JPWO2008090759A1 - マイクロ総合分析システム - Google Patents

Abstract

蛍光色素で標識されたプローブと標的分子の反応において反応前後での蛍光強度の変化分を正確に測定し、精度良い検出を行うことのできるマイクロ総合分析システムを提供することである。更に、マイクロチップの蛍光検出に適した、特にサイクリングプローブ法を用いたバイオ検査用マイクロチップの蛍光検出に適用したマイクロ総合分析システムを提供することを目的する。そのためには、マイクロチップ内の化学反応の進行に応じて発せられる蛍光の発光量に基づいてマイクロチップ内の測定部の標的分子の存在や量を測定するマイクロ総合分析システムであって、当該化学反応前後に蛍光発光量を測定し、かつ当該蛍光発光量を測定する際に、マイクロチップ内の試薬及びマイクロチップ内の測定部位を含む反応系の温度を、当該化学反応前後において、同一となるように制御することを特徴とするマイクロ総合分析システムとする。

Description

本発明は、マイクロ総合分析システムに関する。特にサイクリングプローブ法を用いて標的核酸配列を検出するための蛍光検出に適用したマイクロ総合分析システムに関する。

近年、微細流路が集積加工されたマイクロチップ上において、複数の溶液を混合して反応させ、当該反応の状態を検出して分析を行うマイクロ総合分析システム（Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ；以下において、「μＴＡＳ」ともいう。）が注目されている。

μＴＡＳでは、試料の量が少ない、反応時間が短い、廃棄物が少ない等のメリットがある。医療分野に使用した場合、検体（血液、尿、拭い液等）の量を少なくすることで患者への負担を軽減でき、試薬の量を少なくすることで検査のコストを下げることができる。また、検体、試薬の量が少ないことから、反応時間が大幅に短縮され、検査の効率化が図れる。さらに、装置が小型であるため小さな医療機関にも設置することができ、場所を選ばず迅速に検査を行うことができる。

マイクロチップ検査システムでは、マイクロポンプ等からマイクロチップに駆動液を供給することにより、マイクロチップ内に収容されている検体及び試薬が流路に沿って送液される。これにより、検体及び試薬は、流路内で混合され反応を生じる。反応液はマイクロチップ内の被検出部に送液され、被検出部において反応液内の標的物質の濃度等の検出が行われる。

例えば、特許文献１には、微細流路が集積加工されたマイクロチップを用いる標的遺伝子の検出例が記載されている。ここで、マイクロチップの被検出部には、標的遺伝子をトラップする物質が予め固定化されている。

先ず、標的遺伝子の増幅に用いる試薬と検体とを反応させて増幅産物を生成する。これにより、検体に標的遺伝子が含まれていれば、増幅産物内に増幅された標的遺伝子が存在することになる。次に、増幅された標的遺伝子を一本鎖に変性させる。これを被検出部に供給することで、被検出部に固定化されている標的遺伝子をトラップする物質に標的遺伝子をトラップさせる。

次に、当該一本鎖の標的遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡプローブを被検出部に供給し、ハイブリダイゼーション反応により標的遺伝子とＤＮＡプローブとを結合させる。ここでＤＮＡプローブは、予め蛍光標識されている。続いてトラップされた標的遺伝子に結合しているＤＮＡプローブに、結合する金コロイド液を被検出部に供給し、金コロイドをＤＮＡプローブに結合させる。次に、結合していない金コロイドを被検出部から除去するため、被検出部に洗浄液を供給する。そして、被検出部の金コロイドの濃度を光学的に検出することにより、標的遺伝子の検出を行っている。

また、特許文献２には、バイオチップ内の標的遺伝子の検出において、蛍光標識された標的遺伝子とＤＮＡプローブとがハイブリダイズした処理液に励起光を照射し、処理液から発せられる蛍光の蛍光強度を検出することが記載されている。

また、特許文献３には、標的遺伝子の検出を高感度に行うことができる技術としてサイクリングプローブ法が適用されるマイクロチップの検査装置が開示されている。

ところで、上記サイクリングプローブ法は、特定（標的）の核酸配列を効率よく検出する方法として知られている。

このサイクリングプローブ法は、標的核酸配列に対して標識化された合成核酸プローブを用いる。プローブの内部には、配列特異的なＲＮＡ鎖を含んでおり、標的核酸の目的配列と結合したプローブのＲＮＡ部分が、ＲｎａｓｅＨにより切断される。切断前のプローブは、ＲＮＡを挟んだ一端側に標識用の蛍光物質が、もう一方に蛍光物質を消光するためクエンチャー物質で修飾されている。切断前の蛍光物質とクエンチャー物質は、隣接しておりＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｔ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ：蛍光共鳴エネルギー遷移現象）と呼ばれる共鳴による励起エネルギーの遷移が蛍光物質からクエンチャーに起こり、蛍光物質の蛍光発光が抑制される。プローブ切断後は、両物質が解離しＦＲＥＴを起こさなくなるため、蛍光物質の蛍光強度が増大する。

サイクリングプローブ法は、この様に作製した標識プローブと反応を利用し、
イ）標的核酸配列と標識化プローブとの結合反応（ハイブリダイゼーション）、
ロ）プローブのＲＮＡ部分の切断、
ハ）切断プローブの標的からの解離と蛍光発光、
を繰り返すことにより標識用蛍光物質を効率良く生成することができる。

