WO2009081733A1 - マイクロチップ - Google Patents

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WO2009081733A1
WO2009081733A1 PCT/JP2008/072410 JP2008072410W WO2009081733A1 WO 2009081733 A1 WO2009081733 A1 WO 2009081733A1 JP 2008072410 W JP2008072410 W JP 2008072410W WO 2009081733 A1 WO2009081733 A1 WO 2009081733A1
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WO
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probe
microchip
reagent
nucleic acid
amplification
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PCT/JP2008/072410
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Inventor
Akihisa Nakajima
Yasuhiro Sando
Kusunoki Higashino
Original Assignee
Konica Minolta Medical & Graphic, Inc.
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Publication date
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    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
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    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
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    • B01L2200/143—Quality control, feedback systems
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
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    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/00029—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor provided with flat sample substrates, e.g. slides
    • G01N2035/00099—Characterised by type of test elements
    • G01N2035/00158—Elements containing microarrays, i.e. "biochip"

Definitions

  • the present invention relates to a microchip for genetic testing.
  • Microchips use a photolithographic process (a method of creating a groove by etching a pattern image with a chemical) or a groove using a laser beam on a substrate made of a resin material or glass material, and flow a reagent or specimen.
  • a fine channel and a liquid reservoir for storing reagents have been provided, and various patterns have been proposed.
  • the reagent and specimen contained in the microchip are sent by a micropump or the like, and the reagent and specimen are subjected to an amplification reaction to the detection section. Guide and detect.
  • the target substance is detected by, for example, an optical detection method.
  • the microchip can detect even a small amount of sample by amplification reaction.
  • an inspection error may occur due to contamination or contamination of a reaction inhibitory substance, or a failure in amplification due to reagent inactivation, inappropriate reaction conditions, or the like. It is customary to analyze the controls in parallel to detect that such an inspection error has occurred.
  • Patent Document 1 a positive control and a negative control are used as controls, and a mixed liquid of specimen and reagent (1), a mixed liquid of positive control and reagent (2), a mixed liquid of negative control and reagent (3) is obtained. And then (A) a mixture of the mixture (1) and the mixture (2); (B) Only mixed liquid (1), (C) Mixture (2) only, (D) Only the mixture (3), A microreactor is disclosed in which each fluid is subjected to an amplification reaction in an amplification section to detect the increased production substance.
  • International Publication No. 07/058077 Pamphlet International Publication No. 07/058077 Pamphlet
  • each fluid of (a) to (d) needs to be amplified and reacted by a corresponding amplifying unit to detect a by-product, so that the flow path is complicated. There was a problem of becoming. Further, since the ratio of the inhibitory substance brought from the specimen is different between the fluid (a) and the fluid (b), there is a problem that the influence of the amplification inhibition cannot be detected with high accuracy.
  • the present invention provides a microchip capable of detecting the presence of a specific target substance by performing an amplification reaction and detecting the influence of amplification inhibition with high accuracy even with a simple flow path configuration. With the goal.
  • Specimen storage part into which a specimen or a sample liquid containing DNA extracted from the specimen is injected, a reagent storage part in which a reagent used for nucleic acid amplification reaction is stored, and an internal control storage part in which an internal control is stored
  • a negative control accommodating portion for accommodating a negative control, a fine channel communicating with each of the accommodating portions, and a detecting portion for detecting a nucleic acid amplification reaction, wherein the internal control accommodating portion
  • the internal control that has been fed through the fine channel from the section into a first channel and a second channel, and the fine channel is fed through the first channel
  • the internal control, the sample liquid from the sample container and the reagent from the reagent container are merged to form a first mixed solution, and the second flow path is
  • the liquid internal control, the negative control from the negative control container, and the reagent from the reagent container are merged to form a second mixed liquid, and the first mixed liquid and the second mixed liquid
  • a microchip characterized
  • the probe housing portion includes a first probe DNA that hybridizes with a specific DNA sequence of the specimen and a second probe DNA that hybridizes with a specific DNA sequence of the internal control.
  • the microchip according to (1) wherein the microchip is contained and is modified with a fluorescent dye having a fluorescence wavelength different from that of the first probe DNA and the second probe DNA.
  • the present invention it is possible to obtain a microchip capable of detecting the presence of a specific target substance by performing an amplification reaction and accurately detecting the influence of amplification inhibition even with a simple flow path configuration. It becomes.
  • the inspection is performed. It can be determined whether or not the operation has been performed normally.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating an example of a flow path configuration of a microchip 1.
  • FIG. 1 is an external view of a microchip analysis system 8 using the microchip according to the present embodiment.
  • the microchip analysis system 8 is a device that automatically reacts a sample and a reagent previously injected into the microchip 1 and automatically outputs a reaction result.
  • a housing 82 of the microchip analysis system 8 includes an insertion port 83 for inserting the microchip 1 into the apparatus, a display unit 84, a memory card slot 85, a print output port 86, an operation panel 87, and an external input / output terminal 88. Is provided.
  • the person in charge of inspection inserts the microchip 1 in the direction of the arrow in FIG. 1 and operates the operation panel 87 to start the inspection.
  • the reaction in the microchip 1 is automatically inspected, and when the inspection is completed, the result is displayed on the display unit 84.
  • the inspection result can be output from the print output port 86 or stored in a memory card inserted into the memory card slot 85 by operating the operation panel 87. Further, data can be stored in the personal computer or the like from the external input / output terminal 88 using, for example, a LAN cable. After completion of the inspection, the inspection person takes out the microchip 1 from the insertion port 83.
  • FIG. 3 is a configuration diagram of the microchip analysis system 8 using the microchip according to the present embodiment.
  • FIG. 2 shows a state where the microchip is inserted from the insertion port 83 shown in FIG. 1 and the setting is completed.
  • the microchip analysis system 8 includes a driving liquid tank 70 that stores a driving liquid L0 for feeding a sample and a reagent previously injected into the microchip 1, and a micropump 5 for supplying the driving liquid L0 to the microchip 1.
  • the pump connection part 6 that connects the micropump 5 and the microchip 1 so that the driving liquid L0 does not leak, the temperature control unit 3 that controls the temperature of the necessary part of the microchip 1, and the temperature control so that the microchip 1 does not deviate.
  • a chip pressing plate 2 for bringing the chip pressing plate 2 into close contact with the unit 3 and the pump connection unit 6; a pressing plate driving unit 21 for moving the chip pressing plate 2 up and down; a regulating member 22 for positioning the microchip 1 with respect to the micro pump 5 with high accuracy;
  • the chip pressing plate 2 is retracted upward from the position shown in FIG. 2 in the initial state. Thereby, the microchip 1 can be inserted / removed in the direction of the arrow X, and the person inspecting inserts the microchip 1 from the insertion port 83 (see FIG. 1) until it comes into contact with the regulating member 22. Thereafter, the chip pressing plate 2 is lowered by the pressing plate driving unit 21 and comes into contact with the microchip 1, and the lower surface of the microchip 1 is in close contact with the temperature adjustment unit 3 and the pump connection unit 6.
