine Target-Bindungssequenz (P2-DNA), die in nächster Nähe an denselben Strang des Target-Polynucleotids hybridisiert, und eine Sondenbindungssequenz (P2-P) umfasst, die nicht an das Target-Polynucleotid hybridisiert; (b) das Bereitstellen einer universellen Nicht-Target hybridisierenden Sonde 3, die mit dem Label A gelabelt ist, und einer universellen Nicht-Target hybridisierenden Sonde 4, die mit dem Label B gelabelt ist, wobei die universelle Sonde 3 an die P1-P-Sequenz hybridisiert und die universelle Sonde 4 an die P2-P-Sequenz hybridisiert, und wobei das Label A mit dem Label B in Wechselwirkung steht, um ein erfassbares Signal zu erzeugen; und (c) das Erfassen des erzeugten Signals, als für die Menge des Polynucleotids in der Probe indikativ.
  • Die vorliegende Offenbarung bezieht sich auf ein Verfahren für das Erfassen der Menge eines Target-Polynucleotids in einer Amplifikationsreaktionsmischung, umfassend: (a) das Bereitstellen eines Vorwärts- und eines Reverseprimer, die das Target-Polynucleotid in der Amplifikationsreaktionsmischung amplifizieren; (b) das Bereitstellen für die Reaktionsmischung einer Target hybridisierenden Sonde 1, die eine Target-Bindungssequenz (P1-DNA), die an einen Strang des Target-Polynucleotids hybridisiert, und eine Sondenbindungssequenz (P1-P) umfasst, die nicht an das Target-Polynucleotid hybridisiert, und einer Target hybridisierenden Sonde 2, die eine Target-Bindungssequenz (P2-DNA), die in nächster Nähe an denselben Strang des Target-Polynucleotids hybridisiert und eine Sondenbindungssequenz (P2-P) umfasst, die nicht an das Target-Polynucleotid hybridisiert; (c) das Bereitstellen für die Reaktionsmischung einer universellen Nicht-Target hybridisierenden Sonde 3, die mit dem Label A gelabelt ist, und einer universellen Nicht-Target hybridisierenden Sonde 4, die mit dem Label B gelabelt ist, wobei die universelle Sonde 3 an die P1-P-Sequenz hybridisiert und die universelle Sonde 4 an die P2-P-Sequenz hybridisiert, und wobei das Label A mit dem Label B in Wechselwirkung steht, um ein Signal zu erzeugen; und (d) das Erfassen des erzeugten Signals, als für die Menge des Polynucleotids in der Probe indikativ.
  • Bevorzugt steht in der betreffenden Zusammensetzung oder dem betreffenden Verfahren das Label A in Wechselwirkung mit dem Label B, um ein Signal zu erzeugen, das für die Menge des Target-Polynucleotids indikativ ist. Außerdem können Label A und Label B bevorzugt Teile eines Paars interaktiver Label sein. Stärker bevorzugt können Label A und Label B fluoreszierende Farbstoffe sein. In einer Ausführungsform können Label A und Label B ein Donator-Akzeptorpaar sein, die mit einander in Wechselwirkung stehen, um durch Fluoreszenzresonanzenergieübertragung (FRET) ein Signal zu erzeugen. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Donator-Akzeptorpaar ein FAM/ROX-Paar sein. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann der Akzeptor ein dunkler Löscher sein.
  • Bevorzugt hat die Sonde 3 oder 4 keine Homologie mit irgendeinem Polynucleotid gemeinsam, das von der Probe isoliert worden ist, die das Target-Polynucleotid enthält, In einer Ausführungsform ist die Sonde 3 an ihrem 3'-Ende gelabelt und die Sonde 4 an ihrem 5'-Ende gelabelt. Bevorzugt ist das 3'-Ende einer Sonde modifiziert, um die Sondenverlängerung zu verhindern. In einer Ausführungsform ist das 3'-Ende einer Sonde phosphoryliert, um die Sondenverlängerung zu verhindern. In einer Ausführungsform liegt die Target-Bindungssequenz bei 5' der Sondenbindungssequenz in der Sonde 1, während die Target-Bindungssequenz bei 3' der Sondenbindungssequenz in der Sonde 2 liegt. Bevorzugt hybridisiert die universelle Sonde 3 an die P1-P-Sequenz und die universelle Sonde 4 hybridisiert an die P2-P-Sequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform hat die universelle Sonde 3 einen höheren Schmelzpunkt Tm als die P1-DNA-Sequenz, und die universelle Sonde 4 hat einen höheren Tm als die P2-DNA-Sequenz. Bevorzugt binden sich die P1-DNA und die P2-DNA an den Strang, der durch einen Reverseprimer amplifiziert ist, wobei die Menge des Vorwärtsprimers zur Menge des Reverseprimers in der Reaktionsmischung 1:5 beträgt; und wenn die P1-DNA und die P2-DNA sich an den Strang binden, der durch einen Vorwärtsprimer amplifiziert ist, beträgt die Menge des Vorwärtsprimers zur Menge des Reverseprimers 5:1.
  • In einer Ausführungsform umfasst die betreffende Zusammensetzung einen Vorwärts- und einen Reverseprimer, die verwendet werden, um das Target-Polynucleotid zu amplifizieren. In einer anderen Ausführungsform umfasst die betreffende Zusammensetzung des Weiteren ein Kontrollpolynucleotid. In einer Ausführungsform ist die Amplifikationsreaktion eine Polymerasekettenreaktion (PCR). In einer anderen Ausführungsform wird das erzeugte erfassbare Signal am Ende von zwei oder mehreren PCR-Zyklen erfasst.
  • Bevorzugt wird das erzeugte Signal erfasst und mit Signalen verglichen, die durch eine oder mehrere Bezugssubstanzen erzeugt werden, die eine bekannte Menge des Target-Polynucleotids für die Bestimmung der Menge des Target-Polynucleotids in der Probe oder in der Amplifikationsreaktionsmischung enthalten.
  • Die Offenbarung beinhaltet außerdem Kits für die betreffenden Zusammensetzungen. Die Kits sind bevorzugt in einem Einheitsbehälter verpackt und können die Reagenzien in abgemessenen Mengen enthalten, die so ausgelegt sind, dass sie zusammenwirken, um das gewünscht Ergebnis zu produzieren. Die Kits können des Weiteren ein oder mehrere der folgenden Teile umfassen, DNA-Polymerase, Kontrollsonden, Kontroll-Target-Polynucleotid, Reaktionspuffer, Amplifikationsprimer, Exonuclease zum Abbau von überschüssigem Amplifikationsprimer und Hybridisierungs-/Waschpuffer.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, umfassend:
    • – ein Polynucleotid-Target;
    • – eine erste Target hybridisierende Sonde, die eine Target-Bindungssequenz (P1-DNA), die an einen Strang des Target-Polynucleotids hybridisiert, und eine Sondenbindungssequenz (P1-P) umfasst;
    • – eine zweite Target hybridisierende Sonde, die eine Target-Bindungssequenz (P2-DNA) umfasst, die in nächster Nähe zu der ersten Target hybridisierenden Sonde hybridisiert und die an denselben Strang des Target-Polynucleotids wie die erste Target hybridisierende Sonde hybridisiert und wobei die zweite Target hybridisierende Sonde des Weiteren eine Sondenbindungssequenz (P2-DNA) umfasst;
    • – eine Nicht-Target hybridisierende Sonde 3, die mit dem Label A gelabelt ist; und
    • – eine Nicht-Target hybridisierende Sonde 4, die mit dem Label B gelabelt ist, wobei die Sonde 3 an die P1-P Sequenz hybridisiert und die Sonde 4 an die P2-P-Sequenz hybridisiert und wobei das Label A und das Label B interaktive Label sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine Zusammensetzung bereit, wie oben erwähnt, des Weiteren gekennzeichnet dadurch, dass:
    • – die Target-Bindungssequenz sich bei 5' der Sondenbindung in der Sonde 1 befindet, während die Target-Bindungssequenz sich bei 3' der Sondenbindungssequenz in der Sonde 2 befindet,
    • – die Zusammensetzung des Weiteren einen Vorwärts- und einen Reverseprimer für die Amplifizierung des Target-Polynucleotids umfasst, und/oder
    • – die Zusammensetzung des Weiteren ein Kontrollpolynucleotid umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine Zusammensetzung wie oben erwähnt bereit, wobei, wenn sich die P1-DNA und die P2-DNA an den Strang binden, der durch den Reverseprimer amplifiziert ist, die Menge des Vorwärtsprimers zur Menge des Reverseprimers in der Zusammensetzung 1:5 beträgt, und wenn die P1-DNA und die P2-DNA sich an den Strang binden, der durch den Vorwärtsprimer amplifiziert ist, die Menge des Vorwärtsprimers zur Menge des Reverseprimers 5:1 beträgt
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine Zusammensetzung bereit, wie oben erwähnt, des Weiteren gekennzeichnet dadurch, dass:
    • – die Label A und B fluoreszierende Farbstoffe sind,
    • – die Label A und B ein Donator-Akzeptorpaar sind, die mit einander in Wechselwirkung stehen, um durch Fluoreszenzresonanzenergieübertragung (FRET) ein Signal zu erzeugen,
    • – wobei die Sonde 3 oder 4 keine Homologie mit irgendeinem Polynucleotid gemeinsam hat, das von einer Probe isoliert worden ist, die das Target-Polynucleotid enthält,
    • – wobei die Sonde 3 an ihrem 3'-Ende gelabelt ist und die Sonde 4 an ihrem 5'-Ende gelabelt ist,
    • – das 3'-Ende einer Sonde modifiziert ist, um die Sondenverlängerung zu verhindern,
    • – das 3'-Ende einer Sonde phosphoryliert ist und/oder die Sonde 3 einen höheren Schmelzpunkt (Tm) als die P1-DNA-Sequenz aufweist und die Sonde 4 eine höhere Tm aufweist als die P2-DNA-Sequenz.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine Zusammensetzung, wie oben erwähnt, bereit, des Weiteren gekennzeichnet dadurch, dass das Donator-Akzeptorpaar ein FAM/ROX-Paar und/oder der Akzeptor ein dunkler Löscher ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren einen Kit bereit, umfassend:
    • – ein Polynucleotid-Target;
    • – eine erste Target hybridisierende Sonde, die eine Target-Bindungssequenz (P1-DNA), die an einen Strang des Target- Polynucleotids hybridisiert, und eine Sondenbindungssequenz (P1-P) umfasst;
    • – eine zweite Target hybridisierende Sonde, die eine Target-Bindungssequenz (P2-DNA) umfasst, die in nächster Nähe zu der ersten Target hybridisierenden Sonde hybridisiert und die an denselben Strang des Target-Polynucleotids wie die erste Target hybridisierende Sonde hybridisiert und wobei die zweite Target hybridisierende Sonde des Weiteren eine Sondenbindungssequenz (P2-DNA) umfasst,
    • – eine Nicht-Target hybridisierende Sonde 3, die mit dem Label A gelabelt ist; und
    • – eine Nicht-Target hybridisierende Sonde 4, die mit dem Label B gelabelt ist, wobei die Sonde 3 an die P1-P-Sequenz hybridisiert und die Sonde 4 an die P2-P-Sequenz hybridisiert und wobei das Label A und das Label B interaktive Label sind; und
    • – Verpackungsmaterialien dafür.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem einen Kit bereit, wie oben erwähnt, des Weiteren gekennzeichnet dadurch, dass:
    • – das 3'-Ende einer Sonde modifiziert ist, um die Sondenverlängerung zu verhindern,
    • – das 3'-Ende einer Sonde phosphoryliert ist,
    • – wobei der Kit des Weiteren einen Vorwärts- und einen Reverseprimer für die Amplifizierung des Target-Polynucleotids umfasst,
    • – wobei der Kit des Weiteren ein Kontrollpolynucleotid umfasst und/oder
    • – die Target-Bindungssequenz sich bei 5' der Sondenbindung der Sonde 1 befindet, während die Target-Bindungssequenz sich bei 3' der Sondenbindungssequenz in der Sonde 2 befindet.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem einen Kit wie oben erwähnt bereit, wobei, wenn sich die P1-DNA und die P2-DNA an den Strang binden, der durch den Reverseprimer amplifiziert ist, die Menge des Vorwärtsprimers zur Menge des Reverseprimers in dem Kit 1:5 beträgt; und wenn die P1-DNA und die P2-DNA sich an den Strang, binden, der durch den Vorwärtsprimer amplifiziert ist, die Menge des Vorwärtsprimers zur Menge des Reverseprimers 5:1 beträgt
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem einen Kit bereit, wie oben erwähnt, des Weiteren gekennzeichnet dadurch, dass:
    • – die Label A und B fluoreszierende Farbstoffe sind,
    • – die Label A und B ein Donator-Akzeptorpaar sind, die mit einander in Wechselwirkung stehen, um durch Fluoreszenzresonanzenergieübertragung (FRET) ein Signal zu erzeugen,
    • – wobei die Sonde 3 oder 4 keine Homologie mit irgendeinem Polynucleotid gemeinsam hat, das von einer Probe isoliert worden ist, die das Target-Polynucleotid enthält,
    • – wobei die Sonde 3 an ihrem 3'-Ende gelabelt ist und die Sonde 4 an ihrem 5'-Ende gelabelt ist, und/oder die Sonde 3 einen höheren Schmelzpunkt (Tm) als die P1-DNA-Sequenz aufweist und die Sonde 4 eine höhere Tm aufweist als die P2-DNA-Sequenz.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem einen Kit bereit, wie oben erwähnt, des Weiteren gekennzeichnet dadurch, dass: das Donator-Akzeptorpaar ein FAM/ROX-Paar ist und/oder der Akzeptor ein dunkler Löscher ist.
  • Überdies stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für das Erfassen der Menge eines Target-Polynucleotids bereit, umfassend:
    • (a) das Zugeben zu dem Target-Polynucleotid: (1) einer Target hybridisierenden Sonde 1, die eine Target-Bindungssequenz (P1-DNA), die an einen Strang des Target-Polynucleotids hybridisiert, und eine Sondenbindungssequenz (P1-P) umfasst; (2) einer Target hybridisierenden Sonde 2, die eine Target-Bindungssequenz (P2-DNA), die in nächster Nähe zur ersten Target hybridisierenden Sonde hybridisiert und die an denselben Strang des Target-Polynucleotids wie die erste Target hybridisierende Sonde hybridisiert und eine Sondenbindungssequenz (P2-P) umfasst; (3) einer Nicht-Target hybridisierenden Sonde 3, die mit dem Label A gelabelt ist, das an die P1-P-Sequenz hybridisiert; und (4) einer Nicht-Target hybridisierenden Sonde 4, die mit dem Label B gelabelt ist, das an die P2-P-Sequenz hybridisiert, wobei die Zugabe es erlaubt, dass das Label A mit dem Label B in Wechselwirkung steht, um ein erfassbares Signal zu erzeugen; und
    • (b) Erfassen des erzeugten Signals als für die Menge des Polynucleotids indikativ.
