JP2008180677A - マイクロチップ検査システム、マイクロチップ検査装置及びプログラム - Google Patents

Abstract

【課題】反応前後での蛍光強度の変化分を正確に測定し、精度良い検出を行うことのできるマイクロチップ検査システムを提供する。
【解決手段】標的物質と蛍光標識された標的物質に特異的に結合する試薬とを含み、標的物質と前記試薬との反応が行われ、被検出部において蛍光強度の検出が行われるマイクロチップと、マイクロチップを収容可能なマイクロチップ収容部と、収容されたマイクロチップの被検出部に対応して設けられ、被検出部に励起光を照射する発光部と被検出部からの蛍光を受光する受光部とを有する光検出部と、を有するマイクロチップ検査システムにおいて、反応を開始させる反応開始手段と、反応開始手段の反応開始タイミング及び光検出部による反応前及び反応後の蛍光強度の検出タイミングを制御する制御部と、を有し、制御部は、光検出部による反応前の蛍光強度の検出タイミングと、反応開始手段による反応開始タイミングとを対応付ける。
【選択図】図５

Description

本発明は、マイクロチップ検査システム、マイクロチップ検査装置及びプログラムに関する。

近年、微細流路が集積加工されたマイクロチップ上において、複数の溶液を混合して反応させ、当該反応の状態を検出して分析を行うマイクロ総合分析システム（Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ；μＴＡＳ）が注目されている。

μＴＡＳでは、試料の量が少ない、反応時間が短い、廃棄物が少ない等のメリットがある。医療分野に使用した場合、検体（血液、尿、拭い液等）の量を少なくすることで患者への負担を軽減でき、試薬の量を少なくすることで検査のコストを下げることができる。また、検体、試薬の量が少ないことから、反応時間が大幅に短縮され、検査の効率化が図れる。さらに、装置が小型であるため小さな医療機関にも設置することができ、場所を選ばず迅速に検査を行うことができる。

マイクロチップ検査システムでは、マイクロポンプ等からマイクロチップに駆動液を供給することにより、マイクロチップ内に収容されている検体及び試薬が流路に沿って送液される。これにより、検体及び試薬は、流路内で混合され反応を生じる。反応液はマイクロチップ内の被検出部に送液され、被検出部において反応液内の標的物質の濃度等の検出が行われる。

例えば、特許文献１には、微細流路が集積加工されたマイクロチップを用いる標的遺伝子の検出例が記載されている。まず、マイクロチップの被検出部には、標的遺伝子をトラップする物質が予め固定化されている。次に、標的遺伝子の増幅に用いる試薬と検体とを反応させて増幅産物を生成する。これにより、検体に標的遺伝子が含まれていれば、増幅産物内に増幅された標的遺伝子が存在することになる。次に、増幅された標的遺伝子を一本鎖に変性する。これを被検出部に供給することで、被検出部に固定化されている標的遺伝子をトラップする物質に標的遺伝子をトラップさせる。次に、当該一本鎖の標的遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡプローブを被検出部に供給し、ハイブリダイゼーション反応により標的遺伝子とＤＮＡプローブとを結合させる。ＤＮＡプローブは予め蛍光標識されている。次に、トラップされた標的遺伝子に結合しているＤＮＡプローブに結合する金コロイド液を被検出部に供給し、金コロイドをＤＮＡプローブに結合させる。次に、結合していない金コロイドを被検出部から除去するため、被検出部に洗浄液を供給する。そして、被検出部の金コロイドの濃度を光学的に検出することにより、標的遺伝子の検出を行っている。

また、特許文献２には、バイオチップ内の標的遺伝子の検出において、蛍光標識された標的遺伝子とＤＮＡプローブとがハイブリダイズした処理液に励起光を照射し、処理液から発せられる蛍光の蛍光強度を検出することが記載されている。

また、特許文献３には、標的遺伝子の検出を高感度に行うことができる技術としてサイクリングプローブ法が記載されている。標的遺伝子を鋳型にしてＤＮＡプローブの標的遺伝子へのハイブリダイズ、遊離をサイクル的に繰り返すことにより、少数の標的遺伝子に対して多数の蛍光標識を生成することができる方法である。