  • the temperature control unit 3 includes a Peltier element 31 and a heater 32 on the surface facing the microchip 1.
  • the Peltier element 31 and the heater 32 are attached to the microchip 1. It comes to adhere closely. A part containing the reagent is cooled by the Peltier element 31 so that the reagent is not denatured, or the reaction part 139 where the specimen and the reagent react is heated by the heater 32 to promote the reaction.
  • the control temperature at the time of heating in the reaction unit 139 can be changed as appropriate. Depending on the type of nucleic acid to be detected, the temperature at which the amplification reaction occurs and the temperature of hybridization with the probe vary.By switching the control temperature, whether the nucleic acid to be detected is contained or not is determined by the amplification reaction. You may make it detect by presence or absence.
  • the microchip 1 is detected as excitation light through an excitation filter that allows light of a wavelength in a specific region to pass through, for example, light from the light emitting unit 4a composed of a mercury lamp Irradiate the fluorescent material present in the portion 148. Fluorescence emitted from the fluorescent material irradiated with the excitation light is transmitted, and the transmitted light is detected by the light receiving unit 4b.
  • the light receiving portion 4b is integrally provided inside the chip pressing plate 2.
  • the light emitting unit 4a and the light receiving unit 4b are provided so as to face the detecting unit 148 of the microchip 1 shown in FIG. 2 (generically referring to the detecting units 148a and 148b, hereinafter the same).
  • a micro pump using a piezoelectric element using a piezoelectric element
  • the present invention is not limited thereto, and a syringe pump, a diaphragm type micro pump, an electroosmotic flow pump, or the like may be used.
  • the micropump 5 is located on the pump chamber 52, the piezoelectric element 51 that changes the volume of the pump chamber 52, the first throttle channel 53 located on the microchip 1 side of the pump chamber 52, and the driving fluid tank 70 side of the pump chamber.
  • the second throttle channel 54 is formed.
  • the first throttle channel 53 and the second throttle channel 54 are narrow and narrow channels, and the first throttle channel 53 is longer than the second throttle channel 54.
  • the piezoelectric element 51 is driven so as to rapidly reduce the volume of the pump chamber 52. Then, turbulent flow is generated in the second throttle channel 54, which is a short throttle channel, and the channel resistance in the second throttle channel 54 is relative to that of the first throttle channel 53, which is a long throttle channel. Become bigger. As a result, the driving liquid L0 in the pump chamber 52 is predominantly pushed toward the first throttle channel 53 and fed. Next, the piezoelectric element 51 is driven so that the volume of the pump chamber 52 is gradually increased. Then, the driving liquid L0 flows from the first throttle channel 53 and the second throttle channel 54 as the volume in the pump chamber 52 increases.
  • the driving liquid L 0 flows into the pump chamber 52 predominantly from the second throttle channel 54.
  • the piezoelectric element 51 repeats the above operation, the driving liquid L0 is fed in the forward direction.
  • the piezoelectric element 51 is driven so as to gently reduce the volume of the pump chamber 52. Then, since the length of the second throttle channel 54 is shorter than that of the first throttle channel 53, the channel resistance of the second throttle channel 54 is smaller than that of the first throttle channel 53. . As a result, the driving liquid L0 in the pump chamber 52 is predominantly pushed out toward the second throttle channel 54 and fed. Next, the piezoelectric element 51 is driven so that the volume of the pump chamber 52 is rapidly increased. Then, the driving liquid L0 flows from the first throttle channel 53 and the second throttle channel 54 as the volume in the pump chamber 52 increases.
  • the pump connection portion 6 is formed of a contact surface made of a resin having flexibility (elasticity, shape followability) such as polytetrafluoroethylene or silicon resin in order to ensure necessary sealing performance and prevent leakage of driving liquid. It is preferred that Such a close contact surface having flexibility may be, for example, due to the constituent substrate of the microchip itself, or may be a separate additional having flexibility attached around the flow path opening in the pump connection portion 6. It may be due to a member.
  • a resin having flexibility such as polytetrafluoroethylene or silicon resin
  • FIG. 3 is a schematic configuration diagram illustrating the relationship between the flow path elements of the microchip 1
  • FIG. 4 is a schematic diagram illustrating an example of the flow path configuration of the microchip 1.
  • the internal control is divided into two parts by the dividing unit SP, and one of the divided internal controls is sent to the first flow path 131, and the sample and A “first mixed solution” is created by combining with a reagent.
  • the other of the divided internal controls is sent to the second flow path 132 and merged with the negative control and the reagent to create a “second mixture”.
  • the “first mixed solution” and the “second mixed solution” are amplified in the respective reaction units 139 and then hybridized with the probe DNA (or simply referred to as a probe) in the detection unit 148, and this amplification is performed. Based on the product, the amplification reaction is detected by each of the detection units 148a and 148b.
  • the above is the outline of the whole.
  • the “first probe” and the “second probe” described later are modified with fluorescent dyes having different fluorescence wavelengths, so that the reaction of the “first mixed solution”
  • the detection of the product can be simultaneously detected by one detection unit 148a using two types of probes, “first probe” and “second probe”. If two types of probes are modified with the same fluorescent dye, they cannot be detected by one detection unit 148. Therefore, the “first mixed solution” is divided into two parts, and each reaction product is divided. Must be detected by separate detectors 148.
  • the detection unit 148 may be provided with the temperature control unit 3 so that the detection unit 148 performs a nucleic acid amplification reaction.
  • the detection target nucleic acid being amplified and the probe are hybridized by the nucleic acid amplification reaction, and the presence or absence of amplification can be detected by the detection unit 148 based on the amplification product.
  • the probe hybridizes with the amplification product so that the FRET disappears and the fluorescence is emitted
  • the probe may be decomposed by further amplifying reaction after hybridization of the probe with the amplification product, resulting in free fluorescent dye. it can. This makes it possible to detect the presence or absence of amplification by fluorescence. Furthermore, since it can be quantified in real time by monitoring the time change of the detected value, the presence or absence of amplification can be detected in a shorter time.
  • probe DNA refers to a DNA fragment that has a complementary relationship with a gene to be detected using the complementarity of DNA, and is combined with the gene to be detected by hybridization.
  • the probe DNA is fluorescently labeled with a fluorescent dye such as FITC (Fluorescein isothiocyanate) at its end.
  • FITC Fluorescein isothiocyanate
  • fluorescent dyes fluorescent labels that modify the “first probe DNA” and the “second probe DNA”, respectively, have different fluorescence wavelengths.
  • Internal control is used as an internal standard for monitoring amplification or quantification of the gene to be detected.
  • the internal control sequence can be amplified in the same manner as the sample because it has sequences that can hybridize with the same primer as the sample primer on both sides of the sequence different from the sample.
  • the internal control causes a hybridization reaction with the probe DNA and a generation reaction with a fluorescent substance described later.
  • the sequence is a specific sequence for detecting the sample, and the portion where the primer hybridizes and the sequence between them are the same as the sample. In this embodiment, the portion where probe DNA hybridizes and the sequence between them are different from the sample.