  • Zudem stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für das Erfassen der Menge eines Target-Polynucleotids in einer Amplifikationsreaktionsmischung bereit, umfassend:
    • (a) das Zugeben zu der Amplifikationsreaktionsmischung: (1) einer Target hybridisierenden Sonde 1, die eine Target-Bindungssequenz (P1-DNA), die an einen Strang des Target-Polynucleotids hybridisiert, und eine Sondenbindungssequenz (P1-P) umfasst; (2) einer Target hybridisierenden Sonde 2, die eine Target-Bindungssequenz (P2-DNA), die in nächster Nähe zur ersten Target-Bindungssonde hybridisiert und die an denselben Strang des Target-Polynucleotids wie die erste Target hybridisierende Sonde hybridisiert, und eine Sondenbindungssequenz (P2-P) umfasst; (3) einer Nicht-Target hybridisierenden Sonde 3, die mit dem Label A gelabelt ist, das an die P1-P-Sequenz hybridisiert; und (4) einer Nicht-Target hybridisierenden Sonde 4, die mit dem Label B gelabelt ist, das an die P2-P-Sequenz hybridisiert, wobei das Zugeben erlaubt, dass das Label A mit dem Label B in Wechselwirkung steht, um ein Signal zu erzeugen; und
    • (b) Erfassen des erzeugten Signals als für die Menge des Polynucleotids indikativ.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit, wie oben erwähnt, des Weiteren gekennzeichnet dadurch, dass:
    • – wenn die P1-DNA und die P2-DNA sich an den Strang binden, der durch einen Reverseprimer amplifiziert ist, die Menge des Vorwärtsprimers zur Menge des Reverseprimers in der Reaktionsmischung 1:5 beträgt und wenn die P1-DNA und die P2-DNA sich an den Strang, binden, der durch einen Vorwärtsprimer amplifiziert ist, die Menge des Vorwärtsprimers zur Menge des Reverseprimers 5:1 beträgt und/oder
    • – die Amplifikationsreaktion eine Polymerasekettenreaktion (PCR) ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren wie oben erwähnt bereit, wobei das erzeugte erfassbare Signal am Ende von zwei oder mehreren PCR-Zyklen erfasst wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit, wie oben erwähnt, des Weiteren gekennzeichnet dadurch, dass:
    • – die Label A und B fluoreszierende Farbstoffe sind,
    • – die Label A und B ein Donator-Akzeptorpaar sind, die mit einander in Wechselwirkung stehen, um durch Fluoreszenzresonanzenergieübertragung (FRET) ein Signal zu erzeugen,
    • – wobei die Sonde 3 oder 4 keine Homologie mit irgendeinem Polynucleotid gemeinsam hat, das von einer Probe isoliert worden ist, die das Target-Polynucleotid enthält,
    • – wobei die Sonde 3 an ihrem 3'-Ende gelabelt ist und die Sonde 4 an ihrem 5'-Ende gelabelt ist,
    • – das 3'-Ende einer Sonde modifiziert ist, um die Sondenverlängerung zu verhindern,
    • – das 3'-Ende einer Sonde phosphoryliert ist,
    • – die Target-Bindungssequenz sich an 5' der Sondenbindung in der Sonde 1 befindet, während die Target-Bindungssequenz sich bei 3' der Sondenbindung in der Sonde 2 befindet,
    • – die Sonde 3 einen höheren Schmelzpunkt (Tm) als die P1-DNA-Sequenz aufweist und die Sonde 4 eine höhere Tm aufweist als die P2-DNA-Sequenz und/oder
    • – das erzeugte Signal erfasst und mit Signalen verglichen wird, die durch eine oder mehrere Bezugssubstanzen erzeugt werden, die eine bekannte Menge des Target-Polynucleotids für die Bestimmung der Menge des Target-Polynucleotids enthalten.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit, wie oben erwähnt, des Weiteren gekennzeichnet dadurch, dass: das Donator-Akzeptorpaar ein FAM/ROX-Paar ist und/oder der Akzeptor ein dunkler Löscher ist.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 illustriert das Schema eines universellen Sondensystems gemäß einer Ausführungsform der Erfindung. In dieser Ausführungsform werden P1 und P2 (Target hybridisierende Sonden) zuerst mit UP-A und UP-B (Nicht-Target hybridisierende universelle Sonden) vorgeladen. Die universellen Sonden binden die jeweiligen universellen Sondenbindungssequenzen innerhalb der Target hybridisierenden Sonden. In Gegenwart des spezifischen Targets binden sich P und P2 in nächster Nähe durch ihre Target-Bindungssequenzen aneinander. Während der PCR-Amplifikation wird das das Rezeptorfluoreszenzsignal (z. B. ROX), wenn es mit der Anregungswellenlänge des Fluoreszenz-Donators (z. B. FAN) angeregt wird, aufgrund des FRET-Mechanismus erfasst werden.
  • 2A ist eine graphische Darstellung, die das von der Target-Konzentration abhängige Amplifikationsdiagramm unter Verwendung eines universellen Sondensystems gemäß einer Ausführungsform der Erfindung zeigt. Die Fluoreszenzsignale blieben unverändert, wenn kein Template (NTC) zugefügt wurde. Das Fluoreszenzsignal vergrößerte sich, je weiter der PCR-Zyklus fortschritt, wenn die Plasmid-DNA, die das Target, den nicotinischen Mausmuskel- -Untereinheit, enthielt, zugefügt wurde. Die vergrößerten Signale waren proportional zur Target-Konzentration.
  • 2B ist eine graphische Darstellung, die die lineare Charakteristik zwischen Ct-Werten und Log-Konzentration des Target-Templates unter Verwendung eines universellen Sondensystems und des nikotinischen Mausmuskel-Acetylcholinrezep--Untereinheit, als Target, gemäß einer Ausführungsform der Erfindung zeigt.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Definitionen
  • Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff „Target-Polynucleotid" auf ein Polynucleotid, dessen Menge in einer Probe zu bestimmen ist. Ein „Target-Polynucleotid" der vorliegenden Erfindung enthält eine bekannte Sequenz von mindestens 20 Nucleotiden, bevorzugt von mindestens 50 Nucleotiden, stärker bevorzugt von mindestens 100 oder mehr Nucleotiden, zum Beispiel 500 oder mehr Nucleotiden. Ein „Target-Polynucleotid" der Erfindung kann ein natürlich vorkommendes Polynucleotid (d. h. eines, das in der Natur ohne Eingriff des Menschen existiert) oder ein rekombinantes Polynucleotid (d. h. eines, das nur durch Eingriff des Menschen existiert) sein. Das Target-Polynucleotid beinhaltet außerdem amplifizierte Produkte seiner selbst, wie zum Beispiel in einer Polymerasekettenreaktion. Gemäß der Erfindung kann ein „Target-Polynucleotid" ein modifiziertes Nucleotid enthalten, das Phosphorothioat, Phosphit, Ringatom-modifizierte Derivate usw. beinhaltet.
  • Wie hier verwendet bezieht sich ein „Polynucleotid" auf eine kovalent gebundene Sequenz von Nucleotiden (d. h. Ribonucleotide für RNA und Desoxyribonucleotide für DNA), in der die 3'-Position der Pentose eines Nucleotids durch eine Phosphodiestergruppe an die 5'-Position der Pentose des nächsten gebunden ist. Der Begriff „Polynucleotid" beinhaltet ohne Beschränkung ein einzel- und ein doppelsträngiges Polynucleotid. Der Begriff „Polynucleotid", wie er hier benutzt wird, schließt chemisch, enzymatisch oder metabolisch modifizierte Polynucleotidformen ein. „Polynucleotid" schließt außerdem ein kurzes Polynucleotid ein, das häufig als Oligonucleotid (z. b. Primer oder Sonde) bezeichnet wird. Ein Polynucleotid hat ein „5'-Ende" und ein „3'-Ende", weil Polynucleotid-Phosphodiester-Verknüpfungen an dem 5'-Kohlenstoff und dem 3'-Kohlenstoff des Pentoserings der substituierenden Mononucleotide auftreten. Das Ende eines Polynucleotids, an dem eine neue Verknüpfung an einem 5'-Kohlenstoff sein würde, ist dessen 5'-terminales Nucleotid. Das Ende eines Polynucleotids, an dem eine neue Verknüpfung an einem 3'-Kohlenstoff sein würde, ist dessen 3'-terminales Nucleotid. Ein terminales Nucleotid, wie hier verwendet, ist das Nucleotid an der Endposition des 3'- oder 5'-Endes. Wie hier verwendet, kann von einer Polynucleotidsequenz, sogar wenn sie im Innern eines größeren Polynucleotids liegt (z. B. eine Sequenzregion innerhalb eines Polynucleotids), auch gesagt werden, dass sie 5'- und 3'-Enden hat.
  • Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff „Oligonucleotid" auf ein kurzes Polynucleotid, typischerweise weniger als 150 Nucleotide lang (z. B. zwischen 5 und 150, bevorzugt zwischen 10 und 100, stärker bevorzugt zwischen 15 und 50 Nucleotide lang). Der Begriff, wie hier verwendet, soll jedoch auch längere oder kürzere Polynucleotidketten umfassen. Ein „Oligonucleotid" kann zu anderen Polynucleotiden hybridisieren, und daher als Sonde für die Polynucleotiderfassung oder als Primer für die Polynucleotidkettenverlängerung dienen.
  • Wie hier verwendet bezieht sich ein „Primer" auf einen Oligonucleotidtyp, der die Längengrenzen eines „Oligonucleotids", wie oben definiert, aufweist oder enthält, und dabei eine Sequenz aufweist oder enthält, die zu einem Target-Polynucleotid komplementär ist, das zu dem Target-Polynucleotid durch Basenpaarung hybridisiert, um eine Elongationsreaktion (Verlängerungsreaktion) zu initiieren, um ein Nucleotid in den Oligonucleotidprimer zu inkorporieren. Die Länge eines Primer ist die gleiche wie oben allgemein für ein Oligonucleotid beschrieben.
  • Wie hier verwendet bezieht sich eine „Sonde" auf einen Oligonucleotidtyp, der eine Sequenz aufweist oder enthält, die zu einem anderen Polynucleotid, z. B. einem Target-Polynucleotid oder einem anderen Oligonucleotid, komplementär ist. Eine „Sonde" gemäß der Erfindung kann zwischen 10 und 100 Nucleotide lang sein, und innerhalb der Sondendefinition zwischen 15 bis 50 Nucleotide lang sein.
  • Wie hier verwendet bezieht sich eine „Target hybridisierende Sonde" auf eine Sonde, die zu einem Target-Polynucleotid hybridisiert. In einer Ausführungsform beinhaltet eine „Target hybridisierende Sonde" der vorliegenden Erfindung eine erste Sequenz (eine Target-Bindungssequenz: „P-DNA"), die zu dem Target-Polynucleotid hybridisiert, und eine zweite Sequenz (eine universelle Sondenbindungssequenz: „P-P"), die an eine Sonde, z. B. eine Nicht-Target hybridisierende Sonde, bindet, aber nicht zu dem Target-Polynucleotid hybridisiert.
  • Eine „Nicht-Target hybridisierende Sonde" bezieht sich auf eine Sonde, die zu einer „Target hybridisierenden Sonde", aber nicht zu dem Target-Polynucleotid selbst hybridisiert. In einer Ausführungsform beinhaltet eine „Nicht-Target hybridisierende Sonde" der vorliegenden Erfindung eine Sequenz, die zu der zweiten Sequenz innerhalb der Target hybridisierenden Sonde hybridisiert. Eine gemeinsame Nucleotidsequenz kann mit der zweiten Sequenz von zwei oder mehreren Target hybridisierenden Sonden geteilt werden, so dass eine gemeinsame Nicht-Target hybridisierende Sonde verwendet wird, um zu den zwei oder mehreren Target hybridisierenden Sonden zu hybridisieren, und diese Sonde hybridisiert nicht zu einem Target. Die zweite Sequenz kann von der Target-Polynucleotidsequenz unabhängig sein, d. h., die zweite Sequenz wird üblicherweise von zwei oder mehreren Target hybridisierenden Sonden geteilt, die verwendet werden, um mit verschiedenen Target-Polynucleotiden zu hybridisieren. Eine solche Nicht-Target hybridisierende Sonde, die zu einer gemeinsamen und unabhängigen zweiten Sequenz hybridisiert, wird als „universelle Sonde" bezeichnet. Die erste Sequenz oder die zweite Sequenz einer Sonde kann zwischen 10 und 100 Nucleotide lang, zwischen 15 und 50 Nucleotide lang, und zwischen 15 bis 30 Nucleotide lang sein.
  • Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff „in nächster Nähe" auf den relativen Abstand, mit dem zwei Target hybridisierende Sonden an denselben Strang eines Target-Polynucleotids hybridisieren, wobei der Abstand ausreichend ist, um die Wechselwirkung zwischen Labeln auf den beiden Nicht-Target hybridisierenden Sonden zu erlauben, die zu den Target hybridisierenden Sonden hybridisieren. Der Abstand zwischen den beiden Hybridisierungsstellen beträgt weniger als 50 Nucleotide, bevorzugt weniger als 30 Nucleotide, stärker bevorzugt weniger als 10 Nucleotide, zum Beispiel weniger als 6 Nucleotide.
  • Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff „komplementär" auf das Konzept der Sequenzkomplementarität zwischen Regionen von zwei Polynucleotidsträngen oder zwischen zwei Regionen des gleichen Polynucleotidstrangs. Es ist bekannt, dass eine Adeninbase einer ersten Polynucleotidregion in der Lage ist, spezifische Wasserstoffbindungen („Basenpaarung") mit einer Base einer zweiten Polynucleotidregion zu bilden, die zu der ersten Region antiparallel ist, wenn die Base Thymin oder Uracil ist. Es ist ebenfalls bekannt, dass eine Cytosinbase eines ersten Polynucleotidstrangs zur Basenpaarung mit einer Base eines zweiten Polynucleotidstrangs in der Lage ist, der zu dem ersten Strang antiparallel ist, wenn die Base Guanin ist. Eine erste Region eines Polynucleotids ist zu einer zweiten Region desselben oder eines anderen Polynucleotids komplementär, wenn mindestens ein Nucleotid der ersten Region zur Basenpaarung mit einer Base der zweiten Region in der Lage ist, falls die beiden Regionen auf antiparallele Weise angeordnet sind. Daher ist es für zwei komplementäre Polynucleotide nicht erforderlich, dass sie an jeder Nucleotidposition zur Basenpaarung in der Lage sind. „Komplementär" bezieht sich auf ein erstes Polynucleotid, das zu 100 mit einem zweiten Polynucleotid komplementär ist, das an jeder Nucleotidposition ein Basenpaar bildet. „Komplementär" bezieht sich außerdem auf ein erstes Polynucleotid, das nicht 100 (z. B. 90 oder 80 oder 70 komplementär) komplementär ist, das Nucleotid-Fehlpaarungen an einer oder mehreren Nucleotidpositionen enthält. In einer Ausführungsform sind zwei komplementäre Polynucleotide in der Lage, unter Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz zueinander zu hybridisieren.
  • Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff „Probe" auf ein biologisches Material, das aus seiner natürlichen Umgebung isoliert ist, und ein Polynucleotid enthält. Eine „Probe" gemäß der Erfindung kann aus gereinigtem oder isoliertem Polynucleotid bestehen, oder es kann eine biologische Probe, wie etwa eine Gewebeprobe, eine biologische Flüssigkeitsprobe oder eine Zellprobe, die ein Polynucleotid umfasst, umfassen. Eine biologische Flüssigkeit beinhaltet Blut, Plasma, Sputum, Urin, Zerebrospinalflüssigkeit, Lavagen und Leukophoreseproben. Eine Probe der vorliegenden Erfindung kann ein pflanzliches, tierisches, bakterielles oder virales Material sein, das ein Target-Polynucleotid enthält. Geeignete Proben der vorliegenden Erfindung können aus verschiedenen Quellen erhalten werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf zum Beispiel verschiedene Individuen, verschiedene Entwicklungsstadien des selben Individuums oder verschiedener Individuen, verschiedene kranke Individuen, normale Individuen, verschiedene Krank heitsstadien des selben Individuums oder verschiedener Individuen, Individuen, die verschiedenen Krankheitsbehandlungen, unterzogen wurden, Individuen, die verschiedenen Umweltfaktoren ausgesetzt wurden, Individuen, mit einer Prädisposition für eine Erkrankung, Individuen, mit Gefährdung durch eine Infektionskrankheit (z. B. HIV). Geeignete Proben können außerdem aus in vitro kultivierten Geweben, Zellen oder anderen, Polynucleotid enthaltenden Quellen erhalten werden. Die kultivierten Proben können von Quellen entnommen werden, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Kulturen (z. B. Gewebe oder Zellen), die in verschiedenen Medien und unter verschiedenen Bedingungen (z. B. pH-Wert, Druck oder Temperatur) kultiviert wurden, Kulturen (z. B. Gewebe oder Zellen), die über verschiedenen Zeitspannen kultiviert wurden, Kulturen (z. B. Gewebe oder Zellen), die mit verschiedenen Faktoren oder Reagenzien (z. B. einem Kandidatenwirkstoff oder einem Modulator) behandelt wurden, oder Kulturen verschiedener Gewebe- oder Zelltypen.