サイクリングプローブ法では、蛍光共鳴エネルギー移動を利用した蛍光色素によりＤＮＡプローブの標識化がなされている。当該ＤＮＡプローブは、通常状態ではドナーである蛍光物質とアクセプタであるクエンチャとが対になって存在しており、励起光が照射されても蛍光物質から発せられた蛍光はクエンチャにより吸収され、ドナーの蛍光は発生しない。当該ＤＮＡプローブが標的遺伝子とハイブリダイゼーション反応を起こした状態では、蛍光物質とクエンチャとの結合が切断され、蛍光物質の蛍光が外部に発せられるようになる。蛍光物質とクエンチャとの結合が切断されると、当該ＤＮＡプローブは標的遺伝子から遊離する。そして、フリーになった標的遺伝子に通常状態のＤＮＡプローブが再びハイブリダイゼーション反応により結合する。このように、ハイブリダイゼーション反応が繰り返されることにより、クエンチャの切断されたＤＮＡプローブが増幅され、反応の進行に伴い、強い蛍光強度が得られる。
国際公開第２００５／１０８５７１号パンフレット 特開２００１−２５５３２８号公報 特表２００３−５１７５９１号公報

特許文献２のように蛍光強度により検出を行う場合、精度良い検出を行うためには、ハイブリダイゼーション反応前の蛍光強度を測定し、反応後の蛍光強度を補正する必要が生じる。

特に、サイクリングプローブ法を用いる場合には、ハイブリダイゼーション反応前において、蛍光物質からの蛍光はクエンチャにより吸収されるはずであるが、現実にはクエンチャに吸収されなかった蛍光物質からの蛍光が微弱な蛍光となって現れている。このため、反応前の蛍光強度を測定し反応後の蛍光強度を補正することには大きな意義がある。

本発明は、このような要請に基づいてなされたものであり、反応前後での蛍光強度の変化分を正確に測定し、精度良い検出を行うことのできるマイクロチップ検査システム、マイクロチップ検査装置及びプログラムを提供することを目的としている。

本発明のマイクロチップ検査システムは、少なくとも標的物質と前記標的物質に特異的に結合する蛍光標識された試薬とを含み、前記標的物質と前記試薬との反応が行われ、被検出部において蛍光強度の検出が行われるマイクロチップと、前記マイクロチップを収容可能なマイクロチップ収容部と、前記マイクロチップ収容部に収容されたマイクロチップの被検出部に対応して設けられ、前記被検出部に励起光を照射する発光部と前記被検出部からの蛍光を受光する受光部とを有する光検出部と、を有するマイクロチップ検査システムにおいて、前記反応を開始させる反応開始手段と、前記反応開始手段の反応開始タイミング及び前記光検出部による反応前及び反応後の蛍光強度の検出タイミングを制御する制御部と、を有し、前記制御部は、前記光検出部による反応前の蛍光強度の検出タイミングと、前記反応開始手段による前記反応開始タイミングとを対応付けることを特徴としている。

本発明のマイクロチップ検査装置は、少なくとも標的物質と蛍光標識された前記標的物質に特異的に結合する試薬とを含み、前記標的物質と前記試薬との反応が行われ、被検出部において蛍光強度の検出が行われるマイクロチップ、を収容可能なマイクロチップ収容部と、前記マイクロチップ収容部に収容されたマイクロチップの被検出部に対応して設けられ、前記被検出部に励起光を照射する発光部と前記被検出部からの蛍光を受光する受光部とを有する光検出部と、を有するマイクロチップ検査装置において、前記反応を開始させる反応開始手段と、前記反応開始手段の反応開始タイミング及び前記光検出部による反応前及び反応後の蛍光強度の検出タイミングを制御する制御部と、を有し、前記制御部は、前記光検出部による反応前の蛍光強度の検出タイミングと、前記反応開始手段による前記反応開始タイミングとを対応付けることを特徴としている。

本発明のプログラムは、マイクロチップ収容部に収容されたマイクロチップの被検出部に少なくとも標的物質と蛍光標識された前記標的物質に特異的に結合する試薬とを収容させるステップと、反応開始手段により前記標的物質と前記試薬との反応を開始させるステップと、光検出部による反応前の蛍光強度の検出を行わせるステップと、光検出部による反応後の蛍光強度の検出を行わせるステップと、をコンピュータに実行させるプログラムであって、前記光検出部による反応前の蛍光強度の検出タイミングと、前記反応開始手段による反応開始タイミングとが対応付けられていることを特徴としている。

請求項１、１０、１１に記載の発明によれば、反応前の蛍光強度の検出タイミングと反応開始タイミングとを対応づけているので、反応前後での蛍光強度の変化分をマイクロチップ毎に正確にかつ効率よく測定することができる。

請求項２に記載の発明によれば、反応開始を加熱によって行うことで、反応前後での蛍光強度の変化分をマイクロチップ毎に正確にかつ効率よく測定することが容易になる。

請求項３に記載の発明によれば、反応前の蛍光強度の検出の所定時間経過後に加熱により反応を開始させるので、加熱による液の対流などに起因した混合や反応のバラツキの影響を排除でき、測定精度が向上する。