  • “Negative control” alone does not cause a production reaction with a fluorescent substance. It contains all reagents other than nucleic acid (DNA, RNA), etc., and is used for checking for contamination and for background correction.
  • the “dissociation temperature” is a temperature at which a double-stranded nucleic acid dissociates into a single strand due to heat, and is also referred to as a denaturation temperature.
  • the dissociation temperature tends to be high for duplexes with high homology and low for duplexes with low homology.
  • the dissociation temperature is high when the GC arrangement is large.
  • FIG. 4 shows an example of the microchip 1 according to the present embodiment.
  • positioning of the microchannel and channel element in the state from which the coating substrate was removed is shown typically.
  • the microchip 1 is provided with a fine channel and a channel element for mixing and reacting a liquid specimen (sample) on the microchip 1 using a hydrophobic base material in the same manner as a liquid reagent.
  • the microchannel is formed in the order of micrometers, for example, the width w is several tens to several hundreds ⁇ m, preferably 50 to 300 ⁇ m, and the height h (depth) is about 25 to 1000 ⁇ m, preferably 50 to 300 ⁇ m. is there.
  • the two reaction detection channels are arranged in a substantially symmetrical shape (left half and right half in the figure). Similar to the schematic diagram shown in FIG. 3, the reaction detection channel on the left half is used for detecting the reaction between the specimen, the internal control, and the reagent, and the reaction detection channel on the right half is used for the negative control and the internal control. It is used for detecting the reaction between the reagent and the reagent. By comparing the two reaction detections, the influence of amplification inhibition can be detected with high accuracy. Since the two reaction detection channels are symmetrically arranged and basically have the same channel configuration, only the reaction detection channel in the left half will be mainly described below.
  • G1a to g1c, g2a to g2f, g6, g7, and g8 are upstream openings released from one surface of the microchip 1 to the outside (hereinafter collectively referred to as upstream openings g). These upstream openings g are aligned with the flow path openings provided on the connection surface of the micropump 5 when the microchip 1 is overlapped and connected to the micropump 5 via the pump connection part 6. The pump 5 communicates. Then, a driving liquid L0 for feeding liquid is injected from the upstream opening.
  • i (white circle in the figure, part of which is omitted) is an injection hole for injecting a liquid such as a reagent or a specimen (hereinafter also simply referred to as a reagent liquid), and is released from the upper surface of the microchip 1 to the outside. It has become an opening.
  • the reagent solution is injected with the upstream opening g in the vicinity of each injection hole i opened.
  • the injected liquid is sent through the fine channel toward the nearby upstream opening g.
  • a part of the fine channel for storing the liquid is used as the reagent storage unit st (st1 to st8).
  • the internal control accommodation unit stI accommodates internal control
  • the negative control accommodation unit stN accommodates negative control.
  • the sample storage unit stE stores a sample or a sample solution containing DNA extracted from the sample.
  • a part of the fine flow path is used as the internal control accommodation part stI and the negative control accommodation part stN.
  • a first probe DNA is stored in a reagent storage unit st6 described later, and a second probe DNA is stored in the reagent storage unit st7.
  • the reagent storage units st6 and st7 function as “probe storage units”.
  • the reagent solution When the reagent solution is injected, only the upstream opening g and the injection hole i are open, and only the injection hole i is sealed after the reagent is injected. By doing so, the reagent solution can be injected from the injection hole i toward the upstream opening g. Then, by the driving liquid L0 fed from the micropump 5 communicating with the reagent storage unit st and the upstream opening g, the liquid such as the reagent or the specimen is sent between the driving liquid L0 and the liquid such as the reagent or the specimen. To be liquidated.
  • 130a, 130b, and 130c are mixed solution storage portions, and the reagent solutions from the reagent storage portions st1 to st3 that have joined together on the upstream side are mixed.
  • J1 to j6 are merging sections, and SP is a dividing section.
  • the reagent solution sent from the upstream microchannel is joined.
  • the division part SP the internal control sent from the internal control accommodation part stI on the upstream side is divided into two. One of the divided parts is fed through the first flow path 131 and joined at the junction j5 with the specimen sent from the specimen storage part stE and the reagent from the reagent storage parts st41, st42, etc. A “mixed liquid” is created.
  • the other internal control divided by the dividing unit SP is fed through the second flow path 132 and is joined at the junction j6, and the negative control and reagent containing unit st42 fed from the negative control containing unit stN,
  • the “second mixture” is created by combining with the reagents from st43 and the like.
  • a mixing channel 138 is provided on the downstream side of the junctions j5 and j6 for sufficiently molecularly diffusing and mixing the first mixed solution and the second mixed solution.
  • a reaction unit 139 is provided downstream of the mixing channel 138.
  • the reaction unit 139 is a part that heats and reacts the mixed liquid of the sample and the reagent sufficiently mixed in the mixing channel 138.
  • the reaction unit 139 performs microchip analysis.
  • the heaters 32 of the system 8 are opposed to each other.
  • the gene amplification reaction is performed by heating the reaction unit 139 with the heater 32.
  • the amplification product amplified by the reaction unit 139 by the gene amplification reaction is sent to the detection unit 148 (148a, 148b) and detected by the photodetector.
  • a means for detecting the amplification product in the detection unit 148 will be described.
  • the detection unit 148 cannot optically detect the amplification product as it is.
  • the amplification product is allowed to trap in the detection unit 148 by reacting the amplification product with a reactant carried on the flow path wall of the detection unit 148.
  • a fluorescently labeled probe DNA is bound to the amplification product so that it can be detected optically.
  • At least the detection part of the detection unit 148 is made of a transparent material, preferably a transparent plastic, in order to enable optical measurement.
  • the reagent is a biotin-modified primer, and the reaction unit 139 performs gene amplification of the sample, and sends the sample after the reaction in which the amplified gene is made into a single strand by denaturation treatment to the detection unit 148.
  • a biotin-affinity protein such as streptavidin (avidin, streptavidin, extraavidin, preferably streptavidin) is supported and immobilized in advance on the flow path wall of the detection unit 148.
  • streptavidin avidin, streptavidin, extraavidin, preferably streptavidin
  • the gene of the sample is immobilized on the channel wall of the detection unit 148 by a binding reaction between biotin affinity protein and biotin labeled with the probe DNA ( Trapped).
  • the above-described binding reaction between the biotin affinity protein and biotin is a known avidin-biotin reaction.
  • a probe DNA (first probe DNA and second probe) fluorescently labeled with FITC (Fluorescein isothiocyanate) at the end is applied to the detection unit 148 that traps the amplification gene.
  • the probe DNA is flowed and hybridized with the gene immobilized on the flow path wall of the detection unit 148.
  • a hybrid of an amplified gene and a fluorescently labeled probe DNA may be trapped by the detection unit.
  • the fluorescent label is irradiated with excitation light and optically measured.