また、標的核酸配列の増幅反応との組合せにより、指数関数的に蛍光発光を増幅することができる。

上記原理的作用機構から分かるように、当該方法は、反応時間やプローブ濃度により、蛍光発光量をある程度制御・増幅することができるので、少量の検体試料で分析可能であるという長所を有する。従って、この特長を活かす分析手法の進展が期待されている。

しかしながら、上記検出システムにおいて、蛍光強度により検出を行う場合、精度良い検出を行うためには、ハイブリダイゼーション反応前の蛍光強度を測定し、反応後の蛍光強度を補正する必要が生じる。特に、サイクリングプローブ法を用いる場合には、ハイブリダイゼーション反応前において、蛍光物質からの蛍光はクエンチャーにより吸収されるはずであるが、現実にはクエンチャーに吸収されなかった蛍光物質からの蛍光が微弱な蛍光となって現れている。このため、反応前の蛍光強度を測定し反応後の蛍光強度を補正することには大きな意義がある。
国際公開第２００５／１０８５７１号パンフレット 特開２００１−２５５３２８号公報 国際公開第２００１／０４１９３１号パンフレット

本発明は、上記要請等に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、蛍光色素で標識されたプローブと標的分子の反応において反応前後での蛍光強度の変化分を正確に測定し、精度良い検出を行うことのできるマイクロ総合分析システムを提供することである。更に、マイクロチップの蛍光検出に適した、特にサイクリングプローブ法に代表される標的ＤＮＡ配列の検出反応を用いたバイオ検査用マイクロチップの蛍光検出に適用したマイクロ総合分析システムを提供することである。

本発明に係る上記課題は下記手段によって解決される。

１．マイクロチップ内の化学反応の進行に応じて発せられる蛍光の発光量に基づいてマイクロチップ内の測定部の標的分子の存在や量を測定するマイクロ総合分析システムであって、当該化学反応前後に蛍光発光量を測定し、かつ当該蛍光発光量を測定する際に、マイクロチップ内の試薬及びマイクロチップ内の測定部位を含む反応系の温度を、当該化学反応前後において、同一となるように制御することを特徴とするマイクロ総合分析システム。

２．前記化学反応が、標的ＤＮＡと蛍光標識したプローブとのハイブリダイゼーションにより蛍光共鳴エネルギー遷移現象に変化を生ずる反応であることを特徴とする前記１に記載のマイクロ総合分析システム。

３．化学反応前の蛍光発光量の測定値に基づいて、化学反応後の蛍光発光量の測定値の補正を行うことを特徴とする前記１又は前記２に記載のマイクロ総合分析システム。

４．測定した化学反応前後の蛍光発光量の測定値に対して、両者の差、もしくは両者の比を算出・出力する機能を設けたことを特徴とする前記１乃至前記３のいずれかに記載のマイクロ総合分析シス
テム。

５．前記化学反応前後の蛍光発光量を測定する際に、マイクロチップ内の試薬及びマイクロチップ内の測定部位を含む反応系の温度を、当該化学反応前後において測定し、その測定結果に基づき、蛍光発光量の測定値を補正することを特徴とする前記１乃至前記３のいずれかに記載のマイクロ総合分析システム。

６．補正した化学反応前後の蛍光発光量の測定値に対して、両者の差、もしくは両者の比を算出・出力する機能を設けたことを特徴とする前記５に記載のマイクロ総合分析システム。

本発明の上記手段により、蛍光色素で標識されたプローブと標的分子の反応において反応前後での蛍光強度の変化分を正確に測定し、精度良い検出を行うことのできるマイクロ総合分析システムを提供することができる。更に、マイクロチップの蛍光検出に適した、特にサイクリングプローブ法に代表される標的ＤＮＡ配列の検出反応を用いたバイオ検査用マイクロチップの蛍光検出に適用したマイクロ総合分析システムを提供することができる。

より詳しくは、請求の範囲第１項に係る発明により、蛍光発光量の温度依存性を無視できるような条件にして、精度良い蛍光測定を行うことができる。また、請求の範囲第３項及び第４項に係る発明により、試薬量、濃度、環境条件等の変動に拘わらず、精度良い蛍光測定を行うことができる。更に、マイクロチップの蛍光検出に適した、特にサイクリングプローブ法に代表される標的ＤＮＡ配列の検出反応を用いたバイオ検査用マイクロチップの蛍光検出に適用することにより請求の範囲第２項乃至第４項に係る発明の効果を顕著に発現することができる。

本発明の実施形態に係るバイオチップを用いる検査装置の外観図 本発明の実施形態に係るバイオチップを用いる検査装置の内部構成図 本発明に係るバイオチップ１の構成図 本発明に係るバイオチップを用いる検査装置の制御構成の要部を示す図 本発明の実施形態に係る検出制御（１）のフロー図 本発明の実施形態に係る検出制御（２）のフロー図 本発明の実施形態に係る検出制御（３）のフロー図 本発明の実施形態に係る検出制御（４）のフロー図

符号の説明

１ バイオチップ
４ 光検出部
５ マイクロポンプ
２３ ヒータ
８０ 検査装置
９０ ＣＰＵ
１１１ 被検出部
１２０ 検体収容部
１２４ ＤＮＡプローブ収容部

