JPWO2008065911A1 - マイクロチップ - Google Patents

Abstract

被検出部に複数の試薬を順次送液する場合に、目的物質を正確に検出できるマイクロチップを提供するという課題に対して以下により解決を図る。微細流路を通して複数の試薬を順次固体表面と反応させるマイクロチップにおいて、前記複数の試薬のそれぞれを保管する複数の試薬保管流路と、前記複数の試薬保管流路のそれぞれの試薬出口と、前記微細流路と、を接続する複数の接続部を有し、前記複数の接続部は、前記複数の試薬を反応させる順に前記固体表面から近い位置に設ける。

Description

本発明は、マイクロチップに関する。

近年、マイクロマシン技術および超微細加工技術を駆使することにより、従来の試料調製、化学分析、化学合成などを行うための装置、手段（例えばポンプ、バルブ、流路、センサーなど）を微細化して１チップ上に集積化したシステムが注目されている。これは、μ−ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）とも呼ばれ、マイクロチップといわれる部材に、試薬と試料（例えば、検査を受ける被験者の尿、唾液、血液を処理して抽出したＤＮＡ処理した抽出溶液など）を合流させ、その反応を検出することにより試料の特性を調べる方法である。

マイクロチップは、樹脂材料やガラス材料からなる基体に、フォトリソプロセス（パターン像を薬品によってエッチングして溝を作成する方法）や、レーザ光を利用して溝加工を行い、試薬や試料を流すことができる微細な流路と試薬を蓄える液溜部を設けており、さまざまなパターンが提案されている。

そして、これらマイクロチップを用いて試料の特性を調べる際は、マイクロポンプなどでマイクロチップ内に収容されている試薬や試料を送液することにより、試薬と試料とを反応させて被検出部に導き、検出を行う。被検出部では、例えば光学的な検出方法などによって目的物質の検出が行われる。

例えば、特許文献１には、マイクロチップの被検出部に目的物質をトラップするための物質を予め固定化しておき、当該被検出部に試料の増幅に用いる試薬と試料とを反応させて得られた増幅産物及び検出に用いる複数の試薬を定められた順番に供給して検出のための反応を行わせた後、検出を行うことが記載されている。
国際公開第２００５／１０８５７１号パンフレット

上記のように、被検出部に試料及び試薬を定められた順番に供給して、被検出部で検出を行う場合、例えば、検出部に向かう第１の試薬の流路の途中から第２の試薬の流路を合流させる構成が考えられる。この場合、第１の試薬を送液する際に、第２の試薬が第１の試薬の流れによる負圧の影響により引っ張り込まれ、第２の試薬が第１の試薬の中に混入した状態で、第１の試薬が被検出部に送液されてしまうことが考えられる。

こうなると、試薬と試薬、または、試薬と試料とが事前にお互いに反応して、目的物質の検出を正確に行うことができないという問題が生じる。

本発明の目的は、被検出部に複数の試薬を順次送液する場合に、目的物質を正確に検出できるマイクロチップを提供することである。

上記目的は、下記構成により達成できる。

１．微細流路を通して複数の試薬を順次固体表面と反応させるマイクロチップにおいて、前記複数の試薬のそれぞれを保管する複数の試薬保管流路と、
前記複数の試薬のそれぞれを保管する複数の試薬保管流路と、
前記複数の試薬保管流路のそれぞれの試薬出口と、前記微細流路と、を接続する複数の接続部を有し、
前記複数の接続部は、該接続部に接続されている試薬保管流路に保管されている試薬の反応させる順に前記固体表面から近い位置に設けられていることを特徴とするマイクロチップ。

２．前記固体表面には、前記複数の試薬のうち少なくとも１つの試薬と反応する物質が固定化されていることを特徴とする１に記載のマイクロチップ。

本発明によれば、被検出部への試料又は試薬の送液順に従って、被検出部の近くから流路を合流させるようにしたので、試料又は試薬を送液する際に別の試料又は試薬が引っ張り込まれることがない。その結果、目的物質の検出を正確に行うことができる。

本実施形態に係るマイクロチップを用いる検査装置の外観図である。 本実施形態に係るマイクロチップを用いる検査装置の構成図である。 本実施形態に係るマイクロチップの構成図である。

符号の説明

１ マイクロチップ
４ 光検出部
５ マイクロポンプ
６０ 廃液部
８０ 検査装置
１３２ 開口
１３３ 試薬収容部
１３７ 試料収溶部
１３９ 反応部
１４４ａ〜１４４ｄ 試薬入口部
１４７ 試料入口部
１４８ 被検出部
１４９ａ〜１４９ｄ 試薬保管流路
１５０ａ〜１５０ｄ 流路接続部
Ｒ 流路