  • the two types of fluorescent dyes that respectively modify the “first probe DNA” and the “second probe DNA” are selected so that the excitation wavelengths are different from each other and the fluorescence wavelengths do not overlap each other. In this way, since the detection unit 148 can detect two reaction products from the sample by internal control, the number of detection units 148 can be reduced, and the microchip can be simplified. A simple flow path configuration can be obtained.
  • each reagent contained in the fine channel is sequentially sent and reacts with the reactants immobilized on the detection unit 148. This order is determined in advance.
  • the amplification product sent from the reaction unit 139 to the detection unit 148 starts to react with the reactant in the detection unit 148 (for example, an avidin-biotin reaction).
  • the cleaning liquid in the reagent storage unit st8 is sent to the detection unit 148 by starting to feed the driving liquid L0 from the upstream opening g8.
  • the amplified product sent to the detection unit 148 and subjected to a reaction for detection is detected by a photodetector configured by the light emitting unit 4a and the light receiving unit 4b.
  • the amplified product after detection is sent to the waste liquid section 160.
  • the target gene is positive, that is, if the target gene is contained in the specimen, fluorescence is generated by the fluorescent dye that modifies the “first probe DNA” (hereinafter referred to as the first fluorescent dye) in the detection unit 148a.
  • the fluorescent dye that modifies the “first probe DNA” (hereinafter referred to as the first fluorescent dye) in the detection unit 148a.
  • the target gene is not contained in the negative sample, that is, the fluorescence emission by the first fluorescent dye does not occur.
  • the influence of amplification inhibition is obtained by comparing the fluorescence emission by the fluorescent dye that modifies the “second probe DNA” that reacts with the internal control (hereinafter referred to as the second fluorescent dye). Or the like can be determined.
  • the detection unit 148a does not detect the fluorescence emission of the first fluorescent dye and the second fluorescence dye and the detection unit 148b detects the fluorescence emission of the second fluorescence dye
  • the sample pretreatment is performed. It is possible to determine that amplification inhibition has occurred due to the effect of.
  • an abnormality such as deactivation of the reagent contained in the microchip 1 is considered.
  • re-examination can be promoted as an inspection result in which an abnormal reaction is performed.

Abstract

　簡単な流路構成であっても、増幅反応を行うことにより特定の目的物資の存在を検出するとともに、増幅阻害の影響を精度良く検出可能なマイクロチップを得ることを課題とする。 　そのためには、インターナルコントロールｓｔＩから微細流路内を送液された検体液を第１流路と第２流路に分割する検体分割部ＳＰを有し、微細流路は、第１流路を送液されたインターナルコントロールと検体収容部ｓｔＥからの検体液と試薬収容部ｓｔからの試薬とを合流させて第１の混合液を形成し、第２流路を送液されたインターナルコントロールとネガティブコントロール収容部ｓｔＮからのネガティブコントロールと試薬収容部ｓｔからの試薬とを合流させて第２の混合液を形成し、第１の混合液と第２の混合液それぞれを核酸増幅反応により増幅させ、増幅の有無に基づいた増幅産物を検出部１４８で検出するよう構成したマイクロチップとする。

Description

マイクロチップ
　本願発明は、遺伝子検査用のマイクロチップに関する。
　近年、マイクロマシン技術および超微細加工技術を駆使することにより、従来の試料調製、化学分析、化学合成などを行うための装置、手段（例えばポンプ、バルブ、流路、センサーなど）を微細化して１チップ上に集積化したシステムが注目されている。これは、μ－ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ　Ｔｏｔａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ）とも呼ばれ、マイクロチップといわれる部材に、試薬と検体（例えば、検査を受ける被験者の尿、唾液、血液を処理して抽出したＤＮＡ処理した抽出溶液など）を合流させ、その反応を検出することにより検体の特性を調べる方法である。
