DE69531133T2

DE69531133T2 - Verfahren zur Dämpfung der Fluoreszene in Lösung von Fluoreszenzmarkierten Oligonucleotidsonden

Info

Publication number: DE69531133T2
Application number: DE69531133T
Authority: DE
Inventors: Mary Ellen Oakland Fisher; Robert Malcolm Berkeley Watson
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1994-09-01
Filing date: 1995-08-18
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2015-08-19
Also published as: JP3795557B2; CA2157200C; JPH0870876A; US5491063A; EP0699768B1; PT699768E; ATE243759T1; DK0699768T3; EP0699768A1; CA2157200A1; DE69531133D1; ES2202333T3

Description

Diese Erfindung betrifft Verfahren zum Modifizieren der Lichtemission von Oligonucleotiden, die mit einer lichtemittierenden Markierung markiert sind, in Lösung, unter Verwendung eines DNA-bindenden Chromophors. Darüber hinaus betrifft sie Verfahren zum Nachweis des Abbaus einzelsträngiger Oligonucleotide, die mit einer lichtemittierenden Markierung markiert sind, in Lösung. Darüber hinaus betrifft die Erfindung Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuresequenzen durch Hybridisierung mit einer komplementären Oligonucleotidsonde.
Der Nachweis von Nucleinsäuren unter Verwendung von Oligonucleotidsonden ist zu einem Standardverfahren für den Nachweis von Zielsequenzen geworden. Es sind zahlreiche Modifikationen des Verfahrens beschrieben worden. Im Allgemeinen wird eine DNA-Probe auf einem festen Träger immobilisiert und dann mit einer markierten, zielspezifischen Sonde hybridisiert (vergleiche zum Beispiel Falkow et al., U.S.-Patent-Nr. 4,358,535).
Es sind verschiedene Nucleinsäure-Nachweisverfahren beschrieben worden, die die selektive Spaltung von Oligonucleotidsonden nach der Bildung von Hybridisierungsduplices aus Sonde und Zielsequenz mit einbeziehen. Der Nachweis der gespaltenen Sonden zeigt das Auftreten der Hybridisierung und daher das Vorliegen der Zielsequenzen an. Zum Beispiel beschreiben Saiki et al., 1985, Biotechnology 3: 1008–1012 "Oligomer-Restriktions"-Nachweisverfahren, wobei die Hybridisierung der zielspezifischen Sonde eine Restriktionsschnittstelle erzeugt, die dann durch das entsprechende Restriktionsenzym gespalten wird. Die Patentveröffentlichung WO 89/09284 beschreibt Verfahren, bei denen RNA-Sonden dazu verwendet werden DNA-Zielsequenzen nachzuweisen. RNA-Sonden, die an DNA-Zielsequenzen hybridisiert sind, werden unter Verwendung von RNase H gespalten, welche die RNA in RNA-DNA-Hybrid-Duplices selektiv spaltet. Das U.S.-Patent-Nr. 5,210,015 beschreibt Verfahren, die die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität einer Nucleinsäure-Polymerase dazu verwenden, Sonden zu spalten, die an Zielsequenzen hybridisiert sind, und auf diese Weise markierte Oligonucleotid-Fragmente zum Nachweis freisetzen. Diese Verfahren erfordern ein zusätzliches Oligonucleotid, das stromaufwärts der Hybridisierungsstelle der Sonde hybridisiert hat, um als Primer für die durch die Polymerase vermittelte Verlängerungsreaktion zu dienen. Die Spaltung der Sonde erfolgt gleichzeitig mit der Verlängerung des Primers.
Die Erfindung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), ein Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäuren, ermöglichte den Nachweis von Nucleinsäuren mit außerordentlich erhöhter Sensitivität und Spezifität. Unter Verwendung der PCR können Segmente von in Einzelkopie vorliegender genomischer DNA vor dem Nachweis bis zu einer leicht nachweisbaren Menge selektiv amplifiziert werden. PCR-Verfahren werden in dem U.S.-Patent-Nr. 4,683,202 offengelegt. Die PCR und Verfahren zum Nachweis von PCR-Produkten unter Verwendung einer Oligonucleotidsonde, die in der Lage ist, mit der amplifizierten Ziel-Nucleinsäure zu hybridisieren, werden im U.S.-Patent-Nr. 4,683,195 und der europäischen Patentveröffentlichung-Nr. 237,362 beschrieben.
Ähnlich wie bei den vorstehend beschriebenen Verfahren zum Nachweis von nicht amplifizierten Nucleinsäuren, sind Verfahren zum Nachweis von Amplifikationsprodukten beschrieben worden, die die selektive Spaltung von Hybridisierungssonden nach der Bildung von Hybridisierungs-Duplices aus Sonde und Zielsequenz mit einbeziehen. Saiki et al., 1985, Science 230: 1350–1353 beschreiben die Anwendung der "Oligomer-Restriktion" zum Nachweis des amplifizierten Produkts. Das U.S.-Patent-Nr. 5,210,015 beschreibt ebenfalls die Analyse der PCR-Amplifikationsprodukte unter Verwendung der 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität einer Nucleinsäure-Polymerase, die dazu dient, die markierten Sonden zu spalten, die an Zielsequenzen hybridisiert haben (vergleiche auch mit Holland et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276–7280). Sonden, die in einem Abschnitt der Zielnucleinsäure hybridisieren, die durch die Amplifikationsprimer begrenzt wird, werden dem Amplifikationsreaktionsgemisch beigefügt. Hybridisierte Sonden werden durch die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität der Polymerase während der Verlängerung der Primer gespalten. Der Nachweis der markierten Fragmente zeigt das Auftreten sowohl der Primerverlängerung als auch die Hybridisierung der Sonde und daher die Amplifikation der spezifischen Zielsequenz an.
Es sind eine Reihe von Agenzien zur Markierung von Nucleinsäuren, entweder von Sonde oder von Zielsequenz, zur Erleichterung des Nachweises von Zielnucleinsäuren beschrieben worden. Es wurden Markierungen beschrieben, die Signale liefern, welche durch Fluoreszenz, Radioaktivität, Kolorimetrie, Röntgenstrahlbeugung oder -absorption, Magnetismus und enzymatische Aktivität nachweisbar sind, und diese umfassen zum Beispiel Fluorophore, Chromophore, radioaktive Isotope (insbesondere ³²P und ¹²⁵I), elektronendichte Reagenzien und Enzyme sowie Liganden, die spezifische Bindepartner besitzen. Die Markierung kann auf verschiedene Weise erfolgen, wie z. B. durch chemische Modifizierung eines Primers oder einer Sonde, um eine Markierung einzubauen oder durch die Verwendung von polymerisierenden Mitteln, um ein modifiziertes Nucleosidtriphosphat in ein Verlängerungsprodukt einzubauen.
Es sind eine Vielzahl von fluoreszierenden DNA-bindenden Verbindungen bekannt. Diese umfassen interkalierende (sich einlagernde) Agenzien, die nicht kovalent an die gestapelten Basen von Nucleinsäuren binden, und als Resultat eine Veränderung der Fluoreszenz zeigen, d. h. entweder eine Erhöhung oder eine Verschiebung zu einer unterschiedlichen Wellenlänge. Das U.S.-Patent-Nr. 4,582,789 beschreibt verschiedene interkalierende Einheiten einschließlich Psoralenen. Ethidiumbromid (EtBr) ist eine interkalierende Verbindung, die eine erhöhte Fluoreszenz aufweist, wenn sie an doppelsträngige DNA gebunden ist, statt wenn sie frei in Lösung ist, (Sharp et al., 1973, Biochemistry 12: 3055). Obwohl EtBr dazu verwendet werden kann, sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige Nucleinsäuren nachzuweisen, ist die Affinität von EtBr zu einzelsträngigen Nucleinsäuren relativ niedrig. EtBr wird gewöhnlich dazu verwendet, Nucleinsäuren nach der Gelelektrophorese generell (nicht spezifisch) nachzuweisen. Nach der Größenauftrennung über eine geeignete Gelmatrix, wie zum Beispiel Agarose oder Acrylamid, wird das Gel in einer verdünnten Lösung von EtBr inkubiert. Dann wird die DNA durch Untersuchung des Gels unter UV-Licht sichtbar gemacht (vergleiche Maniatis et al., Hrsg., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory).
Ein homogener Testansatz zur PCR und zum gleichzeitigen Nachweis des PCR-Produkts, der auf der erhöhten Fluoreszenz basiert, die EtBr und andere DNA-bindende Markierungen zeigen, wenn sie an doppelsträngige DNA gebunden sind, wird in Higuchi et al., 1992, Bio/Techniques 10: 413–417; Higuchi et al., 1993, Bio/Techniques 11: 1026–1030 und in den europäischen Patentveröffentlichungs-Nrn. 487,218 und 512,334 beschrieben. Die Verfahren erlauben den direkten Nachweis der Erhöhung der Menge an doppelsträngiger DNA während einer Amplifikationsreaktion, insbesondere aus der Erhöhung der amplifizierten Zielsequenz. Diese Verfahren weisen jedoch nur die Gesamtmenge an doppelsträngiger DNA in der Reaktion nach und unterscheiden nicht zwischen spezifischen Nucleinsäuresequenzen; die Spezifität des Testansatzes hängt von der Spezifität der Amplifikationsreaktion ab.
Die Verwendung von Oligonucleotidsonden in Nucleinsäure-Hybridisierungs-Testansätzen, die miteinander in Wechselwirkung tretenden Fluoreszenzmarkierungen markiert sind, wird durch Morrison, 1992, in: Nonisotopic DNA Probe Techniques, Kricka, Hrsg., Academic Press, Inc., San Diego, CA, Kapitel 13 und durch Heller und Morrison, 1985, in: Rapid Detection and Identification of Infectious Agents, Academic Press, Inc., San Diego, CA, auf den Seiten 245–256 beschrieben. Die Verfahren basieren auf der Veränderung der Fluoreszenz, die auftritt, wenn geeignete fluoreszierende Markierungen in enge Nachbarschaft zueinander gebracht werden, was in der Literatur als Fluoreszenz-Energieübertragung (FET), Fluoreszenz-Resonanz-Energieübertragung, strahlungsfreie Energieübertragung, Langstrecken-Energieübertragung, Dipol-gekoppelte Energieübertragung oder Energieübertragung nach dem Förster-Mechanismus beschrieben wird. Eine Anzahl an geeigneten Fluoreszenzmarkierungen sind im Fachgebiet bekannt und kommerziell erhältlich, zum Beispiel von Molecular Probes (Eugene, OR).
Morrison, 1992, vorstehend, beschreibt auf FET basierende Testansatz-Ausführungsformen bei denen miteinander wechselwirkende Fluoreszenzmarkierungen an getrennte Oligonucleotide gebunden werden, die durch Hybridisierung der Sonde entweder zusammengebracht oder getrennt werden. Diese Testansatz-Ausführungsformen, die zwei Sonden erfordern, werden entweder als nicht kompetitiv oder als kompetitiv beschrieben, in Abhängigkeit davon, ob die Sonde-Sonde-Hybridisierung mit der Sonde-Zielsequenz-Hybridisierung kompetitiert oder nicht. Bei einer anderen Testansatz-Ausführungsform wird eine Fluoreszenzmarkierung an die Hybridisierungs-Sonde gebunden, und die zweite Fluoreszenzmarkierung wird durch Interkalation (Einlagerung) in den doppelsträngigen Hybridisierungs-Duplex in enge Nachbarschaft gebracht. Zwischen der interkalierenden Markierung und der nicht hybridisierten Sonde findet in Lösung keine signifikante Wechselwirkung statt. Da die interkalierende Markierung in jede beliebige Nucleinsäure interkalieren kann, ist diese Ausführungsform nur zum Nachweis der einzelsträngigen Ziel-Nucleinsäure praktisch anwendbar.
