DE69828908T2

DE69828908T2 - Fluorimetrisches system zum nachweis von nucleinsäuren

Info

Publication number: DE69828908T2
Application number: DE69828908T
Authority: DE
Inventors: Alan Martin Salisbury LEE; Roderick Kimbolton FUERST
Original assignee: UK Secretary of State for Defence
Current assignee: UK Secretary of State for Defence
Priority date: 1997-11-29
Filing date: 1998-11-27
Publication date: 2006-01-05
Anticipated expiration: 2018-11-28
Also published as: ATE447624T1; EP1049802B1; DE69841281D1; EP1489190A2; GB2346972A; AU743543B2; GB9825924D0; PT1049802E; AU1342599A; GB2333359A; KR20010015854A; NZ504818A; ATE288500T1; CA2311952C; WO1999028500A1; CA2311952A1; DE69828908D1; GB0012468D0; KR100641595B1; GB2346972B

Description

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis eines Zielpolynucleotids in einer Probe bereit, z.B. durch quantitatives Verfolgen einer Amplifikationsreaktion. Das Verfahren ist besonders gut geeignet für den Nachweis von Polymorphismen oder Allelvariationen und kann daher in diagnostischen Verfahren eingesetzt werden.
Bekannte Fluoreszenz-Nachweis-Techniken für Polymerasekettenreaktionen (PCR) schließen strangspezifische und generische DNA-Interkalationstechniken ein, die in einigen Thermocyclern der zweiten Generation verwendet werden können.
Generische Verfahren verwenden DNA-interkalierende Farbstoffe, die eine verstärkte Fluoreszenz zeigen, wenn sie an doppelsträngige DNA gebunden werden. Die Zunahme der Fluoreszenz, die auf einem Anstieg der Volumenkonzentration an DNA während der Amplifikationen (im Folgenden vorwiegend als Amplifikation bezeichnet) zurückgeht, kann für die Messung des Reaktionsfortschritts und die Bestimmung der Zahl der Kopien des Zielmoleküls verwendet werden. Außerdem können durch die Messung der Fluoreszenz bei einer kontrollierten Temperaturänderung DNA-Schmelzkurven erzeugt werden, z.B. am Ende des PCR-Thermocyclings.
Wenn generische DNA-Verfahren für die Messung der Zunahme der Volumenkonzentration an Nucleinsäuren verwendet werden, können diese Prozesse mit einem minimalen Zeitverlust gemessen werden (verglichen mit einigen anderen bekannten Analysenmethoden, die weiter unten diskutiert werden). Ein einziges Ablesen der Fluoreszenz kann am gleichen Punkt bei jeder Reaktion durchgeführt werden. Die Analyse der Schmelzkurven am Endpunkt kann verwendet werden, um Artefakte von Amplikonen zu unterscheiden, und um Amplikone zu unterscheiden. Schmelzpeaks von Produkten können für Konzentrationen ermittelt werden, die durch Agarose-Gelelektrophorese nicht sichtbar gemacht werden können.
Um hoch aufgelöste Schmelzdaten zu erhalten, z.B. für mehrere Proben, muß das Schmelzexperiment langsam mit vorhandenen Geräten durchgeführt werden, was bis zu fünf Minuten dauert. Durch die kontinuierliche Messung der Zunahme der Fluoreszenz kann hingegen ein dreidimensionales Bild der Hysterese des Schmelzvorgangs und der Hybridisierung erzeugt werden. Dieses dreidimensionale Bild hängt vom Amplikon ab und kann genügend Informationen für die Produktunterscheidung liefern.
Man hat festgestellt, dass die Analyse von DNA-Schmelzkurven allgemein ein sehr wirkungsvolles Werkzeug für die Optimierung des PCR-Thermocyclings ist. Durch die Bestimmung der Schmelztemperaturen der Amplikone ist es möglich, die Denaturierungstemperaturen bei späteren PCR-Zyklen auf diese Temperatur zu senken. Durch die Optimierung der Amplifikation der Reaktionsprodukte der ersten Generation anstelle der Ziel-DNA wird die Bildung von Artefakten verringert, die in späteren Zyklen auftreten. Schmelztemperaturen von Primer-Oligonucleotiden und ihrer Komplemente können für die Ermittlung ihrer Annealing-Temperaturen (das Annealing wird im Folgenden überwiegend als Anlagerung oder Anhybridisierung bezeichnet) verwendet werden, wodurch der Bedarf an einer empirischen Optimierung verringert wird.
Die generischen Interkalationsverfahren sind jedoch nur quasistrangspezifisch und daher nicht sehr gut brauchbar, wenn ein strangspezifischer Nachweis erforderlich ist.