　マイクロチップは、樹脂材料やガラス材料からなる基体に、フォトリソプロセス（パターン像を薬品によってエッチングして溝を作成する方法）や、レーザ光を利用して溝加工を行い、試薬や検体を流すことができる微細な流路と試薬を蓄える液溜部を設けており、さまざまなパターンが提案されている。
　そして、これらマイクロチップを用いて検体の特性を調べる際は、マイクロポンプなどでマイクロチップ内に収容されている試薬や検体を送液することにより、試薬と検体とを増幅反応させて検出部に導き、検出を行う。検出部では、例えば光学的な検出方法などによって目的物質の検出が行われる。
　マイクロチップは少量の検体であっても増幅反応させることにより検出可能とさせている。このような増幅反応を行う場合に、コンタミネーションあるいは、反応阻害物質の混入あるいは、試薬の不活性化、不適切な反応条件、等による増幅不調の障害、による検査エラーが生じる場合がある。そのような検査エラーが発生したことを検知するためにコントロールを平行して分析することが通例である。
　特許文献１では、コントロールとしてポジティブコントロールとネガティブコントロールを用い、検体と試薬の混合液（１）ポジティブコントロールと試薬の混合液（２）ネガティブコントロールと試薬との混合液（３）、を得る。そして次に、
（ａ）混合液（１）と混合液（２）の混合物、
（ｂ）混合液（１）のみ、
（ｃ）混合液（２）のみ、
（ｄ）混合液（３）のみ、
の各流体を増幅部で増幅反応させ、当該増産物質を検出するマイクロリアクタが開示されている。
国際公開第０７／０５８０７７号パンフレット
　しかし、特許文献１に開示されているマイクロリアクタでは（ａ）～（ｄ）のそれぞれの流体を対応する増幅部で増幅反応させ、増副産物を検出する必要があるために、流路経路が複雑になるという問題があった。また流体（ａ）と流体（ｂ）とでは検体から持ち込まれる阻害物質の割合が異なるために、増幅阻害の影響を精度良く検出できないという問題があった。
　本願発明は上記問題に鑑み、簡単な流路構成であっても、増幅反応を行うことにより特定の目的物資の存在を検出するとともに、増幅阻害の影響を精度良く検出可能なマイクロチップを得ることを目的とする。
　上記の目的は、下記に記載する発明により達成される。
　（１）検体もしくは検体から抽出したＤＮＡを含む検体液が注入される検体収容部と、核酸増幅反応に用いる試薬が収容される試薬収容部と、インターナルコントロールが収容されるインターナルコントロール収容部と、ネガティブコントロールが収容されるネガティブコントロール収容部と、これらの各収容部に連通する微細流路と、核酸増幅反応を検出する検出部と、を有するマイクロチップであって、前記インターナルコントロール収容部から前記微細流路内を送液されたインターナルコンロールを第１流路と第２流路に分割する分割部を有し、前記微細流路は、前記第１流路を送液されたインターナルコントロールと前記検体収容部からの検体液と前記試薬収容部からの試薬とを合流させて第１の混合液を形成し、前記第２流路を送液されたインターナルコントロールと前記ネガティブコントロール収容部からのネガティブコントロールと前記試薬収容部からの試薬とを合流させて第２の混合液を形成し、第１の混合液と第２の混合液のそれぞれを核酸増幅反応により増幅させ、増幅の有無に基づいた増幅産物を前記検出部で検出するよう構成されていることを特徴とするマイクロチップ。
　（２）プローブ収容部を有し、該プローブ収容部には検体の特定のＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションする第１プローブＤＮＡと、インターナルコントロールの特定のＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションする第２プローブＤＮＡとが収容されており、前記第１プローブＤＮＡと第２プローブＤＮＡとは異なる蛍光波長を有する蛍光色素が修飾されていることを特徴とする（１）に記載のマイクロチップ。
　（３）プローブ収容部を有し、前記核酸増幅反応により増幅させた検出対象の核酸と、前記プローブ収容部からのプローブとのハイブリダイゼーションにより、前記増幅の有無を検出するよう構成されていることを特徴とする（１）又は（２）に記載のマイクロチップ。
　（４）プローブ収容部を有し、前記核酸増幅反応により増幅させた検出対象の核酸と、前記プローブ収容部からのプローブとのハイブリダイゼーション反応時の乖離温度により、前記増幅の有無を検出するよう構成されていることを特徴とする（１）又は（２）に記載のマイクロチップ。
　（５）プローブ収容部を有し、前記核酸増幅反応により増幅中の検出対象の核酸と、前記プローブ収容部からのプローブとのハイブリダイゼーションにより、前記増幅の有無を検出するよう構成されていることを特徴とする（１）又は（２）に記載のマイクロチップ。
　本発明によれば、簡単な流路構成であっても、増幅反応を行うことにより特定の目的物資の存在を検出するとともに、増幅阻害の影響を精度良く検出可能なマイクロチップを得ることが可能となる。
　また「第１の混合液」から生成された増幅産物を検出する検出部と「第２の混合液」から生成された増幅産物を検出する検出部での検出結果を比較することにより、検査は正常に行われたか否かを判断することができる。
本実施形態に係るマイクロチップを用いるマイクロチップ分析システム８の外観図である。 本実施形態に係るマイクロチップを用いるマイクロチップ分析システム８の構成図である。 マイクロチップ１の各流路エレメントの関係を表す構成概略図である。 マイクロチップ１の流路構成の一例を示す模式図である。
符号の説明
　１　マイクロチップ
　６　ポンプ接続部
　ｇ　上流開口部
　ｓｔ１乃至ｓｔ８　試薬収容部
　ｓｔＥ　検体収容部
　ｓｔＩ　インターナルコントロール収容部
　ｓｔＮ　ネガティブコントロール収容部
　ｉ　注入孔
　ｊ　合流部
　ＳＰ　分割部
　１３０　混合液収容部
　１３８　混合流路
　１３９　反応部
　１４８　検出部
　１６０　廃液部
　７０　駆動液タンク
　本発明を実施の形態に基づいて説明するが、本発明は該実施の形態に限られない。
　［分析システムの装置構成］
　図１は、本実施形態に係るマイクロチップを用いるマイクロチップ分析システム８の外観図である。マイクロチップ分析システム８は、マイクロチップ１に予め注入された検体と試薬とを自動的に反応させ、反応結果を自動的に出力する装置である。
　マイクロチップ分析システム８の筐体８２には、マイクロチップ１を装置内部に挿入するための挿入口８３、表示部８４、メモリカードスロット８５、プリント出力口８６、操作パネル８７、外部入出力端子８８が設けられている。
　検査担当者は、図１の矢印方向にマイクロチップ１を挿入し、操作パネル８７を操作して検査を開始させる。マイクロチップ分析システム８の内部では、マイクロチップ１内の反応の検査が自動的に行われ、検査が終了すると表示部８４に結果が表示される。検査結果は操作パネル８７の操作により、プリント出力口８６よりプリントを出力したり、メモリカードスロット８５に挿入されたメモリカードに記憶したりすることができる。また、外部入出力端子８８から例えばＬＡＮケーブルを使って、パソコンなどにデータを保存することができる。検査終了後、検査担当者はマイクロチップ１を挿入口８３から取り出す。
　図３は、本実施形態に係るマイクロチップを用いるマイクロチップ分析システム８の構成図である。図２においては、マイクロチップが図１に示す挿入口８３から挿入され、セットが完了している状態を示している。
　マイクロチップ分析システム８は、マイクロチップ１に予め注入された検体及び試薬を送液するための駆動液Ｌ０を貯留する駆動液タンク７０、マイクロチップ１に駆動液Ｌ０を供給するためのマイクロポンプ５、マイクロポンプ５とマイクロチップ１とを駆動液Ｌ０が漏れないように接続するポンプ接続部６、マイクロチップ１の必要部分を温調する温度調節ユニット３、マイクロチップ１をずれないように温度調節ユニット３及びポンプ接続部６に密着させるためのチップ押圧板２、チップ押圧板２を昇降させるための押圧板駆動部２１、マイクロチップ１をマイクロポンプ５に対して精度良く位置決めする規制部材２２、マイクロチップ１内の検体と試薬との反応状態等を検出するための発光部４ａ及び受光部４ｂから構成される光検出器、等を備えている。