Bei einer Ausführungsform der Nucleinsäure-Nachweisverfahren, die im vorstehend beschriebenen U.S.-Patent-Nr. 5,210,015 beschrieben werden, wird eine Sonde verwendet, die mit miteinander wechselwirkenden Fluoreszenzmarkierungen in enger Nachbarschaft zueinander markiert wurde. Die Markierungen werden an die Sonde angeheftet und sind durch eines oder mehrere Nucleotide voneinander getrennt, so dass der Abbau der Sonde während der Amplifikation die Markierungen voneinander trennt und dadurch eine nachweisbare Veränderung der Fluoreszenz hervorruft. Solche mehrfach markierten Sonden sind schwierig handzuhaben und müssen unter hohen Kosten synthetisiert werden.
Herkömmliche Verfahren der Molekularbiologie und der Nucleinsäurechemie, die sich im Rahmen des Fachgebiet befinden, werden in der Literatur ausführlich erklärt; vergleiche zum Beispiel mit Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, Hrsg., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames und S. J. Higgins, Hrsg., 1984); und die Reihe Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.).
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Modifizieren der Lichtemission einer Oligonucleotidsonde bereit, die mit einer lichtemittierenden Markierung markiert ist, in Lösung, unter Verwendung eines DNA-bindenden Chromophors, der mit der Markierung in Wechselwirkung treten kann, um die Lichtemission der Markierung zu modifizieren, und wobei das einzelsträngige Oligonucleotid nicht an seinen komplementären Strang hybridisiert ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zum Nachweis des Abbaus von Oligonucleotiden in Lösung bereit. Die Oligonucleotide werden mit einer lichtemittierenden Markierung markiert. Die Spaltung des Oligonucleotid wird in Gegenwart eines DNAbindenden Chromophors durchgeführt, der mit der Markierung in Wechselwirkung treten kann, um die Lichtemission der Markierung zu modifizieren. Der Abbau des Oligonucleotids wird durch Messung der sich ergebenden Veränderung der Lichtemission der Markierung nachgewiesen.
Die vorliegende Erfindung stellt Bedingungen bereit, unter denen eine signifikante Fluoreszenzlöschung einer lichtemittierenden Verbindung, die an ein Oligonucleotid gebunden ist, durch ein DNA-bindendes Chromophor in Lösung stattfindet. Diese Fluoreszenzlöschung findet ohne die Hybridisierung des markierten Oligonucleotids an seine komplementäre Sequenz statt. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwenden die Abhängigkeit dieser Fluoreszenzlöschung von der Länge des markierten Oligonucleotids. Die Löschung einer lichtemittierenden Markierung, die an ein kurzes Oligonucleotid gebunden ist (etwa 6 Nucleotide oder kürzer), ist nachweisbar geringer, als die Löschung einer lichtemittierenden Markierung, die an ein längeres Oligonucleotid gebunden ist.
Sowohl das Auftreten der Fluoreszenzlöschung einer lichtemittierenden Markierung, die an ein einzelsträngiges Oligonucleotid gebunden ist, durch ein DNA-bindendes Chromophor in Lösung, als auch die Abhängigkeit von der Länge des Oligonucleotids sind aus Sicht des Fachgebiets überraschend. Die früher beschriebenen Testansätze (vergleiche Morrison, 1992, vorstehend), die auf der Fluoreszenzlöschung einer Fluoreszenzmarkierung, die an eine Sonde gebunden ist, durch eine interkalierende Verbindung basieren, hängen von der Interkalation des Quenchers in einen doppelsträngigen Hybridisierungs-Duplex ab, um den Quencher und die Markierung in enge Nachbarschaft zueinander zu bringen. Das Fachgebiet lehrt, dass die Fluoreszenzlöschung einer Markierung, die an nicht hybridisierte einzelsträngige Sonden gebunden ist, in Lösung nicht signifikant ist. Es ist gut bekannt, dass die Fluoreszenzlöschung durch Fluoreszenz-Energieübertragung erfordert, dass die in Wechselwirkung tretenden Markierungen sich in enger Nachbarschaft zueinander befinden, und dass die beiden Moleküle in der Lösung nicht so in enger Nachbarschaft zueinander gehalten werden dürfen, so dass eine signifikante Fluoreszenzlöschung auftritt. Darüber hinaus binden die interkalierenden Quencher, die im Fachgebiet beschrieben werden, nicht signifikant an einzelsträngige DNA, und daher wurde keine deutliche Fluoreszenzlöschung einer Markierung, die an einzelsträngige DNA gebunden ist, in Lösung erwartet. Im Gegensatz dazu, basiert die vorliegende Erfindung auf der Fluoreszenzlöschung einer Fluoreszenzmarkierung, die an eine einzelsträngige Nucleinsäure gebunden ist, durch einen DNA-bindenden Chromophor, die in Lösung auftritt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin verbesserte Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nucleinsäure in einer Probe durch Hybridisierung an eine Oligonucleotidsonde bereit. Die Verfahren basieren auf der selektiven Spaltung von Sonden, die an Ziel-Nucleinsäuren hybridisiert sind. Der Nachweis der gespaltenen Sonden unter Verwendung der vorliegenden Erfindung zeigt die Anwesenheit der Ziel-Nucleinsäure an.
Daher stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nucleinsäure in einer Probe bereit, wobei das Verfahren umfaßt:

(a) Bereitstellen eines Reaktionsgemisches, das die Probe, einen DNA-bindenden Chromophor und eine Oligonucleotidsonde umfaßt, die mit einer lichtemittierenden Markierung markiert ist, wobei die Sonde eine Sequenz enthält, die in der Lage ist, mit der Ziel-Nucleinsäure zu hybridisieren, und wobei die DNA-bindende Verbindung in der Lage ist, die Lichtemssion der Markierung zu modifizieren;
(b) Messen der Lichtemission der Markierung;
(c) Behandeln des Gemisches unter Bedingungen, unter denen die Oligonucleotidsonde mit der Zielsequenz hybridisiert und gespalten wird;
(d) Messen der Lichtemission der Markierung; und
(e) Bestimmen, ob die Zielsequenz anwesend ist, durch den Unterschied in der Lichtemission, die zwischen Schritt (b) und Schritt (d) gemessen wurde.

Die selektive Spaltung von Sonden, die an Ziel-Nucleinsäuren hybridisiert sind, kann über eine Reihe bekannter Verfahren erreicht werden. Beispiele für geeignete Reaktionen, die selektiv Sonden spalten, die an eine Zielsequenz hybridisiert sind, werden vorstehend in Saiki et al., 1985, vorstehend; der Patentveröffentlichung-Nr. WO 89/09284 und dem U.S.-Patent-Nr. 5,210,015 beschrieben.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Nachweis von Nucleinsäuren sind besonders zur Verwendung in Verbindung mit Amplifikationsvorgängen geeignet. Daher wird in einer Ausführungsform der Erfindung die Zielsequenz vor Schritt (c) amplifiziert.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Verbesserungen gegenüber der homogenen PCR-Amplifikation und dem Testansatz zum Nachweis von PCR-Produkten bereit, der im U.S.-Patent-Nr. 5,210,015 beschrieben werden, und bei dem eine einzige Nucleinsäure-Polymerase sowohl zur Primerverlängerung als auch zur Spaltung der hybridisierten, markierten Sonden verwendet wird. Die Verbesserungen, die durch die vorliegende Erfindung bereit gestellt werden, erlauben die Verwendung einer Sonde, die mit einer einzigen lichtemittierenden Markierung markiert ist, und erfordern keine Manipulationen nach der Reaktion, um die gespaltenen und die ungespaltenen Sonden voneinander zu trennen.
Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nucleinsäuresequenz in einer Probe unter Verwendung der PCR bereit, wobei das Verfahren umfaßt:

(a) Bereitstellen eines PCR-Reaktionsgemisches, das diese Probe, ein Oligonucleotid-Primerpaar, eine Nucleinsäure-Polymerase mit 5' nach 3'-Nucleaseaktivität, ein DNAbindendes Chromophor und eine Oligonucleotidsonde umfaßt, die in der Lage ist, an einen Abschnitt der Ziel-Nucleinsäure zu hybridisieren, der durch die Oligonucleotid-Primer begrenzt wird, und wobei die Sonde mit einer lichtemitierenden Markierung markiert ist, und wobei die DNA-bindende Verbindung in der Lage ist, die Lichtemission der Markierung zu modifizieren;
(b) Messen der Lichtemission der Markierung;
(c) Behandeln des PCR-Reaktionsgemisches unter PCR-Bedingungen, wobei die 5' nach 3'-Nucleaseaktivität der Nucleinsäure-Polymerase Sonden spaltet, die an die Zielsequenz hybridisiert sind;
(d) Messen der Lichtemission der Markierung;
(e) Bestimmen, ob die Zielsequenz anwesend ist, durch den Unterschied in der Lichtenssion, die zwischen Schritt (b) und Schritt (d) gemessen wurde.

Bei einer anderen Ausführungsform des homogenen PCR-Amplifikations/Nachweis-Testansatzes ist das DNA-bindende Chromophor, das in dem Reaktionsgemisch bereit gestellt wird, dadurch charakterisiert, dass es ein nachweisbares Signal liefert, wenn es an doppelsträngige DNA gebunden ist, wobei das Signal größer ist als das Signal, das durch diese Verbindung bereit gestellt wird, wenn sie ungebunden vorliegt, und das Signal des DNA-bindenden Chromophors wird aufgezeichnet, um die Erhöhung der Gesamtmenge an doppelsträngiger DNA zu messen, die sich durch den Amplifikationsvorgang ergibt. Bei dieser Ausführungsform fungiert das DNA-bindende Chromophor sowohl als Quencher der Lichtemission der ungebundenen Sonde, als auch als Signal-erzeugende Verbindung, wie es z. B. in den durch Higuchi et al., 1992, vorstehend, beschriebenen Verfahren verwendet wird. Bei dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt die Veränderung des Signals, das durch die DNA-bindende Verbindung erzeugt wird, an, dass die Amplifkation stattgefunden hat, und die Veränderung der Lichtenssion der Sondenmarkierung zeigt die Amplifikation der spezifischen Zielsequenz an. Somit stellen die Verfahren getrennte Messungen für den Erfolg der Amplifikation in einen homogenen Testansatz ohne weitere erforderliche Reagenzien bereit.
1 bezieht sich auf die Abhängigkeit der Fluoreszenzlöschung in Lösung von der Länge des Oligonucleotids, an den das Fluorophor gebunden ist.
2 bezieht sich auf die Abhängigkeit der Fluoreszenzlöschung in Lösung von der Temperatur.
3 bezieht sich auf die Abhängigkeit der Fluoreszenzlöschung in Lösung von der Temperatur und der Verbesserung der beobachteten Fluoreszenzlöschung, die sich aus der Anwesenheit einer Haarnadel-Sekundärstruktur innerhalb des markierten, einzelsträngigen Oligonucleotids ergibt.