本発明のマイクロ総合分析システムは、マイクロチップ内の化学反応の進行に応じて発せられる蛍光の発光量に基づいてマイクロチップ内の測定部の標的分子の存在や量を測定するマイクロ総合分析システムであって、当該化学反応前後に蛍光発光量を測定し、かつ当該蛍光発光量を測定する際に、マイクロチップ内の試薬及びマイクロチップ内の測定部位を含む反応系の温度を、当該化学反応前後において、同一となるように制御することを特徴とする。この特徴は、請求の範囲第１項乃至第６項に係る発明に共通する技術的特徴である。

なお、本願において、「マイクロチップ」とは、１枚の基板（チップ）上に数十〜数百ミクロンの微細流路（マイクロチャネル）を作製したものであって、当該チャネル内の小空間に混合、反応、分離、検出などの化学操作（分析システム）等を集積化し可能としたものをいう。また、「バイオ検査用マイクロチップ」とは、上記マイクロチップであって、特にＤＮＡ，ＲＮＡなど核酸やタンパク質などのバイオ分子の混合、分離、合成、抽出などの化学操作と生化学反応を当該マイクロチップ内ですることを可能としたものである。「マイクロ総合分析システム（Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ：μ−ＴＡＳ）」とは、上記マイクロチップないしバイオ検査用マイクロチップと化学操作・化学反応等の結果生ずる物理化学的現象の分析装置とを組み合わせて構成されるシステムをいう。

本願において、「反応系の温度を、当該化学反応前後において、同一となるように制御する」とは、当該反応系の温度が、反応前後で温度差が±１０％以内の差異で一致するように制御することをいう。また、「サイクリングプローブ法」とは、［背景技術］の欄において詳しく説明した核酸の標的配列等の検出方法をいう。

以下、図面に基づいて本発明の実施形態、構成要素等について詳細な説明をするが、一例であり、本実施形態に限定するものではない。

≪蛍光検出装置（検査装置）の構成≫
〈外部構成〉
図１は、本実施形態に係るマイクロチップを用いる検査装置８０の外観図である。検査装置８０は、マイクロチップ１に予め注入された検体と試薬とを自動的に反応させ、反応結果を自動的に出力する装置である。

検査装置８０の筐体８２には、マイクロチップ１を装置内部に挿入するための挿入口８３、表示部８４、メモリカードスロット８５、プリント出力口８６、操作パネル８７、外部入出力端子８８が設けられている。

検査担当者は、図１の矢印方向にマイクロチップ１を挿入し、操作パネル８７を操作して検査を開始させる。

開始操作に伴って、後述するように、検査装置８０内にあるマイクロチップ１内では蛍光反応が開始され、蛍光の検出結果に基づく検査結果が表示部８４に表示される。

検査結果は操作パネル８７の操作により、プリント出力口８６よりプリントを出力したり、メモリカードスロット８５に挿入されたメモリカードに記憶したりすることができる。また、外部入出力端子８８からケーブルを介して、パソコンなどに検査結果を転送し保存することができる。検査終了後、検査担当者はマイクロチップ１を挿入口８３から取り出す。

〈内部構成〉
図２は、本実施形態に係るマイクロチップを用いる検査装置８０の内部構成図である。図２においては、マイクロチップが図１に示す挿入口８３から挿入され、セットが完了している状態を示している。

検査装置８０は、マイクロチップ１に予め注入された検体及び試薬を送液するための駆動液１１を貯留する駆動液タンク１０、マイクロチップ１に駆動液１１を供給するためのマイクロポンプ５、マイクロポンプ５とマイクロチップ１とを駆動液１１が漏れないように接続するパッキン６、マイクロチップ１の必要部分を温調する温度調節ユニット３、マイクロチップ１を温度調節ユニット３及びパッキン６に密着させ、保持させるためのチップ押圧板２、チップ押圧板２を昇降させるための押圧板駆動部２１、マイクロチップ１をマイクロポンプ５に対して正確に位置決めする規制部材２２、マイクロチップ１内の検体と試薬との反応状態等を検出する光検出部４、等を備えている。

《チップ押圧板》
チップ押圧板２は、初期状態においては、図２に示す位置より上方に退避している。これにより、マイクロチップ１は矢印Ｘ方向に挿抜可能であり、検査担当者は挿入口８３（図１参照）から規制部材２２に当接するまでマイクロチップ１を挿入する。

その後、チップ押圧板２は、押圧板駆動部２１により下降してマイクロチップ１に当接し、マイクロチップ１の下面が温度調節ユニット３及びパッキン６に密着される。これにより、マイクロチップ１のセットが完了する。

規制部材２２、押圧板２、温度調節ユニット３及びパッキン６等で本発明のマイクロチップ収容部が構成される。また、チップ押圧板２の内部には、セットされたマイクロチップ１の被検出部１２５，１２６（図３参照。）を加熱するためのヒータ２３が設けられている。

《温度調節ユニット》
温度調節ユニット３は、マイクロチップ１と対向する面にペルチェ素子３１及びヒータ２３を備え、マイクロチップ１が検査装置８０にセットされたときに、ペルチェ素子３１及びヒータ２３がマイクロチップ１に密着するようになっている。試薬が収容されている部分をペルチェ素子３１で冷却して試薬が変性しないようにしたり、検体と試薬とが反応する部分をヒータ２３で加熱して反応を促進させたりする。