  • Wie hier verwendet ist ein Polynucleotid, das aus einer Probe „isoliert" ist, eine natürlich vorkommende Polynucleotidsequenz innerhalb dieser Probe, die aus ihrer normalen zellulären (z. B. chromosomalen) Umgebung entfernt wurde. Somit kann sich ein „isoliertes" Polynucleotid in einer zellfreien Lösung befinden oder in eine andere zelluläre Umgebung verbracht worden sein.
  • Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff „Menge" auf eine Menge eines Target-Polynucleotids in einer Probe, die z. B. in Pg, Pmol oder in Kopienzahl gemessen wird. Die Abundanz eines Polynucleotids in der vorliegenden Erfindung wird durch die Fluoreszenzintensität gemessen, die von einem solchen Polynucleotid emittiert wird, und mit der Fluoreszenzintensität verglichen, die von einem Referenzpolynucleotid, d. h., einem Polynucleotid mit einer bekannten Menge, emittiert wird.
  • Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff „Homologie" auf die optimale Anordnung von Sequenzen (entweder Nucleotide oder Aminosäuren), die durch die computergestützten Implementationen von Algorithmen durchgeführt werden kann. „Homologie" kann, bezogen auf Polynucleotide, zum Beispiel durch Analyse mit BLASTN, Version 2.0, unter Verwendung der voreingestellten Parameter bestimmt werden. Eine „Sonde, die keine Homologie mit einem anderen Polynucleotid gemeinsam hat" bezieht sich darauf, dass die Homologie zwischen der Sonde und dem Polynucleotid, wie mit BLASTN, Version 2.0 unter Verwendung der voreingestellten Parameter gemessen, nicht größer als 40 z. B. weniger als 35 oder weniger als 30 oder weniger als 25 oder weniger als 20 beträgt.
  • Wie hier verwendet bezieht sich eine „erfassbares Label" oder ein „Label" auf ein Molekül, das in der Lage ist, entweder aus sich selbst oder durch die Wechselwirkung mit einem anderen Label ein erfassbares Signal zu erzeugen. Ein „Label" kann ein direkt erfassbares Label sein oder es kann ein Teil eines Signal-erzeugenden Systems sein, und kann somit ein erfassbares Signal im Zusammenhang mit anderen Teilen des Signal-erzeugenden Systems, z. B. einem Biotin-Avidin-Signal-Erzeugungssystem, oder einem Donator-Akzeptorpaar zur Fluoreszenzresonanzenergieübertragung (FRET) (Stryer et al., 1978, Ann. Rev. Biochem., 47: 819; Selvin, 1995, Methods Enzymol., 246: 300) erzeugen. Das Label kann isotop oder nicht isotop, üblicherweise nicht isotop sein, und es kann ein Katalysator sein, wie etwa ein Enzym (auch als Enzymlabel bezeichnet), ein Polynucleotid, das für einen Katalysator kodiert, ein Promoter, ein Farbstoff, ein fluoreszierendes Molekül (auch als Fluoreszenzlabel bezeichnet), ein Chemiluminescer (auch als Chemilumineszenzlabel bezeichnet), ein Coenzym, ein Enzymsubstrat, eine radioaktive Gruppe (auch als radioaktives Label bezeichnet), ein kleines organisches Molekül, eine amplifizierbare Polynucleotidsequenz, ein Teilchen, wie etwa ein Latex- oder Kohlenstoffteilchen, ein Metallsol, Krystallit, Liposom, Zelle usw., das weiter mit einem Farbstoff gelabelt werden kann oder nicht (auch als kolorimetrisches Label bezeichnet), ein Katalysator oder eine andere erfassbare Gruppe und dergleichen sein. Bevorzugt ist ein Label der vorliegenden Erfindung ein Teil eines interaktiven Labels. Die Teile eines Paars „interaktiver Label" stehen miteinander in Wechselwirkung und erzeugen ein erfassbares Signal, wenn sie in nächste Nähe gebracht werden. Die erzeugten Signale sind bevorzugt durch Sichtprüfungsverfahren erfassbar, die dem Fachmann gut bekannt sind, bevorzugt mit dem FRET-Assay. Die Teile eines Paars interaktiver Label können ein Donator und ein Akzeptor oder ein Rezeptor und ein Löscher sein.
  • Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff „Donator" auf ein Fluorophor, das bei einer ersten Wellenlänge absorbiert und bei einer zweiten, längeren Wellenlänge, emittiert. Der Begriff „Akzeptor" bezieht sich auf ein Fluorophor, Chromophor oder einen Löscher mit einem Absorptionsspektrum, das das Emissionsspektrum des Donators überlappt, und in der Lage ist, etwas oder den Großteil der von dem Donator emittierten Energie zu absorbieren, wenn er sich Nahe (typischerweise zwischen 1 und 100 nm) an der Donatorgruppe befindet. Wenn der Akzeptor ein Fluorophor ist, das in der Lage ist, FRET aufzuweisen, dann re-emittiert er bei einer dritten, noch längeren Wellenlänge; wenn er ein Chromophor oder ein Löscher ist, dann setzt er die Energie, die er von dem Donator absorbiert hat, frei ohne ein Photon zu emittieren. Wenngleich das Absorptionsspektrum des Akzeptors das Emissionsspektrum des Donators überlappt, wenn sich die beiden Gruppen nahe beieinander befinden, muss dies für die Spektren der Moleküle nicht der Fall sein, wenn sie frei in Lösung sind. Akzeptoren beinhalten Fluorophore, Chromophore oder Löscher, die, nachdem sie entweder an einen Kettenterminator oder an ein Anti-tag-Molekül angeheftet wurden, Veränderungen im Absorptionsspektrum zeigen, was es der Gruppe erlaubt durch die Bindungswechselwirkungen des Anti-Tag-Moleküls und eines Tag-Moleküls, das den Kettenterminator umfasst, entweder FRET oder Löschung aufzuweisen, wenn sie in die Nähe des Donators gebracht werden.
  • Wie hier verwendet beinhaltet die Bezugnahme auf „Fluoreszenz" oder „Fluoreszenzgruppen" oder „Fluorophore" Lumineszenz bzw. Lumineszenzgruppen.
  • Wie hier verwendet wird der Begriff „Hybridisierung" unter Bezugnahme auf das Paaren komplementärer (einschließlich teilweise komplementärer) Polynucleotidstränge verwendet. Hybridisierung und die Stärke der Hybridisierung (d. h., die Stärke der Assoziation zwischen den Polynucleotidsträngen) wird durch viele Faktoren beeinflusst, die dem Fachmann gut bekannt sind, einschließlich dem Komplementaritätsgrad zwischen den Polynucleotiden, der Stringenz der betreffenden Bedingungen, die von solchen Bedingungen beeinflusst werden, wie der Salzkonzentration, der Schmelztemperatur (Tm) des gebildeten Hybrids, der Gegenwart anderer Komponenten (z. B. der Gegenwart oder Abwesenheit von Polyethylenglycol), der Molarität der hybridisierenden Stränge und des G/C-Gehalts der Polynucleotidstränge.
  • Wenn, wie hier verwendet, von einem Polynucleotid gesagt wird, dass es zu einem anderen Polynucleotid „hybridisiert", bedeutet das, dass es eine gewisse Komplementarität zwischen den beiden Polynucleotiden gibt, oder dass die beiden Polynucleotide unter einer Bedingung hoher Stringenz ein Hybrid bilden. Wenn von einem Polynucleotid gesagt wird, dass es nicht zu einem anderen Polynucleotid hybridisiert, bedeutet das, dass es keine Sequenzkomplementarität zwischen den beiden Polynucleotiden gibt, oder dass die beiden Polynucleotide unter einer Bedingung hoher Stringenz kein Hybrid bilden.
  • Wie hier verwendet wird der Begriff „Stringenz" unter Bezugnahme auf die Bedingungen der Temperatur, Innenstärke und der Gegenwart anderer Verbindungen verwendet, unter denen die Polynucleotidhybridisierung durchgeführt wird. Unter Bedingungen „hoher Stringenz" wird die Polynucleotidpaarung nur zwischen Polynucleotidfragmenten stattfinden, die eine hohe Frequenz komplementärer Rasensequenzen haben. Somit sind Bedingungen „schwacher" oder „niedriger" Stringenz häufig erforderlich, wenn es gewünscht wird, dass Polynucleotide, die nicht vollständig komplementär zueinander sind, hybridisiert oder zusammen annealed werden. Dem Fachmann ist bekannt, dass es zahlreiche äquivalente Bedingungen gibt, die benutzt werden können, um Bedingungen hoher oder niedriger Stringenz zu umfassen.
  • Wie hier verwendet, beziehen sich „Bedingungen hoher Stringenz" auf die Temperatur- und Ionenbedingung, die während der Polynucleotidhybridisierung und/oder -Wäsche verwendet werden. Das Ausmaß der „hohen Stringenz" ist von der Nucleotidsequenz abhängig und hängt auch von den unterschiedlichen Komponenten ab, die während der Hybridisierung vorhanden sind. Im Allgemeinen werden hoch stringente Bedingungen so gewählt, dass sie, bei definierter Innenstärke und definiertem pH-Wert, etwa 5 bis 20 Grad C niedriger sind als der thermische Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz. „Bedingungen hoher Stringenz", wie hier verwendet, beziehen sich auf einen Waschvorgang, der die Inkubation von zwei oder mehreren hybridisierten Polynucleotiden in einer wässrigen Lösung beinhaltet, die 0,1 X SSC und 0,2% SDS enthält, bei Raumtemperatur für 2 bis 60 Minuten, gefolgt von der Inkubation in einer Lösung, die 0,1 X SSC enthält, bei Raumtemperatur für 2 bis 60 Minuten. „Bedingungen hoher Stringenz" sind dem Fachmann bekannt, und sind zum Beispiel in Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory und Schena, ibid., zu finden.
  • Wie hier verwendet beziehen sich „Bedingungen niedriger Stringenz" auf einen Waschvorgang, der die Inkubation von zwei oder mehreren hybridisierten Polynucleotiden in einer wässrigen Lösung beinhaltet, die IX SSC und 0,2 SDS umfasst, bei Raumtemperatur für 2 bis 60 Minuten.
  • Wie hier verwendet, wird der Begriff „Tm" unter Bezugnahme auf die „Schmelztemperatur" verwendet. Die Schmelztemperatur ist die Temperatur, bei der 50 einer Population doppelsträngiger Polynucleotidmoleküle in Einzelstränge dissoziiert werden. Die Gleichung zur Berechnung der Tm von Polynucleotiden ist dem Fachmann gut bekannt. Zum Beispiel kann die Tm durch die folgende Gleichung berechnet werden: Tm = 69,3 + 0,41 X(G + C)% – 650/L, wobei L die Länge der Sonde in Nucleotiden ist. Die Tm eines hybriden Polynucleotids kann außerdem unter Verwendung einer Formel geschätzt werden, die aus Hybridisierungsassays in 1M Salz übernommen wurde, und die gewöhnlich zur Berechnung der Tm für PCR-Primer verwendet wird: [(Anzahl von A + T) × 2°C + (Anzahl von G + C) × 4°C], vgl. zum Beispiel C. R. Newton et al. PCR, 2nd Ed., Springer-Verlag (New York: 1997), p. 24. Auf dem Stand der Technik sind auch andere, ausgereiftere Berechnungen bekannt, die sowohl strukturelle als auch sequenzielle Merkmale für die Berechnung der Tm berücksichtigen. Eine berechnete Tm ist lediglich eine Schätzung; die optimale Temperatur wird gewöhnlich empirisch bestimmt.
  • „Primer-Verlängerungsreaktion" oder „Kettenelongationsreaktion" bedeutet eine Reaktion zwischen einem Target-Primer-Hybrid und einem Nucleotid, die zum Anfügen des Nucleotids an ein 3'-Ende des Primer führt, so dass das inkorporierte Nucleotid zu dem entsprechenden Nucleotid des Target-Polynucleotids komplementär ist. Primer-Verlängerungsreagenzien beinhalten typischerweise (i) ein Polymeraseenzym; (ii) einen Puffer; und (iii) ein oder mehrere verlängerbare Nucleotide.
  • Wie hier verwendet bezieht sich „Polymerasekettenreaktion" oder „PCR" auf ein In-vitro-Verfahren zum Amplifizieren einer spezifischen Polynucleotid-Templatesequenz. Die PCR-Reaktion betrifft eine repetitive Reihe von Temperaturzyklen und wird typischerweise in einem Volumen von 50 bis 100 P1 ausgeführt. Die Reaktionsmischung umfasst dNTPs (jedes der vier Desoxynucleotide dATP, dCTP, dGTP und dTTP), Primer, Puffer, DNA-Polymerase und Polynucleotidtemplate. Eine PCR-Reaktion kann aus 5 bis 100 „Zyklen" der Denaturierung und Synthese eines Polynucleotidmoleküls bestehen.
  • Wie hier verwendet bezieht sich „Polynucleotidpolymerase" auf ein Enzym, das die Polymerisierung des Nucleotids katalysiert. Im Allgemeinen wird das Enzym die Synthese am 3'-Ende des Primer initiieren, der zu einer Polynucleotidtemplatesequenz annealed ist, und wird in Richtung des 5'-Ende des Template-Strangs fortschreiten. „DNA-Polymerase" katalysiert die Polymerisation von Desoxynucleotiden. Geeignete DNA-Polymerasen beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, exo + DNA-Polymerase, zum Beispiel, DNA-Polymerase von Pyrococcus furiosus (Pfu) (Lundberg et al., 1991, Gene, 108: 1; US-Patentschrift Nr. 5,556,772 , DNA-Polymerase von Thermus thermophilus (Tth) (Myers and Gelfand 1991, Biochemistry 30: 7661), DNA-Polymerase von Bacillus stearothermophilus (Stenesh and McGowan, 1977, Biochim Biophys Acta 475: 32), DNA-Polymerase von Thermococcus litoralis (Tli) (auch als Vent-DNA-Polymerase bezeichnet, Cariello et al., 1991, Polynucleotides Res, 19: 4193), DNA-Polymerase Thermotoga maritima (Tma) (Diaz and Sabino, 1998 Braz J. Med. Res, 31: 1239), DNA-Polymerase Pyrococcus kodakaraensis KOD (Takagi et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 4504), JDF-3 DNA-Polymerase (Patentanmeldung WO 0132887 ) und DNA-Polymerase Pyrococcus GB-D (PGB-D) (Juncosa-Ginesta et al., 1994, Biotechniques, 16: 820). Geeignete DNA-Polymerasen beinhalten außerdem exo-DNA Polymerasen, zum Beispiel exo-Pfu-DNA-Polymerase (einer mutierten Form von Pfu-DNA-Polymerase, der im Wesentlichen die 3'- bis 5'-Exonucleaseaktivät fehlt, Cline et al., 1996, Nucleic Acids Research, 24: 3546; US-Patentschrift Nr. 5,556,772 ; im Handel erhältlich von Stratagene, La Jolla, Calif. Catalogue # 600163), exo- Tma DNA-Polymerase (einer mutierten Form der Tma-DNA-Polymerase, der im Wesentlichen die 3'- bis 5'-Exonucleaseaktivität fehlt), exo-Tli-DNA-Polymerase (einer mutierten Form von Tli-DNA-Polymerase, der im Wesentlichen die 3'- bis 5'-Exonucleaseaktivität fehlt, New England Biolabs, (Cat # 257)), exo-E.-coli-DNA-Polymerase (einer mutierten Form von E.-coli-DNA-Polymerase, der im Wesentlichen die 3'- bis 5'-Exonucleaseakivität fehlt), exo-Kienow-Fragment von E.-coli; DNA-Polymerase-I (Stratagene, Cat # 600069), exo-T7-DNA-Polymerase (einer mutierten Form von T7-DNA-Polymerase, der im Wesentlichen die 3'- bis 5'-Exonucleaseaktivität fehlt), exo-KOD-DNA-Polymerase (einer mutierten Form von KOD-DNA-Polymerase, der im Wesentlichen die 3'- bis 5'-Exonucleaseaktivität fehlt), exo-JDF-3-DNA-Polymerase (einer mutierten Form von JDF-3-DNA-Polymerase, der im Wesentlichen die 3'- bis 5'-Exonucleaseaktivität fehlt), exoPGB-D-DNA-Polymerase (einer mutierten Form von PGB-D-DNA-Polymerase, der im Wesentlichen die 3'- bis 5'-Exonucleaseaktivität fehlt) New England Biolabs, Cat. # 259, Tth-DNA-Polymerase, Taq-DNA-Polymerase (z. B. Cat. Nr. 600131, 600132, 600139, Stratagene La Jolla, Calif.); UlTma (N-trunkiert) DNA-Polymerase von Thermatoga martima; Klenow-Fragment von DNA-Polymerase-I, 9°Nm-DNA-Polymerase (nicht mehr hergestelltes Produkt von New England Biolab, Beverly, MA), und „3'–5'-exo-reduzierter" Mutant (Southworth et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci 93: 5281). Die Polymeraseaktivität jedes der oben genannten Enzyme kann mittels Techniken definiert werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Eine Einheit der DNA-Polymeraseaktivität gemäß der betreffenden Erfindung wird als die Menge an Enzym definiert, die die Inkorporation von 10 nmol vollständiger dNTPs in Polymerform in 30 Minuten bei optimaler Temperatur katalysiert.