Zum besseren Verständnis der Erfindung werden nachstehend verschiedene Begriffe definiert.
Die Begriffe "Nucleinsäure" und "Oligonucleotid" beziehen sich auf Sonden und auf oligomere Fragmente, die nachgewiesen werden sollen, und sollen sich generell auf Polydesoxyribonucleotide (die 2-Desoxy-D-Ribose enthalten), auf Polyribonucleotide (die D-Ribose enthalten) und auf jedes andere Polynucleotid beziehen, das ein N-Glycosid einer Purin- oder einer Pyrimidinbase darstellt, oder auf modifizierte Purin- oder Pyrimidinbasen. Es gibt keine beabsichtigte Unterscheidung zwischen den Begriffen "Nucleinsäure" und "Oligonucleotid", und diese Begriffe werden austauschbar verwendet. Diese Begriffe beziehen sich nur auf die Primärstruktur des Moleküls. Daher umfassen diese Begriffe doppel- und einzelsträngige DNA, sowie doppel- und einzelsträngige RNA.
Die Begriffe "Zielabschnitt", "Zielsequenz" und "Ziel-Nucleinsäuresequenz" beziehen sich auf einen Abschnitt einer Nucleinsäure, der nachgewiesen werden soll.
Der Begriff "Sonde" bezieht sich auf ein Oligonucleotid, das in der Regel markiert ist, welches aufgrund der komplementären Basenpaarung eine Duplexstruktur mit einer Sequenz einer Ziel-Nucleinsäure bildet. Die Sonde umfaßt einen "hybridisierenden Abschnitt", der bevorzugt aus 10 bis 50 Nucleotiden besteht, noch stärker bevorzugt aus 20–30 Nucleotiden, und der einem Abschnitt der Zielsequenz entspricht. "Entsprechen" bedeutet, mit der bezeichneten Nucleinsäure identisch oder zu ihr komplementär zu sein. In der vorliegenden Erfindung werden Sonden-Oligonucleotide markiert, d. h. an eine Fluoreszenzmarkierung gebunden, um den Nachweis zu ermöglichen.
Der Begriff "Hybridsierung" bezieht sich auf die Bildung einer Duplexstruktur aus zwei einzelsträngigen Nucleinsäuren aufgrund der komplementären Basenpaarung. Die Hybridisierung kann zwischen vollständig komplementären Nucleinsäuresträngen oder zwischen Nucleinsäuresträngen stattfinden, die kleine Abschnitte mit Fehlpaarungen enthalten. Die Bedingungen, unter denen nur vollständig komplementäre Nucleinsäurestränge miteinander hybridisieren, werden als "stringente Hybridisierungsbedingungen" bezeichnet. Zwei einzelsträngige Nucleinsäuren, die bis auf kleine Abschnitte mit Fehlpaarungen zueinander komplementär sind, werden als "im Wesentlichen komplementär" bezeichnet. Stabile Duplices von im Wesentlichen komplementären Sequenzen können unter weniger stringenten Hybridisierungsbedingungen hergestellt werden. Fachleute auf dem Gebiet der Nucleinsäuretechnologie können die Stabilität eines Duplex durch Berücksichtigung einer Reihe von Variablen, die zum Beispiel die Länge und die Anzahl an Basenpaaren der Oligonucleotide, die Innenstärke und das Auftreten von fehlgepaarten Basenpaaren berücksichtigen, empirisch bestimmen.
Die Begriffe "sequenzspezifisches Oligonucleotid" und "SSO" beziehen sich auf Oligonucleotidsonden, bei denen der hybridisierende Abschnitt zu der Sequenz, die nachgewiesen werden soll, exakt komplementär ist. Die Verwendung von stringenten Hybridisierungsbedingungen, unter denen die Sonde nur mit dieser exakt komplementären Zielsequenz hybridisiert, erlaubt den Nachweis der spezifischen Zielsequenz. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind im Fachgebiet wohlbekannt (vergleiche z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Stringente Bedingungen sind von der Sequenz abhängig und können unter verschiedenen Umständen unterschiedlich sein. Im Allgemeinen werden die stringenten Bedingungen so gewählt, dass sie etwa 5°C niedriger als die mittlere Schmelztemperatur (Tm) der spezifischen Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem bestimmten pH-Wert liegen. Der Tm-Wert ist die Temperatur (bei einer definierten Ionenstärke und einem bestimmten pH-Wert), bei der 50% der Basenpaare dissoziiert sind. Ein Vermindern der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen erlaubt, dass Sequenzfehlpaarungen toleriert werden; der Grad der tolerierten Fehlpaarung kann durch die geeignete Einstellung der Hybridisierungsbedingungen kontrolliert werden.
Der Begriff "Untersequenz" bezieht sich hierin auf eine Nucleotidsequenz, die innerhalb einer anderen Sequenz enthalten ist.
Der Begriff "Markierung", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Atom oder ein Molekül, das an eine Nucleinsäure angeheftet werden kann, und das entweder dazu verwendet werden kann, ein nachweisbares Signal bereitzustellen, oder dazu, mit einem zweiten Markierung in Wechselwirkung zu treten, um das nachweisbare Signal, das durch die zweite Markierung bereitgestellt wird, zu modifizieren. Bevorzugte Markierungen sind lichtemittierende Verbindungen, die ein nachweisbares Signal durch Fluoreszenz, Chemolumineszenz oder Biolumineszenz erzeugen.
Der Begriff "Chromophor" bezieht sich auf eine nicht radioaktive Verbindung, die Energie in Form von Licht absorbiert. Einige Chromophoren können zur Lichtemission angeregt werden, entweder durch eine chemische Reaktion, die Chemolumineszenz hervorruft, oder durch die Absorption von Licht, die Fluoreszenz hervorruft.
Der Begriff "Fluorophor" bezieht sich auf eine Verbindung, die in der Lage ist zu fluoreszieren, d. h. Licht einer bestimmten Frequenz zu absorbieren und Licht einer anderen Frequenz, im Allgemeinen einer niedrigeren, zu emittieren.
Der Begriff "Biolumineszenz" bezieht sich auf eine Form der Chemolumineszenz, bei der die lichtemittierende Verbindung in einem lebenden Organismus vorgefunden wird. Beispiele für biolumineszente Verbindungen umfassen die bakterielle Luciferase und die Glühwürmchen (firefly)-Luciferase.
Der Begriff "Fluoreszenzlöschung (Quenchen)" bezieht sich auf die Abnahme der Fluoreszenz einer ersten Verbindung, die durch eine zweite Verbindung verursacht wird, unabhängig vom Mechanismus. Fluoreszenzlöschung erfordert typischerweise, dass sich die Verbindungen in enger Nachbarschaft zueinander befinden. Wie hierin verwendet, wird entweder von der Verbindung oder von der Fluoreszenz der Verbindung gesagt, dass sie gelöscht wird, und es bedeutet, dass beide Verwendungen sich auf das gleiche Phänomen beziehen.
Der Begriff "Interkalator (sich einlagernde Substanz)" bezieht sich auf ein Agens oder eine Einheit, die in der Lage ist, sich nicht kovalent zwischen die gestapelten Basenpaare einer Nucleinsäuredoppelhelix einzulagern.
Der Begriff "homogen" wie er hierin auf aus mehreren Schritten bestehende Vorgänge angewendet wird, bezieht sich auf Verfahren der Ausführung der Schritte des Vorganges, wobei die Notwendigkeit der Handhabung und der Manipulation der Probe zwischen den einzelnen Schritten vermindert oder beseitigt ist. Zum Beispiel bezieht sich ein "homogener" Amplifikations/Nachweis-Testansatz auf einen gekoppelten Amplifikations- und Nachweis-Testansatz, worin die Notwendigkeit zur Handhabung und zur Manipulation der Probe zwischen der Amplifikation und dem Nachweis minimiert oder beseitigt ist.
Der Begriff "Reaktionsgemisch" bezieht sich auf eine Lösung, welche die Reagenzien enthält, die zur Durchführung der Reaktion nötig sind. Ein "Amplifikationsreaktionsgemisch", das sich auf eine Lösung bezieht, welche die Reagenzien enthält, die zur Durchführung einer Amplifikationsreaktion nötig sind, enthält typischerweise Oligonucleotidprimer und eine DNA-Polymerase in einem geeigneten Puffer. Reaktionsgemische für spezifische Reaktionen sind in der Literatur wohlbekannt.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Modifizierung der Lichtemission einer Oligonucleotid-Markierung mit einer lichtemittierenden Markierung in Lösung bereit. Die Verfahren der Erfindung sind für den Nachweis der Spaltung einzelsträngiger Oligonucleotide anwendbar, die mit einer einzigen lichtemittierenden Markierung markiert sind. Der Nachweis des gespaltenen Oligonucleotids wird in einer Lösung durchgeführt, die einen DNA-bindenden Chromophor enthält, der mit der Markierung in Wechselwirkung treten kann, um die Lichtemission der Markierung zu vermindern. Die Veränderung der Länge des markierten Oligonucleotids durch die Spaltung, führt zu einer nachweisbaren Erhöhung der Lichtemission der angehängten Markierung. Geeignete lichtemittierende Markierungen und DNA-bindende Verbindungen, die miteinander in Wechselwirkung treten können, um die Lichtemission der Markierung zu modifizieren, werden nachstehend beschrieben.
Die Mechanismen, durch die die Lichtemission einer Verbindung durch eine zweite Verbindung gelöscht werden kann, werden durch Morrison, 1992, in: Nonisotopic DNA Probe Techniques (Kricka, Hrsg., Academic Press, Inc., San Diego, CA), Kapitel 13 beschrieben. Ein gut bekannter Mechanismus ist die Fluoreszenz-Energieübertragung (FET), die in der Literatur auch als Fluoreszenz-Resonanz-Energieübertragung, strahlungsfreie Energieübertragung, Langstrecken-Energieübertragung, Dipol-gekoppelte Energieübertragung oder Energieübertragung nach dem Förster-Mechanismus beschrieben wird. Die primäre Bedingung für FET ist, dass das Emissionsspektrum einer der Verbindungen, und zwar des Energiedonors, mit dem Absorptionsspektrum der anderen Verbindung, d. h. dem des Energieakzeptors, überlappen muß. Stryer und Haugland, 1967, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 719 zeigen, dass die Wirksamkeit der Energieübertragung einiger gebräuchlicher Emitter-Quencher-Paare annähernd 100% erreichen kann, wenn die trennenden Abstände weniger als 10 Ångström betragen. Die Energieübertragungsrate nimmt proportional zu sechsten Potenz des Abstandes zwischen den Energiedonor- und den Energieakzeptormolekülen ab. Folglich vermindert eine kleine Erhöhung des trennenden Abstands stark die Energieübertragungsrate, was zu einer erhöhten Fluoreszenz des Energiedonors führt, und, wenn das Chromophor des Quenchers ebenfalls ein Fluorophor ist, eine verminderte Fluoreszenz des Energieakzeptors zur Folge hat.