《光検出部》
光検出部４は、本発明の発光部としてのＬＥＤ等の励起光源４１、励起光源４１から発せられた励起光の波長帯域を制限する励起光フィルタ４２、励起光フィルタ４２を透過した励起光をマイクロチップ１の２つの被検出部１２５，１２６（図３参照。）をカバーするサイズに適合したビームスポットに整形するための集光レンズ４３、集光レンズ４３を透過した励起光を反射してマイクロチップ１の２つの被検出部１２５，１２６に照射するとともに当該励起光により発せられたマイクロチップ１の被検出部１２５，１２６からの蛍光を透過するダイクロイック・ミラー４４、ダイクロイック・ミラー４４を透過した蛍光を受光部の４７に導光するための受光レンズ４５、受光レンズ４５を透過した蛍光の波長帯域を制限する検出光フィルタ４６、検出光フィルタ４６を透過した蛍光を受光するフォトダイオードからなる受光部４７等から構成されている。

《マイクロポンプ》
マイクロポンプ５は、ポンプ室５２、ポンプ室５２の容積を変化させる圧電素子５１、ポンプ室５２のマイクロチップ１側に位置する第１絞り流路５３、ポンプ室の駆動液タンク１０側に位置する第２絞り流路５４、等から構成されている。第１絞り流路５３及び第２絞り流路５４は絞られた狭い流路となっており、また、第１絞り流路５３は第２絞り流路５４よりも長い流路となっている。

駆動液１１を順方向（マイクロチップ１に向かう方向）に送液する場合には、まず、ポンプ室５２の容積を急激に減少させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、短い絞り流路である第２絞り流路５４において乱流が発生し、第２絞り流路５４における流路抵抗が長い絞り流路である第１絞り流路５３に比べて相対的に大きくなる。これにより、ポンプ室５２内の駆動液１１は、第１絞り流路５３の方に支配的に押し出され送液される。次に、ポンプ室５２の容積を緩やかに増加させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、ポンプ室５２内の容積増加に伴って駆動液１１が第１絞り流路５３及び第２絞り流路５４から流れ込む。このとき、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて長さが短いので、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて流路抵抗が小さくなり、ポンプ室５２内には第２絞り流路５４の方から支配的に駆動液１１が流入する。以上の動作を圧電素子５１が繰り返すことにより、駆動液１１が順方向に送液されることになる。

一方、駆動液１１を逆方向（駆動液タンク１０に向かう方向）に送液する場合には、まず、ポンプ室５２の容積を緩やかに減少させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて長さが短いので、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて流路抵抗が小さくなる。これにより、ポンプ室５２内の駆動液１１は、第２絞り流路５４の方に支配的に押し出され送液される。次に、ポンプ室５２の容積を急激に増加させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、ポンプ室５２内の容積増加に伴って駆動液１１が第１絞り流路５３及び第２絞り流路５４から流れ込む。このとき、短い絞り流路である第２絞り流路５４において乱流が発生し、第２絞り流路５４における流路抵抗が長い絞り流路である第１絞り流路５３に比べて相対的に大きくなる。これにより、ポンプ室５２内には第１絞り流路５３の方から支配的に駆動液１１が流入する。以上の動作を圧電素子５１が繰り返すことにより、駆動液１１が逆方向に送液されることになる。

（マイクロチップの構成）
図３は、本実施形態に係るマイクロチップ１の構成図である。一例の構成を示すものであり、これに限定されない。

図３（ａ）において矢印は、検査装置８０にマイクロチップ１を挿入する挿入方向であり、図３（ａ）は挿入時にマイクロチップ１の下面となる面を図示している。また、２つの被検出部１２５，１２６部に示した円は励起光のビームスポットを示す。図３（ｂ）はマイクロチップ１の側面図である。

図３（ｂ）に示すように、マイクロチップ１は溝形成基板１０８と、溝形成基板１０８を覆う被覆基板１０９から構成されている。

溝形成基板１０８には、図３（ｃ）に示すように、検体と試薬とをマイクロチップ１上で混合・反応させるための微細流路及び流路エレメントが配設されている。図３（ｃ）では、微細流路を矢印で、流路エレメントを四角形で模式的に示している。

マイクロチップ１上には、以下の流路エレメントが設けられている。

駆動液注入部１１０ａ〜１１０ｅは、マイクロポンプから駆動液１１を注入するための注入部である。

検体注入部１１３は、マイクロチップ１に検体を注入するための注入部である。

駆動液注入部１１０ａ〜１１０ｅの下流には、それぞれ、検体を収容する検体収容部１２０、標的遺伝子のポジティブコントロール用試薬収容部１２１、ネガティブコントロール用試薬収容部１２２、標的遺伝子を増幅するための酵素及び基質の収容部１２３、プライマー及び蛍光標識されたＤＮＡプローブの収容部１２４が設けられている。

なお、標的遺伝子及びその増幅産物は、本発明に係る標的分子に相当する。ＤＮＡプローブは、本発明に係る標的ＤＮＡとハイブリダイゼーション反応を起こす蛍光標識したプローブに相当する。ポジティブコントロール用試薬は、標的遺伝子として特定したいＤＮＡ配列を持つ試薬である。