  • „Nucleotidanalog" bezieht sich auf ein Nucleotid, bei dem der Pentosezucker und/oder ein oder mehrere der Phosphatester mit ihrem jeweiligen Analog ersetzt werden. Beispielhafte Pentosezuckeranaloga sind jene, die zuvor im Zusammenhang mit Nucleosidanaloga beschrieben wurden. Beispielhafte Phosphatesteranaloga beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Alkylphosphonate, Methylphosphonate, Phosphoramidate, Phosphotriester, Phosphorothioate, Phosphorodithioate, Phosphoroselenoate, Phosphorodiselenoate, Phosphoroanilothioate, Phosphoroanilidate, Phosphoroamidate, Borophosphate usw., einschließlich aller assoziierten Gegenionen, wenn vorhanden. Außerdem sind in der Definition von „Nucleotidanalog" Nucleobase-Monomere enthalten, die zu Polynucleotidanaloga polymerisiert werden, bei denen die DNA/RNA-Phosphatester- und/oder Zuckerphosphatester-Hauptkette durch eine andere Art von Verknüpfung ersetzt ist.
  • Wie hier verwendet bedeutet der Begriff „entgegengesetzte Orientierung", wenn er sich auf Primer bezieht, dass ein Primer (d. h. der Reverseprimer) eine Nucleotidsequenz umfasst, die zu dem Sense-Strang des Target Nukleinsäuretemplates komplementär ist, und ein anderer Primer (d. h. der Vorwärtsprimer) eine Nucleotidsequenz umfasst, die zu dem Antisense-Strang des gleichen Target-Nukleinsäuretemplate komplementär ist. Primer mit entgegengesetzten Orientierungen können ein PCR-amplifiziertes Produkt aus dem angepassten Nukleinsäuretemplate erzeugen, zu dem sie komplementär sind.
  • Wie hier verwendet bedeutet der Begriff „gleiche Orientierung", dass beide oder alle Primer Nucleotidsequenzen umfassen, die zu dem gleichen Strang des Target-Nukleinsäuretemplate komplementär sind. Primer mit der gleichen Orientierung werden kein PCR-amplifiziertes Produkt aus dem angepassten Nukleinsäuretemplate erzeugen, zu dem sie komplementär sind.
  • Beschreibung
  • Die vorliegende Offenbarung bezieht sich auf ein universelles Sondensystem zur Polynucleotiderfassung und basiert auf der Verwendung einer oder mehrerer Target hybridisierender und Nicht-Target hybridisierender Sonden, sowie einem Signal, das durch die Wechselwirkung der Nicht-Target hybridisierenden Sonden erzeugt wird.
  • Das universelle Sondensystem der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um einen Polynucleotidamplifikationsprozess, wie z. B. bei einer Echtzeit-PCR, zu überwachen, oder es kann für die Erfassung jedes nicht amplifizierten Polynucleotids verwendet werden.
  • Wenn die universellen Sonden zum Erfassen des Vorhandenseins oder der Menge eines Target-Polynucleotids in einer Probe verwendet werden, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Target hybridisierenden Sonde 1, die eine Target-Bindungssequenz (P1-DNA) umfasst, die zu einem Strang des Target-Polynucleotids hybridisiert, und eine Sondenbindungssequenz (P1-P), die nicht zu dem Target-Polynucleotid hybridisiert, und eine Target hybridisierende Sonde 2, die eine Target-Bindungssequenz (P2-DNA) umfasst, die in nächster Nähe zu dem gleichen Strang des Target-Polynucleotids hybridisiert, und eine Sondenbindungssequenz (P2-P), die nicht zu dem Target-Polynucleotid hybridisiert.
  • In einer Ausführungsform hybridisiert eine universelle Nicht-Target hybridisierende Sonde 3, die mit dem Label A gelabelt ist, zu der P1-P-Sequenz, und eine universelle Nicht-Target hybridisierende Sonde 4, die mit dem Label B gelabelt ist, hybridisiert zu der P2-P-Sequenz. Nachdem die beiden universellen Sonden zu den beiden Target hybridisierenden Sonden hybridisieren, werden Label A und Label B in nächste Nähe gebracht, und die Wechselwirkung zwischen Label A und Label B erzeugt ein erfassbares Signal, das für die Menge des Target-Polynucleotids in der Probe indikativ ist.
  • Wenn das universelle Sondensystem der vorliegenden Erfindung verwendet wird, um den Amplifikationsprozess einer Amplifikationsreaktion zu überwachen, werden die zwei Target hybridisierenden Sonden und die zwei universellen Sonden der Amplifikationsreaktionsmischung, entweder vor der Zugabe der Amplifikationsprimer oder nach der Zugabe der Amplifikationprimer, aber bevorzugt vor der Zugabe von DNA-Polymerase, zugefügt. Die Amplifikation eines Target-Polynucleotids kann während des Amplifikationsprozesses, zum Beispiel während oder am Ende jedes Zyklus einer PCR-Reaktion, überwacht werden.
  • Herstellung von Primer und Sonden
  • Sonden und Primer werden typischerweise durch biologische oder chemische Synthese hergestellt, wenngleich sie auch durch biologische Aufreinigung oder Abbau, z. B. Endonucleaseverdauung, hergestellt werden können.
  • Für kurze Sequenzen, wie etwa Sonden und Primer, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ist die chemische Synthese, verglichen mit biologischer Synthese, häufig wirtschaftlicher. Für längere Sequenzen können Standard-Replikationsverfahren verwendet werden, die in der Molekularbiologie benutzt werden, wie etwa die Verwendung von M13 für Einzelstrang-DNA, wie von Messing, 1983, Methods Enzymol. 101: 20–78, beschrieben. Chemische Verfahren zur Polynucleotid- oder Oligonucleotidsynthese beinhalten Phosphotriester- und Phosphodiesterverfahren (Narang, et al., Meth. Enzymol. (1979) 68: 90) und Synthese auf einem Träger (Beaucage, et al., Tetrahedron Letters. (1981) 22: 1859–1862) sowie Phosphoramidat-Technik, Caruthers, M. H., et al., Methods in Enzymology (1988) 154: 287–314 (1988), und andere, die in „Synthesis and Applications of DNA and RNA," S. A. Narang, editor, Academic Press, New York, 1987, beschrieben wird, und die darin enthaltenden Quellenangaben.
  • Oligonucleotidsonden und -primer können durch jedes oben beschriebene Verfahren und andere Verfahren synthetisiert werden, die dem Fachmann bekannt sind.
  • In einer Ausführungsform betrifft das Verfahren zum Erfassen eines Target-Polynucleotids der vorliegenden Erfindung die Verwendung von zwei Target hybridisierenden Sonden und zwei universellen Sonden. Jede der beiden universellen Sonden hybridisieren zu einer Target hybridisierenden Sonde.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft das Verfahren der vorliegenden Erfindung das Erfassen von zwei oder mehreren Target-Polynucleotiden, z. B. durch Multiplex-Verfahren. In diesem Fall wird es zwei Target hybridisierende Sonden und zwei entsprechende Nicht-Target hybridisierende Sonden für jedes zu erfassende Target-Polynucleotid geben. Die zwei entsprechenden Nicht-Target hybridisierenden Sonden sollten nur zu den Target hybridisierende Sonden hybridisieren, die für das Erfassen des gleichen Target-Polynucleotids verwendet werden. Zudem sollten die Nicht-Target hybridisierenden Sonden für das Erfassen eines Target-Polynucleotids mit verschiedenen Labeln gelabelt sein, so dass die Wechselwirkung zwischen den gelabelten Sonden ein unterscheidbares Signal von zwei anderen Nicht-Target hybridisierenden Sonden erzeugt, die für das Erfassen eines anderen Target-Polynucleotids verwendet werden.
  • Die Target hybridisierende Sonde der vorliegenden Erfindung ist so konzipiert, dass sie eine Target-Bindungssequenz aufweist, die zu dem Target-Polynucleotid hybridisiert, und eine Sondenbindungssequenz, die zu einer universellen Sonde hybridisiert. Die Target-Bindungssequenz, die zu dem Target-Polynucleotid hybridisiert, kann eine Sequenz aufweisen, die zu mindestens 70 (z. B. mindestens 80 oder mindestens 90 oder mehr) zu dem Target-Polynucleotid komplementär ist und die 10 bis 100 Nucleotide lang, bevorzugt 15 bis 50 Nucleotide lang, stärker bevorzugt 17 bis 30 Nucleotide lang ist. Die Sondenbindungssequenz kann jede Sequenz sein, so lange sie nicht zu dem Target-Polynucleotid hybridisiert und die Hybridisierung der Target-Bindungssequenz zu dem Target-Polynucleotid nicht beeinträchtigt. Bevorzugt kann die Sondenbindungssequenz weniger als 30 (z. B. weniger als 20 oder 10 oder 5%) komplementär zu dem Target-Polynucleotid sein, und 10 bis 50 Nucleotide lang, bevorzugt 15 bis 30 Nucleotide lang sein.
  • Die zwei Target hybridisierenden Sonden, die für die Erfassung des gleichen Target-Nucleotids verwendet werden, weisen ihre Sondenbindungssequenz an verschiedenen Enden der Sonden auf. Wenn zum Beispiel bei einer Target hybridisierenden Sonde (z. B. Sonde 1) die Sondenbindungssequenz 5' von der Target-Bindungssequenz liegt, liegt bei der anderen Target hybridisierende Sonde (z. B. Sonde 2) die Sondenbindungssequenz 3' von der Target-Bindungssequenz oder umgekehrt.
  • Die Sondenbindungssequenz sowie die universelle Sonde, zu der sie hybridisiert, weist eine Sequenz auf, die nicht mit dem Target-Polynucleotid hybridisiert, und weist eine minimale Homologie zu einem Polynucleotid der selben Sonde auf, die das Target-Polynucleotid enthält. Wenn zum Beispiel die Probe eine humane Probe ist, dann ist die Sondenbindungssequenz oder die universelle Sonde so konzipiert, dass sie keine Homologie zu irgendwelchen humanen Polynucleotiden, z. B. DNAs oder cDNAs, die aus dem Menschen isoliert wurden, aufweist.
  • Die Sondenbindungssequenz der Target hybridisierenden Sonde, sowie die Nicht-Target hybridisierende Sonde der vorliegenden Erfindung weisen bevorzugt eine höhere Tm (z. B. mindestens 2°C oder 4°C oder 6°C oder 8°C oder 10°C oder 15°C oder 20°C oder höher) auf als die jeweilige Target-Bindungssequenz der Target hybridisierenden Sonde. In einer Ausführungsformen werden die Target hybridisierenden Sonden mit den universellen Sequenzen vor dem Hybridisieren zu den Target-Polynucleotidmolekülen in einer Probe vorgeladen.
  • Bevorzugt wird das 3'-Ende einer Sonde (z. B. einer Target hybridisierenden Sonde oder einer universellen Sonde) durch die Zugabe eines Phosphats oder einer Amingruppe oder ähnlichem blockiert, um einer Kettenelongation aus dem 3'-Ende der Sonde vorzubeugen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Sondenbindungssequenz gemäß der Erfindung eine universelle Sequenz (d. h. eine gemeinsame Sequenz) sein, die für eine Anzahl von Target hybridisierenden Sonden identisch ist, die verschiedene Target-Bindungssequenzen enthalten. Daher enthält jede der Anzahl an Target hybridisierenden Sonden außerdem ihre einzigartige Target-Bindungssequenz, die zu ihrem einzigartigen Target-Polynucleotid hybridisiert. Die universelle Sondenbindungssequenz hybridisiert nicht zu dem Target-Polynucleotid, sie dient dazu, eine gemeinsame Sequenz bereitzustellen, auf der eine universelle Nicht-Target hybridisierende Sonde basiert. Durch die Verwendung der universellen Sondenbindungssequenz und der universellen Nicht-Target hybridisierenden Sonde für eine Anzahl verschiedener Target hybridisierenden Sonden für die Erfassung einer Anzahl verschiedener Target-Polynucleotiden wird daher die arbeits- und kostenintensive Konzeption einer gelabelten spezifischen Oligonucleotidsonde für jedes zu erfassende Polynucleotid vermieden.
  • Die universelle Sonde der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt gelabelt. Die beiden universellen Sonden, die für das Erfassen des gleichen Target-Polynucleotids verwendet werden, sind bevorzugt an verschiedenen Enden gelabelt, das heißt, eine universelle Sonde (z. B. Sonde 3) ist am 3'-Ende und die andere universelle Sonde (z. B. Sonde 4) ist am 5'-Ende gelabelt, oder umgekehrt. Die Label auf den beiden universellen Sonden sind bevorzugt Teile eines Paars interaktiver Label, stärker bevorzugt eines Donator-Akzeptorpaars oder eines Donator-Löscherpaars, das durch FRET ein erfassbares Signal erzeugen kann.
  • Nucleotidanaloga können in der universellen Sonde für Labelzwecke verwendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein herkömmliches Desoxynucleotid auf einer universellen Sonde, z. B. dem 3'- oder 5'-terminalen Nucleotid, mit einem Teil eines Paar interaktiver Label gelabelt. Nicht beschränkende Beispiele einiger geeigneter gelabelter Nucleotide sind in Tabelle 1 aufgelistet. Tabelle 1. Beispiele gelabelter Nucleotide
    Fluorescein gelabelt Fluorophor gelabelt
    Fluorescein-12-dCTP Eosin-6-dCTP
    Fluorescein-12-dUTP Coumarin-5-ddUTP
    Fluorescein-12-dATP Tetramethylrhodamin-6-dUTP
    Fluorescein-12-dGTP Texas Red-5-dATP
    Fluorescein-N6-dATP LISSAMINETM-Rhodamin-5-dGTP
    FAM gelabelt TAMRA gelabelt
    FAM-dUTP TAMRA-dUTP
    FAM-dCTP TAMRA-dCTP
    FAM-dATP TAMRA-dATP
    FAM-dGTP TAMRA-dGTP
    ROX gelabelt JOE gelabelt
    ROX-dUTP JOE-dUTP
    ROX-dCTP JOE-dCTP
    ROX-dATP JOE-dATP
    ROX-dGTP JOE-dGTP
    R6G gelabelt R110 gelabelt
    R6G-dUTP R110-dUTP
    R6G-dCTP R110-dCTP
    R6G-dATP R110-dATP
    R6G-dGTP R110-dGTP
    BIOTIN gelabelt DNP gelabelt
    Biotin-N6-dATP DNP-N6-dATP
  • Fluoreszierende Farbstoffe
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die universelle Sonde der vorliegenden Erfindung mit einem fluoreszierenden Farbstoff gelabelt. Stärker bevorzugt ist die universelle Sonde mit einem Teil eines Paars interaktiver Label gelabelt.