本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明を図示の実施の形態に基づいて説明するが、本発明は該実施の形態に限らない。また、以下の、本発明の実施の形態における断定的な説明は、ベストモードを示すものであって、本発明の用語の意義や技術的範囲を限定するものではない。

以下、図面に基づき本発明の実施形態を説明する。
（装置構成）
図１は、本実施形態に係るマイクロチップを用いる検査装置８０の外観図である。検査装置８０は、マイクロチップ１に予め注入された検体と試薬とを自動的に反応させ、反応結果を自動的に出力する装置である。

検査装置８０の筐体８２には、マイクロチップ１を装置内部に挿入するための挿入口８３、表示部８４、メモリカードスロット８５、プリント出力口８６、操作パネル８７、外部入出力端子８８が設けられている。

検査担当者は、図１の矢印方向にマイクロチップ１を挿入し、操作パネル８７を操作して検査を開始させる。検査装置８０の内部では、マイクロチップ１内の反応の検査が自動的に行われ、検査が終了すると表示部８４に結果が表示される。検査結果は操作パネル８７の操作により、プリント出力口８６よりプリントを出力したり、メモリカードスロット８５に挿入されたメモリカードに記憶したりすることができる。また、外部入出力端子８８から例えばＬＡＮケーブルを使って、パソコンなどにデータを保存することができる。検査終了後、検査担当者はマイクロチップ１を挿入口８３から取り出す。

図２は、本実施形態に係るマイクロチップを用いる検査装置８０の構成図である。図２においては、マイクロチップが図１に示す挿入口８３から挿入され、セットが完了している状態を示している。

検査装置８０は、マイクロチップ１に予め注入された検体及び試薬を送液するための駆動液１１を貯留する駆動液タンク１０、マイクロチップ１に駆動液１１を供給するためのマイクロポンプ５、マイクロポンプ５とマイクロチップ１とを駆動液１１が漏れないように接続するポンプ接続部６、マイクロチップ１の必要部分を温調する温度調節ユニット３、マイクロチップ１をずれないように温度調節ユニット３及びポンプ接続部６に密着させるためのチップ押圧板２、チップ押圧板２を昇降させるための押圧板駆動部２１、マイクロチップ１をマイクロポンプ５に対して精度良く位置決めする規制部材２２、マイクロチップ１内の検体と試薬との反応状態等を検出する光検出部４、等を備えている。

チップ押圧板２は、初期状態においては、図２に示す位置より上方に退避している。これにより、マイクロチップ１は矢印Ｘ方向に挿抜可能であり、検査担当者は挿入口８３（図１参照）から規制部材２２に当接するまでマイクロチップ１を挿入する。その後、チップ押圧板２は、押圧板駆動部２１により下降してマイクロチップ１に当接し、マイクロチップ１の下面が温度調節ユニット３及びポンプ接続部６に密着される。

温度調節ユニット３は、マイクロチップ１と対向する面にペルチェ素子３１及びヒータ３２を備え、マイクロチップ１が検査装置８０にセットされたときに、ペルチェ素子３１及びヒータ３２がマイクロチップ１に密着するようになっている。試薬が収容されている部分をペルチェ素子３１で冷却して試薬が変性しないようにしたり、検体と試薬とが反応する部分をヒータ３２で加熱して反応を促進させたりする。

光検出部４は、発光部４ａ及び受光部４ｂから構成され、発光部４ａからの光をマイクロチップ１に照射し、マイクロチップ１を透過した光を受光部４ｂにより検出する。受光部４ｂはチップ押圧板２の内部に一体的に設けられている。発光部４ａ及び受光部４ｂは、後述のマイクロチップ１の被検出部１４８に対向するように設けられている。

マイクロポンプ５は、ポンプ室５２、ポンプ室５２の容積を変化させる圧電素子５１、ポンプ室５２のマイクロチップ１側に位置する第１絞り流路５３、ポンプ室の駆動液タンク１０側に位置する第２絞り流路５４、等から構成されている。第１絞り流路５３及び第２絞り流路５４は絞られた狭い流路となっており、また、第１絞り流路５３は第２絞り流路５４よりも長い流路となっている。

駆動液１１を順方向（マイクロチップ１に向かう方向）に送液する場合には、まず、ポンプ室５２の容積を急激に減少させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、短い絞り流路である第２絞り流路５４において乱流が発生し、第２絞り流路５４における流路抵抗が長い絞り流路である第１絞り流路５３に比べて相対的に大きくなる。これにより、ポンプ室５２内の駆動液１１は、第１絞り流路５３の方に支配的に押し出され送液される。次に、ポンプ室５２の容積を緩やかに増加させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、ポンプ室５２内の容積増加に伴って駆動液１１が第１絞り流路５３及び第２絞り流路５４から流れ込む。このとき、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて長さが短いので、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて流路抵抗が小さくなり、ポンプ室５２内には第２絞り流路５４の方から支配的に駆動液１１が流入する。以上の動作を圧電素子５１が繰り返すことにより、駆動液１１が順方向に送液されることになる。