In den beispielhaft dargestellten Verfahren der vorliegenden Erfindung wird die Emission einer fluoreszierenden Markierung nachgewiesen, die an das einzelsträngige Oligonucleotid gebunden ist. Ein DNA-bindender Chromophor löscht die Fluoreszenz der Markierung bis zu einem Grad, der von der Länge des angelagerten Oligonucleotids abhängig ist. Obwohl FET-Löschung gut bekannt ist, sind sowohl das Auftreten der Fluoreszenzlöschung in Lösung einer Fluoreszenzmarkierung, die an ein einzelsträngiges Oligonucleotid gebunden ist, durch einen DNA-bindenden Chromophor, als auch die Abhängigkeit der Fluoreszenzlöschung von der Länge des Oligonucleotids aus Sicht des Fachgebiets unerwartet. Aufgrund der äußerst raschen Abnahme der Wechselwirkung zwischen fluoreszierenden Markierungen mit steigendem Abstand, wurde angenommen, dass Markierungen in Lösung nicht signifikant miteinander in Wechselwirkung treten. Das allgemeine Fehlen einer solcher Wechselwirkung in Lösung wird durch die früher beschriebenen Testansätze ersichtlich, die auf der Fluoreszenzlöschung einer Fluoreszenzmarkierung, die an eine Sonde gebunden ist, durch eine interkalierende Verbindung basierten (vergleiche Morrison, 1992, vorstehend). Diese früher beschriebenen Testansätze hängen von der Interkalation des Quenchers in einen doppelsträngigen Hybridisierungs-Duplex ab, um den Quencher und die Markierung in enge Nachbarschaft zueinander zu bringen und erhöhen dadurch die Fluoreszenzlöschung relativ zu dem Hintergrund des nicht gelöschten Zustands, der aus der nicht hybridisierten, markierten, einzelsträngigen Sonde in Lösung mit dem interkalierenden Quencher besteht. Die beschriebenen interkalierenden Quencher binden an einzelsträngige DNA, d. h. die nicht hybridisierte Sonde, nicht signifikant. Wie aus der Abstandsabhängigkeit des FET erwartet wurde, gibt es im daher Fachgebiet keine Berichte über eine signifikante Fluoreszenzlöschung der nicht-hybridisierten Sonde in Lösung. Im Gegensatz zu den Lehren des Fachgebiets, stellt die vorliegende Erfindung Bedingungen bereit, unter denen eine signifikante Fluoreszenzlöschung einer Fluoreszenzmarkierung, die an eine einzelsträngige Nucleinsäure gebunden ist, durch einen DNA-bindenden Chromophor in Lösung stattfindet.
Viele Fluorophore und DNA-bindende Chromophore, die im Fachgebiet beschrieben wurden, sind zur Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet. Geeignete Paare aus Fluorophor und DNA-bindendem Chromophor werden so ausgewählt, dass das Emissionsspektrum des Fluorophors mit dem Absorptionsspektrum des Chromophors überlappt. Idealerweise besitzt das Fluorophor eine große Stokes-Verschiebung (Stokes shift) (einen großen Unterschied zwischen der Wellenlänge der maximalen Absorption und der Wellenlänge der maximalen Emission), um die Interferenz durch gestreutes Anregungslicht gering zu halten.
Geeignete Markierungen, die im Fachgebiet wohlbekannt sind, umfassen Fluorescein und seine Derivate, wie z. B. FAM^TM, HEX^TM und JOE^TM; Rhodamin und seine Derivate, wie z. B. Texasrot, ROX^TM und TAMRA^TM; Lucifer-Gelb und Coumarin-Derivate, wie z. B. 7-Me₂N-Coumarin-4-acetat, 7-OH-4-CH₃-Coumarin-3-acetat und 7-NH₂-4-CH₃-Coumarin-3-acetat (AMCA), sind aber nicht auf diese beschränkt. FAM^TM, HEX^TM, TET^TM, JOE^TM, ROX^TM und TAMRA^TM werden durch Perkin Elmer, Applied Biosystems Division (Foster City, CA) vertrieben. Texasrot und viele andere geeignete Verbindungen werden durch Molecular Probes (Eugene, OR) vertrieben. Beispiele für chemilumineszente und biolumineszente Verbindungen, die als Energiedonatoren geeignet sein können, umfassen Luminol (Aminophthalhydrazid) und seine Derivate sowie Luciferasen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das DNA-bindende Agens ein interkalierendes Agens. Geeignete wohlbekannte interkalierende Agenzien umfassen Ethidiumbromid und Acridinorange.
Nicht interkalierende DNA-bindende Agenzien sind ebenfalls geeignet. Zum Beispiel sind die Mitglieder einer Gruppe von DNA-bindenden Verbindungen geeignet, die üblicherweise als "Furchenbinder" bezeichnet werden. Diese Verbindungen erkennen und binden an die kleine Furche der Duplex-DNA. Malachitgrün ist ein Beispiel für diese Klasse an Verbindungen, von dem gezeigt wurde, dass es mit den vorliegenden Verfahren funktioniert.
In einer Ausführungsform der Erfindung liefert das DNA-bindende Chromophor ebenfalls ein Signal, das nach der Interkalierung in doppelsträngige DNA nachweisbar verändert wird. Ethidiumbromid, sowie andere DNA-bindende Markierungen wie z. B. Acridine, Proflavin, Acridinorange, Acriflavin, Fluorcoumarin, Ellipticin, Daunomycin, Chloroquin, Distamycin D, Chromomycin, Homidium, Mithramycin, Ruthenium-Polypyridyle und Anthramycin, weisen eine veränderte Fluoreszenzemission auf, wenn sie an doppelsträngige DNA gebunden sind. Es wird bevorzugt eine DNA-bindende Verbindung verwendet, die die Amplifikationsreaktion nicht hemmt, um die Akkumulation der amplifizierten Sequenzen zu überwachen.
Das Oligonucleotid kann durch jedes geeignete Verfahren hergestellt werden, einschließlich zum Beispiel Clonierung und Isolierung der geeigneten Sequenzen unter Verwendung von Restriktionsenzymen oder durch direkte chemische Synthese durch Verfahren wie z. B. das Phosphotriester-Verfahren von Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 90–99; das Phosphodiester-Verfahren von Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 109–151; das Diethylphosphoramidit-Verfahren von Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 und das mit einem festen Träger arbeitende Verfahren des U.S.-Patents-Nr. 4,458,066. Verfahren zur Synthese markierter Oligonucleotide werden in Agrawal und Zamecnik, 1990, Nucl. Acids Res. 18(18): 5419–5423; MacMillan und Verdine, 1990, J. Org. Chem. 55: 5931-5933; Pieles et al., 1989, Nucl. Acids Res. 17(22): 8967–8978, Roget et al., 1989, Nucl. Acids Res. 17(19): 7643–7651 und in Tesler et al., 1989, J. Am. Chem. Soc. 111: 6966–6976 beschrieben. Eine Übersicht über die Syntheseverfahren liefert Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(3): 165–187.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind insbesondere zum Nachweis von amplifizierten Nucleinsäuren, entweder von DNA oder von RNA, geeignet. Geeignete Amplifikationsverfahren neben der PCR (U.S.-Patent-Nrn. 4,683,195; 4,683,202 und 4,965,188) umfassen die Folgenden, sind aber nicht auf diese beschränkt: Ligase-Kettenreaktion (LCR, Wu und Wallace, 1989, Genomics 4: 560–569 und Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189–193); Polymerase-Ligase-Kettenreaktion (Barany, 1991, PCR Methods and Applic. 1: 5–16); Lücken-PCR (Gap-PCR) (Patentveröffentlichung Nr. WO 90/01069); Reparatur-Kettenreaktion (Europäische Patent-Veröffentlichung-Nr. 439,182 A2), 3SR (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 1173–1177; Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874–1878); Patent-Veröffentlichung-Nr. WO 92/0880A) und NASBA (U.S.-Patent-Nr. 5,130,238). Diese Erfindung ist nicht auf irgendein bestimmtes Amplifikationssystem beschränkt. Wenn andere Systeme entwickelt werden, können diese Systeme aus der Anwendung dieser Erfindung profitieren. Eine vor Kurzem erschienene Übersicht über Amplifikationssysteme wurde durch Abramson und Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4: 41–47 veröffentlicht.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung stellt Verbesserungen gegenüber den Verfahren bereit, die im U.S.-Patent-Nr. 5,210,015 und in Holland et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276–7280 beschrieben wurden. Der Vorgang verwendet die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität einer hitzebeständigen DNA-Polymerase, um angelagerte, markierte Oligonucleotidsonden in Hybridisierungs-Duplices zu spalten und markierte Fragmente zum Nachweis freizusetzen. Die Spaltung der markierten Sonden der vorliegenden Erfindung durch die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität der DNA-Polymerase setzt die Markierungen in dem Reaktionsgemisch frei. Die Fluoreszenzlöschung des Signals in Lösung durch das DNAbindende Chromophor ist deutlich größer, wenn das Fluorophor an die nicht gespaltene Voll-Länge-Oligonucleotidsonde gebunden ist, als wenn es an die verkürzten, gespaltenen Fragmente gebunden vorliegt. Die sich ergebende Erhöhung der beobachteten Fluoreszenz zeigt die Spaltung der Sonde an, die notwendigerweise sowohl die Anwesenheit der Zielsequenzen als auch die Hybridisierung der Sonde mit der Zielsequenz anzeigt.
Der vorliegende homogene PCR/Nachweis-Testansatz ist zur Verwendung in Verbindung mit Verfahren geeignet, die in Higuchi et al., 1992, vorstehend, beschrieben wurden. In dieser Ausführungsform wird die Fluoreszenz des DNA-bindenden Chromophors ebenfalls gemessen. Somit ermöglicht die Fluoreszenz des DNA-bindenden Agens den Nachweis, dass die Amplifikation stattgefunden hat, und die Fluoreszenz der gespaltenen, hybridisierten Sonde zeigt die zielspezifische Amplifikation an.
Die Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung sind auf eine Vielzahl von Testansätzen anwendbar. Jeder Testansatz erfordert eine Ziel-Probe in einem Puffer, der mit den Testansatz-Reagenzien verträglich ist. Wenn die Zielsequenz entweder vor oder gleichzeitig mit dem Nachweis der Spaltung der Sonde amplifiziert wird, muß die Ziel-Nucleinsäure in einem Puffer vorliegen, der mit den Enzymen verträglich ist, die zur Amplifikation der Zielsequenz verwendet werden. Die Ziel-Nucleinsäure kann aus einer Vielzahl biologischer Materialien isoliert werden, einschließlich Geweben, Körperflüssigkeiten, Stuhl, Sputum, Speichel, Pflanzenzellen, Bakterienkulturen und ähnlichem. Verfahren zur Herstellung der Probe werden im Fachgebiet beschrieben.
Im Allgemeinen wird es sich bei der Nucleinsäure in der Probe um eine DNA-Sequenz handeln, in der Regel um genomische DNA. Die vorliegende Erfindung kann jedoch auch mit anderen Nucleinsäuren wie z. B. mit Messenger-RNA, ribosomaler RNA, viraler RNA oder clonierter DNA durchgeführt werden. Geeignete Nucleinsäureproben zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen einzel- oder doppelsträngige DNA oder RNA. Die Fachleute werden erkennen, dass je nachdem, welche Reaktion dazu verwendet wird die markierten Oligonucleotidsonden zu spalten, die Nucleinsäure bereits allein durch Durchführung der geeigneten und wohlbekannten Modifizierungen des verwendeten Verfahrens nachgewiesen werden kann, egal welche Art der Nucleinsäure es sich handelt.