  • Mit fluoreszierendem Farbstoff gelabelte Polynucleotide oder Sonden können von kommerziellen Quellen bezogen werden. Gelabelte Polynucleotidsonden können außerdem durch jede einer Anzahl von Methoden hergestellt werden. Zum Beispiel kann das Labeln einer Polynucleotidsonde mit einem fluoreszierenden Farbstoff im Innern oder durch das Labeln der Enden unter Verwendung von Verfahren erfolgen, die dem Fachmann gut bekannt sind (vgl. zum Beispiel Ju et al., Proc Nat Acad Sci 92: 4347–4351, 1995; Nelson et al. Polynucleotides Res 20: 6253–6259, 1992.
  • Bevorzugt wird eine Oligonucleotidsonde mit einem fluoreszierenden Farbstoff gelabelt. Fluoreszierende Farbstoffe, die als erfassbare Label geeignet sind, sind dem Fachmann gut bekannt, und zahlreiche Beispiele sind im Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 6th Edition, Richard Haugland, Molecular Probes, Inc., 1996 (ISBN 0-9652240-0-7) zu finden. Das erfassbare Label kann direkt mit der Sonde verbunden werden, oder es kann durch einen Linker verbunden werden. Beispiele für geeignete Linker sind in der US-Patentschrift Nr. 5,770,716 beschrieben. Die Label können jedes fluoreszierende Label oder Fluorophor sein, das die Fähigkeit der Oligonucleotidsonde nicht beeinträchtigt, zu einem anderen Polynucleotid (z. B. einem Target-Molekül oder einer anderen Sonde) zu hybridisieren. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die beiden universellen Sonden, die für das Erfassen des gleichen Target-Polynucleotids verwendet werden, mit beliebigen fluoreszierenden Labeln oder Fluorophoren gelabelt, die die Fluoreszenzresonanzenergieübertragung erlauben. Erfassbare Label können Verbindungen oder Elemente sein, die durch Techniken erfassbar sind, die keine Fluoreszenztechniken sind, oder die zusätzlich zu Fluoreszenztechniken verwendet werden. Solche zusätzlichen Label beinhalten Radioisotope, Chemilumineszenzverbindungen, Spinlabel, immunologisch erfassbare Haptene und dergleichen.
  • Bevorzugt werden die fluoreszierenden Farbstoffe nach ihrer Kompatibilität mit dem Erfassen auf einem DNA-Sequenzierungsautomaten ausgewählt, und sollten somit spektral auflösbar sein und die elektrophoretische Analyse nicht signifikant beeinträchtigen. Beispiele für geeignete fluoreszierende Farbstoffe für die Verwendung als erfassbare Label sind unter anderem zu finden in den US-Patentschriften Nr. 5,750,409 ; 5,366,860 ; 5,231,191 ; 5,840,999 ; 5,847,162 ; 4,439,356 ; 4,481,136 ; 5,188,934 ; 5,654,442 ; 5,840,999 ; 5,750,409 ; 5,066,580 ; 5,750,409 ; 5,366,860 ; 5,231,191 ; 5,840,999 ; 5,847,162 ; 5,486,616 ; 5,569,587 ; 5,569,766 ; 5,627;027 ; 5,321,130 ; 5,410,030 ; 5,436,134 ; 5,534,416 ; 5,582,977 ; 5,658,751 ; 5,656,449 ; 5,863,753 ; PCT-Veröffentlichungen WO 97/36960 ; 99/27020 ; 99/16832 ; europäischen Patentschriften EP 0 050 684 ; Sauer et al, 1995, J. Fluorescence 5: 247–261; Lee et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20: 2471–2483; mid Tu et al., 1998, Nucl. Acids Res. 26: 2797–2802.
  • Die aligonucleotidsonde kann an jeder geeigneten Position fluoreszierend gelabelt sein. Bevorzugt wird die fluorezierende Gruppe auf oder benachbart zum 5'- oder 3'-Ende der aligonucleotidsonde angeordnet.
  • Alternativ kann die fluoreszierende Gruppe auf oder benachbart zum 3'- oder 5'-Ende eines Nucleotids innerhalb der aligonucleotidsonde angeordnet werden, zum Beispiel durch Inkorporation eines fluoreszierenden Nucleotidderivats, Modifikation eines Nucleotids oder Substitution eines Nucleotids durch ein fluoreszierendes Molekül. Zum Beispiel kann Tetramethylrhodamin (TAMRA) in die Oligonucleotidsonde eingeführt werden, indem modifiziertes Desoxythymidinphosphoramidit (5'-Dimethoxytrityloxy-5-[N-((tetramethyl-odaminyl)-aminohexyl)-3-acryimido]-2'-desoxy-thymidin-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidit) inkorporiert wird. Fluorescein kann auf ähnliche Weise inkorporiert werden mit: 5'-Dimethoxytrityloxy-5-[N-((3',6'-dipivaloylfluoresceinyl)-aminohexyl)-3-acryimido]-2'-desoxy-thymidin-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]phosphoramidit. Die DABCYL-Gruppe kann ebenfalls unter Verwendung von 5'-Dimethoxytrityloxy-5-[N-((4-(dimethylamino)azobenzen)-aminohexyl)-3-acryimido]-2'-deoxy-thymidin-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidit inkorporiert werden. Allgemeiner kann eine freie Aminogruppe mit einem aktiven Ester irgendeines Farbstoffs umgesetzt werden; ein solche Aminogruppe kann durch den Einschluss des modifizierten Thymidin-5'-Dimethoxytrityl-5-[N-(trifluoracetylaminohexyl)-3-acrylimido]-2'-desoxythymidin, 3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidits eingeführt werden. Bevorzugt ermöglicht die Inkorporation einer modifizierten Base die normale Basenpaarung. Ein Fachmann wird verstehen, dass Thymidin in den oben genannten Analoga mit einem anderen Nucleotid (z. B. Guanosin, Adenosin oder Cytidin) substituiert werden kann.
  • Die Oligonucleotidsonden enthalten primäre und sekundäre Amine, Hydroxyl-, Nitro- und Carbonylgruppen. Verfahren, die verwendet werden können, um fluoreszierende Oligonucleotidsonden und Kettenterminatoren herzustellen, werden nachfolgend beschrieben.
  • Es können eine Anzahl chemischer Reaktionen zum Fluoreszenzlabeln von Aminen angewendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die folgenden, wobei der fluoreszierende Farbstoff zu der angegebenen reaktiven Gruppe konjugiert wird: Tabelle 2
    Funktionelle Gruppe Reaktion Produkt
    Amin Farbstoff-Isothiocyanate Thiourea
    Amin Farbstoff-Succinimidylester Carboxamid
    Amin Farbstoff-Sulfonylchlorid Sulfonamid
    Amin Farbstoff-Aldehyd Alkylamin
  • Oligonucleotidsonden, die Amingruppen enthalten, die sich für die Einführung von fluoreszierendem Farbstoff eignen, beinhalten, sind aber nicht beschrankt auf diejenigen, die in Tabelle 2 aufgelistet sind.
  • Es können eine Anzahl chemischer Reaktionen zum Fluoreszenzlabeln von Ketongruppen angewendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die folgenden, wobei der fluoreszierende Farbstoff zu der angegebenen reaktiven Gruppe konjugiert wird: Tabelle 3
    Funktionelle Gruppe Reaktion Produkt
    Keton Farbstoff-Hyrazide Hydrazone
    Keton Farbstoff-Semicarbazide Hydrazone
    Keton Farbstoff-Carbohyrazide Hydrazone
    Keton Farbstoff-Amine Alkylamin
  • Oligonucleotidsonden, die Ketongruppen enthalten, die sich für die Einführung von fluoreszierendem Farbstoff eignen, beinhalten, sind aber nicht beschrankt auf diejenigen, die in Tabelle 3 aufgelistet sind.
  • Es können eine Anzahl chemischer Reaktionen zum Fluoreszenzlabeln von Aldehydgruppen angewendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die folgenden, wobei der fluoreszierende Farbstoff zu der angegebenen reaktiven Gruppe konjugiert wird: Tabelle 4
    Funktionelle Gruppe Reaktion Produkt
    Aldehyd Farbstoff-Hyrazide Hydrazone
    Aldehyd Farbstoff-Semicarbazide Hydrazone
    Aldehyd Farbstoff-Carbohyrazide Hydrazone
    Aldehyd Farbstoff-Amine Alkylamin
  • Oligonucleotidsonden, die Aldehydgruppen enthalten, die sich für die Einführung von fluoreszierendem Farbstoff eignen, beinhalten, sind aber nicht beschrankt auf diejenigen, die in Tabelle 4 aufgelistet sind.
  • Dehydrobutyren- und Dehydroalaninkomponenten weisen charakteristische Reaktioen auf, die benutzt werden können, um Fluorophore einzuführen, wie durch die folgenden illustriert, aber nicht auf diese beschränkt, wobei der fluoreszierende Farbstoff zu der angegebenen reaktiven Gruppe konjugiert wird: Tabelle 5
    Funktionelle Gruppe Reaktion Produkt
    Dehydrobutyrin Farbstoff-Sulfydryl Methyllanthionin
    Dehydroalanin Farbstoff-Sulfydryl Lanthionin
  • Oligonucleotidsonden, die Aldehydgruppen enthalten, die sich für die Einführung von fluoreszierendem Farbstoff eignen, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf diejenigen, die in Tabelle 5 aufgelistet sind.
  • Andere geeignete Fluorophore (zusätzlich zu jenen, die in den Tabellen 1 bis 5 aufgelistet sind) beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf: Texas RedTM (TR), LissamineTM Rhodamin B, Oregon GreenTM 488 (2',7'-Difluorfluorescein), Carboxyrhodol und Carboxyrhodamin, Oregon GreenTM 500, 6-JOE (6-Carboxy-4',5'-dichlor-2',7'-dimethyoxyfluorescein, Eosin F3S (6-Carboxymethylthio-2',4',5',7'-tetrabrom-trifluorfluorescein), Cascade blueTM (CB), Aminomethylcoumarin (AMC), Pyrene, Dansylchlorid (5-Dimethylaminonaphthalen-1-sulfonylchlorid) und andere Napththalene, PyMPO, ITC(1-(3-Isothiocyanatophenyl)-4-(5-(4-methoxyphenyl)oxazol-2-yl)pyridiniumbromid).
  • Teile eines Paars interaktiver Label
  • Ein Paar interaktiver Label umfasst einen ersten und einen zweiten Teil. Ein erster Teil kann mehr als einen, z. B. zwei, drei oder vier verschiedene zweite Teile aufweisen. Die Teile können ein Donator- und ein Akzeptorpaar zum Erzeugen des erfassbaren Signaltransfers sein. Es ist nicht entscheidend, welche der beiden universellen Sonden für das Erfassen des gleichen Target-Polynucleotids mit dem Donator oder dem Akzeptor gelabelt ist. Die Stimulation des Akzeptors durch den Donator, wenn sie in nächste Nähe gebracht werden, erzeugt ein erfassbares Signal. Verschiedene Donator-Akzeptorpaare erzeugen verschiedene erfassbare Signale, die durch einen FRET-Assay erfasst werden können.
  • Wenn zwei Target hybridisierende Sonde zu einem Target-Polynucleotid in nächster Nähe hybridisieren, werden die zwei jeweiligen universellen Sonden, entweder vorgeladen oder zu den Target hybridisierenden Sonden hybridisiert, anschließend in nächste Nähe gebracht. Dieser Komplex bringt den ersten und den zweiten Teil eines Paars interaktiver Label in Nähe zueinander. Wenn die Teile des Paars interaktiver Label ein Donator-Akzeptorpaar sind, wird die „Fluoreszenz", oder das Licht, das von diesem Komplex emittiert wird, durch Fluoreszenzresonanzenergieübertragung (FRET) verändert. „FRET" ist eine abstandsabhängige Wechselwirkung zwischen den elektronisch angeregten Zuständen von zwei Farbstoffmolekülen, bei der die Anregung von einem Donatormolekül auf ein Akzeptormolekül übertragen wird. FRET ist von der inversen sechsten Potenz der intermolekularen Trennung abhängig, was sie bei Abständen geeignet macht, die mit den Dimensionen biologischer Makromoleküle vergleichbar sind, und die in den Komplexen erhalten werden können, die zwischen den universellen Sonden in dem Verfahren der Erfindung gebildet werden. In einigen Ausführungsformen sind die Donator- und die Akzeptorfarbstoffe für FRET verschieden, wobei in diesem Fall FRET durch das Auftreten von sensibilisierter Fluoreszenz auf dem Akzeptor erfasst werden kann. Wenn der Donator und der Akzeptor dieselben sind, wird FRET durch die resultierende Fluoreszenzdepolarisierung erfasst.
  • In einer Ausführungsform ist der Akzeptor des Donator-Akzeptorpaars ein dunkles Löschermolekül, das Hitze anstelle von sichtbarem Licht emittiert, wie nachfolgend beschrieben. In diesem Fall wird der Donator auch Reporter genannt.
  • Die Donator- und Akzeptorgruppen können unabhängig aus geeigneten fluoreszierenden Gruppen, Chromophoren und Löschergruppen ausgewählt werden. Geeignete Donatoren und Akzeptoren gemäß der Erfindung beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf: 5-FAM (auch 5-Carboxyfluorescein genannt; auch Spiro(isobenzofuran-1(3H) genannt, 9'-(9H)xanthen)-5-carbonsäure, 3',6'-Dihydroxy-3-oxo-6-carboxyfluorescein); 5-Hexachlor-Fluorescein ([4,7,2',4',5',7'-Hexachlor-(3',6'-dipivaloylfluoresceinyl)-6-carbonsäure]); 6-Hexachlor-Fluorescein ([4,7,2',4',5',7'-hexachlor-(3',6'-dipivaloylfluoresceinyl)-5-carbonsäure]); 5-Tetrachlor-Fluorescein([4,7,2',7'-Tetrachlor-(3',6'-dipivaloylfluoresceinyl)-5-carbonsäure]); 6-Tetrachlor-Fluorescein([4,7,2',7'-Tetrachlor-(3',6'-dipivaloylfluoresceinyl)-6-carbonsäure]); 5-TAMRA(5-carboxytetramethylrhodamin; Xanthylium, 9-(2,4-Dicarboxyphenyl)-3,6-bis(dimethylamino); 6-TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamin; Xanthylium, 9-(2,5-Dicarboxyphenyl)-3,6-bis(dimethylamino); EDANS(5-((2-aminoethyl)amino)naphthalen-1-sulfonsäure); 1,5-IAEDANS(5-((((2-Iodacetyl)amino)ethyl)amino)naphthalen-1-sulfonsäure); DABCYL(4-((4-(Dimethylamino)phenyl)azo)benzoesäure) Cy5(Indodicarbocyanin-5) Cy3(Indo-dicarbocyanin-3); und BODIPY FL (2,6-Dibrom-4,4-difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-proprionsäure), ROX, sowie geeignete Derivate davon.
  • Bevorzugte Kombinationen von Donatoren und Akzeptoren sind aufgelistet als, aber nicht beschränkt auf, die Donator/Akzeptorpaare, die in den Tabellen 6 und 7 gezeigt werden (die Werte für R0 – dem Abstand bei dem 50 der angeregten Donatoren durch FRET desaktiviert sindbeinhalten). Tabelle 6. Typische Werte für R0
    Donator Akzeptor R0 (Å)*
    Fluorescein Tetramethylrhodamin 55
    IAEDANS Fluorescein 46
    EDANS DABCYL 33
    Fluorescein Fluorescein 44
    BODIPY FL BODIPY FL 57
    *R0 ist der Abstand, bei dem 50% der angeregten Donatoren durch FRET desaktiviert sind. Daten aus Haugland, RP. 1996. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th edition. Molecular Probes, Inc. Eugene OR, USA.