標的遺伝子を増幅させるための試薬、ポジティブコントロール用試薬、ネガティブコントロール用試薬、プライマー及びＤＮＡプローブは、各収容部に予め収容されている。

ポジティブコントロール用試薬とネガティブコントロール用試薬は、検査が正常に行われたか否かをモニタリングするための試薬である。

これらの各収容部は、マイクロチップ１を検査装置８０にセットした際にペルチェ素子３１に対向し、収容されている検体や試薬が変性しないように冷却される。

検体収容部１２０及びポジティブコントロール収容部１２１の下流には、標的遺伝子とポジティブコントロール用試薬を増幅させるための試薬とが反応して増幅産物を生成するための反応部１２５が設けられている。

また、ネガティブコントロール収容部１２２及び検体収容部１２０の下流には、標的遺伝子を増幅させるための試薬とが反応して増幅産物生成するための反応部１２６が設けられている。この反応部１２５、１２６は、被検出部を兼ね、本発明のマイクロチップ内の測定部位に相当する。

反応部１２５、１２６は、マイクロチップ１を検査装置８０にセットした際にヒータ２３に対向し、増幅促進のために過熱される。

反応部１２５、１２６には、１２３及び１２４の収納部からからの流路が合流し、増幅用試薬やプローブが同時もしくは、遂次供給される。

これら試薬の反応により、標的遺伝子の増幅と、増幅産物と蛍光プローブのハイブリダイゼーション反応及び蛍光物質とクエンチャーとの遊離反応も同時進行させ、増幅から蛍光物質生成までの反応を一括して進行させる。

被検出部１２５，１２６の窓にあたる被覆基板１０９は、光学的な検出を行うことができるよう、透明なガラスや樹脂等の材料から構成されている。

検体及び各試薬の流れについて説明する。まず、マイクロチップ１による検査を行うに先立って、検査担当者は検体を検体注入部１１３から注射器等を用いて注入する。検体注入部１１３から注入された検体は、連通する微細流路を通って検体収容部１２０に収容される。

次に、検体の注入されたマイクロチップ１は、検査担当者により図１に示す検査装置８０の挿入口８３に挿入され、図２に示すようにセットされる。これにより、マイクロポンプ５を駆動して駆動液注入部１１０ａ〜１１０ｅから駆動液１１を注入することが可能となる。

駆動液注入部１１０ａから駆動液１１を注入すると、連通する微細流路を通って検体収容部１２０に収容されている検体が押し出され、被検出部１２５に検体が送り込まれる。

駆動液注入部１１０ｃから駆動液１１を注入すると、連通する微細流路を通ってネガティブコントロール収容部１２２に収容されているネガティブコントロール用試薬（例えば純水）が押し出され、反応部（被検出部）１２６にネガティブコントロール用試薬が送り込まれ、先に送液された検体と混合する。

駆動液注入部１１０ｂから駆動液１１を注入すると、連通する微細流路を通ってポジティブコントロール収容部１２１に収容されているポジティブコントロール用試薬（標的と同一のＤＮＡ配列箇所を持つ試薬）が押し出され、反応部（被検出部）１２５にポジティブコントロールが送り込まれ、先に送液された検体と混合する。

駆動液注入部１１０ｄと１１０ｅから駆動液１１を注入し、連通する微細流路を通って収容部１２３、１２４から、標的遺伝子を増幅するための酵素及び基質とプライマー及び蛍光標識されたＤＮＡプローブが、反応部（被検出部）１２５、１２６にそれぞれ送りこまれ、先に送液された検体・コントロール液の混合液と混合する。

その後、反応部（被検出部）１２５，１２６をヒータ２３により加熱することでそれぞれの被検出部において標的遺伝子（及びポジティブコントロールＤＮＡ）の増幅と、増幅産物と蛍光プローブのハイブリダイゼーション反応及び蛍光物質とクエンチャーとの遊離反応も同時進行させ、増幅から蛍光物質生成までの反応を一括して進行させる。

そして、被検出部１２５、１２６に光検出部４の励起光源４１から励起光を照射し、被検出部１２５、１２６から発せられる蛍光を受光部４７で受光することにより光検出を行うことが可能となる。

なお、被検出部１２５、１２６の検出結果を基に、検査の総合判定を行うルールの一例を次に記載する（表１参照。）。

ポジティブコントロール用試薬は、その試薬単独でも、標的遺伝子と同等の増幅反応と蛍光プローブとのハイブリダイゼーション反応及び蛍光物質の生成反応を起こす。ネガティブコントロール用試薬は、その試薬単独では、蛍光物質の生成反応を起こさない。

これらの試薬を検体と混合した液で反応と検出を行うことで、検査結果の良否の判定が可能となる。

陽性すなわち検体に標的遺伝子が含まれる場合、ポジティブコントロール用試薬＋検体、及びネガティブコントロール用試薬＋検体のいずれも蛍光発光が測定される。

陰性すなわち検体に標的遺伝子が含まれない場合、ポジティブコントロール用試薬＋検体は、ポジティブコントロール用試薬の反応による蛍光発光が測定されるが、ネガティブコントロール用試薬＋検体は、反応が生じず蛍光が発光しない。これら２つのケースは、正常な反応を行った検査結果として扱うことができる。