請求項４に記載の発明によれば、加熱開始と同時又は加熱開始から所定時間後に反応前の蛍光強度の検出を行うので、温度条件を近づけた状態で、反応前後での蛍光強度の変化分を求めることが可能となり、測定が正確に行えるようになる。

請求項５、７に記載の発明によれば、反応開始を標的物質又は及び試薬の送液によって行い、反応前の蛍光強度の検出タイミングと前記送液による標的物質と試薬との混合が完了する混合完了タイミングとを対応付けているので、温度依存性の無い反応であっても、反応前後での蛍光強度の変化分をマイクロチップ毎に正確にかつ効率よく測定することができる。

請求項６に記載の発明によれば、標的物質と前記試薬との混合が完了する混合完了時又は混合完了から所定時間後に反応前の蛍光強度の検出を行うので、被検出部に収容される反応前と反応後とで液量が同等になるので、反応前後での蛍光強度の変化分をより正確に検出することができる。

請求項８に記載の発明によれば、最終結果である検出値の補正まで行うので検査効率が向上する。

請求項９に記載の発明によれば、標的遺伝子と蛍光標識したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションにより蛍光共鳴エネルギー遷移現象に変化を生じる反応における系に適用するので、非常に意義が大きい。

以下、図面に基づいて本実施形態について説明するが、一例であり、本実施形態に限定するものではない。

ここで、「マイクロチップ」と「検査システム」とは、ＤＮＡ，ＲＮＡなど核酸やタンパク質などのバイオ分子の混合、分離、合成、抽出などの化学操作と生化学反応を小型のチップ内で行い、さらにその反応結果を検出する装置と組み合わせて成るシステムをいう。

（装置構成）
図１は、本実施形態に係るマイクロチップを用いる検査装置８０の外観図である。検査装置８０は、マイクロチップ１に予め注入された検体と試薬とを自動的に反応させ、反応結果を自動的に出力する装置である。

検査装置８０の筐体８２には、マイクロチップ１を装置内部に挿入するための挿入口８３、表示部８４、メモリカードスロット８５、プリント出力口８６、操作パネル８７、外部入出力端子８８が設けられている。

検査担当者は、図１の矢印方向にマイクロチップ１を挿入し、操作パネル８７を操作して検査を開始させる。開始操作に伴って、後述するように、検査装置８０内にあるマイクロチップ１内では蛍光反応が開始され、蛍光の検出結果に基づく検査結果が表示部８４に表示される。検査結果は操作パネル８７の操作により、プリント出力口８６よりプリントを出力したり、メモリカードスロット８５に挿入されたメモリカードに記憶することができる。また、外部入出力端子８８から例えばＬＡＮケーブルを使って、パソコンなどにデータを保存することができる。検査終了後、検査担当者はマイクロチップ１を挿入口８３から取り出す。

図２は、本実施形態に係るマイクロチップを用いる検査装置８０の構成図である。図２においては、マイクロチップが図１に示す挿入口８３から挿入され、セットが完了している状態を示している。

検査装置８０は、マイクロチップ１に予め注入された検体及び試薬を送液するための駆動液１１を貯留する駆動液タンク１０、マイクロチップ１に駆動液１１を供給するためのマイクロポンプ５、マイクロポンプ５とマイクロチップ１とを駆動液１１が漏れないように接続するパッキン６、マイクロチップ１の必要部分を温調する温度調節ユニット３、マイクロチップ１をずれないように温度調節ユニット３及びパッキン６に密着させるためのチップ押圧板２、チップ押圧板２を昇降させるための押圧板駆動部２１、マイクロチップ１をマイクロポンプ５に対して精度良く位置決めする規制部材２２、マイクロチップ１内の検体と試薬との反応状態等を検出する光検出部４、等を備えている。

チップ押圧板２は、初期状態においては、図２に示す位置より上方に退避している。これにより、マイクロチップ１は矢印Ｘ方向に挿抜可能であり、検査担当者は挿入口８３（図１参照）から規制部材２２に当接するまでマイクロチップ１を挿入する。その後、チップ押圧板２は、押圧板駆動部２１により下降してマイクロチップ１に当接し、マイクロチップ１の下面が温度調節ユニット３及びパッキン６に密着される。これにより、マイクロチップ１のセットが完了する。規制部材２２、押圧板２、温度調節ユニット３及びパッキン６等で本発明のマイクロチップ収容部が構成される。また、チップ押圧板２の内部には、セットされたマイクロチップ１の被検出部１２５、１２６（図３参照）を加熱し、後述の標的遺伝子の増幅反応及びハイブリダイゼーション反応を促進するためのヒータ２３が設けられている。ヒータ２３は、本発明の加熱手段に相当する。