    Tabelle 7. FRET-Paare, die für die Verwendung in dem erfahren dieser Erfindung geeignet sind.
    Donator Akzeptor
    (a) Fluoreszenz-Donatoren
    Fluorescein Tetramethylrhodamin
    Fluorescein Cy-3
    Fluorescein Rox
    EDANS DABCYL
    Dansyl Fluorescein
    Cy3 Cy-5
    Tryptophan AEDANS
    Fluorescein Tetramethylrhodamin
    Tetramethylrhodamin DABCYL
    Fluorescein DABCYL
    DABCYL Cy-3
    Fluorescein Hexachlorfluorescein
    Tetrachlorfluorescein Cy-5
    (b) Lumineszenz-Donatoren
    Europium Cy-5
    Terbium Tetramethylrhodamin
    Terbium Cy-3
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Donator-Akzeptorpaar ein Fluorescein-ROX-Paar, z. B. FAM-ROX sein.
  • Die Bezugnahme auf „Fluoreszenz", „fluoreszierender Farbstoff" oder „Fluoreszenzgruppen" oder „Fluorophore" beinhaltet Lumineszenz, Lumineszenzgruppen bzw. geeignete Chromophore. In der vorliegenden Erfindung kann die universelle Sonde mit Lumineszenz-Labeln gelabelt werden, und die Lumineszenzresonanzenergieübertragung ist für die Komplexbildung indikativ. Geeignete Lumineszenzsonden beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf die Lumineszenzionen von Europium und Terbium, die als Lanthiumchelate eingeführt sind (Heyduk & Heyduk, 1997). Die Lanthanidionen sind außerdem gute Donatoren für den Energieübertragung zu fluoreszierenden Gruppen (Selvin, 1995).
  • Lumineszenzgruppen, die Lanthanidionen enthalten, können in Polynucleotide inkorporiert werden, die ein 'Open-cage'-Chelator-Phosphoramidit benutzen. In Tabelle 6 sind einige bevorzugte Lumineszenzgruppe genannt.
  • In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung können die universellen Sonden auch mit zwei Chromophoren gelabelt sein, und eine Veränderung in den Absorptionsspektren des Labelpaars wird als Erfassungssignal, alternativ zum Messen einer Fluoreszenzveränderung, verwendet.
  • In der Literatur ist eine große Menge praktischer Anleitungen zum Auswählen geeigneter Donator(Rezeptor)-Löscherpaare für bestimmte Sonden verfügbar, wie durch die folgenden Quellenangaben veranschaulicht wird: Clegg (1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 2994–2998); Wu et al. (1994, Anal. Biochem., 218: 1–13); Pesce et al., editors, Fluorescence Spectroscopy (1971, Marcel Dekker, New York); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (1970, Marcel Dekker, New York); und dergleichen. Die Literatur beinhaltet außerdem Quellenangaben, die umfassende Listen fluoreszierender und chromogener Moleküle und deren relevanter optischer Eigenschaften zum Wählen der Reporter-Löscherpaare bereitstellen, z. B. Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (1971, Academic Press, New York); Griffiths, Colour and Constitution of Organic Molecules (1976, Academic Press, New York); Bishop, editor, Indicators (1972, Pergamon Press, Oxford); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1992 Molecular Probes, Eugene) Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (1949, Interscience Publishers, New York). Ferner gibt es in der Literatur umfassende Anleitungen für das Derivatisieren von Reporter- und Löschermolekülen für das kovalente Anheften über gemeinsame reaktive Gruppen, die einem Oligonucleotid zugefügt werden können, wie durch die folgenden Quellenangaben veranschaulicht wird, vgl. zum Beispiel Haugland (supra); Ullman et al., US-Patentschrift Nr. 3,996,345 ; Khanna et al., US-Patentschrift Nr. 4,351,760 ; US-Patentschrift Nr. 6,030,78 und 5,795,729 .
  • Beispielhafte Reporter-Löscherpaare können aus Xanthen-Farbstoffen, einschließlich Fluorescein- und Rhodamin-Farbstoffen, gewählt werden. Viele geeignete Formen dieser Verbindungen mit Substituenten auf ihren Phenylkomponenten, die als Bindungsstelle oder als Bindungsfunktionalität zum Anheften an ein Oligonucleotid verwendet werden können, sind fast überall im Handel verfügbar. Eine andere Gruppe fluoreszierender Verbindungen sind die Naphthylamine, die eine Aminogruppe an der alpha- oder beta-Position aufweisen. Zu solchen Naphthylamino-Verbindungen gehören 1-Dimethylaminonaphthyl-5-sulfonat, 1-Anilino-8-naphthalensulfonat und 2-p-Touidinyl-6-naphthalensulfonat. Andere Farbstoffe beinhalten 3-Phenyl-7-isocyanatocoumarin, Acridine, wie etwa 9-Isothiocyanatoacridin und Acridinorange; N-(p-(2-Benzoxazolyl)phenyl)maleimid; Benzoxadiazole, Stilbene, Pyrene und dergleichen.
  • In einer Ausführungsform ist eine universelle Sonde mit einem dunklen Löscher (z. B. einem Black Hole Quencher, BHQ) gelabelt, der die Fluoreszenz absorbiert oder löscht, die von einem Rezeptormolekül (z. B. FAM) emittiert wird. Die BHQ-Farbstoffe sind eine neue Klasse dunkler Löscher, die Fluoreszenz verhindern, bis ein Hybridisierungsereignis auftritt. Zudem weisen diese neuen Farbstoffe keine native Fluoreszenz auf, was die Hintergrundprobleme praktisch beseitigt, die bei anderen Löschern auftreten. BHQ-Farbstoffe können verwendet werde, um fast alle Reporter-Farbstoffe zu löschen, die im Handel erhältlich sind, zum Beispiel von Biosearch Technologies, Inc (Novato, CA). Das Rezeptor-Fluorophor wird verwendet, um einen Kettenterminator zu labeln. Das Löschermolekül löscht das Fluoreszenzsignal, das von dem Rezeptormolekül auf der anderen universellen Sonde emittiert wird, wenn sie in nächste Nähe zueinander gebracht werden, dies führt zu einer Verringerung des Fluoreszenzsignals, das durch FRET erzeugt wird.
  • Bevorzugt sind Reportermoleküle fluoreszierende organische Farbstoffe, die derivatisiert wurden, um sich an den terminalen 3'-Kohlenstoff oder den terminalen 5'- Kohlenstoff einer Sonde über eine Verbindungskomponente anzuheften. In einigen Ausführungsformen sind Löschermoleküle organische Farbstoffe, die, abhängig von der Ausführungsform der Erfindung, fluoreszierend sein können oder nicht. Im Allgemeinen sollte, unabhängig davon, ob das Löschermolekül fluoreszierend ist, oder die von dem Reporter übertragene Energie durch strahlungsfreien Zerfall freisetzt, die Absorptionsbande des Löschers im Wesentlichen die fluoreszierende Emissionsbande des Reportermoleküls überlappen. Nicht fluoreszierende Löschermoleküle, die Energie von angeregten Reportermolekülen absorbieren, die die Energie aber nicht strahlend freisetzen, werden in der Anmeldung als chromogene Moleküle bezeichnet.
  • Fluorescein- und Rhodaminfarbstoffe und geeignete Verbindungsmethoden zum Anheften an Oligonucleotide sind in vielen Quellenangaben beschrieben, z. B. Marshall, Histochemical J., 7: 299–303 (1975); Menchen et al., US-Patentschrit Nr. 5,188,934 ; Menchen et al., europäische Patentanmeldung 87310256.0 ; und Bergot et al., internationale Anmeldung PCT/US90/05565 . Es gibt viel Verbindungskomponenten und -methoden zum Anheften labelnder Moleküle (z. B. eines Teils eines interaktiven Labels) an die 5'- oder 3'-Enden von Oligonucleotiden, wie durch die folgenden Quellenangaben veranschaulicht wird: Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); Zuckerman et al., Polynucleotides Research, 15: 5305–5321 (1987) (3' thiol group an oligonucleotide); Sharma et al., Polynucleotides Research, 19: 3019 (1991) (3' sulfhydryl); Giusti et al., PCR Methods and Applications. 2: 223–227 (1993) und Fung et al., US-Patentschrift Nr. 4,757,141 (5'-Phosphoaminogruppe über Aminolink. TM. II, verfügbar von Applied Biosystems, Foster City, Calif.) Stabinsky, US-Patentschrift Nr. 4.739,044 (3'-Aminoalkylphosphorylgruppe); Agrawal et al., Tetrahedron Letters, 31: 1543–1546 (1990) (Anheftung über Phosphoramidatverbindungen); Sproat et al., Polynucleotides Research, 15: 4837 (1987) (5'-Mercaptogruppe); Nelson et al., Polynucleotides Research, 17: 7187–7194 (1989) (3'-Aminogruppe); und dergleichen.
  • Eine universelle Sonde kann mit einem Teil eines Paars interaktiver Label an ihrem 5'- oder 3'-Ende verknüpft werden. Das 3'-Ende der Oligonucleotidsonde ist durch ein Phosphat blockiert, um eine Sonden-initiierte Template-unabhängige Elongation zu verhindern.
  • Messbare Veränderungen
  • In einem Verfahren der vorliegenden Erfindung sind die gelabelten universellen Sonden in der Lage, zu den Target hybridisierenden Sonden zu hybridisieren, die an das Target-Polynucleotid binden. Diese Wechselwirkungen führen zur Bildung eines Komplexes, in dem die beiden gelabelten universellen Sonden in nächste Nähe gebracht werden. Die Label auf den beiden universellen Sonden, z. B. das Donator-Akeptorpaar (z. B. ein FRET-Fluoreszenzfarbstoffpaar) werden daher in nächste Nähe gebracht. Die Anregung des Donators führt zu Emission auf Licht mit einer größeren Wellenlänge, das seinerseits den Akzeptor anregen wird. Der Akzeptor emittiert Licht mit einer größeren Wellenlänge als die Wellenlänge der Anregungswellenlänge. Dies führt zu einer veränderten Fluoreszenz des Komplexes im Vergleich mit der nicht komplexierten Fluoreszenz, die die universellen Sonden selbst aufweisen, wenn sie frei in Lösung sind.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Fluoreszenzintensität der universellen Sonde und die Fluoreszenzintensität des Komplexes bei einer oder mehreren Wellenlängen mit einem Fluoreszenzspektrophotometer, einem Mikrotiterplattenleser oder Echtzeit-PCR-Instrumenten gemessen. Es ist im Allgemeinen bevorzugt, dass die beiden universellen Sonden einen Eins-zu-eins-Komplex bilden und äquivalente Molkonzentrationen der universellen Sonden in der Bindungsreaktion vorhanden sind. Es kann jedoch eine Überschuss einer Sonde verwendet werden, ohne den Umfang der Erfindung zu verlassen.
  • Typischerweise ist es bevorzugt, in einem Assay der Erfindung nach einem Signal (einem Positivwert) zu suchen, und nicht nach der Abwesenheit eines Signals (einem Negativwert), aber man wird zu schätzen wissen, dass eines von beiden oder beide verfolgt werden. Das bevorzugte Verfahren zum Erzeugen eines erfassbaren Signals gemäß der Erfindung ist FRET. Der Vorteil von FRET ist, dass eine neue Lichtwellenlänge geschaffen wird. Es ist leichter, ein kleines Signal vor dem Hintergrund zu erfassen, als eine kleine Abnahme in einem großen Signal. Wenn künftige Energieübertragungsreaktionen zu entwickeln sind, wie etwa magnetischer Resonanzenergieübertragung oder biologischer Resonanzenergieübertragung (wie zwischen grünem fluoreszierendem Protein und Luciferase), können solche Prozesse ebenfalls verwendet werden.
  • In einigen Ausführungsformen der Erfindung wird das Signal, das durch FRET erzeugt wird, durch statische Messungen der integralen Emissionsintensität des Donators (d. h., des Fluoreszenzfarbstoffs, der durch die Lichtquelle angeregt wird, die bei der Spektralmessung verwendet wird) und/oder des Akzeptors (d. h., des Fluoreszenzfarbstoffs, der ein Absorptionsspektrum aufweist, das das Emissionsspektrum des Donators überlappt) erfasst. Zudem kann FRET erfasst werden durch zeitaufgelöste Messungen, bei denen der Zerfall der Donatorfluoreszenz nach einem kurzen Anregungsimpuls gemessen wird. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird der Donator bei einer Wellenlänge angeregt, die selbst nicht zu einer wirksamen Anregung des Akzeptors führt, und FRET wird durch das Messen der Anregung des Akzeptors aufgrund des Transfers eines Photons von dem Donator erfasst.
  • In einigen Ausführungsformen wird das Signal durch Löschen erzeugt und dann durch Fluoreszenzleser erfasst. Für die vorliegende Erfindung kann jeder FRET-Löscher (z. B. Black Hole) oder Nicht-FRET-Löscher (z. B. Dabcyl) für das Löscher-Reporterpaar verwendet werden.
  • In einigen Ausführungsformen der Erfindung, wird das Donator-Akzeptorpaar durch ein Rezeptor-Löscherpaar ersetzt. Es ist für die Erfindung nicht entscheidend, welche der universellen Sonden mit einem löschenden Molekül gelabelt wird, solange die andere mit einem entsprechenden Rezeptormolekül eines Rezeptor-Löscherpaars gelabelt wird. Es können Sonden entwickelt werden, bei denen die Intensität der Reportermolekülfluoreszenz aufgrund der Trennung des Reportermoleküls von dem Löschermoleküls größer wird. Es können außerdem Sonden entwickelt werden, die ihre Fluoreszenz verlieren, weil das Löschermolekül in nächste Nähe zu dem Reportermolekül gebracht wird. Diese Reporter-Löschermolekülpaarsonden können in dem universellen Sondensystem der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um ein Target-Polynucleotid zu erfassen, indem entweder das Auftreten oder das Verschwinden des Fluoreszenzsignals, das von dem Reportermolekül erzeugt wird, überwacht wird.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Veränderung des Signals unter Verwendung eines Spektrofluorophotometers gemessen.
  • Kettenelongation-Primerverlängerung
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Target- Polynucleotid einer Amplifikationsreaktion unterzogen bevor seine Menge oder die Menge seines amplifizierten Produkts erfasst wird. Die in den betreffenden Verfahren benutzte Amplifikationsreaktion wird bevorzugt durch eine DNA-Polymerase katalysiert. Die Reaktion kann mit Verfahren durchgeführt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind, wie zum Beispiel in Current Protocols in Molecular Biology (1997, Ausubel et al., John Weley & Sons, Inc.) beschrieben.
  • Die Target-Bindungssonden und die universellen Sonden zum Erfassen eines Target-Polynucleotids können vor oder nach dem Beginn der Amplifikationsreaktion zugefügt werden. Oder sie können am Ende jedes Zyklus der Amplifikationsreaktion zugefügt werden, wenn es eine ist, die der Polymerasekettenreaktion (PCR) gleicht.
  • Bevorzugt werden die Target-Bindungsonden und die universellen Sonden vor Beginn der Amplifikationsreaktion zugefügt.
  • In einer Ausführungsform ist die Amplifikationsreaktion eine PCR-Reaktion und das PCR-Programm kann so eingerichtet werden, dass die Hybridisierung zwischen den Target hybridisierenden Sonden mit deren entsprechenden universellen Sonden vorgeladen sind, bevor die eigentliche Target-Amplifikation stattfindet. Dies kann mit jedem geeignetem Verfahren erreicht werden, das dem Fachmann bekannt ist, zum Beispiel, indem die Primerzugabe zur Reaktionsmischung bis nach dem Stattfinden des Annealings der Target hybridisierenden Sonden und der universellen Sonden verschoben wird, oder indem eine Annealingtemperatur eingestellt wird, die das Annealing der Sonden, aber nicht der Primer oder der Target-Bindungssonden zu dem Target ermöglicht. Daher ist es in diesem Fall bevorzugt, die Sequenzen der universellen Sonden so zu konzipieren, dass sie eine höhere Schmelztemperatur (z. B. 1°C oder 2°C oder 5°C oder 10°C oder höher) aufweisen als die Target hybridisierenden Sonden und die Primer.