Die Herstellung der Proben wird in Abhängigkeit von der Quelle der Probe, der Zielsequenz, die nachgewiesen werden soll, sowie der verwendeten Reaktion variieren. Geeignete Vorschriften zur Probenherstellung sind im Fachgebiet bekannt und werden in der vorstehend zitierten Literatur beschrieben (z. B. vergleiche Sambrook et al., vorstehend. Einfache und schnelle Verfahren zur Herstellung von Proben für die PCR-Amplifikation von Zielsequenzen werden durch Higuchi, 1989, in: PCR-Technology (Erlich, Hrsg., Stockton Press, New York) und in: PCR Protocols, Kapitel 18–20 (Innis et al., Hrsg., Academic Press, 1990) beschrieben, die beide hierin als Referenz mit beigelegt sind. Ein Fachmann ist in der Lage, ein geeignete Vorschrift auszuwählen und zu optimieren.
Die Fluoreszenz der Markierungen in Lösungen wird mit einem Spektrofluorimeter gemessen, wie z. B. dem Hitachi/Perkin Elmer Model 650-40 (Perkin Elmer, Norwalk, CT) oder dem PTI LS-100 Lumineszenz-Spektrophotometer (Photon Technology International, London, Ontario, Kanada). Ein Spektrofluorimeter bietet in Abhängigkeit von den Eigenschaften des bestimmten verwendeten Geräts die Möglichkeit, die Anregungs- und die Emissions-Wellenlänge, sowie die Bandbreite einzustellen. Es ist Fachleuten offensichtlich, die Einstellung der Wellenlängen und der Bandbreiten zum Nachweis der Fluoreszenz für eine bestimmte Fluoreszenzmarkierung zu bestimmen. Allgemeine Hinweise finden sich zum Beispiel im Merck Index (Hrsg. Budavari et al., 1989, Merck Co., Inc., Rahway, NJ) und im Katalog von Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oregon), 1990, von Haugland. Obwohl jede Markierung ein bestimmtes Fluoreszenzspektrum besitzt, sind eine große Anzahl an Wellenlängen zum Nachweis bei der Durchführung der Erfindung geeignet.
Die Fluoreszenzmessungen werden vor und nach der Reaktion durchgeführt, die zur Spaltung der Sonde führt, und die Veränderung der Fluoreszenz wird relativ zu dem Wert vor der Reaktion berechnet. Entsprechend wird ein Teil des Reaktionsgemisches den Reaktionsbedingungen nicht ausgesetzt. Auf diese Weise kann die Fluoreszenz vor der Reaktion zusammen mit der Fluoreszenz nach der Reaktion nach Beendigung der Reaktion gemessen werden. Die Verwendung von Reaktionsgefäßen, die gleichzeitig zur Messung der Fluoreszenz geeignet sind, erlaubt die direkte Messung der Fluoreszenz sowohl vor als auch nach der Reaktion ohne ein Öffnen der Reaktionsgefäße oder anderer Manipulationen nach der Reaktion.
Bei bevorzugten Verfahren, bei denen das Nucleinsäure-Nachweisverfahren wie vorstehend beschrieben mit der PCR-Amplifikation kombiniert wird, wird die Ampliflkationsreaktion als automatisierter Vorgang durchgeführt. Derzeit sind Thermal-Zykler-Geräte von Perkin Elmer (Norwalk, CT) erhältlich, die einen Heizblock verwenden, der 48 oder 96 Reaktionsgefäße faßt. Folglich können bis zu 96 Amplifikationsreaktionen gleichzeitig durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht den automatischen Nachweis von PCR-Produkten in allen Proben, ohne die Notwendigkeit die Proben handhaben zu müssen, die Gefäße öffnen zu müssen oder die Zyklisierungsreaktion unterbrechen zu müssen. Geeignete optische Systeme werden zum Beispiel in Higuchi et al., 1992, vorstehend, Higuchi et al., 1993, vorstehend, und in der europäischen Patent-Veröffentlichung-Nr. 512,334 beschrieben. Bei einem solchen optischen System werden Mehrfach-Faseroptik-Leiter dazu verwendet, das Anregungslicht von der Quelle zu dem Reaktionsgefäß zu übertragen und das Emissionslicht jedes Gefäßes zu messen. Es wird nur ein einziges Fluorimeter benötigt, um die Fluoreszenz in den Reaktionsgefäßen abzulesen, da jede Faseroptik jeweils gleichzeitig schnell abgelesen werden kann. Ein alternatives optisches System verwendet eine Videokamera, um die Fluoreszenz der vielen Reaktionsgefäße gleichzeitig zu messen. Die Verwendung von durchsichtigen Reaktionsgefäßdeckeln erlaubt die Messung der Fluoreszenz, ohne das Gefäß öffnen zu müssen.
Es ist eine alternative geeignete Anlage zum Nachweis beschrieben worden, die ein Mikrotiterformat mit 96 Probenvertiefungen verwendet. Diese Art von Format wird oft in klinischen Laboratorien zur Durchmusterung großer Probenmengen gewünscht, zum Beispiel zur genetischen Analyse, wie z. B. dem Durchmustern von Sichelzell-Anämien oder von AIDS-Viren bei Durchmusterungsverfahren in Blutbanken. Die vorliegende Erfindung ist für diese Art der Analyse geeignet und eliminiert den Bedarf der zahlreichen Waschungen und Extraktionsverfahren, die mit den bekannten Testverfahren in "Probenvertiefungen", wie z. B. ELISA-ähnlichen Formaten oder anderen Verfahren, die auf der optischen Dichte basieren, erforderlich sind (Vergleiche Kolber et al., 1988, J. Immun. Meth. 108: 255–264, Huschtscha et al., 1989, In Vitro Cell and Dev. Biol. 25(1): 105–108 und Voller et al., 1979, The Enzyme Linked Immunosorbent Assay, Dynatech Labs, Alexandria, VA).
Die vorliegenden Nachweisverfahren erlauben ebenfalls die direkte Fluoreszenzmessung unter Verwendung eines Geräts, das einem ELISA-Platten-Lesegerät ähnlich ist, aber so umgestaltet wurde, dass es die Fluoreszenz anregen und messen kann. Zum Beispiel ist das CytoFluor^TM 2300-Gerät, das durch Millipore (Bedford, MA) hergestellt wird, für ein solches Verfahren geeignet. Alternativ ist ein Gerät, das einen kontinuierlichen Nachweis der Fluoreszenz liefert, dazu nützlich, die Zunahme des PCR-Produkts während der Amplifikationsreaktion aufzuzeichnen.
Für Fachleute ist es offensichtlich, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht auf ein bestimmtes Nachweisverfahren, ein bestimmtes Thermalzykler-Gerät oder bestimmte Signal-Meßgeräte oder auf eine bestimmte Anzahl an Reaktionsgefäßen beschränkt sind.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können dazu verwendet werden, gleichzeitig mehrere Zielsequenzen nachzuweisen. Dabei liegen Sonden, die für jede Zielsequenz spezifisch sind, im Reaktionsgemisch vor. Die entsprechende Sonde wird an jede in der Probe vorliegende Ziel-Nucleinsäure hybridisieren und gespalten werden. Um die gespaltenen Sonden getrennt nachzuweisen, wird jede Sondenart mit einer Markierung markiert, die bei einer bestimmten Wellenlänge fluoresziert. Dann wird jede Sondenart getrennt durch die geeignete Auswahl der Meßwellenlänge nachgewiesen.
Somit sind die Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Nachweis der Amplifikationsprodukte bei PCR-Koamplifikationsverfahren zum Nachweis mehrerer verschiedener Zielsequenzen in einer Probe geeignet, ohne jemals das Reaktionsgefäß öffnen zu müssen nachdem die Reaktion gestartet wurde. Die Erfindung ist besonders für quantitative Vergleiche von zwei unterschiedlichen Nucleinsäure-Zielsequenzen in der gleichen Probe geeignet. Verfahren zur Quantifizierung von Nucleinsäuren werden in dem U.S.-Patent-Nr. 5,219,727 beschrieben. Die beschriebenen Quantifizierungsverfahren sind auf der PCR basierende Verfahren, die einen internen Standard verwenden, um entweder die relative Menge einer Zielsequenz oder um die Menge einer Zielsequenz, die vor der Amplifikation vorlag, exakt zu bestimmen.
Die Nucleotidsequenz der einzelsträngigen Oligonucleotidsonde ist zu der Zielsequenz komplementär, damit die Sonde an die Zielsequenz hybridisieren kann. Eine Oligonucleotidsonde kann bei niedrigen Temperaturen in Abhängigkeit von der Nucleotidsequenz eine Sekundärstruktur bilden, die zu Abschnitten doppelsträngiger DNA führt. Eine interkalierende, DNA-bindende Verbindung kann in die doppelsträngigen Abschnitte in enger Nachbarschaft zu der Fluoreszenzmarkierung interkalieren und dadurch die Wirksamkeit der Energieübertragung steigern. Obwohl die Verfahren der vorliegenden Erfindung die Bildung von doppelsträngigen Abschnitten über Sekundärstrukturen innerhalb der Sonde nicht erfordern, können solche Abschnitte die Löschung der Markierung verbessern.
Durch das Anhängen einer endständigen Sequenz, die zu dem anderen Ende komplementär ist, können Sekundärstrukturen in eine einzelsträngige Sonde eingeführt werden, die ansonsten keine Sekundärstruktur bilden würde. Die ausgebildete Sekundärstruktur beinhaltet die Hybridisierung der 5'- und der 3'-Enden der Sonde um eine "Haarnadel"-Struktur zu bilden. Die Länge der komplementären Sequenzen an jedem Ende der Sonde muss ausreichend sein, um eine stabile Haarnadel-Sekundärstruktur bei der Temperatur und den Bedingungen des Testansatzes zu bilden, typischerweise bei Zimmertemperatur, sie darf jedoch nicht so lang sein, dass die Haarnadelstruktur stabilisiert wird, so dass die Selbsthybridisierung der Sonde, die Hybridisierung der Sonde mit der Zielsequenz kompetitiert, wodurch die Sonde nicht mehr in der Lage wäre, an die Zielsequenz zu hybridisieren. Die genaue Sequenz der Sonde wird von der Zielsequenz abhängen, die nachgewiesen werden soll, sowie von den Bedingungen des Testsansatzes. Vorzugsweise sind komplementäre Endabschnitte von etwa 6–9 Nucleotiden Länge ausreichend, um die Bildung einer stabilen Haarnadelstruktur zu bewirken, obwohl in Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen mehr oder weniger wünschenswert sind. Die Stabilität der Haarnadel-Sekundärstruktur der Sonde und die Stabilität des Hybridisierungs-Duplex aus Sonde und Zielsequenz können empirisch bestimmt werden.
Beispiel 1
Die Synthese von markierten Oligonucleotidsonden
Oligonucleotidsonden, die mit einem Fluorophor an einem Ende markiert sind, wurden mit einem ABI 394 DNA-Synthesegerät (Perkin Elmer ABD, Foster City, CA) in Mengen von etwa 1 Mikromol synthetisiert. Während der Oligonucleotidsynthese wurden die Amidite der Fluoreszenzmarkierung dazu verwendet, ein 5'-markiertes Oligonucleotid direkt zu erhalten. Dies machte die Modifizierung des Oligonucleotids nach der Synthese unnötig.