温度調節ユニット３は、マイクロチップ１と対向する面にペルチェ素子３１を備え、マイクロチップ１が検査装置８０にセットされたときに、ペルチェ素子３１がマイクロチップ１に密着するようになっている。試薬が収容されている部分をペルチェ素子３１で冷却して試薬が変性しないようにする。

光検出部４は、本発明の発光部としてのＬＥＤ等の励起光源４１、励起光源４１から発せられた励起光の波長帯域を制限する励起光フィルタ４２、励起光フィルタ４２を透過した励起光をマイクロチップ１の被検出部１２５、１２６（図３参照）をカバーするサイズに適合したビームスポットに整形するための集光レンズ４３、集光レンズ４３を透過した励起光を反射してマイクロチップ１の被検出部１２５、１２６に照射するとともに当該励起光により発せられたマイクロチップ１の被検出部１２５、１２６からの蛍光を透過するダイクロイックミラー４４、ダイクロイックミラー４４を透過した蛍光を受光部４７に導光するための受光レンズ４５、受光レンズ４５を透過した蛍光の波長帯域を制限する検出光フィルタ４６、検出光フィルタ４６を透過した蛍光を受光するフォトダイオード等からなる受光部４７、等から構成されている。

マイクロポンプ５は、ポンプ室５２、ポンプ室５２の容積を変化させる圧電素子５１、ポンプ室５２のマイクロチップ１側に位置する第１絞り流路５３、ポンプ室の駆動液タンク１０側に位置する第２絞り流路５４、等から構成されている。第１絞り流路５３及び第２絞り流路５４は絞られた狭い流路となっており、また、第１絞り流路５３は第２絞り流路５４よりも長い流路となっている。

駆動液１１を順方向（マイクロチップ１に向かう方向）に送液する場合には、まず、ポンプ室５２の容積を急激に減少させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、短い絞り流路である第２絞り流路５４において乱流が発生し、第２絞り流路５４における流路抵抗が長い絞り流路である第１絞り流路５３に比べて相対的に大きくなる。これにより、ポンプ室５２内の駆動液１１は、第１絞り流路５３の方に支配的に押し出され送液される。次に、ポンプ室５２の容積を緩やかに増加させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、ポンプ室５２内の容積増加に伴って駆動液１１が第１絞り流路５３及び第２絞り流路５４から流れ込む。このとき、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて長さが短いので、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて流路抵抗が小さくなり、ポンプ室５２内には第２絞り流路５４の方から支配的に駆動液１１が流入する。以上の動作を圧電素子５１が繰り返すことにより、駆動液１１が順方向に送液されることになる。

一方、駆動液１１を逆方向（駆動液タンク１０に向かう方向）に送液する場合には、まず、ポンプ室５２の容積を緩やかに減少させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて長さが短いので、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて流路抵抗が小さくなる。これにより、ポンプ室５２内の駆動液１１は、第２絞り流路５４の方に支配的に押し出され送液される。次に、ポンプ室５２の容積を急激に増加させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、ポンプ室５２内の容積増加に伴って駆動液１１が第１絞り流路５３及び第２絞り流路５４から流れ込む。このとき、短い絞り流路である第２絞り流路５４において乱流が発生し、第２絞り流路５４における流路抵抗が長い絞り流路である第１絞り流路５３に比べて相対的に大きくなる。これにより、ポンプ室５２内には第１絞り流路５３の方から支配的に駆動液１１が流入する。以上の動作を圧電素子５１が繰り返すことにより、駆動液１１が逆方向に送液されることになる。

（マイクロチップの構成）
図３は、本実施形態に係るマイクロチップ１の構成図である。図３（ａ）は、マイクロチップ１の上面図である。図３（ｂ）は、マイクロチップ１の側面図である。図３（ｃ）は、図３（ａ）において被覆基板１０９を取り外した図である。一例の構成を示すものであり、これに限定されない。

図３（ａ）において矢印は、検査装置８０にマイクロチップ１を挿入する挿入方向であり、図３（ａ）は挿入時にマイクロチップ１の下面となる面を図示している。図３（ｂ）はマイクロチップ１の側面図である。

図３（ｂ）に示すように、マイクロチップ１は溝形成基板１０８と、溝形成基板１０８を覆う被覆基板１０９から構成されている。

溝形成基板１０８には、図３（ｃ）に示すように、検体と試薬とをマイクロチップ１上で混合・反応させるための微細流路及び流路エレメントが配設されている。図３（ｃ）では、微細流路を矢印で、流路エレメントを四角形で模式的に示している。