一方、駆動液１１を逆方向（駆動液タンク１０に向かう方向）に送液する場合には、まず、ポンプ室５２の容積を緩やかに減少させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて長さが短いので、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて流路抵抗が小さくなる。これにより、ポンプ室５２内の駆動液１１は、第２絞り流路５４の方に支配的に押し出され送液される。次に、ポンプ室５２の容積を急激に増加させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、ポンプ室５２内の容積増加に伴って駆動液１１が第１絞り流路５３及び第２絞り流路５４から流れ込む。このとき、短い絞り流路である第２絞り流路５４において乱流が発生し、第２絞り流路５４における流路抵抗が長い絞り流路である第１絞り流路５３に比べて相対的に大きくなる。これにより、ポンプ室５２内には第１絞り流路５３の方から支配的に駆動液１１が流入する。以上の動作を圧電素子５１が繰り返すことにより、駆動液１１が逆方向に送液されることになる。

ポンプ接続部６は、必要なシール性を確保して駆動液の漏出を防止するために、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン樹脂などの柔軟性（弾性、形状追随性）をもつ樹脂によって密着面が形成されることが好ましい。このような柔軟性を有する密着面は、例えばマイクロチップの構成基材自体によるものであってもよく、また、ポンプ接続部６における流路開口の周囲に貼着された柔軟性を有する別途の部材によるものであってもよい。
（マイクロチップの構成）
図３は本実施形態に係るマイクロチップ１の一例を示すものであり、被覆基板が取り外された状態での微細流路及び流路エレメントの配置を模式的に示している。更に図３において矢印は、検査装置８０にマイクロチップ１を挿入する挿入方向を示している。

マイクロチップ１には、液状の試薬と同じく液状の試料（検体）をマイクロチップ１上で混合・反応させるための微細流路及び流路エレメントが配設されている。これらの微細流路および流路エレメントによってマイクロチップ１内で行われる処理の一例について説明する。またマイクロチップ１は溝形成基板と、溝形成基板を覆う被覆基板から構成されている。微細流路はマイクロメーターオーダーで形成されており、例えぱ幅は数十〜数百μｍ、好ましくは５０〜１００μｍで、深さは２５〜２００μｍ程度、好ましくは５０〜１００μｍである。

図中１３２ａ〜１３２ｅはマイクロチップ１の一方の面から外部へ解放された開口である。これらの開口１３２ａ〜１３２ｅは、ポンプ接続部６を介してマイクロチップ１をマイクロポンプ５に重ね合わせて接続した際に、マイクロポンプ５の接続面に設けられた流路開口と位置合わせされてマイクロポンプ５に連通される。さらに、１４４ａ〜１４４ｄは、試薬を注入する試薬入口部であり、マイクロチップ１の一方の面から外部へ解放された開口となっている。また、１４７は、試料を注入する試料入口部であり、試薬入口部と同様にマイクロチップ１の一方の面から外部へ解放された開口となっている。１３３は試薬を収容する試薬収容部であり、１３７は試料を収容する試料収容部である。なお、１４６は駆動液と試薬または試液との間の空気を抜く空気抜き用流路である。

試薬収容部１３３及び試料収容部１３７の下流には、試薬収容部１３３からの試薬と試料収容部１３７からの試料とが混合され反応する反応部１３９が設けられている。

試薬収容部１３３に収容された試薬は、開口１３２ａに連通するマイクロポンプ５から送り込まれる駆動液１１により、反応部１３９へ流れ込む。一方、試料収容部１３７に収容された試料は、開口１３２ｂに連通する別途のマイクロポンプ５から送り込まれる駆動液１１により、反応部１３９へ流れ込む。これにより、反応部１３９において、試薬収容部１３３から送り込まれた試薬と試料収容部１３７から送り込まれた試料とが混合される。なお本発明において、混合された試料と試薬を増幅産物と称する。

反応部１３９で混合された増幅産物は、検査装置８０に設けられたヒータ３２からの加熱によって反応が促進される。反応後の増幅産物は、被検出部１４８へ送液され、光検出部４により検出が行われる。

（本発明の構成）
被検出部１４８において、増幅産物を検出する手段について説明する。被検出部１４８では増幅産物をそのまま光検出することはできず、一般には、増幅産物を被検出部１４８の流路壁（本発明の固体表面）に担持されている反応物質と反応させることにより増幅産物を被検出部１４８にトラップさせ、さらに増幅産物に蛍光標識したプローブを結合させて光学的に検出できるようにしている。被検出部１４８の少なくともその検出部分は、光学的測定を可能とするために透明な材質、好ましくは透明なプラスチックとなっている。