一方、例えば、検体に反応の阻害物質が混入した場合などは、ポジティブコントロール用試薬＋検体及びネガティブコントロール用試＋検体のいずれも蛍光発光が生じない。

また、ポジティブコントロール用試薬＋検体の蛍光発光無し、ネガティブコントロール用試＋検体の蛍光発光は有りの様な検査結果が得られる場合は、チップに収容した試薬の失活などの異常が考えられる。これら２つのケースは、異常な反応を行った検査結果として、再検査を促すことが可能となる。

なお、バイオチップ内での反応制御等について補足説明をする。

１）チップ内でＤＮＡ増幅や標的ＤＮＡと蛍光物質で修飾された標識プローブとの反応を制御・促進させる。

２）チップに設けた微細流路に、予め反応試薬を導入しておき、マイクロポンプによる送液制御で、所定の手順・時間・タイミングで、混合・分岐などの化学操作が自動的に進行する様に制御される。

３）反応を促進させたり、制御するために、試薬や混合試薬を温調する機構を設ける。

また、装置に搭載したヒータなどの温調機構により、チップを介して温度制御する。

４）チップ上の反応検出部は、標的ＤＮＡを検出するエリアの他に、試薬や反応の正常／異常、反応阻害物質の混入などを試験するためのポジティブコントロールやネガティブコントロールなどのモニタリング用の反応を併設する方が、確度を高めるために好ましい。

５）この様に、複数の反応を同時に検出するために、蛍光検出部を走査してチップ上の各検出部を測定できる様な構成にする。

６）なお、当該チップは、励起光を透過する分光透過特性を持つカバー部材（図３における被覆基板１０９及び被検出部の窓１１１ｃ）を蛍光発光部の上面に有していることが好ましい。また、当該カバー部材は蛍光をも透過する分光透過特性を持っていることが好ましい。

図４は、本実施形態に係るバイオチップを用いる検査装置の制御構成の要部を示す図である。本発明の制御に関係する主な構成要素について示している。

プログラムに従って検査装置８０の制御を実行するＣＰＵ９０を中心に、バス９１により、ＲＯＭ９２、ＲＡＭ９３、不揮発性メモリ９４、光検出部４、ペルチェ素子３１、ヒータ２３、表示部８４、操作パネル８７、等が相互に接続されている。

ＲＯＭ９２は、ＣＰＵ９０によって実行される各種制御プログラムやデータ等を記憶する。

ＲＡＭ９３は、ＣＰＵ９０によってワークエリアとして利用され、ＣＰＵ９０が制御を実行する際に必要なプログラムやデータを一時的に記憶する。

不揮発性メモリ９４は、光検出部４による検出結果等を記憶する。

ＣＰＵ９０がＲＯＭ９２に記憶されているプログラムに基づいて制御を実行する。本発明の制御部として機能する。

光検出部４、ペルチェ素子３１、ヒータ２３、表示部８４及び操作パネル８７についての説明は、前述したので省略する。

（検出制御のフロー）
図５〜８は、本実施形態に係る検出制御のフローの一例を示す図である。ヒータ２３による加熱が行われることによりサイクリングプローブ法によるＤＮＡ増幅及び標識プローブとのハイブリダイゼーション反応が開始される場合を一例に説明する。ヒータ２３が本発明の反応開始手段に相当する。

検出制御は、ＲＯＭ９２に記憶されている検出制御プログラムに基づいてＣＰＵ９０が処理を実行することにより行われる。尚、前提として、検査装置８０の操作パネル８７から検査開始の入力がされて検査が開始され、既に被検出部１２５、１２６には、チップ内の流路で混合などの化学操作された各試薬が送り込まれているものとする。

以下において、本発明の実施形態に係る３種の検出制御フローについて説明する。

１）検出制御（１）のフロー；図５参照
まず、ＣＰＵ９０は、光検出部４により反応前の蛍光強度を測定する（ステップＳ１１）。これにより、クエンチャーに吸収されなかった蛍光物質からの微弱な蛍光を検出することが可能となる。この際、被検出部１２５，１２６の温度を測定する（ステップＳ１２）。

次に、ＣＰＵ９０は、所定時間が経過した後、ヒータ２３により被検出部１２５，１２６の加熱（温調）を開始する（ステップＳ１３）。ＤＮＡ増幅及びハイブリダイゼーション反応に適した温度に温調制御される。

次に、十分にＤＮＡ増幅及びハイブリダイゼーション反応が進行するために要する所定時間Ｔ１が経過すると（ステップＳ１４）、加熱を止め（ステップＳ１５）、その後、反応前の温度と実質上同一の温度になるまで待機する（ステップＳ１６）。つまり、ステップＳ１６においてＣＰＵ９０は、マイクロチップ内の試薬及びマイクロチップ内の測定部位を含む反応系の温度を、当該化学反応前後において、同一となるように制御する。

次に、ＣＰＵ９０は、光検出部４により反応後の蛍光強度を測定する（ステップＳ１７）。

以上のように、本実施形態によれば蛍光発行量の温度依存性を無視できるような条件に反応系の温度を制御することにより、精度良い蛍光測定を行うことができる。

２）検出制御（２）のフロー；図６参照
上記実施形態では、反応前の測定をヒータ２３による加熱前に蛍光強度の測定を行ったが、加熱を開始しても暫くＤＮＡ増幅及びハイブリダイゼーション反応が進行しないような場合には、加熱と同時、又は加熱後ＤＮＡ増幅及びハイブリダイゼーション反応が進行する前に蛍光強度の測定を行ってもよい。加熱後ＤＮＡ増幅及びハイブリダイゼーション反応が進行する前に蛍光強度の測定を行うようにすると、例えば、被検出部１２５，１２６の加熱による液の対流等が蛍光強度に与える影響を取り除くことができる。また、温度により蛍光強度が大きく変化する蛍光物質の場合、その影響を取り除くことができる。この場合には、加熱開始から所定時間経過した後に反応前の検出を行うよう制御すればよい。具体的には、下記の検出制御フローに従って行うことができる。