  • Um die Hybridisierung zwischen den Target hybridisierenden Sonden und den universellen Sonden zu gewährleisten, kann man auch Sequenzen verwenden, die eine andere thermische Beständigkeit aufweisen. Zum Beispiel kann die Sondenbindungssequenz der Target hybridisierenden Sonde so gewählt werden, dass sie einen höheren G/C-Gehalt und folglich eine größere thermische Beständigkeit aufweist als die Target-Bindungssequenz der Target hybridisierenden Sonde. Auf ähnliche Weise kann man modifizierte Nucleotide in die Sondenbindungssequenz inkorporieren, wobei die modifizierten Nucleotide Basenanaloga enthalten, die stabilere Basenpaare bilden als die Basen, die typischerweise in natürlich vorkommenden Nukleinsäuren vorhanden sind.
  • Modifikationen der Sondenbindungssequenz, die die Sonden-Sonden-Bindung vor der Sonden-Primer-Bindung erleichtern können, um die Wirksamkeit des vorliegenden Assays zu verbessern, beinhalten die Inkorporation positiv geladener oder neutraler Phosphodiesterverbindungen in die Sonde, um die Repulsion der Polyanion-Hauptketten der Sonde und des Targets zu verringern (vgl. Letsinger et al., 1988, J. Amer. Chem. Soc. 110: 4470); die Inkorporation alkylierter oder halogenierter Basen, wie etwa 5-Bromuridin, in die Sondenbindungssequenz, um die Basenstapelung zu erhöhen; die Inkorporation von Ribonucleotiden in die Sondenbindungssequenz, um den Sonden:Sonden-Duplex in eine „A"-Struktur zu zwingen, was die Basenstapelung vergrößert; und die Substitution von 2,6-Diaminopurin (Aminoadenosin) für einige oder alle Adenosine in der Sondenbindungssequenz.
  • Zudem kann, um die Bindung der universellen Sonden vor den Primer an die Target hybridisierende Sonden zu erleichtern, ein hoher Molüberschuss, bezogen auf die Primer, universeller Sonden verwendet werden. Ein Fachmann kann außerdem erkennen, dass die Oligonucleotidkonzentration, Länge und Basenzusammensetzung wichtige Faktoren sind, die die Tm jedes einzelnen Oligonucleotids in einer Reaktionsmischung beeinflussen. Jeder dieser Faktoren kann manipuliert werden, um einen thermodynamischen Bias zu erzeugen, um das Annealing der universellen Sonde gegenüber dem Annealing der Primer zu der Target hybridisierenden Sonde zu erleichtern.
  • In einer Ausführungsform werden die Primer, z. B. die Vorwärts- und die Reverseprimer, der Reaktionsmischung der vorliegenden Erfindung nicht in der gleichen Konzentration zugefügt. Wenn zum Beispiel die Target hybridisierende Sonde zu dem Target-Polynucleotidstrang hybridisiert, der durch den Vorwärtsprimer amplifiziert wird, wird der Vorwärtsprimer in einer höheren Konzentration zugefügt als der Reverseprimer, der den anderen Target-Polynucleotidstrang amplifiziert, der nicht durch die Target hybridisierende Sonde hybridisiert wird. Wenn andererseits die Target hybridisierende Sonde zu dem Target-Polynucleotidstrang hybridisiert, der durch den Reverseprimer amplifiziert wird, wird der Reverseprimer in einer höheren Konzentration zugefügt als der Vorwärtsprimer, der den anderen Target-Polynucleotidstrang amplifiziert, der nicht durch die Target hybridisierende Sonde hybridisiert wird.
  • In einer Ausführungsform wird der Primer, der den Sonden hybridisierenden Target-Strang amplifiziert in einem Verhältnis 5:1 zu dem anderen Primer zugefügt, der den anderen Target-Strang amplifizierte, der nicht zu der Sonde hybridisiert.
  • Nach oder während der Amplifikationsreaktion binden die Target hybridisierenden Sonden an das Target-Polynucleotid und/oder dessen amplifizierten Produkte. Die vorgeladenen universellen Sonden oder die universellen Sonden, die an die Target hybridisierenden Sonden während oder nach der Amplifikation binden, werden dann durch die beiden Target hybridisierenden Sonden zusammengebracht, die das Target-Polynucleotid in nächster Nähe binden. Die Label auf den universellen Sonden, zum Beispiel ein Donator-Akzeptorpaar, befinden sich daher auch in nächster Nähe. Der Donator wird durch eine angelegte Wellenlänge angeregt, der Donator führt zu Emission von Licht mit einer größeren Wellenlänge, das seinerseits den Akzeptor anregen wird. Der Akzeptor emittiert Licht mit einer größeren Wellenlänge als die Wellenlänge der Anregungswellenlänge. Diese führt zu einer veränderten Fluoreszenz, die durch FRET-Assays erfassbar ist.
  • Hybridisierung
  • In den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung hybridisieren die Target hybridisierenden Sonden zu dem Target-Polynucleotid oder dessen amplifizierten Produkten, die universellen Sonden hybridisieren zu den Target hybridisierenden Sonden. In einigen Ausführungsformen, bei denen das Target-Polynucleotid zuerst amplifiziert wird, müssen die Primer, die für die Amplifikation verwendet werden, zu dem Target-Polynucleotidtemplate hybridisieren, um die Amplifikationsreaktion zu initiieren.
  • Polynucleotidhybridisierung beinhaltet das Bereitstellen denaturierter Polynucleotide (z. B. die Target hybridisierende Sonde und die universelle Sonde) unter Bedingungen, bei denen zwei komplementäre (oder teilweise komplementäre) Polynucleotide durch Paarung komplementärer Basen stabile Hybridduplexe bilden können. Die Polynucleotide, die keine Hybridduplexe bilden, können dann optional durch Waschen entfernt werden, wodurch die hybridisierten Polynucleotide zurückbleiben, die typischerweise durch Erfassen eines angehefteten erfassbaren Labels erfasst werden sollen.
  • Alternativ kann die Hybridisierung in einer homogenen Reaktion ausgeführt werden, bei der alle Reagenzien gleichzeitig vorhanden sind und keine Wäsche vorgenommen wird. In einer bevorzugten Ausführungsform hybridisieren zwei universelle Sonden zu zwei Target-Bindungssonden, wobei jede Target hybridisierende Sonde eine Target-Bindungssequenz umfasst, die das Target-Polynucleotid bindet, und eine Sondenbindungssequenz, die zu einer universellen Sonde bindet, wobei die beiden Target hybridisierenden Sonden zum gleichen Strang des Target-Polynucleotids in nächster Nähe hybridisieren. Bevorzugt umfasst die Target hybridisierende Sonde, die näher zum 3'-Ende des Target-Strangs bindet, die Target-Bindungssequenz bei 5' der Sondenbindungssequenz, und die Target hybridisierende Sonde, die näher zum 5'-Ende des Target-Strangs bindet, umfasst die Target-Bindungssequenz bei 3' der Sondenbindungssequenz, so dass die Hybridisierung der beiden Target hybridisierenden Sonden zum Target-Polynucleotid zur Bildung eines Hybridkomplexes führt, wie in 1 gezeigt. Ebenfalls bevorzugt sind die beiden universellen Sonden, die zu den beiden Target hybridisierenden Sonden hybridisieren, an unterschiedlichen Enden gelabelt, z. B. ist eine am 3'-Ende gelabelt und die andere am 5'-Ende gelabelt. Auf diese Weise führt die Hybridisierung der beiden universellen Sonden zu dem Hybridkomplex aus Target hybridisierender Sonde/Target-Polynucleotid zu den beiden Labeln auf den beiden universellen Sonden, die zum Zweck der Erzeugung eines erfassbaren Signals in nächste Nähe gebracht werden. Die nicht hybridisierten Sonden können durch Wäsche entfernt werden, wenngleich dies für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich ist.
  • Es ist allgemein anerkannt, dass Polynucleotide durch Erhöhen der Temperatur oder Verringerung der Salzkonzentration in dem Puffer, der die Polynucleotide enthält, denaturiert werden. Die erforderliche Stringenz ist von der Nucleotidsequenz abhängig und hängt auch von den unterschiedlichen Komponenten ab, die während der Hybridisierung und/oder der Wäsche vorhanden sind. In einigen Ausführungsformen, bei denen die Vorladung der universellen Sonden zu den Target hybridisierenden Sonden wünschenswert ist, werden hoch stringente Hybridisierung-/Wäschebedingungen verwendet. Bevorzugt werden die Sonden in einer homogenen wässrigen Lösung vorgeladen, die das Target-Polynucleotid enthält, wobei die Vorladung erreicht wird, indem die Nicht-Target hybridisierende Sonden höhere Tm aufweisen als die Target-Bindungsdomäne der Target hybridisierenden Sonden.
  • Unter hoch stringenten Bedingungen findet der Großteil der Hybridisierung nur zwischen Molekülen statt, die komplementäre Sequenzen umfassen, wie etwa zwischen einer Target hybridisierenden Sonde, die eine Target-Bindungssequenz und eine Sondenbindungssequenz umfasst, und einer universellen Sonde, die zu der Sondenbindungssequenz der Target hybridisierenden Sonde hybridisiert. Es ist jedoch nicht erforderlich, dass zwei Moleküle vollständig komplementär sind, um unter Bedingungen hoher Stringenz zu hybridisieren. Unter Bedingungen niedriger Stringenz (z. B. niedrige Temperatur und/oder hoher Salzgehalt) werden sich selbst dann Hybridduplexe bilden, wenn die annealed Sequenzen nicht völlig komplementär sind. Somit wird die Spezifität der Hybridisierung bei niedriger Stringenz reduziert ist. Dagegen erfordert eine erfolgreiche Hybridisierung bei hoher Stringenz (z. B. höhere Temperatur oder niedrigerer Salzgehalt) weniger Fehlpaarungen. In einer Ausführungsform wird die Hybridisierung zwischen den Target hybridisierenden Sonden und dem Target-Polynucleotid unter Bedingungen niedriger Stringenz durchgeführt.
  • In einer Ausführungsform wird die Hybridisierung der Target hybridisierenden Sonden und der universellen Sonden durchgeführt, bevor ein Target-Polynucleotid zugefügt wird, d. h.. die Target hybridisierenden Sonden werden mit den universellen Sonden, z. B. vor dem Beginn der Amplifikationsreaktion, vorgeladen.
  • In einer anderen Ausführungsformen werden die universellen Sonden zugefügt, nachdem die Target hybridisierende Sonde bereits zu dem Target-Polypeptid hybridisiert wurde, z. B. nach dem Ende der Amplifikationsreaktion oder nach dem Ende eines Amplifikationsreaktionszyklus.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die Target hybridisierenden Sonden und die universellen Sonden einfach in die Amplifikationsreaktionsmischung zugefügt und die Hybridisierung zwischen den Sonden wird während der Amplifikationsreaktion (z. B. einer PCR-Reaktion) ausgeführt. Dies stellt ein homogenes Assayverfahren bereit, das keine Reinigung des Sondenkomplexes von den nicht hybridisierten Sonden erfordert.
  • Vorbehandlung vor dem Messen
  • In einigen Ausführungsformen können unerwünschte Label, die ein starkes Hintergrundrauschen oder andere Probleme während der Messung oder Analyse verursachen könnten (z. B. nicht hybridisierte universelle Sonden) optional auf verschiedene Weisen entfernt werden. Die Durchführbarkeit der betreffenden Verfahren der vorliegenden Erfindung ist unabhängig vom exakten Entfernungsverfahren. Die Trennung des Komplexes aus hybridisierter Sonde/Target und nicht hybridisierten universellen Sonden kann auf verschiedenerlei Weise erreicht werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Elektrophorese, Trennung durch Bindung an eine Festphase über eine Bindungskomponente auf einem Polynucleotid des Komplexes, z. B. einer Target hybridisierenden Sonde, Chromatographie und dergleichen. Geeignete Systeme zum elektrophoretischen Erfassen und Trennen beinhalten Systeme, die für die gleichzeitige elektrophoretische Trennung und Erfassung von fluoreszent gelabelten Polynucleotiden konzipiert sind; z. B. DNA-Sequenzierungsautomaten, wie etwa PE Applied Biosystems (Foster City, Calif., USA) 310, 377 oder 3700.
  • Ein beliebiger Träger aus einem breiten Spektrum fester Träger, die dem Fachmann bekannt sind, könnte wirksam in Verfahren der Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel sind mit Streptavidin überzogene feste Träger im Handel erhältlich, wie zum Beispiel mit Streptavidin überzogene magnetische Kugeln, die von Promega (Madison, Wis.) erhältlich sind, und mit Streptavidin überzogene Mikrotiterplatten (Covalink), die von NUNC (Roskilde, Dänemark) oder Labsystems (Marlboro, Mass.) erhältlich sind.
  • Es können Trennungsmethoden, abhängig von nichtspezifischen physikalisch-chemischen Eigenschaften, benutzt werden. Bevorzugte Methoden beinhalten solche Methoden, bei denen spezifische Affinitätswechselwirkungen benutzt werden, wie etwa auf einem festen Träger basierende Affinitätschromatographie.
  • Die Offenbarung bezieht sich außerdem auf Zusammensetzungen zum Ausführen der betreffenden Verfahren, wie oben beschrieben. Die Zusammensetzungen der Erfindung beinhalten Mischungen, die im Verlauf der Ausführung der Verfahren der Erfindung gebildet werden, oder Zusammensetzungen, die in dem Vorbereitungsprozess gebildet werden können, um die Verfahren der Erfindung auszuführen. Beispiele der betreffenden Zusammensetzung beinhalten Mischungen, die Kombinationen einer Target hybridisierenden Sonde und einer universellen Sonde umfassen, die zu der Target hybridisierenden Sonde hybridisiert. Die universelle Sonde kann mit einem Label gelabelt sein, das in der Lage ist, erfassbare Signale zu erzeugen. Die Target hybridisierende Sonde kann eine Target-Bindungssequenz und eine Sondenbindungssequenz umfassen. Die Target-Bindungssequenz hybridisiert nicht zu dem Target-Polynucleotid und kann für eine Anzahl von Target hybridisierenden Sonden gemeinsam sein, die verschiedene Sequenzen der Target-Bindungssequenz enthält und für das Erfassen verschiedener Target-Polynucleotide verwendet wird. Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auf ein universelles Sondensystem zum Erfassen verschiedener Target-Polynucleotide, so dass es nicht länger notwendig ist, für jede Target-Erfassung eine einzigartig gelabelte Sonde herzustellen. Zum Beispiel können gemäß dem universellen Sondensystem der vorliegenden Erfindung zwei gelabelte universelle Sonden für das Erfassen jedes Target-Polynucleotids verwendet werden, solange ein Paar entsprechender Target hybridisierenden Sonden (nicht gelabelt) gemäß der Erfindung konzipiert werden können. Dieses universelle Sondensystem beseitigt daher die Notwendigkeit eine spezifische Sonde für das Erfassen eines spezifischen Target-Polynucleotids individuell zu labeln, was arbeitsintensiv und teuer ist.
  • Die vorliegende Zusammensetzung kann auf Systeme angewendet werden, die keine Amplifikation beinhalten. In diesem Fall werden keine Primer für die Amplifikationsreaktion benötigt. Tatsächlich erfordert es die vorliegende Erfindung noch nicht einmal, dass Polymerisation oder Amplifikation stattfinden. In Abwesenheit einer Amplifikationsreaktion hybridisieren die Target hybridisierenden Sonden einfach zu einem denaturierten Target-Polynucleotid. Die universellen Sonden können zu den Target hybridisierenden Sonden vorgeladen sein, wie oben beschrieben, oder sie können danach zu dem Komplex aus Target-Polynucleotid/Target hybridisierender Sonde hybridisieren.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • In diesem Beispiel werden die folgenden Sonden einer Probe zugefügt, die eine Plasmid-DNA enthält, die das Target, einen nikotinischen Mausmuskel- -Untereinheit, enthält:
    Figure 00620001
  • B7-P1-53 und B7-P2-50 waren zwei Target hybridisierende Sonden, UP-A und UP-B waren die entsprechenden Nicht-Target hybridisierenden Sonden, die für die Erfassung verwendet wurden. Die interaktiven Label FAM und ROX auf den beiden Nicht-Target hybridisierenden Sonden UP-A und UP-B stehen in Wechselwirkung miteinander, wenn die Sonden zu den beiden Target hybridisierenden Sonden B7-P1-53 und B7-P2-50 hybridisieren, die zu dem Target-Polynucleotid hybridisieren, das den nikotinischen Mausmuskel- -Untereinheit, kodiert. Diese Wechselwirkung erzeugt ein Signal, das durch FRET erfassbar ist.