マイクロチップ１上には、以下の流路エレメントが設けられている。

駆動液注入部１１０ａ〜１１０ｅは、マイクロポンプから駆動液１１を注入するための注入部である。

検体注入部１１３は、マイクロチップ１に検体を注入するための注入部である。

駆動液注入部１１０ａ〜１１０ｅの下流には、それぞれ、検体を収容する検体収容部１２０、標的遺伝子のポジティブコントロール用試薬を収容するポジティブコントロール収容部１２１、ネガティブコントロール用試薬を収容するネガティブコントール収容部１２２、標的遺伝子を増幅するための酵素及び基質の収容部１２３、プライマー及び蛍光標識されたＤＮＡプローブの収容部１２４、が設けられている。各試薬は、予め各収容部に収容されている。

ポジティブコントロール用試薬及びネガティブコントロール用試薬は、検査が正常に行われたか否かをモニタリングするための試薬である。

サイクリングプローブ法で用いる蛍光標識されたＤＮＡプローブは、ＲＮＡとＤＮＡからなるキメラオリゴヌクレオチドで、一方の末端が蛍光物質で、もう一方の末端がクエンチャで修飾されている。インタクトな状態では、蛍光共鳴エネルギー遷移現象により、蛍光を発しないが、標的遺伝子とハイブリダイゼーション反応を起こすと、ＲＮＡ部分が切断されて蛍光を発する。

上記の各収容部は、マイクロチップ１を検査装置８０にセットした際にペルチェ素子３１に対向し、収容されている検体や試薬が変性しないように冷却される。

検体収容部１２０、ポジティブコントロール収容部１２１、酵素及び基質の収容部１２３、プライマー及び蛍光標識されたＤＮＡプローブの収容部１２４の下流には、検体とポジティブコントロール用試薬との混合液に対して増幅反応及び検出を行うための被検出部１２５が設けられている。

また、検体収容部１２０、ネガティブコントール収容部１２２、酵素及び基質の収容部１２３、プライマー及び蛍光標識されたＤＮＡプローブの収容部１２４の下流には、検体とネガティブコントール用の試薬との混合液に対して増幅反応及び検出を行うための被検出部１２６が設けられている。

被検出部１２５、１２６は、マイクロチップ１を検査装置８０にセットした際にヒータ２３に対向し、増幅促進のために加熱される。

被検出部１２５、１２６、及び被検出部１２５、１２６に対応する被覆基板１０９の窓部１０９ａは、光学的な検出を行うことができるよう、透明なガラスや樹脂等の材料から構成されている。

検体及び各試薬の流れについて説明する。まず、マイクロチップ１による検査を行うに先立って、検査担当者は検体を検体注入部１１３から注射器等を用いて注入する。検体注入部１１３から注入された検体は、連通する微細流路を通って検体収容部１２０に収容される。

次に、検体の注入されたマイクロチップ１は、検査担当者により図１に示す検査装置８０の挿入口８３に挿入され、図２に示すようにセットされる。これにより、マイクロポンプ５を駆動して駆動液注入部１１０ａ〜１１０ｅから駆動液１１を注入することが可能となる。

まず、駆動液注入部１１０ａから駆動液１１を注入すると、連通する微細流路を通って検体収容部１２０に収容されている検体が押し出され、被検出部１２５、１２６に検体が送り込まれる。

次に、駆動液注入部１１０ｂから駆動液１１を注入すると、連通する微細流路を通ってポジティブコントロール収容部１２１に収容されているポジティブコントール用の試薬（標的遺伝子と同一のＤＮＡ配列箇所をもつ試薬）が押し出され、被検出部１２５にポジティブコントロール用試薬が送り込まれ、先に送液された検体と混合される。

次に、駆動液注入部１１０ｃから駆動液１１を注入すると、連通する微細流路を通ってネガティブコントロール収容部１２２に収容されているネガティブコントロール用試薬（例えば純水）が押し出され、被検出部１２６にネガティブコントロールが送り込まれ、先に送液された検体と混合される。

次に、駆動液注入部１１０ｄと１１０ｅから駆動液１１を注入すると、連通する微細流路を通って、１２３、１２４の各収容部から酵素及び基質、並びにプライマー及び蛍光標識されたＤＮＡプローブが被検出部１２５、１２６にそれぞれ送りこまれ、先に送液された検体及びコントロール液の混合液と混合される。

次に、被検出部１２５，１２６をヒータ２３により加熱すると、それぞれの被検出部において標的遺伝子（及びポジティブコントロールＤＮＡ）の増幅反応、増幅産物と蛍光プローブのハイブリダイゼーション反応、及び蛍光物質とクエンチャとの遊離反応が同時進行し、増幅から蛍光物質生成までの反応が一括して行われる。

そして、被検出部１２５、１２６に光検出部４の励起光源４１から励起光を照射し、被検出部１２５、１２６から発せられる蛍光を受光部４７で受光することにより光検出を行うことが可能となる。