　チップ押圧板２は、初期状態においては、図２に示す位置より上方に退避している。これにより、マイクロチップ１は矢印Ｘ方向に挿抜可能であり、検査担当者は挿入口８３（図１参照）から規制部材２２に当接するまでマイクロチップ１を挿入する。その後、チップ押圧板２は、押圧板駆動部２１により下降してマイクロチップ１に当接し、マイクロチップ１の下面が温度調節ユニット３及びポンプ接続部６に密着される。
　温度調節ユニット３は、マイクロチップ１と対向する面にペルチェ素子３１及びヒータ３２を備え、マイクロチップ１がマイクロチップ分析システム８にセットされたときに、ペルチェ素子３１及びヒータ３２がマイクロチップ１に密着するようになっている。試薬が収容されている部分をペルチェ素子３１で冷却して試薬が変性しないようにしたり、検体と試薬とが反応する反応部１３９をヒータ３２で加熱して反応を促進させたりする。
　反応部１３９での加熱時の制御温度は適宜変更することが可能である。検出対象の核酸の種類によっては増幅反応が生じる温度やプローブとのハイブリダイゼーションの温度は異なるので、制御温度を切り換えることにより、検出対象の核酸が含まれているか否かをハイブリダイゼーション反応による増幅の有無により検出するようにしてもよい。
　発光部４ａ及び受光部４ｂから構成される光検出器では、例えば水銀ランプからなる発光部４ａからの光を特定領域の波長の光を通過させる励起フィルタを介して励起光としてマイクロチップ１の検出部１４８に存在する蛍光物質に照射する。励起光が照射された蛍光物質から発せられた蛍光を透過させて当該透過光を受光部４ｂにより検出する。受光部４ｂはチップ押圧板２の内部に一体的に設けられている。発光部４ａ及び受光部４ｂは、図２に示すマイクロチップ１の検出部１４８（検出部１４８ａ、１４８ｂの総称、以下同様）に対向するように設けられている。
　以下は、圧電素子を用いたマイクロポンプの例について説明するが、これに限られずシリンジポンプ、ダイヤフラム型のマイクロポンプ、電気浸透流ポンプなどを用いてもよい。
　マイクロポンプ５は、ポンプ室５２、ポンプ室５２の容積を変化させる圧電素子５１、ポンプ室５２のマイクロチップ１側に位置する第１絞り流路５３、ポンプ室の駆動液タンク７０側に位置する第２絞り流路５４、等から構成されている。第１絞り流路５３及び第２絞り流路５４は絞られた狭い流路となっており、また、第１絞り流路５３は第２絞り流路５４よりも長い流路となっている。
　駆動液Ｌ０を順方向（マイクロチップ１に向かう方向）に送液する場合には、まず、ポンプ室５２の容積を急激に減少させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、短い絞り流路である第２絞り流路５４において乱流が発生し、第２絞り流路５４における流路抵抗が、長い絞り流路である第１絞り流路５３に比べて相対的に大きくなる。これにより、ポンプ室５２内の駆動液Ｌ０は、第１絞り流路５３の方に支配的に押し出され送液される。次に、ポンプ室５２の容積を緩やかに増加させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、ポンプ室５２内の容積増加に伴って駆動液Ｌ０が第１絞り流路５３及び第２絞り流路５４から流れ込む。このとき、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて長さが短いので、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて流路抵抗が小さくなり、ポンプ室５２内には第２絞り流路５４の方から支配的に駆動液Ｌ０が流入する。以上の動作を圧電素子５１が繰り返すことにより、駆動液Ｌ０が順方向に送液されることになる。
　一方、駆動液Ｌ０を逆方向（駆動液タンク７０に向かう方向）に送液する場合には、まず、ポンプ室５２の容積を緩やかに減少させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて長さが短いので、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて流路抵抗が小さくなる。これにより、ポンプ室５２内の駆動液Ｌ０は、第２絞り流路５４の方に支配的に押し出され送液される。次に、ポンプ室５２の容積を急激に増加させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、ポンプ室５２内の容積増加に伴って駆動液Ｌ０が第１絞り流路５３及び第２絞り流路５４から流れ込む。このとき、短い絞り流路である第２絞り流路５４において乱流が発生し、第２絞り流路５４における流路抵抗が、長い絞り流路である第１絞り流路５３に比べて相対的に大きくなる。これにより、ポンプ室５２内には第１絞り流路５３の方から支配的に駆動液Ｌ０が流入する。以上の動作を圧電素子５１が繰り返すことにより、駆動液Ｌ０が逆方向に送液されることになる。また圧電素子５１への駆動電圧を変更することにより駆動液Ｌ０の送液圧力を変更することが可能である。
　ポンプ接続部６は、必要なシール性を確保して駆動液の漏出を防止するために、ポリテトラフルオロエチレン、シリコン樹脂などの柔軟性（弾性、形状追随性）をもつ樹脂によって密着面が形成されることが好ましい。このような柔軟性を有する密着面は、例えばマイクロチップの構成基材自体によるものであってもよく、また、ポンプ接続部６における流路開口の周囲に貼着された柔軟性を有する別途の部材によるものであってもよい。
　［マイクロチップ１の構成］
　次に図３、図４に基づいて、本実施形態に係るマイクロチップ１の構成について説明する。図３はマイクロチップ１の各流路エレメントの関係を表す構成概略図であり、図４は、マイクロチップ１の流路構成の一例を示す模式図である。
　図３に示すように本実施形態に係るマイクロチップ１においては、インターナルコントロールを分割部ＳＰで２分割し、分割した一方のインターナルコントロールを第１流路１３１に送液して、検体及び試薬と合流させて「第１の混合液」を作成する。分割したうちの他方のインターナルコントロールは第２流路１３２に送液させて、ネガティブコントロール、試薬と合流させて「第２の混合液」を作成する。
　そして「第１の混合液」及び「第２の混合液」はそれぞれの反応部１３９で増幅反応させてから、検出部１４８でプローブＤＮＡ（あるいは単にプローブとも称す）とをハイブリダイゼーションさせ、この増幅産物に基づいて増幅反応をそれぞれの検出部１４８ａ、１４８ｂで検出する。以上が全体の概略である。
　なお図３に示す例においては、後述の「第１のプローブ」と「第２のプローブ」とは互いに異なる蛍光波長を有する蛍光色素で修飾されているので、「第１の混合液」の反応生成物の検出は「第１のプローブ」と「第２のプローブ」の２種類のプローブで一つの検出部１４８ａにおいて同時に検出することが可能である。なお２種類のプローブが同一の蛍光色素で修飾されている場合には、一つの検出部１４８で検出することはできないので、「第１の混合液」を２分割して、それぞれの反応生成物を別々の検出部１４８により検出する必要がある。
　更に、他の形態として、検出部１４８に温度調節ユニット３を設けることにより、検出部１４８で核酸増幅反応を行う構成としてもよい。この場合、当該核酸増幅反応により増幅中の検出対象の核酸と、プローブとをハイブリダイゼーションさせ、この増幅産物に基づいて、増幅の有無を検出部１４８で検出することができる。用いるプローブとしては、両末端をＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー遷移）の関係にある蛍光色素で修飾することが好ましい。この場合、蛍光色素の修飾されている末端近傍の配列同士がハイブリダイゼーションするように設計すると、（１）プローブが増幅産物とハイブリダイゼーションすることでＦＲＥＴがなくなり蛍光を発するようにしたり、（２）増幅反応に用いる酵素にエクソヌクリアーゼ活性を持たせることにより、プローブが増幅産物とハイブリダイゼーションした後に更に増幅反応が進行することでプローブを分解して、フリーの蛍光色素を生じさせたりすることができる。このことにより増幅の有無を蛍光で検出することが可能となる。更に、検出値の時間変化をモニターすることによりリアルタイムで定量できるので、より短時間で増幅の有無を検出することができる。