  • Beispiel 2
  • In diesem Beispiel wurde die PCR-Reaktion wie folgt eingerichtet:
    Bestandteile
    Endkonzentration
    H2O 12
    10 X Brilliant Core PCR-Puffer 5 1 X
    MgCl2 (50 mM) 5.5 5,5 mM
    dNTP (20 mM)) 2 jeweils 200 uM
    V-Prime 1 100 nM
    R- 5 500 nM
    UPA- 2 200 nM
    UPB- 4 400 nM
    P1- 1 100 nM
    P2-50 (5 uM) 2 200 nM
    0,5 2,5 U
    Insgesamt 40
  • Die oben genannte Reaktionsmischung wurde auf ein Endvolumen von 50 -Puffer oder 10 -Puffer zugefügt wurde, der eine Plasmid-DNA enthält, die das Target, nikotinischen Mausmuskel -Untereinheit, enthält. In dieser Mischung betragen die Mischungsverhältnisse: Vorwärtsprimer:
    Reverseprimer = 1:5; und P1:P2 = 1:2, UP-A: P1 = 2:1, UP-B: P2 = 2:1.
  • Die PCR-Reaktion wurde in einem Thermocycler gemäß dem folgenden Profil ausgeführt: 95°C, 10 Min, gefolgt von 40 Zyklen mit 95°C, 30 Sek., 55°C, 1 Min., 72°C, 30 Sec. Die Signale wurden bei 55°C jedes Zyklus aufgenommen.
  • Die verwendeten Primer und Sonden waren die folgenden:
    Figure 00640001
  • Wie in 2A gezeigt, blieben die Fluoreszenzsignale unverändert, wenn kein Template (NTC) zugefügt wurde. Das Fluoreszenzsignal vergrößerte sich, je weiter der PCR-Zyklus fortschritt, wenn die Plasmid-DNA, die das Target, den nicotinischen Hausmuskel-Acetylcholinrezeptor, γ-Untereinheit, enthielt, zugefügt wurde. Die vergrößerten Signale waren proportional zur Target-Konzentration. 2B zeigt die lineare Charakteristik zwischen den Ct-Werten und der Log-Konzentration des Target-Templates unter Verwendung eines universellen Sondensystems und des Targets, des nikotinischen Hausmuskel-Acetylcholinrezeptors, γ-Untereinheit.
  • ANDERE AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorausgehenden Beispiele veranschaulichen Versuche, die von den betreffenden Erfindern beim Erdenken und Durchführen der Erfindung ausgeführt und erwogen wurden. Man glaubt, dass diese Beispiele eine Offenbarung von Techniken beinhalten, die dazu dienen, sowohl die Fachwelt von der Methode der Erfindung in Kenntnis zu setzen als auch deren Nützlichkeit zu veranschaulichen. Der Fachmann wird zu schätzen wissen, dass die hier offenbarten Techniken und Ausführungsformen nur bevorzugte Ausführungsformen sind, die in allgemeinen zahlreichen äquivalenten Verfahren und Techniken benutzt werden können, um die gleichen Ergebnisse zu erzielen.
  • Alle Quellenangaben, einschließlich der oben nachgewiesenen Patente und Patentanmeldungen, beschreiben, offenbaren, stellen eine Basis dar für Zusammensetzungen und/oder Verfahren, die für die Umsetzung einer oder mehrere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindungen wichtig sein können, oder ermöglichen diese.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001
  • Figure 00690001
  • Figure 00700001
  • Figure 00710001
  • Figure 00720001
  • Figure 00730001
  • Figure 00740001
  • Figure 00750001

Claims (16)

  1. Zusammensetzung umfassend: – ein Polynucleotid-Target; – eine erste Target hybridisierende Sonde, die eine Target-Bindungssequenz (P1-DNA), die an einen Strang des Target-Polynucleotids hybridisiert, und eine Sondenbindungssequenz (P1-P) umfasst; – eine zweite Target hybridisierende Sonde, die eine Target-Bindungssequenz (P2-DNA) umfasst, die in nächster Nähe zu der ersten Target hybridisierenden Sonde hybridisiert und die an denselben Strang des Target-Polynucleotids wie die erste Target hybridisierende Sonde hybridisiert und wobei die zweite Target hybridisierende Sonde des Weiteren eine Sondenbindungssequenz (P2-DNA) umfasst; – eine Nicht-Target hybridisierende Sonde 3, die mit dem Label A gelabelt ist; und eine Nicht-Target hybridisierende Sonde 4, die mit dem Label B gelabelt ist, wobei die Sonde 3 an die P1-P-Sequenz hybridisiert und die Sonde 4 an die P2-2-Sequenz hybridisiert und wobei das Label A und das Label B interaktive Label sind.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, des Weitere gekennzeichnet dadurch, dass: – die Target-Bindungssequenz sich bei 5' der Sondenbindung in der Sonde 1 befindet, während die Target-Bindungssequenz sich bei 3' der Sondenbindungssequenz in der Sonde 2 befindet, – die Zusammensetzung des Weiteren einen Vorwärts- und einen Reverseprimer für die Amplifizierung des Targetpolynucleotids umfasst und/oder – die Zusammensetzung des Weiteren ein Kontrollpolynucleotid umfasst.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei, wenn die P1-DNA und die P2-DNA sich an den Strang binden, der durch den Reverseprimer amplifiziert ist, die Mengen des Vorwärtsprimers zur Menge des Reverseprimers in der Zusammensetzung 1:5 beträgt, und wenn die P1-DNA und die P2-DNA sich an den Strang, binden, der durch den Vorwärtsprimer amplifiziert ist, die Menge des Vorwärtsprimers zur Menge des Reverseprimers 5:1 beträgt.
  4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, des Weiteren gekennzeichnet dadurch, dass: – das Label A und das Label B fluoreszierende Farbstoffe sind, – das Label A und das Label B ein Donator-Akzeptorpaar sind, die mit einander in Wechselwirkung stehen, um durch Fluoreszenzresonanzenergieübertragung (FRET) ein Signal zu erzeugen, – die Sonde 3 oder 4 keine Homologie mit irgendeinem Polynucleotid gemeinsam hat, das von einer Probe isoliert worden ist, die das Target-Polynucleotid enthält, – wobei die Sonde 3 an ihrem 3'-Ende gelabelt ist und die Sonde 4 an ihrem 5'-Ende gelabelt ist, – das 3'-Ende einer Sonde modifiziert ist, um die Sondenverlängerung zu verhindern, – das 3'-Ende einer Sonde phosphoryliert ist und/oder – die Sonde 3 einen höheren Schmelzpunkt (Tm) als die P1-DNA-Sequenz aufweist und die Sonde 4 eine höhere Tm aufweist als die P2-DNA-Sequenz.
  5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, des Weiteren gekennzeichnet dadurch, dass: – das Donator-Akzeptorpaar ein FAM/ROX-Paar ist und/oder – der Akzeptor ein dunkler Löscher ist.
  6. Kit umfassend: – ein Polynucleotid-Target; – eine erste Target hybridisierende Sonde, die eine Target-Bindungssequenz (P1-DNA), die an einen Strang des Target-Polynucleotids hybridisiert, und eine Sondenbindungssequenz (P1-P) umfasst; – eine zweite Target hybridisierende Sonde, die eine Target-Bindungssequenz (P2-DNA) umfasst, die in nächster Nähe zur ersten Target hybridisierenden Sonde hybridisiert und die an denselben Strang des Target-Polynucleotids wie die erste Target hybridisierende Sonde hybridisert und wobei die zweite Target hybridisierende Sonde des Weiteren eine Sondenbindungssequenz (P2-P) umfasst; – eine Nicht-Target hybridisierende Sonde 3, die mit dem Label A gelabelt ist; – eine Nicht-Target hybridisierende Sonde 4, die mit dem Label B gelabelt ist, wobei die Sonde 3 an die P1-P-Sequenz hybridisiert und die Sonde 4 an die P2-P-Sequenz hybridisiert und wobei das Label A und das Label B interaktive Label sind; und – Verpackungsmaterialien dafür.
  7. Kit nach Anspruch 6, des Weiteren dadurch gekennzeichnet, dass: – das 3'-Ende einer Sonde modifiziert wird, um die Sondenverlängerung zu verhindern, – das 3'-Ende einer Sonde phosphoryliert wird, – wobei der Kit des Weiteren einen Vorwärts- und einen Reverseprimer für die Amplifizierung des Targetpolynucleotids umfasst, – wobei der Kit des Weiteren ein Kontrollpolynucleotid umfasst und/oder – die Target-Bindungssequenz sich bei 5' der Sondenbindung der Sonde 1 befindet, während die Target-Bindungssequenz sich bei 3' der Sondenbindungssequenz in der Sonde 2 befindet.
  8. Kit nach Anspruch 7, wobei, wenn die P1-DNA und die P2-DNA sich an den Strang binden, der durch den Reverseprimer amplifiziert ist, die Menge des Vorwärtsprimers zur Menge des Reverseprimers in dem Kit 1:5 beträgt und wenn die P1-DNA und die P2-DNA sich an den Strang, binden, der durch den Vorwärtsprimer amplifiziert ist, die Menge des Vorwärtsprimers zur Menge des Reverseprimers 5:1 beträgt.
  9. Kit nach einem der Ansprüche 7 bis 8, des Weiteren gekennzeichnet dadurch, dass: – das Label A und das Label B fluoreszierende Farbstoffe sind, – das Label A und das Label B ein Donator-Akzeptorpaar sind, die mit einander in Wechselwirkung stehen, um durch Fluoreszenzresonanzenergieübertragung (FRET) ein Signal zu erzeugen, – wobei die Sonde 3 oder 4 keine Homologie mit irgendeinem Polynucleotid gemeinsam hat, das von einer Probe isoliert worden ist, die das Target-Polynucleotid enthält, – wobei die Sonde 3 an ihrem 3'-Ende gelabelt ist und die Sonde 4 an ihrem 5'-Ende gelabelt ist und/oder – die Sonde 3 einen höheren Schmelzpunkt (Tm) als die P1-DNA-Sequenz aufweist und die Sonde 4 eine höhere Tm als die P2-DNA-Sequenz aufweist.
  10. Kit nach Anspruch 9, des Weiteren dadurch gekennzeichnet, dass: – das Donator-Akzeptorpaar ein FAM/ROX-Paar ist und/oder – der Akzeptor ein dunkler Löscher ist.
  11. Verfahren für das Erfassen der Menge eines Target-Polynucleotids umfassend: (a) das Zugeben zu dem Target-Polynucleotid: (1) einer Target hybridisierenden Sonde 1, die eine Target-bindungssequenz (P1-DNA), die an einen Strang des Target-Polynucleotids hybridisiert, und eine Sondenbindungssequenz (P1-P) umfasst; (2) einer Target hybridisierenden Sonde 2, die eine Target-Bindungssequenz (P2-DNA), die in nächster Nähe zur ersten Target hybridisierenden Sonde hybridisiert und die an denselben Strang des Target-Polynucleotids wie die erste Target hybridisierende Sonde hybridisiert und eine Sondenbindungssequenz (P2-P) umfasst; (3) einer Nicht-Target hybridisierenden Sonde 3, die mit dem Label A gelabelt ist, das an die P1-P-Sequenz hybridisiert; und (4) einer Nicht-Target hybridisierenden Sonde 4, die mit dem Label B gelabelt ist, das an die P2-P-Sequenz hybridisiert, wobei die Zugabe es erlaubt, dass das Label A mit dem Label B in Wechselwirkung steht, um ein erfassbares Signal zu erzeugen; und (b) das Erfassen des erzeugten Signals, wie es für die Menge des Polynucleotids indikativ ist.
  12. Verfahren für das Erfassen der Menge eines Target-Polynucleotids in einer Amplifikationsreaktionsmischung, umfassend: (a) das Zugeben zu der Amplifikationsreaktionsmischung: (1) einer Target hybridisierenden Sonde 1, die eine Target-Bindungssequenz (P1-DNA), die an einen Strang des Target-Polynucleotids hybridisiert, und eine Sondenbindungssequenz (P1-P) umfasst; (2) einer Target hybridisierenden Sonde 2, die eine Target-Bindungssequenz (P2-DNA), die in nächster Nähe zur ersten Target-Bindungssonde hybridisiert und die an denselben Strang des Target-Polynucleotids wie die erste Target hybridisierende Sonde hybridisiert, und eine Sondenbindungssequenz (P2-P) umfasst; (3) einer Nicht-Target hybridisierenden Sonde 3, die mit dem Label A gelabelt ist, das an die P1-P-Sequenz hybridisiert; und (4) einer Nicht-Target hybridisierenden Sonde 4, die mit dem Label B gelabelt ist, das an die P2-P-Sequenz hybridisiert, wobei das Zugeben erlaubt, dass das Label A mit dem Label B in Wechselwirkung steht, um ein Signal zu erzeugen; und (b) Erfassen des erzeugten Signals als für die Menge des Polynucleotids indikativ.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, des Weiteren dadurch gekennzeichnet, dass: – wenn die P1-DNA und die P2-DNA sich an den Strang binden, der durch einen Reverseprimer amplifiziert ist, die Menge des Vorwärtsprimers zur Menge des Reverseprimers in der Reaktionsmischung 1:5 beträgt und wenn die P1-DNA und die P2-DNA sich an den Strang, binden, der durch einen Vorwärtsprimer amplifiziert ist, die Menge des Vorwärtsprimers zur Menge des Reverseprimers 5:1 beträgt und/oder – die Amplifikationsreaktion eine Polymerasekettenreaktion (PCR) ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das erzeugte erfassbare Signal am Ende von zwei oder mehreren PCR-Zyklen erfasst wird.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, des Weiteren gekennzeichnet dadurch, dass: – die Label A und B fluoreszierende Farbstoffe sind, – die Label A und B ein Donator-Akzeptorpaar sind, die mit einander in Wechselwirkung stehen, um durch Fluoreszenzresonanzenergieübertragung (FRET) ein Signal zu erzeugen, – wobei die Sonde 3 oder 4 keine Homologie mit irgendeinem Polynucleotid gemeinsam hat, das von einer Probe isoliert worden ist, die das Target-Polynucleotid enthält, – wobei die Sonde 3 an ihrem 3'-Ende gelabelt ist und die Sonde 4 an ihrem 5'-Ende gelabelt ist, – das 3'-Ende einer Sonde modifiziert ist, um die Sondenverlängerung zu verhindern, – das 3'-Ende einer Sonde phosphoryliert ist, – die Target-Bindungssequenz sich an 5' der Sondenbindung in der Sonde 1 befindet, während die Target-Bindungssequenz sich bei 3' der Sondenbindung in der Sonde 2 befindet, – die Sonde 3 einen höheren Schmelzpunkt (Tm) als die P1-DNA-Sequenz aufweist und die Sonde 4 eine höhere Tm aufweist als die P2-DNA-Sequenz und/oder – das erzeugte Signal erfasst und mit Signalen verglichen wird, die durch eine oder mehrere Bezugssubstanzen erzeugt werden, die eine bekannte Menge des Target-Polynucleotids für die Bestimmung der Menge des Target-Polynucleotids enthalten.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, des Weiteren dadurch gekennzeichnet, dass: – das Donator-Akzeptorpaar ein FAM/ROX-Paar ist und/oder – der Akzeptor ein dunkler Löscher ist.
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