Der 5'-Terminus des Oligonucleotids wurde durch Anfügen eines Phosphoramidit-Derivats von Fluorescein (FAM^TM, Perkin Elmer ABD, Foster City, CA) synthetisiert. Das Phosphoramidit enthält ein Verbindungsstück, das die Markierung von dem Nucleotid trennt. Nach 4 Stunden Behandlung des Kontrollierten-Porenglases (CPG) mit Ammoniumhydroxid bei 55°C, um das markierte Oligonucleotid von dem CPG zu trennen, wurde das Oligonucleotid abfiltriert und in einem Luftstrom eingetrocknet, dann wurde es resuspendiert und filtriert und über Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Fraktionen, die das reine 5'-markierte Oligonucleotid enthielten, wurden dann bis zur Trockne eingedampft.
Beispiel 2
Die Auswirkung der Länge des Oligonucleotids auf die Fluoreszenzlöschung
Die Fluoreszenz von markierten Oligonucleotiden mit 2–34 Nucleotiden Länge wurde in Lösungen sowohl mit als auch ohne EtBr gemessen. Zusätzlich wurden Messungen der Fluoreszenz der freien Markierung für Vergleichszwecke vorgenommen.
Es wurden eine Reihe von Sonden synthetisiert, die am 5'-Ende mit FAM^TM markiert waren, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Nucleinsäuresequenzen der Sonden werden nachstehend in der Orientierung von 5' nach 3' gezeigt.
Die Oligonucleotide wurden in 400 μl Lösung gemessen, die den PCR-Reaktionspuffer (50 mM KCl, 10 mM Tris [pH 8,3] und 3 mM MgCl₂) sowie EtBr in einer Konzentration von 0,2 oder 4 μg/ml (0,5 oder 10 μM) enthielt. Das Oligonucleotid lag in einer Konzentration von 1 μM vor. Zum Nachweis der Fluoreszenz der FAM-Markierung wurde eine Wellenlänge des Anregungslichts von 495 Nanometer gewählt, und die Fluoreszenz wurde bei einer Wellenlänge von 518 Nanometer gemessen. Die Ablesungen erfolgten bei 20°C. Die Messungen, die bei einer EtBr-Konzentration von 4 μg/ml durchgeführt worden waren, wurden am nächsten Tag wiederholt, um die Reproduzierbarkeit der Messungen zu untersuchen.
Die Ergebnisse werden in 1 gezeigt. Es wird die Fluoreszenz der Sonde in Gegenwart von EtBr relativ zu der Fluoreszenz ohne EtBr gezeigt. Es wurde eine Abnahme der Fluoreszenz der freien Markierung in Gegenwart von EtBr von etwa 6% beobachtet. Die Abnahme der Fluoreszenz der Markierung, die an Oligonucleotide mit weniger als 6 Basen Länge gebunden war, war von der der freien Markierung nicht nachweisbar verschieden. Eine deutliche Fluoreszenzlöschung wurde erst bei Oligonucleotiden von mindestens 10 Nucleotiden Länge beobachtet.
Beispiel 3
Die Temperaturabhängigkeit der Fluoreszenzlöschung
Es wurden Experimente durchgeführt, um die Temperaturabhängigkeit der Fluoreszenzlöschung von EtBr durch mit Fluorescein markierte Oligonucleotidsonden zu bestimmen. Die Fluoreszenz von Lösungen der Sonde mit und ohne EtBr wurde gemessen, während die Sonden erhitzt und abgekühlt wurden.
Es wurden Lösungen hergestellt, die 0,5 μM, entweder von BW118 (SEQ ID Nr. 4) oder von SGW128 (SEQ ID Nr. 6) in dem Puffer enthielten, der im vorstehenden Beispiel 2 beschrieben wurde, sowohl mit als auch ohne 4 μg/ml EtBr. Es wurden ähnliche Lösungen hergestellt, die die ungebundene Fluorescein-Markierung enthielten. Lösungen, die nicht sofort verwendet wurden, wurden im Kühlschrank im Dunkeln aufbewahrt bis sie benötigt wurden. Um die Temperatur der Lösungen zu kontrollieren während die Fluoreszenz gemessen wurde, wurden ummantelte Küvetten verwendet, die an ein Heizwasserbad angeschlossen waren. Die Temperatur der Lösung wurde durch Umwälzen von Wasser aus dem Heizwasserbad durch die ummantelten Küvetten eingestellt. Die Temperatur des umgewälzten Wassers wurde nahe der ummantelten Küvette gemessen, um die Temperatur der in Messung befindlichen Lösung genau zu bestimmen. Um die Verdunstung zu verhindern, wurde über die Probe Mineralöl geschichtet. Die Lösung wurde dem Anregungslicht nur während der Messung ausgesetzt, um ein Ausbleichen durch Licht zu verhindern. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen wurden wie vorstehend beschrieben ausgewählt.
Die Messungen wurden durchgeführt, während die Lösungen sowohl erhitzt als auch gekühlt wurden. Wenn bei einer einzigen bestimmten Temperatur zwei Messungen durchgeführt wurden, d. h. eine während des Erhitzens und eine während des Abkühlens, wurde der Mittelwert der erhaltenen Werte gebildet. Die Daten werden in 2 gezeigt. Jeder Wert wird relativ zu dem entsprechenden Wert normalisiert, der mit der ungelöschten Lösung (ohne EtBr) erhalten wurde.
Bei allen Temperaturen wurde eine deutliche Fluoreszenzlöschung der markierten Oligonucleotidsonden beobachtet. Eine deutliche Zunahme der Menge der Fluoreszenzlöschung wurde unter 40 °C beobachtet, wobei die Menge der Fluoreszenzlöschung mit abnehmender Temperatur über den beobachteten Temperaturbereich zunahm. Obwohl sogar eine noch stärkere Fluoreszenzlöschung unter Zimmertemperatur beobachtet wurde, ist es aus Gründen der Bequemlichkeit wünschenswert, die Fluoreszenz bei 20°C zu messen.
Beispiel 4
Die Freisetzung der PCR-Sonden-Markierung
Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung von EtBr um die Fluoreszenz der ungespaltenen, markierten Sonden in einem PCR-Reaktionsgemisch zu löschen. Eine PCR-Amplifikationsreaktion wurde in Gegenwart einer mit FAM markierten Sonde durchgeführt, die am 3'-Ende modifiziert worden war, um die Synthese eines Verlängerungsprodukts zu verhindern. Die Exonuclease-Aktivität der DNA-Polymerase spaltete die Sonde, die an die Zielsequenz stromabwärts des Primers hybridisiert war, wodurch ein kleines markiertes Oligonucleotidfragment der Sonde freigesetzt wurde. Die Zunahme der Fluoreszenz der Markierung, die an die abgespaltenen Fragmente gebunden war, wurde nachgewiesen, was die Amplifikation der Zielsequenz anzeigte.
Die Amplifikationen wurden in Gegenwart einer der beiden nachstehend gezeigten mit FAM markierten Sonden durchgeführt. Die Nucleinsäuresequenzen der Sonden werden in 5' nach 3'-Orientierung gezeigt. Die Sonden wurden wie vorstehend beschrieben mit FAM am 5'-Ende gebunden synthetisiert. Jede Sonde wurde so synthetisiert, dass sie ein 3'-PO₄ anstelle eines 3'-OH besaß, so dass eine Verlängerung durch die Taq-Polymerase blockiert wurde.
Amplifikation
Der amplifizierte Abschnitt war ein 142 Basenpaare langes Produkt aus dem gag-Bereich von HIV, das durch die Primer SK431 und SK145 begrenzt wurde, die durch Hoffmann-La Roche hergestellt und durch Perkin Elmer (Norwalk, CT) vertrieben werden. Die Amplifikationen wurden mit einem Plasmid durchgeführt, das ein cloniertes Fragment des HIV-gag-Gens enthielt.
Für jede der beiden Sonden wurden zwei Replika-Amplifikationen in 150 μl Reaktionsvolumen durchgeführt, das die folgenden Reagenzien enthielten:
3 × 10⁸ Kopien der Zielsequenz
50 mM KCl
10 mM Tris-HCl, pH 8,3
3 mM MgCl₂
75 pM jedes Primers
50 μM jedes der vier Desoxyribonucleosid-Triphosphate
3,75 Einheiten Taq-Polymerase (entwickelt und hergestellt durch Hoffmann-La Roche und vertrieben durch Perkin Elmer, Norwalk, CT)
0,5 μM Sonde
4 μg/ml EtBr (10 μM)
Für jedes Reaktionsgemisch, das den Bedingungen des PCR-Thermal-Zyklisierens unterworfen wurde, wurden zwei zusätzliche Reaktionsgemische, eines mit EtBr und eines ohne EtBr hergestellt und zur Verwendung als Meßkontrollen aufbewahrt (keine Temperatur-Zyklisierung). Die Reaktionsgemische wurden dem folgenden Amplifikationsschema in einem GeneAmp 9600 Thermal-Zyklisiergerät (Perkin Elmer, Norwalk, CT) unterworfen: 35 Zyklen, von denen jeder aus einem Denaturierungs-Schritt (95°C, 15 Sekunden), gefolgt von einem Anlagerungs/Verlängerungs-Schritt (55°C, 30 Sekunden) bestand, sowie eine abschließende Inkubation (72°C, 10 Minuten), um die vollständige Verlängerung der Produkte sicherzustellen. Nach der Amplifikation wurden die Reaktionen bei 4°C aufbewahrt, bis sie analysiert wurden.
Analyse
Um zu bestätigen, dass die Amplifikation stattgefunden hatte, wurde das Amplifikationsprodukt durch Agarose-Gelelektrophorese untersucht. Der Abbau der Sonde wurde wie nachstehend beschrieben untersucht.
A. Analyse des Abbaus der Sonde durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Nach der Amplifikation wurden 5 μl der Amplifikationsreaktion mit Formamid auf eine Sondenkonzentration von 10 pMol/μl verdünnt. Dann wurden 5 μl (50 pMol Sonde pro Bahn) der verdünnten Amplifikationsreaktion in eine rechteckige Probenvertiefung eines 0,4 mm dicken, 7 M Harnstoff enthaltenden, 10%-igen Polyacrylamidgels geladen und auf einem ABI 373A-DNA-Sequenziergerät (Perkin Elmer, Norwalk, CT) 6 Stunden bei 1500 V, 20 W, 20 mA (Sequenzierungslauf mit maximaler Auftrennung) elektrophoretisch aufgetrennt. Die Daten wurden unter Verwendung des 373A-DNA-Sequenzier-Daten-Aufzeichnungs-Programms (Perkin Elmer, Norwalk, CT) gesammelt.
Die gesammelten Daten wurden unter Verwendung des 362-Gene-Scanner^TM-Daten-Analyse-Programms (v.1.2d1) (Perkin Elmer, Norwalk, CT) untersucht. Der Anteil der gespaltenen Sonde wurde durch den Vergleich der Summen der Peakflächen, die der freigesetzten Sonde entsprachen, und der Summe der Peakflächen der gesamten Bahn abgeschätzt. Die Gesamtmenge der freigesetzten Sonde wurde als abgeschätzter Anteil der Gesamtmenge der Sonde berechnet, die in das Reaktionsgemisch eingesetzt worden war.
Der Grad des Abbaus der Sonde, der durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt wurde, wird nachstehend gezeigt. Es werden die berechneten Werte für jede der beiden Replika-Reaktionen gezeigt.