　ここで「プローブＤＮＡ」とは、ＤＮＡの相補性を利用して、検出対象の遺伝子と相補関係となるＤＮＡ断片のことであり、ハイブリダイゼーションにより検出対象の遺伝子と結合させる。プローブＤＮＡはその末端にＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）等の蛍光色素で蛍光標識させている。また本実施形態においては、プローブＤＮＡは、（１）検体を検出対象とする「第１プローブＤＮＡ」と、（２）インターナルコントロールを検出対象とする「第２プローブＤＮＡ」の、異なる２種類の配列のものを用いている。更に「第１プローブＤＮＡ」と「第２プローブＤＮＡ」をそれぞれ修飾している蛍光色素（蛍光標識）も異なる蛍光波長のものを用いている。
　「インターナルコントロール」は、検出対象の遺伝子について、増幅のモニタリング、あるいは定量の際の内部標準物質として使用される。インターナルコントロールの配列は、検体とは異なる配列の両側に、検体用プライマーと同じプライマーがハイブリダイズできる配列を有するので検体と同様に増幅できるものである。インターナルコントロールはプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応及び、後述の蛍光物質との生成反応を起こす。その配列は、検体を検出する特異的な配列で、プライマーがハイブリダイズする部分とその間の配列が検体と同じものである。なお、本実施形態においては、プローブＤＮＡがハイブリダイズする部分とその間の配列は検体とは異なるものとしている。
　「ネガティブコントロール」は、単独では蛍光物質との生成反応を起こさない。核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）以外の試薬などをすべて含み、コンタミネーションの有無のチェック、バックグラウンド補正用に用いる。
　また「乖離温度」とは、二本鎖構造の核酸が熱によりそれぞれ一本鎖に乖離する温度のことであり、変性温度とも称される。乖離温度は、相同性の高い二本鎖においては高く、相同性の低い二本鎖では低い傾向を示す。また、ＧＣの配列が多いものは乖離温度が高くなる。
　図４は、本実施形態に係るマイクロチップ１の一例を示すものである。同図においては被覆基板が取り外された状態での微細流路及び流路エレメントの配置を模式的に示している。
　マイクロチップ１には、疎水性の基材を用いて、液状の試薬と同じく液状の検体（試料）をマイクロチップ１上で混合・反応させるための微細流路及び流路エレメントが配設されている。微細流路はマイクロメーターオーダーで形成されており、例えば幅ｗは数十～数百μｍ、好ましくは５０～３００μｍで、高さｈ（深さ）は２５～１０００μｍ程度、好ましくは５０～３００μｍである。
　以下、マイクロチップにおける反応及び検出の工程について説明する。図４に示すマイクロチップ１は、２つの反応検出流路がほぼ左右対称形状的（図中、左半分と右半分）に配置されている。図３で示した概略図と同様に、左半分の反応検出流路は、検体とインターナルコントロールと試薬との反応検出に用いられ、右半分の反応検出流路は、ネガティブコントロールとインターナルコントロールと試薬との反応検出に用いられる。２つの反応検出を比較することにより増幅阻害の影響を精度良く検知することができる。また２つの反応検出流路は対称的に配置され基本的に同様の流路構成であるので、以下では、主に左半分での反応検出流路のみについて説明する。
　ｇ１ａ～ｇ１ｃ、ｇ２ａ～ｇ２ｆ、ｇ６、ｇ７、ｇ８は、マイクロチップ１の一方の面から外部へ解放された上流開口部である（以下、これらを総称して上流開口部ｇという）。これらの上流開口部ｇは、ポンプ接続部６を介してマイクロチップ１をマイクロポンプ５に重ね合わせて接続した際に、マイクロポンプ５の接続面に設けられた流路開口と位置合わせされてマイクロポンプ５に連通される。そして当該上流開口部から送液を行うための駆動液Ｌ０が注入される。
　ｉ（図における白丸部、一部は符号を省略）は試薬或いは検体等の液体（以下、単に試薬液ともいう）を注入する注入孔であり、マイクロチップ１の上方の面から外部へ解放された開口となっている。各注入孔ｉそれぞれの近傍の上流開口部ｇを開口した状態で試薬液を注入する。注入された液体は、近傍の上流開口部ｇに向かって微細流路を送られることになる。本実施形態においては当該液体を蓄えておく微細流路の一部を試薬収容部ｓｔ（ｓｔ１乃至ｓｔ８）として用いている。
　インターナルコントロール収容部ｓｔＩにはインターナルコントロールを収容し、ネガティブコントロール収容部ｓｔＮにはネガティブコントロールを収容する。そして検体収容部ｓｔＥには検体もしくは検体から抽出したＤＮＡを含む検体液を収容する。また本実施形態においては微細流路の一部をインターナルコントロール収容部ｓｔＩ、ネガティブコントロール収容部ｓｔＮとして用いている。更に、後述する試薬収容部ｓｔ６には第１のプローブＤＮＡが、試薬収容部ｓｔ７には第２のプローブＤＮＡを収容する。なお本実施形態において試薬収容部ｓｔ６、ｓｔ７が「プローブ収容部」として機能する。
　試薬液注入時には、上流開口部ｇ及び注入孔ｉのみが開いており、試薬注入後に注入孔ｉのみを封止する。このようにすることにより注入孔ｉから上流開口部ｇに向けて試薬液を注入することができる。そして試薬収容部ｓｔ、上流開口部ｇに連通するマイクロポンプ５から送り込まれる駆動液Ｌ０により、空気を駆動液Ｌ０と試薬或いは検体等の液体の間に介して、試薬或いは検体等の液体は送液される。
　１３０ａ、１３０ｂ、１３０ｃは混合液収容部であり、上流側で合流した試薬収容部ｓｔ１～ｓｔ３からの試薬液が混合される。
　ｊ１乃至ｊ６は合流部であり、ＳＰは分割部である。各合流部ｊ１乃至ｊ６では上流側の微細流路から送液された試薬液を合流させる。分割部ＳＰでは、上流側のインターナルコントロール収容部ｓｔＩから送液されたインターナルコントロールを２分割する。分割された一方は、第１流路１３１を送液されて合流部ｊ５で、検体収容部ｓｔＥから送液された検体と試薬収容部ｓｔ４１、ｓｔ４２等からの試薬と合流して「第１の混合液」が作成される。同様に、分割部ＳＰで分割された他方のインターナルコントロールは、第２流路１３２を送液されて合流部ｊ６で、ネガティブコントロール収容部ｓｔＮから送液されたネガティブコントロールと試薬収容部ｓｔ４２、ｓｔ４３等からの試薬と合流して「第２の混合液」が作成される。
　合流部ｊ５、ｊ６の下流側には、第１の混合液と第２の混合液とを十分に分子拡散させて混合するための混合流路１３８が設けられている。混合流路１３８の下流には、反応部１３９が設けられている。
　反応部１３９は、混合流路１３８で十分混合された検体と試薬との混合液を加熱反応させる部位で、マイクロチップ１をマイクロチップ分析システム８にセットした際に、反応部１３９にマイクロチップ分析システム８のヒータ３２が対向するようになっている。反応部１３９をヒータ３２により加熱することにより、遺伝子増幅反応が行われる。当該遺伝子増幅反応により反応部１３９で増幅された増幅産物は、検出部１４８（１４８ａ、１４８ｂ）へ送液され、光検出器により検出が行われる。
　検出部１４８において、増幅産物を検出する手段について説明する。検出部１４８では増幅産物をそのまま光検出することはできず、一般には、増幅産物を検出部１４８の流路壁に担持されている反応物質と反応させることにより増幅産物を検出部１４８にトラップさせ、さらに増幅産物に蛍光標識したプローブＤＮＡを結合させて光学的に検出できるようにしている。検出部１４８の少なくともその検出部分は、光学的測定を可能とするために透明な材質、好ましくは透明なプラスチックとなっている。