尚、変形例として、増幅反応、ハイブリダイゼーション反応、検出を別個の流路エレメントで行うようにしても構わない。また、装置構成上、ヒータ２３やペルチェ素子３１の位置は、それらの機能を満足する限り多少変動することがあっても構わない。

表１に、被検出部１２５、１２６の検出結果を基づいて検査の総合判定を行うルールの一例を示す。

ポジティブコントロールは、その試薬単独でも、標的遺伝子と同等の増幅反応、ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション反応、及び蛍光物質の生成反応を起こす。ネガティブコントロールは、その試薬単独では、蛍光物質の生成反応を起こさない。

これらの試薬を検体と混合した混合液に対して反応及び検出を行うことで、表１に示した検査結果の良否判定が可能となる。

陽性すなわち検体に標的遺伝子が含まれる場合、検体とポジティブコントロール用試薬との混合液、及び検体とネガティブコントロール用試薬との混合液のいずれの混合液も蛍光発光が生じる。陰性すなわち検体に標的遺伝子が含まれない場合、検体とポジティブコントロール用試薬との混合液は、ポジティブコントロールの反応による蛍光発光が生じるが、検体とネガティブコントロール用試薬との混合液は、反応が生じず蛍光発光は生じない。これら２つのケースは、正常な反応が行われた検査結果として扱う事ができる。

一方、例えば、検体に反応の阻害物質が混入した場合等は、検体とポジティブコントロール用試薬との混合液、及び検体とネガティブコントロール用試薬との混合液のいずれの混合液も蛍光発光は生じない。また、検体とポジティブコントロール用試薬との混合液での蛍光発光無し、検体とネガティブコントロール用試薬との混合液での蛍光発光有りの場合は、マイクロチップ１に収容した試薬の失活などの異常が考えられる。これら２つのケースは、異常な反応を行った検査結果として、再検査を促すことが可能となる。

（制御構成）
図４は、本実施形態に係るマイクロチップを用いる検査装置の制御構成の要部を示す図である。本発明の制御に関係する主な構成要素について示している。

プログラムに従って検査装置８０の制御を実行するＣＰＵ９０を中心に、バス９１により、ＲＯＭ９２、ＲＡＭ９３、不揮発性メモリ９４、光検出部４、ペルチェ素子３１、ヒータ２３、表示部８４、操作パネル８７、等が相互に接続されている。

ＲＯＭ９２は、ＣＰＵ９０によって実行される各種制御プログラムやデータ等を記憶する。

ＲＡＭ９３は、ＣＰＵ９０によってワークエリアとして利用され、ＣＰＵ９０が制御を実行する際に必要なプログラムやデータを一時的に記憶する。

不揮発性メモリ９４は、光検出部４による検出結果等を記憶する。

ＣＰＵ９０がＲＯＭ９２に記憶されているプログラムに基づいて制御を実行する。本発明の制御部として機能する。

光検出部４、ペルチェ素子３１、ヒータ２３、表示部８４及び操作パネル８７についての説明は、前述したので省略する。

（検出制御フロー）
図５は、本実施形態に係る検出制御のフロー図である。ヒータ２３による加熱が行われることによりサイクリングプローブ法による標的遺伝子の増幅反応及び標的遺伝子とＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション反応が開始される場合を一例に説明する。ヒータ２３が本発明の反応開始手段に相当する。

検出制御は、ＲＯＭ９２に記憶されている検出制御プログラムに基づいてＣＰＵ９０が処理を実行することにより行われる。尚、前提として、検査装置８０の操作パネル８７から検査開始の入力がされて検査が開始され、既に被検出部１２５、１２６には、マイクロチップ１内の流路で混合等の化学操作された各試薬が送り込まれているものとする。

まず、ＣＰＵ９０は、光検出部４により反応前の蛍光強度を測定する（ステップＳ１）。これにより、クエンチャに吸収されなかった蛍光物質からの微弱な蛍光を検出することが可能となる。

次に、ＣＰＵ９０は、所定時間Ｔ１（例えば数秒）が経過したか否かを判断する（ステップＳ２）。

所定時間Ｔ１が経過したと判断すると（ステップＳ２；Ｙｅｓ）、ＣＰＵ９０は、ヒータ２３により被検出部１２５、１２６を加熱する（ステップＳ３）。標的遺伝子の増幅反応及びハイブリダイゼーション反応に適した温度に温調制御される。