まず、ＣＰＵ９０は、ヒータ２３により被検出部１２５，１２６の加熱（温調）を開始する（ステップＳ２１）。次に、ＣＰＵ９０は、被検出部の温度が所定の温度に到達したか判断する（ステップＳ２２）。これにより、ＤＮＡ増幅及びハイブリダイゼーション反応に適した所定の温度に温調制御される。被検出部１２５，１２６の温度が所定の温度に到達した場合には（ステップ２２：Ｙｅｓ）、ＣＰＵ９０は、光検出部４により反応前の蛍光強度を測定する（ステップＳ２３）。なお、温度が所定の温度に到達していない場合には（ステップ２２：Ｎｏ）、所定の温度に到達するまで待機し続け、到達した後に当該測定をする。これにより、クエンチャーに吸収されなかった蛍光物質からの微弱な蛍光を検出することが可能となる。

次に、十分にＤＮＡ増幅及びハイブリダイゼーション反応が進行するために要する所定時間Ｔ２が経過下後、ＣＰＵ９０が温度調整ユニット３を制御し続けることにより反応前の温度と実質上同一の温度に制御される（ステップＳ２４）。

次に、ＣＰＵ９０は、光検出部４により反応後の蛍光強度を測定する（ステップＳ２５）。

測定終了後、ＣＰＵ９０は、温度調整ユニット３による被検出部１２５，１２６の加熱を止める（ステップＳ２６）。

３）検出制御（３）のフロー：図７参照
まず、ＣＰＵ９０は、光検出部４により反応前の蛍光強度（蛍光発光量）を測定する（ステップＳ３１）。これにより、クエンチャーに吸収されなかった蛍光物質からの微弱な蛍光を検出することが可能となる。

次に、ＣＰＵ９０は、所定時間Ｔ１が経過した後（ステップＳ３２）、ヒータ２３により被検出部１２５，１２６を加熱する（ステップＳ３３）。ＤＮＡ増幅及びハイブリダイゼーション反応に適した温度に温調制御される。

次に、十分にＤＮＡ増幅及びハイブリダイゼーション反応が進行するために要する所定時間Ｔ２が経過すると（ステップＳ３４）、ＣＰＵ９０は、光検出部４により反応後の蛍光強度を測定する（ステップＳ３５）。

次に、ＣＰＵ９０は、反応前の蛍光強度を基に反応後の蛍光強度を補正する（ステップＳ３６）。例えば、反応後の蛍光強度から反応前の蛍光強度を差し引くこと、又は、反応前後の蛍光発光量の比として補正を行う。

次に、ＣＰＵ９０は、補正後の蛍光強度を表示部８４に表示したり、不揮発性メモリ９４に保存したりする（ステップＳ３７）。その後、フローは終了する。

以上のように、本実施形態によれば、反応による蛍光強度の変化分を補正することにより正確に測定することができる。

４）検出制御（４）のフロー：図８参照
図８に示す検出制御（４）のフローは前述の検出制御（３）のフローの変形例であり、同図と共通のフローに関しては同符号を付すことにより説明を省略する。
まず、ＣＰＵ９０は、反応系の温度の測定及び、光検出部４により反応前の蛍光強度を測定する（ステップＳ３１ｂ）。これにより、クエンチャーに吸収されなかった蛍光物質からの微弱な蛍光を検出することが可能となる。

ステップＳ３２乃至Ｓ３４で反応を行わせた後に、ＣＰＵ９０は、反応系の温度の測定及び、光検出部４により反応後の蛍光強度を測定する（ステップＳ３５ｂ）。

次に、ＣＰＵ９０は、反応前後の反応系の温度の測定結果を基に反応後の蛍光強度を補正する（ステップＳ３６ｂ）。例えば、反応後の蛍光強度から反応前の蛍光強度を差し引くこと、又は、反応前後の蛍光発光量の比として補正を行う。

次に、ＣＰＵ９０は、補正後の蛍光強度を表示部８４に表示したり、不揮発性メモリ９４に保存したりする（ステップＳ３７）。その後、フローは終了する。
以上のように、本実施形態によれば、蛍光発光量の温度依存性を無視できるような条件にして、精度良い蛍光測定を行うことができる。

なお、本発明においては、マイクロチップ内の化学反応に応じて発せられる蛍光の発光量に基づいてマイクロチップ内の測定部の標的分子の存在や量を測定するために、当該化学反応前後に蛍光発光量を測定し、かつ当該蛍光発光量を測定する際に、マイクロチップ内の試薬及びマイクロチップ内の測定部位を含む反応系の温度を、当該化学反応前後において、同一となるように制御することを特徴とする。

更に、前記測定結果を反応前後の蛍光発光量の差もしくは反応前後の蛍光発光量の比として算出・出力する機能を設けた態様とすることが好ましい。これにより、試薬量、濃度、環境条件等の変動に拘わらず、精度良い蛍光測定を行うことができる。