　ここで具体的に遺伝子検査を例にして説明する。
　（１）試薬はビオチン修飾したプライマーであり、反応部１３９において検体の遺伝子増幅を行い、増幅された遺伝子を変性処理により一本鎖にした反応後の検体を検出部１４８に送る。検出部１４８の流路壁には予めストレプトアビジン等のビオチン親和性タンパク質（アビジン、ストレプトアビジン、エクストラアビジン、好ましくはストレプトアビジン）が反応物質として担持されて固定化されている。反応部１３９で反応後の検体が検出部１４８に流入すると、ビオチン親和性タンパク質と、プローブＤＮＡに標識されたビオチンと、の結合反応によって検体の遺伝子が検出部１４８の流路壁に固定化（トラップ）される。前述したビオチン親和性タンパク質とビオチンとの結合反応は、公知のアビチン－ビオチン反応である。
　更に、増幅産物（この例では増幅遺伝子）をトラップする工程を経て、増幅遺伝子をトラップした検出部１４８に、末端にＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で蛍光標識したプローブＤＮＡ（第１のプローブＤＮＡ及び第２のプローブＤＮＡ）を流し、これを検出部１４８の流路壁に固定化した遺伝子にハイブリダイズさせる。（予め増幅遺伝子と蛍光標識したプローブＤＮＡとをハイブリダイズさせたものを検出部でトラップしもよい。）
　（２）蛍光標識に励起光を照射して、光学的に測定する。
　なお「第１プローブＤＮＡ」と「第２プローブＤＮＡ」をそれぞれ修飾する２種類の蛍光色素は、互いに異なる励起波長で、かつ蛍光波長が重複しない関係となるように選択している。このようにすることにより、検出部１４８でインターナルコントロールよる検体からの２つの反応生成物を検出することが可能となるので、検出部１４８の数を少なくすることができ、ひいてはマイクロチップを簡単な流路構成とすることができる。
　以上のように、検出部１４８では、微細流路に収容される各試薬が順に送液され検出部１４８に固定化されている反応物質と反応を行うが、この順序は予め決まっている。
　反応部１３９から検出部１４８に送液された増幅産物は、当該検出部１４８にて反応物質と反応を開始する（例えばアビチン－ビオチン反応）。
　次に、上流開口部ｇ６から駆動液Ｌ０の送り込みを開始し、試薬収容部ｓｔ６に収容されている第１プローブＤＮＡを下流側の検出部１４８に送液することにより検出部１４８の反応物質とハイブリダイゼーション反応が行われる。
　その後、上流開口部ｇ７から駆動液Ｌ０の送り込みを開始し、試薬収容部ｓｔ７に収容されている第２プローブＤＮＡを下流側の検出部１４８に送液することにより検出部１４８の反応物質とハイブリダイゼーション反応が行われる。
　検出部１４８にて検出する際、蛍光色素を修飾された余分なプローブＤＮＡが存在する。この余剰なプローブＤＮＡを洗い流すため、上流開口部ｇ８から駆動液Ｌ０の送り込みを開始することにより試薬収容部ｓｔ８の洗浄液が、検出部１４８に送液される。
　検出部１４８に送液され検出のための反応が行われた増幅産物は、発光部４ａ及び受光部４ｂから構成される光検出器により検出が行われる。検出後の増幅産物は、廃液部１６０に送液される。
　「第１の混合液」から生成された増幅産物を検出する検出部１４８ａと「第２の混合液」から生成された増幅産物を検出する検出部１４８ｂでの検出結果を比較することにより、検査は正常に行われたか否かを判断することができる。
　つまり、陽性すなわち検体に標的遺伝子が含まれる場合、検出部１４８ａにおいて「第１プローブＤＮＡ」を修飾している蛍光色素（以下第１蛍光色素という）による蛍光発光が生じる。一方、陰性すなわち検体に標的遺伝子が含まれない場合は第１蛍光色素による蛍光発光は生じない。
　また検出部１４８ａと検出部１４８ｂにおいて、インターナルコントロールと反応する「第２プローブＤＮＡ」を修飾している蛍光色素（以下第２蛍光色素という）による蛍光発光を比較することにより、増幅阻害の影響等が発生したか否かを判定することができる。例えば、検出部１４８ａの検出部において第１蛍光色素及び第２蛍光色素の蛍光発光が検出されずに、検出部１４８ｂで第２蛍光色素の蛍光発光が検出された場合には、検体の前処理の影響による増幅阻害が発生したと判断することが可能である。また検出部１４８ａと検出部１４８ｂでの第２蛍光色素の蛍光発光の比較において両者に違いが生じた場合には、マイクロチップ１に収容した試薬の失活などの異常が考えられる。これら２つのケースは、異常な反応を行った検査結果として、再検査を促すことが可能となる。
　このように本実施形態においては、簡単な流路構成であっても、増幅反応を行うことにより特定の目的物資の存在を検出するとともに、増幅阻害の影響を精度良く検出可能なマイクロチップを得ることが可能となる。

Claims (5)

  1. 検体もしくは検体から抽出したＤＮＡを含む検体液が注入される検体収容部と、核酸増幅反応に用いる試薬が収容される試薬収容部と、インターナルコントロールが収容されるインターナルコントロール収容部と、ネガティブコントロールが収容されるネガティブコントロール収容部と、これらの各収容部に連通する微細流路と、核酸増幅反応を検出する検出部と、を有するマイクロチップであって、
    前記インターナルコントロール収容部から前記微細流路内を送液されたインターナルコンロールを第１流路と第２流路に分割する分割部を有し、前記微細流路は、前記第１流路を送液されたインターナルコントロールと前記検体収容部からの検体液と前記試薬収容部からの試薬とを合流させて第１の混合液を形成し、前記第２流路を送液されたインターナルコントロールと前記ネガティブコントロール収容部からのネガティブコントロールと前記試薬収容部からの試薬とを合流させて第２の混合液を形成し、
    第１の混合液と第２の混合液のそれぞれを核酸増幅反応により増幅させ、増幅の有無に基づいた増幅産物を前記検出部で検出するよう構成されていることを特徴とするマイクロチップ。
  2. プローブ収容部を有し、該プローブ収容部には検体の特定のＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションする第１プローブＤＮＡと、インターナルコントロールの特定のＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションする第２プローブＤＮＡとが収容されており、前記第１プローブＤＮＡと第２プローブＤＮＡとは異なる蛍光波長を有する蛍光色素が修飾されていることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のマイクロチップ。
  3. プローブ収容部を有し、前記核酸増幅反応により増幅させた検出対象の核酸と、前記プローブ収容部からのプローブとのハイブリダイゼーションにより、前記増幅の有無を検出するよう構成されていることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記載のマイクロチップ。
  4. プローブ収容部を有し、前記核酸増幅反応により増幅させた検出対象の核酸と、前記プローブ収容部からのプローブとのハイブリダイゼーション反応時の乖離温度により、前記増幅の有無を検出するよう構成されていることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記載のマイクロチップ。
  5. プローブ収容部を有し、前記核酸増幅反応により増幅中の検出対象の核酸と、前記プローブ収容部からのプローブとのハイブリダイゼーションにより、前記増幅の有無を検出するよう構成されていることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記載のマイクロチップ。
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