所定時間Ｔ１が経過していないと判断すると（ステップＳ２；Ｎｏ）、ＣＰＵ９０は、所定時間Ｔ１が経過するまで待機する。

次に、ＣＰＵ９０は、所定時間Ｔ２（例えば数分）が経過したか否かを判断する（ステップＳ４）。つまり、所定時間Ｔ２の経過によって十分にハイブリダイゼーション反応が進行したか否かを判断する。

所定時間Ｔ２が経過したと判断すると（ステップＳ４；Ｙｅｓ）、ＣＰＵ９０は、光検出部４により反応後の蛍光強度を測定する（ステップＳ５）。

所定時間Ｔ２が経過していないと判断すると（ステップＳ４；Ｎｏ）、ＣＰＵ９０は、所定時間Ｔ２が経過するまで待機する。この間、加熱は継続される。

次に、ＣＰＵ９０は、反応前の蛍光強度を基に反応後の蛍光強度を補正する（ステップＳ６）。例えば、反応後の蛍光強度から反応前の蛍光強度を差し引くことにより補正を行う。

次に、ＣＰＵ９０は、補正後の蛍光強度を表示部８４に表示したり、不揮発性メモリ９４に保存したりする（ステップＳ７）。その後、フローは終了する。

以上のように、本実施形態によれば、反応前の検出タイミングから反応開始タイミングである加熱開始までの時間（所定時間Ｔ１）を管理して制御を行っているので、例えば、反応開始の直前に反応前の検出のタイミングが行われるように所定時間Ｔ１を設定すれば、反応による蛍光強度の変化分を正確に測定することができる。

本実施形態では、反応前の測定をヒータ２３による加熱前に蛍光強度の測定を行ったが、試薬によっては、加熱を開始しても暫く反応が進行しない場合もあり得る。このような場合には、加熱と同時、又は加熱後反応が進行する前に蛍光強度の測定を行ってもよい。加熱後反応が進行する前に蛍光強度の測定を行うようにすると、例えば、被検出部１２５、１２６の加熱による液の対流等が蛍光強度や検出に与える影響を取り除くことができる。この場合には、図５において、ステップＳ１とステップＳ３とを入れ替えればよい。

また、温度により蛍光強度が大きく変化する場合には、加熱開始から所定時間Ｔ１経過した後に反応前の検出を行うよう制御すればよい。この場合には、図５において、ステップＳ１で、前述したマイクロポンプ５を駆動し、送液が完了する所定時間Ｔ１経過後（ステップＳ２）、反応前の蛍光強度を測定（ステップＳ３）すればよい。

本実施形態では、加熱により反応が開始される場合について説明したが、混合のみにより反応が進行する場合にも本発明の制御を適用することができる。この場合、検出試薬収容部１２４から被検出部１２５、１２６へのＤＮＡプローブの送液が完了した後に、反応前の蛍光強度の測定を行うことが好ましい。被検出部１２５、１２６に収容される反応前と反応後とで液量が同等になるので、より正確に蛍光強度の測定を行うことができる。送液の完了の判断は、マイクロポンプ５の送液量から予測して行ってもよいし、被検出部１２５、１２６の液量を検知する液面センサ等のセンサを別途設けてもよい。この場合には、マイクロポンプ５が本発明の反応開始手段及び送液手段に相当する。

本実施形態のように、微弱な蛍光が生じやすいサイクリングプローブ法による標的遺伝子のＤＮＡ配列検出反応が行われる系に本発明の制御を適用することは、反応前後での蛍光強度の変化分を正確に測定を行う上で大きな意義がある。また、サイクリングプローブ法による反応は、急速に反応が進行するので反応を考慮して測定タイミングを決定しておくことは、反応前後での蛍光強度の変化分を正確に測定を行う上で重要である。

以上のように、本発明によれば、反応前の検出タイミングを反応開始タイミングに対応付けて設定するようにしているので、反応前後での蛍光強度の変化分を正確に測定することができ、精度良い検出を行うことができる。

本実施形態に係るマイクロチップを用いる検査装置の外観図である。 本実施形態に係るマイクロチップを用いる検査装置の構成図である。 本実施形態に係るマイクロチップ１の構成図である。図３（ａ）は、マイクロチップ１の上面図である。図３（ｂ）は、マイクロチップ１の側面図である。図３（ｃ）は、図３（ａ）において被覆基板１０９を取り外した図である。 本実施形態に係るマイクロチップを用いる検査装置の制御構成の要部を示す図である。 本実施形態に係る検出制御のフロー図である。

符号の説明

１ マイクロチップ
４ 光検出部
５ マイクロポンプ
２３ ヒータ
８０ 検査装置
９０ ＣＰＵ
１１１ 被検出部
１２０ 検体収容部
１２４ 検出試薬収容部

Claims (11)