特に、本発明の上記手段をサイクリングプローブ法を用いたマイクロチップの蛍光検出・測定に適用することにより本発明の効果を顕著に発現することができる。

〈蛍光物質及びクエンチャー〉
蛍光物質は、特定の波長の励起光を吸収し、吸収したエネルギーを、非常に短時間で、吸収した波長とは異なる波長の光、いわゆる蛍光を発生じさせる物質である。この励起光の吸収から蛍光発生の過程では、熱放出によるエネルギー損失が起こるため、蛍光は、励起光に比べエネルギーが低い、つまり長波長側にシフトした波長となる（ストークス・シフト）。励起光波長及びストークス・シフト（及びそれに伴う蛍光波長）は、各種蛍光物質において特徴的な特性である。

蛍光共鳴エネルギー遷移は、例えば、蛍光物質としての蛍光色素（Ｆ１）と色素（Ｆ２）（多くの場合蛍光色素）を互いに連結して相互作用している際に、Ｆ２の吸収波長がＦ１の蛍光波長と重複する場合に観察される。

これは、第一の蛍光分子Ｆ１が波長λ１の光によって励起されたのちＦ１は、波長λ１＋ｓ１の光を蛍光として放射する。このときのｓ１は、Ｆ１のストークスシフト量である。第２の蛍光分子Ｆ２として、その吸収波長の広がりがλ１＋ｓ１と重複すれば、この光を吸収することができる。このように、Ｆ２は、λ１＋ｓ１によって励起され、続いて波長λ２＋ｓ２を放射する。

この場合、励起光λ１で励起されないように第２の蛍光色素を選択することで、連結している場合には、λ１の励起でλ２＋ｓ２の蛍光が観察され、連結が切れた場合には、λ１の励起で、λ１＋ｓ１の蛍光が観察される。このような蛍光の遷移現象は統計的で、エネルギー遷移の効率は、ｒ^−６に比例するといわれている。ｒは、２つの蛍光分子間の平均間隔を示す。

本発明に使用できる、蛍光色素としては、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、ダンシル型（ジメチルアミノナフタレンスルホン酸型）蛍光色素、ＮＢＤ型色素、ピレン、ＢＯＤＩＰＹ誘導体、サイ（ｃｙ）色素，マラカイトグリーンなどが上げられ、特許文献などで例示されている蛍光色素としては、例えば米国特許第５４８６６１６号明細書、特開平２−１９１６７４号公報、同５−２８７２０９号公報、同５−２８７２６６号公報、同８−４７４００号公報、同９−１２７１１５号公報、同７−１４５１４８号公報、同６−２２２０５９号公報に記載される蛍光色素、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，５，２３１ページ（１９９５年）に記載される蛍光色素などを用いることができ、また、特開平２−１９１６７４号公報等に記載されている蛍光色素などを用いることが出来る。

好ましい色素の組み合わせとしては、当業者が容易に組み合わせることが出来るもの（例えばインビトロジェン社、アプライドバイオシステムズ社、ロシュ社などのホームページ参照。）をあげることができ、好ましくはフルオレセインとカルボキシローダミンの組み合わせなどを挙げられる。

Ｆ２に使用できる色素としては、蛍光をしていなくてもよく、例えば、ダビシル、特表２００３−５１６６１６記載のｅｃｌｉｐｓｅ（ｅｐｏｃｈ社商標）、米国特許７０１９１２９記載のＢｌａｃｋＨａｌｌＱｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＱＨ一般にダーククエンチャーＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社商標）、米国特許２００６０１７７８５７記載のＢｌａｃｃｂｅｒｒｙＱｕｅｎｃｈｅｒ（Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社商標）などを使用することが出来る。

Claims (6)

1. マイクロチップ内の化学反応の進行に応じて発せられる蛍光の発光量に基づいてマイクロチップ内の測定部の標的分子の存在や量を測定するマイクロ総合分析システムであって、当該化学反応前後に蛍光発光量を測定し、かつ当該蛍光発光量を測定する際に、マイクロチップ内の試薬及びマイクロチップ内の測定部位を含む反応系の温度を、当該化学反応前後において、同一となるように制御することを特徴とするマイクロ総合分析システム。
2. 前記化学反応が、標的ＤＮＡと蛍光標識したプローブとのハイブリダイゼーションにより蛍光共鳴エネルギー遷移現象に変化を生ずる反応であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のマイクロ総合分析システム。
3. 化学反応前の蛍光発光量の測定値に基づいて、化学反応後の蛍光発光量の測定値の補正を行うことを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記載のマイクロ総合分析システム。
4. 測定した化学反応前後の蛍光発光量の測定値に対して、両者の差、もしくは両者の比を算出・出力する機能を設けたことを特徴とする請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載のマイクロ総合分析システム。
5. 前記化学反応前後の蛍光発光量を測定する際に、マイクロチップ内の試薬及びマイクロチップ内の測定部位を含む反応系の温度を、当該化学反応前後において測定し、その測定結果に基づき、蛍光発光量の測定値を補正することを特徴とする請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載のマイクロ総合分析システム。
6. 補正した化学反応前後の蛍光発光量の測定値に対して、両者の差、もしくは両者の比を算出・出力する機能を設けたことを特徴とする請求の範囲第５項に記載のマイクロ総合分析システム。