B. Analyse durch Fluoreszenzmessung unter Verwendung eines Spektrofluorimeters
50 μl jeder PCR und jeder PCR-Kontrolle (nicht zyklisiertes Reaktionsgemisch) wurden mit 350 μl TE (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) verdünnt. Die Fluoreszenz jeder Probe wurde bei 20 °C in einem Hitachi/Perkin Elmer Model 650-40 Fluoreszenz-Spektrofluorimeter (vergleiche Beispiel 2) bei einer Anregungswellenlänge von 494 nm und einer Emissionswellenlänge von 522 nm gemessen. Es wurden auch Ablesungen unter Verwendung des CytoFluor^TM 2300-Geräts (vorstehend beschrieben) mit einem 485 nm-Anregungsfilter (20 nm Bandbreite) und einem 530 nm-Emissionsfilter (25 nm Bandbreite) vorgenommen.
Der Anteil der abgebauten Sonde kann durch die Division der Veränderung der Fluoreszenz, die während der Reaktion auftritt, durch die maximal mögliche Fluoreszenzveränderung, d. h. die Veränderung der Fluoreszenz, die auftreten würde, wenn die Sonde vollständig abgebaut worden wäre, berechnet werden. Die Fluoreszenzveränderung, die während der Reaktion auftritt, wird als Differenz der Fluoreszenz zwischen den zyklisierten und den nicht zyklisierten Proben gemessen, beides in Gegenwart von EtBr, was der Messung des Reaktionsgemisches vor und nach der Thermozyklisierung durch die PCR gleichwertig ist. Es wurde keine direkte Messung der maximal möglichen Fluoreszenzveränderung vorgenommen. Stattdessen wurde die maximal mögliche Fluoreszenzveränderung als Differenz zwischen einer Abschätzung der Fluoreszenz der vollständig abgebauten Sonde in Gegenwart von EtBr und der Fluoreszenz der nicht zyklisierten Probe mit EtBr abgeschätzt. Die Abschätzung der Fluoreszenz der vollständig abgebauten Sonde in Gegenwart von EtBr wurde wie nachstehend beschrieben erhalten.
Die Fluoreszenz der nicht zyklisierten Probe ohne EtBr multipliziert mit 0,94 wurde dazu verwendet, die Fluoreszenz einer Probe in Gegenwart von EtBr anzunähern, bei der die gesamte Sonde abgebaut worden wäre. Ohne EtBr wird die Fluoreszenz der Sonde weniger durch die Länge des Oligonucleotids beeinflußt. Daher ist die Fluoreszenz einer Probe, die nicht abgebaute (Volllänge) Sonden enthält, annähernd die Gleiche, wie die Fluoreszenz einer Probe, die vollständig abgebaute (kurze) Sonden enthält. Daher ist die Fluoreszenz der nicht amplifizierten Probe ohne EtBr annähernd die Gleiche, wie die Fluoreszenz einer Probe, die vollständig abgebaute Fragmente ohne EtBr enthält. Die Fluoreszenz einer Probe die vollständig abgebaute Fragmente enthält, mit EtBr, wird nach Berücksichtigung der restlichen Fluoreszenzlöschung der vollständig abgebauten Sonde durch EtBr erhalten. Wie 1 zeigt, beträgt die restliche Fluoreszenzlöschung der vollständig abgebauten Sondenfragmente durch EtBr annähernd 6%. Daher liefert die Multiplikation der Fluoreszenz der nicht zyklisierten Probe ohne EtBr mit dem Faktor 0,94 eine Abschätzung der Fluoreszenz der Probe, die die vollständig abgebaute Sonde in Gegenwart von EtBr enthält. Die Subtraktion der Fluoreszenz der nicht zyklisierten Probe mit EtBr liefert die gewünschte Abschätzung der maximal möglichen Fluoreszenzveränderung.
Die vorstehende Annäherung nimmt an, dass der Unterschied der Fluoreszenz zwischen langen und kurzen Sonden in Lösung ohne EtBr ignoriert werden kann. In der Praxis hängt die Fluoreszenz einer Markierung in gewissem Grad sowohl von der Länge als auch von der Sequenz des angehängten Oligonucleotids ab, sogar bei Abwesenheit von EtBr. Da diese Abhängigkeit nicht vorhersagbar ist, wird bevorzugt, die maximal mögliche Fluoreszenzveränderung direkt zu messen. Dies wird durch die Herstellung eines weiteren Reaktionsgemisches und der Zugabe einer DNA-Nuclease zu dem Reaktionsgemisch durchgeführt, welche die Sonde vollständig abbaut. Die maximale Fluoreszenzveränderung wird als Differenz zwischen der Fluoreszenz des Reaktionsgemisches vor und nach dem Abbau der Sonde berechnet.
Der Grad des Abbaus der Sonde, wie er aus der Fluoreszenzveränderung berechnet wurde, die unter Verwendung eines Spektrofluorimeters gemessen wurde, wird nachstehend gezeigt. Es werden die berechneten Werte für jede der beiden Replika-Reaktionen gezeigt. Die Werte werden unter Verwendung der Annäherung der vorstehend beschriebenen maximalen Fluoreszenzveränderung berechnet.
Der Grad des Abbaus der Sonde, wie er aus der Fluoreszenzveränderung berechnet wurde, die mit dem CytoFluor^TM 2300-Mikroplatten-Lesegerät gemessen wurde, wird nachstehend gezeigt. Es werden die für jede der beiden Replika-Reaktionen berechneten Werte gezeigt. Die Werte werden unter Verwendung der Annäherung der vorstehend beschriebenen maximalen Fluoreszenzveränderung berechnet.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Fluoreszenzveränderung ausreichte, um den Abbaus der Sonde nachzuweisen.
Beispiel 5
Die Verbesserung der Fluoreszenzlöschung durch die Sekundärstruktur der Sonde
Die Anwesenheit von Sekundärstrukturen in einer einzelsträngigen Oligonucleotidsonde kann die Fluoreszenzlöschung durch einen interkalierenden DNAbindenden Quencher durch die Bereitstellung von Abschnitten doppelsträngiger DNA verbessern, in die der Quencher interkalieren kann. Dies wurde durch den Vergleich der Fluoreszenzlöschung von Sonden gezeigt, die sich darin unterschieden, dass eine Sonde erwartungsgemäß eine Haarnadelstruktur bildet, wenn sie an die Zielsequenz nicht hybridisiert ist.
Die Experimente wurden im Wesentlichen wie im vorstehenden Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Temperatur und die Fluoreszenz kontinuierlich gemessen wurden. Es wurden drei Oligonucleotide, von denen zwei Haarnadel-Sekundärstrukturen bilden, im Wesentlichen wie im vorstehenden Beispiel 1 beschrieben synthetisiert. Diese Sequenzen und die Markierungsstellen werden nachstehend gezeigt.
SGW140 (SEQ ID Nr: 9) (Haarnadel)
FAM^TM-CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGACTATG
SGW146 (SEQ ID Nr: 10) (Haarnadel)
FAM^TM-CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGACTANG
ST50FLC (SEQ ID Nr: 11)
FAM^TM-CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGT
N stellt hier einen modifizierten Thymidin-Rest dar, an den TAMRA gebunden ist.
SGW140 (SEQ ID Nr. 9) und SGW146 (SEQ ID Nr. 10) besitzen zu sich selbst komplementäre Endabschnitte, die miteinander hybridisieren können und eine Haarnadel-Sekundärstruktur bilden. SGW146 (SEQ ID Nr. 10) besitzt zusätzlich eine zweite fluoreszenzlöschende Verbindung (TAMRA^TM), die nahe des 3'-Endes gebunden ist. Die Bildung einer Haarnadelstruktur bringt FAM^TM und TAMRA^TM in enge Nachbarschaft und löscht daher die Fluoreszenz. Bei diesem Oligonucleotid wurde die kombinierte Fluoreszenzlöschung von FAM^TM sowohl durch TAMRA^TM als auch durch EtBr gemessen.
Die Messungen wurden wie vorstehend beschrieben unter Verwendung einer ummantelten Quarzküvette in einem Hitachi/Perkin Elmer-Modell 650-40 Fluoreszenz-Spektrofluorimeter durchgeführt. Die Anregungs- und Emissions-Monochromatoren wurden auf 495, beziehungsweise 522 nm eingestellt. Die Spaltbreiten der Monochromatoren wurden auf 3, beziehungsweise 7 nm eingestellt. Die Messungen wurden unter Verwendung von 400 μl-Lösungen, die 0,5 μM markiertes Oligonucleotid mit und ohne 4 μg/ml EtBr enthielten, in PCR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris [pH 8,3], 3 mM MgCl₂) durchgeführt. Die Lösungen wurden im Kühlschrank im Dunkeln aufbewahrt, bis sie benötigt wurden.
Jede Probe wurde in die ummantelte Küvette des Spektrofluorimeters gestellt, und es wurde Mineralöl über die Probe geschichtet, um die Verdunstung zu verhindern. Die Temperatur der Lösung wurde zwischen etwa 20 und 95°C um 1°C pro Minute erhöht und erniedrigt.
Die Fluoreszenzmessungen, die auf die Fluoreszenz der linearen Sonde ohne EtBr normalisiert wurden, werden in 3 gezeigt. Es werden die Messungen gezeigt, die sowohl während der Erhöhung als auch während der Absenkung der Temperatur aufgezeichnet wurden. Die mittleren Schmelzpunkte, die der Temperatur entsprechen, bei der die größte Fluoreszenzveränderung beobachtet wurde, sind ebenfalls angegeben.
Es wurde beobachtet, dass EtBr den doppelsträngigen Bereich einer Haarnadelsonde stabilisiert und dadurch die Schmelztemperatur erhöht. Dies kann in 3 durch den Vergleich der Verschiebung der mittleren Schmelztemperatur beobachtet werden, die bei der Zugabe von EtBr auftrat. Es wurde beobachtet, dass die Anwesenheit einer Haarnadelstruktur die Fluoreszenzlöschung durch EtBr verbessert.
Beispiel 6
Die Verbesserung der Fluoreszenzlöschung durch eine mehrfach markierte Sonde
Eine alternative Sonde zur Verwendung bei den Verfahren, die im vorstehenden Beispiel 4 beschrieben wurden, enthält eine zweite Markierung, die als Quencher wirkt, und die an das Sonden-Oligonucleotid nur wenige Basen entfernt von der 5'-terminalen Fluoreszenzmarkierung gebunden ist. Die Fluoreszenzmarkierung der nicht gespaltenen Sonde wird durch diese zweite angeheftete Markierung über Fluoreszenz-Energieübertragung gelöscht. Der Abbau der Sonde, der während der Verlängerung des Primers stattfindet, trennt die Markierung und den Quencher und erhöht dadurch das nachweisbare Signal. Die Verwendung einer solchen Sonde wird im U.S.-Patent-Nr. 5,210,015 beschrieben. Die vorliegenden Verfahren der Fluoreszenzlöschung nicht gespaltener Sonden kann in Verbindung mit doppelt markierten Sonden dazu verwendet werden, (die Fluoreszenz) der ungespaltenen Sonde weiter zu löschen, und dadurch die Veränderung des Signals, das durch den Abbau der Sonde entsteht, zu erhöhen.