1. 少なくとも標的物質と前記標的物質に特異的に結合する蛍光標識された試薬とを含み、前記標的物質と前記試薬との反応が行われ、被検出部において蛍光強度の検出が行われるマイクロチップと、
   前記マイクロチップを収容可能なマイクロチップ収容部と、
   前記マイクロチップ収容部に収容されたマイクロチップの被検出部に対応して設けられ、前記被検出部に励起光を照射する発光部と前記被検出部からの蛍光を受光する受光部とを有する光検出部と、
   を有するマイクロチップ検査システムにおいて、
   前記反応を開始させる反応開始手段と、
   前記反応開始手段の反応開始タイミング及び前記光検出部による反応前及び反応後の蛍光強度の検出タイミングを制御する制御部と、を有し、
   前記制御部は、前記光検出部による反応前の蛍光強度の検出タイミングと、前記反応開始手段による前記反応開始タイミングとを対応付けることを特徴とするマイクロチップ検査システム。
2. 前記反応開始手段は、前記マイクロチップ収容部に収容されたマイクロチップを加熱する加熱手段であり、
   前記制御部は、前記光検出部による反応前の蛍光強度の検出タイミングと、前記加熱手段による加熱開始タイミングとを対応付けることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチップ検査システム。
3. 前記制御部は、前記光検出部による反応前の蛍光強度の検出タイミングから所定時間後に、前記加熱手段による加熱を開始させることを特徴とする請求項２に記載のマイクロチップ検査システム。
4. 前記制御部は、前記加熱手段の加熱開始タイミングと同時又は当該加熱開始タイミングから所定時間後に、前記光検出部による反応前の蛍光強度の検出を行わせることを特徴とする請求項２に記載のマイクロチップ検査システム。
5. 前記反応開始手段は、前記マイクロチップ内の前記標的物質又は前記試薬を送液する送液手段であり、
   前記制御部は、前記光検出部による反応前の蛍光強度の検出タイミングと、前記送液手段による前記標的物質と前記試薬との混合が完了する混合完了タイミングとを対応付けることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチップ検査システム。
6. 前記制御部は、前記標的物質と前記試薬との混合が完了する混合完了タイミングと同時又は当該混合完了タイミングから所定時間後に、前記光検出部による反応前の蛍光強度の検出を行わせることを特徴とする請求項５に記載のマイクロチップ検査システム。
7. 前記混合完了タイミングは、前記送液手段による前記標的物質又は前記試薬の前記被検出部への送液が完了したタイミングであることを特徴とする請求項５又は６に記載のマイクロチップ検査システム。
8. 前記制御部は、前記光検出部による反応前の蛍光強度の検出値に基づいて、前記光検出部による反応後の蛍光強度の検出値を補正することを特徴とする請求項１〜７の何れか一項に記載のマイクロチップ検査システム。
9. 前記標的物質は、標的遺伝子であり、
   前記標的物質に特異的に結合する蛍光標識された試薬は、蛍光標識したＤＮＡプローブであり、
   前記反応は、前記標的遺伝子と前記ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションにより蛍光共鳴エネルギー遷移現象に変化を生じる反応であることを特徴とする請求項１〜８の何れか一項に記載のマイクロチップ検査システム。
10. 少なくとも標的物質と蛍光標識された前記標的物質に特異的に結合する試薬とを含み、前記標的物質と前記試薬との反応が行われ、被検出部において蛍光強度の検出が行われるマイクロチップ、を収容可能なマイクロチップ収容部と、
    前記マイクロチップ収容部に収容されたマイクロチップの被検出部に対応して設けられ、前記被検出部に励起光を照射する発光部と前記被検出部からの蛍光を受光する受光部とを有する光検出部と、
    を有するマイクロチップ検査装置において、
    前記反応を開始させる反応開始手段と、
    前記反応開始手段の反応開始タイミング及び前記光検出部による反応前及び反応後の蛍光強度の検出タイミングを制御する制御部と、を有し、
    前記制御部は、前記光検出部による反応前の蛍光強度の検出タイミングと、前記反応開始手段による前記反応開始タイミングとを対応付けることを特徴とするマイクロチップ検査装置。
11. マイクロチップ収容部に収容されたマイクロチップの被検出部に少なくとも標的物質と蛍光標識された前記標的物質に特異的に結合する試薬とを収容させるステップと、
    反応開始手段により前記標的物質と前記試薬との反応を開始させるステップと、
    光検出部による反応前の蛍光強度の検出を行わせるステップと、
    光検出部による反応後の蛍光強度の検出を行わせるステップと、
    をコンピュータに実行させるプログラムであって、
    前記光検出部による反応前の蛍光強度の検出タイミングと、前記反応開始手段による反応開始タイミングとが対応付けられていることを特徴とするプログラム。

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