ここで具体的に遺伝子検査を例にして説明する。

１：試薬はビオチン修飾したプライマーであり、反応部１３９において検体の遺伝子増
幅を行い、増幅された遺伝子を変性処理により一本鎖にした反応後の検体を被検出部１４８に送る。被検出部１４８の流路壁には予めストレプトアビジン等のビオチン親和性タンパク質（アビジン、ストレプトアビジン、エクストラアビジン、好ましくはストレプトアビジン）が反応物質として担持されて固定化されている。反応部１３９で反応後の検体が被検出部１４８に流入すると、ビオチン親和性タンパク質と、プローブ物質に標識されたビオチンと、の結合反応によって検体の遺伝子が被検出部１４８の流路壁に固定化（トラップ）される。前述したビオチン親和性タンパク質とビオチンとの結合反応は、公知のアビチン−ビオチン反応である。

さらに、増幅産物（この例では増幅遺伝子）をトラップする工程を経て、増幅遺伝子をトラップした被検出部１４８に、末端にＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で蛍光標識したプローブＤＮＡを流し、これを固定化した遺伝子にハイブリダイズさせる。（予め増幅遺伝子と蛍光標識したプローブＤＮＡとをハイブリダイズさせたものを被検出部でトラップしもよい。）
２：微細流路内にＦＩＴＣに特異的に結合する抗ＦＩＴＣ抗体で表面を修飾した金コロイド液を流し、これにより遺伝子にハイブリダイズしたＦＩＴＣ修飾プローブに、その金コロイドを吸着させる。

３：上記微細流路の金コロイドの濃度を光学的に測定する。

以上のように、被検出部１４８では、微細流路に収容される各試薬が順に送液され被検出部１４８に固定化されている反応物質と反応を行うが、この順序は予め決まっている。

反応部１３９から送液された増幅産物は、試薬保管流路１４９ａの出口と流路接続部１５０ｄから被検出部１４８に至るまでの経路である流路Ｒとが接続された流路接続部１５０ａを通って、被検出部１４８にて反応物質と反応を開始する（例えばアビチン−ビオチン反応）。次に、試料入口部１４４ｂから送液された試料（例えばプローブＤＮＡ）は、試薬保管流路１４９ｂの出口と流路Ｒが接続された流路接続部１５０ｂを通って、被検出部１４８に合流してハイブリダイゼーション反応が行われる。その後、試料入口部１４４ｃから送液された色素液（例えばＰＥＧ化金コロイド）が試薬保管流路１４９ｃの出口と流路Ｒと接続された流路接続部１５０ｃを通って被検出部１４８にて抗原抗体反応が開始される。

金コロイドが増幅産物と反応した後、被検出部１４８にて検出する際、余分な金コロイドが存在する。この余剰金コロイドを洗い流すため、試料入口部１４４ｄから洗浄液が、試薬保管流路１４９ｄの出口と流路Ｒが接続された流路接続部１５０ｄを通って被検出部１４８に送液される。流路Ｒが本発明の微細流路に相当する。流路接続部１５０ａ〜１５０ｄが本発明の接続部に相当する。

被検出部１４８に送液され検出のための反応が行われた増幅産物は、光検出部４により検出が行われる。

検出後の増幅産物は、廃液部６０に送液される。

このように本実施形態では、複数の試薬を保管する試薬保管流路の出口と流路Ｒとを接続する接続部が、複数の試薬を反応させる順に被検出部１４８から近い位置に設けられている。つまり、流路接続部１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃ、１５０ｄに接続されている試薬保管流路の順、すなわち、１４９ａ、１４９ｂ、１４９ｃ、１４９ｄ順に収容されている試薬又は試料を送液する。このため、当該順番に送液してもよいように各試薬保管流路に保管しておく試薬を決定して保管しておく。

以上のように、本実施形態によれば、被検出部１４８への試料又は試薬の送液順に従って、被検出部１４８の近くから流路を合流させるようにしたので、試料又は試薬を送液する際に別の試料又は試薬が引っ張り込まれることがない。その結果、目的物質の検出を正確に行うことができる。

本実施形態では、一例として被検出部１４８を例として説明したが、これに限らず、ある箇所への流路の途中に別の流路が接続されている流路構成において、順に送液を行う場合に本発明を適用することができる。

Claims (2)

1. 微細流路を通して複数の試薬を順次固体表面と反応させるマイクロチップにおいて、
   前記複数の試薬のそれぞれを保管する複数の試薬保管流路と、
   前記複数の試薬保管流路のそれぞれの試薬出口と、前記微細流路と、を接続する複数の接続部を有し、
   前記複数の接続部は、該接続部に接続されている試薬保管流路に保管されている試薬の反応させる順に前記固体表面から近い位置に設けられていることを特徴とするマイクロチップ。
2. 前記固体表面には、前記複数の試薬のうち少なくとも１つの試薬と反応する物質が固定化されていることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のマイクロチップ。