Um die zusätzliche Fluoreszenzlöschung aufzuzeigen, die durch die Kombination der Quencher bereitgestellt wird, wurde die Fluoreszenzlöschung durch EtBr von Sonden, die mit FAM^TM am 5'-Ende markiert waren, mit der Fluoreszenzlöschung durch EtBr von Sonden verglichen, die sowohl mit FAM^TM als auch mit Malachitgrün (MG) markiert waren. Die Sonden wurden entweder mit einer einzelnen FAM^TM-Markierung, die an das 5'-Ende angeheftet wurde, oder mit einer zusätzlichen MG-Markierung, die 3 Basen entfernt von der FAM^TM-Markierung angeheftet wurde, synthetisiert. Beide Sonden wurden mit der nachstehend gezeigten Sequenz synthetisiert.
SGW55 (SEQ ID Nr. 12)
FAM^TM-CCANCAATGAGGAAGCTGCAAGAATGGGATAGAG.
N stellt hier einen modifizierten Thymidin-Rest dar, an den Malachitgrün gebunden werden kann.
Die Fluoreszenzmessungen wurden im Wesentlichen wie im vorstehenden Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse werden nachstehend gezeigt.
Die Fluoreszenzlöschung entweder durch EtBr oder durch die zusätzliche Markierung im PCR-Reaktionsgemisch reicht aus, um eine nachweisbare Veränderung im Signal zu bewirken. Die Kombination von Fluoreszenzlöschungsverfahren liefert eine deutliche Erhöhung der Löschungswirksamkeit, was eine Unterscheidung zwischen der gespaltenen und der ungespaltenen Sonde mit höherer Empfindlichkeit erlaubt. Die Verwendung einer mehrfach markierten Sonde, wie hierin vorstehend in den in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren beschrieben wurde, würde die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen der gespaltenen und der ungespaltenen Sonde weiter steigern.
Beispiel 7
Die Fluoreszenzlöschung durch andere DNA-bindende Chromophore
Die Auswahl weiterer geeigneter DNA-bindender Chromophore zur Löschung fluoreszenzmarkierter Sonden in Lösung wurde unter Verwendung der folgenden Reihe fluoreszierender DNA-bindender Chromophore aufgezeigt: PO-PRO-1, BO-PRO-1 YO-PRO- 1 und TO-PRO-1. Diese Verbindungen sind miteinander verwandte monomere Cyanin-Nucleinsäure-Farbstoffe, die von Molecular Probes (Eugene, OR) kommerziell erhältlich sind. Die Anregungs- und Emissionsmaxima jeder dieser Verbindungen, gemessen in Nanometer, wird nachstehend angegeben. Die Anregungs- und Emissionsmaxima der Fluorescein-Markierung wird zum Vergleich gezeigt.
Anregungs- und Emissionsmaxima
Es wird erwartet, dass eine maximale Wechselwirkung zwischen einer Fluorescein-Markierung und einer DNA-bindenden Verbindung auftritt, wenn das Emissionsmaximum von Fluorescein (516 nm) möglichst gut mit dem Anregungsmaximum der DNA-bindenden Verbindung übereinstimmt. Daher wurde erwartet, dass TO-PRO-1 die höchste Fluoreszenzlöschung einer Fluorescein-Markierung bewirkt, und von PO-PRO-1 wurde erwartet, dass es die geringste Fluoreszenzlöschung bewirkt.
Oligonucleotide mit 33 und 2 Nucleotiden Länge wurden wie vorstehend beschrieben synthetisiert. Die Sequenzen der beiden Oligonucleotide werden nachstehend in 5' nach 3'-Orientierung gezeigt. Das 2 Nucleotide lange Oligonucleotid entspricht einer abgebauten Form des Volllänge-Oligonucleotids.
Die Fluoreszenz der markierten Oligonucleotide in Lösung mit und ohne die vorstehenden DNA-bindenden Verbindungen wurde im Wesentlichen wie im vorstehenden Beispiel 2 unter Verwendung des PTI LS-100-Lumineszenz-Spektrophotometers (Photon Technology International, London, Ontario, Canada) gemessen. Die Messungen wurden in 400 μl-Lösungen durchgeführt, die 0,5 μM Oligonucleotid, 1 × PCR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris [pH 8,3] und 3 mM MgCl₂) sowie 5 μM einer der beiden DNA-bindenden Verbindungen enthielten oder nicht. Der Grad der Fluoreszenzlöschung für jedes Oligonucleotid und jede DNA-bindende Verbindung, ausgedrückt in Prozent des ungelöschten Signals, wird nachstehend gezeigt.
Fluoreszenzlöschung
Die vorliegenden Verfahren basieren auf der unterschiedlichen Fluoreszenzlöschung langer und kurzer Oligonucleotide. Wie aus dem Vergleich der Emissions- und der Anregungsmaxima erwartet wurde, wurde beobachtet, dass die Fluoreszenzlöschung von Fluoreszein durch TO-PRO-1 am größten war, und die Fluoreszenzlöschung von Fluoreszein durch PO-PRO-1 war am geringsten. TO-PRO-1 zeigte auch die am stärksten verminderte Fluoreszenzlöschung des markierten 2 Nucleotide langen Fragments. Der mehr als 3-fache Unterschied in der Fluoreszenzlöschung (von ~96% bis zu ~30%) reicht aus, um den empfindlichen Nachweis der Spaltung des Oligonucleotids in einer Reaktion unter Verwendung der vorliegenden Verfahren zu ermöglichen.
Die Ergebnisse legen nahe, dass es sich bei dem vorherrschenden Mechanismus der Fluoreszenzlöschung um FET handelt, und dass andere geeignete Markierungs/Quencher-Paare durch einen Vergleich des Emissionsmaximums der Markierung und des Anregungsmaximums des Quenchers vorhersagbar ausgewählt werden können. Nach der Auswahl kann die optimale Konzentration des Quenchers, die den Unterschied zwischen der Fluoreszenzlöschung von langen und kurzen markierten Oligonucleotiden maximiert, durch routinemäßige Durchmusterung wie nachstehend beschrieben bestimmt werden.
Die optimale Konzentration an TP-PRO-1 zur Verwendung in den vorliegenden Verfahren wurde wie folgt bestimmt. Die Fluoreszenzlöschung jeder der vorstehenden Sonden wurde in Lösungen gemessen, die TO-PRO-1 in Konzentrationen von 0 bis 10 μM enthielten. Die Messungen wurden im Wesentlichen wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse werden nachstehend gezeigt.
Restfluoreszenz
Die gezeigten Daten wurden nicht um die Absorption von TO-PRO-1 bei der Anregungs- und Emissionswellenlänge von Fluorescein korrigiert. Die deutliche Fluoreszenzlöschung der kurzen Oligonucleotide bei hohen Konzentrationen an TO-PRO-1 ist auf die optische Dichte von TO-PRO-1 und nicht auf die Fluoreszenzlöschung von Fluorescein zurückzuführen. Eine TO-PRO-1-Konzentrationen von 5,0 μM ergibt den größten Unterschied in der Fluoreszenzlöschung zwischen der Volllänge- und der abgebauten Sonde.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Modifizieren der Lichtemission eines einzelsträngigen Oligonucleotids, das mit einer lichtemittierenden Markierung markiert ist, in Lösung, umfassend das Einbringen eines DNA-bindenden Chromophors in die Lösung, wobei das DNA-bindende Chromophor mit der Markierung in Wechselwirkung tritt, um die Lichtemission der Markierung zu modifizieren, und wobei das einzelsträngige Oligonucleotid nicht an seinen komplementären Strang hybridisiert ist.
Verfahren zum Nachweis des Abbaus durch Spaltung eines einzelsträngigen Oligonucleotids, das mit einer lichtemittierenden Markierung markiert ist, wobei die Spaltung durch eine Reaktion katalysiert wird, und wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen eines Reaktionsgemisches, das zur Ausführung der Reaktion geeignet ist, wobei das Reaktionsgemisch das Oligonucleotid und ein DNA-bindendes Chromophor umfasst, wobei das DNAbindende Chromophor in der Lage ist, mit der Markierung in Wechselwirkung zu treten, um die Lichtemission der Markierung zu modifizieren; (b) Messen der Lichtemission des Oligonucleotids in dem Reaktionsgemisch; (c) Ausführen der Reaktion unter Bedingungen, die die Spaltung des Oligonucleotids zur Folge haben; (d) Messen der Lichtemission des Oligonucleotids in dem Reaktionsgemisch; (e) Nachweisen der Spaltung des Oligonucleotids durch den Unterschied zwischen der Lichtemission, die in Schritt (b) und (d) gemessen wurde.
Verfahren zum Nachweis einer Zielnucleinsäure in einer Probe, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen eines Reaktionsgemisches für eine Reaktion, wobei das Reaktionsgemisch die Probe, ein DNA-bindendes Chromophor und eine einzelsträngige Oligonucleotidsonde umfasst, die mit einer lichtemittierenden Markierung markiert ist, wobei die Sonde eine Sequenz enthält, die in der Lage ist, mit der Zielnucleinsäure zu hybridisieren, und wobei das DNA-bindende Chromophor in der Lage ist, die Lichtemission der Markierung zu modifizieren, und wobei die Reaktion die Spaltung des Oligonucleotids nur katalysiert, wenn das Oligonucleotid an die Zielnucleinsäure hybridisiert ist; (b) Messen der Lichtemission des Oligonucleotids im Reaktionsgemisch; (c) Behandeln des Gemisches unter Bedingungen, unter denen die Oligonucleotidsonde mit der Zielsequenz hybridisiert und gespalten wird; (d) Messen der Lichtemission des Oligonucleotids im Reaktionsgemisch; und (e) Bestimmen, ob die Zielsequenz anwesend ist, durch den Unterschied zwischen der Lichtemission, die in Schritt (b) und Schritt (d) gemessen wurde.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Zielsequenz vor Schritt (c) amplifiziert wird.
Verfahren zum Nachweisen einer Ziel-Nucleinsäuresequenz in einer Probe unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion (PCR), wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen eines PCR-Reaktionsgemisches, das die Probe, ein Oligonucleotid-Primen-Paar, eine Nucleinsäure-Polymerase, die 5'-nach 3'-Nucleaseaktivität hat, ein DNA-bindendes Chromophor und eine Oligonucleotidsonde umfasst, die in der Lage ist, an einen Abschnitt der Zielnucleinsäure zu hybridisieren, wobei die Oligonucleotidsonde innerhalb der Zielnucleinsäuresequenz begrenzt durch die Oligonucleotid-Primen hybridisiert, und wobei die Oligonucleotidsonde mit einer lichtemittierenden Markierung markiert ist, und wobei das DNA-bindende Chromophor in der Lage ist, die Lichtemission der Markierung zu modifizieren; (b) Messen der Lichtemission der Markierung in dem Reaktionsgemisch; (c) Behandeln des PCR-Reaktionsgemisches unter PCR-Bedingungen, wobei die 5'- nach 3'-Nucleaseaktivität der Nucleinsäure-Polymerase Sonden spaltet, die an die Zielsequenz hybridisiert sind; (d) Messen der Lichtemission der Markierung in dem Reaktionsgemisch; (e) Bestimmen, ob die Zielsequenz anwesend ist, durch den Unterschied zwischen der Lichtemission, die in Schritt (b) und der Lichtemission, die in Schritt (d) gemessen wurde.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das DNA-bindende Chromophor ein DNA-Interkalator ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Markierung ein Fluorescein-Derivat ist, und das DNA-bindende Chromophor Ethidiumbromid ist.