Strangspezifische Verfahren verwenden zusätzliche Nucleinsäurereaktionsbestandteile, um den Reaktionsfortschritt der Amplifikationsreaktionen zu verfolgen. Bei diesen Verfahren wird oft der Fluoreszenz-Energietransfer (FET) als Basis für den Nachweis verwendet. Eine oder mehrere Nucleinsäure-Sonden werden mit fluoreszierenden Molekülen markiert, von denen das eine imstande ist, als Energiedonor-Molekül zu wirken, und von denen das andere ein Energieakzeptor-Molekül ist. Diese Moleküle werden manchmal als Reporter-Molekül bzw. Quencher-Molekül bezeichnet. Das Donormolekül wird mit einer bestimmten Lichtwellenlänge angeregt, die in dessen Anregungsspektrum fällt, und anschließend emittiert es Licht im Bereich seiner Fluoreszenzemissionswellenlänge. Das Akzeptormolekül wird ebenfalls bei dieser Wellenlänge angeregt, indem es Energie vom Donormolekül durch eine Vielzahl von abstandsabhängigen Energietransfer-Mechanismen aufnimmt. Ein spezielles Beispiel für einen Fluoreszenz-Energietransfer, der geschehen kann, ist der sogenannte "Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer" oder "FRET". Allgemein nimmt das Akzeptormolekül die vom Donormolekül emittierte Energie auf, wenn sie sich in unmittelbarer Nähe zueinander befinden (z.B. auf dem gleichen oder einem benachbarten Molekül. Die Grundlage des Fluoreszenz-Energietransfer-Nachweises besteht darin, die Änderungen bei der Donoremissionswellenlänge und der Akzeptoremissionswellenlänge zu verfolgen.
Es gibt zwei Typen von FET- oder FRET-Sonden, die üblicherweise verwendet werden, die Typen, bei denen die Hydrolyse der Nucleinsäure-Sonden zur Trennung des Donors vom Akzeptor verwendet wird, und die Sonden, bei denen eine Hybridisierung verwendet wird, um die räumliche Beziehung des Donormoleküls zum Akzeptormolekül zu verändern.
Hydrolyse-Sonden sind im Handel als TaqMan^TM-Sonden erhältlich. Diese bestehen aus DNA-Oligonucleotiden, die mit einem Donormolekül und einem Akzeptormolekül markiert sind. Die Sonden sind so gestaltet, dass sie an einen bestimmten Bereich auf einem Strang eines PCR-Produkts binden. Nach dem Anhybridisieren (d.h. Anlagern) des PCR-Primers an diesen Strang verlängert das Taq-Enzym die DNA durch seine 5'→3'-Polymerase-Aktivität. Das Taq-Enzym hat außerdem eine 5'→3'-Exonuclease-Aktivität. TaqMan^TM-Sonden sind am 3'-Ende durch Phosphorylierung geschützt, wodurch verhindert wird, dass die Taq-Extension stattfindet. Wenn eine TaqMan^TM-Sonde an den Produktstrang hybridisiert hat, kann ein kettenverlängerndes Taq-Molekül auch die Sonde hydrolysieren, wodurch der Donor vom Akzeptor freigesetzt wird, was die Basis für den Nachweis bildet. Das Signal ist in diesem Fall kumulativ, wobei die Konzentration an freien Donormolekülen und Akzeptormolekülen mit jedem Zyklus der Amplifikationsreaktion zunimmt.
Die Tatsache, dass die Signalerzeugung vom Auftreten der Hydrolyse der Sonde abhängt, bedeutet, dass mit diesem Verfahren eine zeitliche Verzögerung verbunden ist. Weiterhin kann die Anwesenheit der Sonde den ungestörten Ablauf der Polymerasekettenreaktion unterbrechen.
Zusätzlich ist festgestellt worden, dass die Hydrolyse unspezifisch werden kann, insbesondere wenn eine große Zahl von Amplifikationszyklen, beispielsweise mehr als 50 Zyklen, erforderlich ist. In diesen Fällen führt die unspezifische Hydrolyse der Sonde zu einem zu intensiven Signal.
Dies bedeutet, dass derartigen Techniken nicht sehr kompatibel mit schnellen PCR-Methoden sind, die mit der Entwicklung schneller Heißluft-Thermocycler, wie RapidCycler^TM und LightCycler^TM von Ida ho Technologies Inc., immer mehr an Bedeutung gewinnen. Weitere schnelle PCR-Geräte werden beispielsweise in den derzeit anhängigen Britischen Patentanmeldung Nr. 9625442.0 und 9716052.7 beschrieben. Über die Vorzüge der Schnellzyklen gegenüber den herkömmlichen Thermozyklen ist an anderer Stelle berichtet worden. Diese Techniken sind beispielsweise besonders brauchbar in Nachweissystemen zum Schutz vor biologischer Kampfführung, wo der schnelle Erhalt von Ergebnissen wichtig ist, um den Verlust von Leben oder schwere Schädigungen zu vermeiden.
Weiterhin liefern Hydrolyse-Sonden keine brauchbaren Informationen hinsichtlich der Hysterese des Schmelzvorgangs, weil die Signalerzeugung im Großen und Ganzen von der Hydrolyse der Sonde und nicht der Schmelztemperatur des Amplikons abhängt.
In dem US-Patent Nr. 5,491,063 wird ein Verfahren zum Löschen von fluoreszierend markierten Sonden in Lösung beschrieben, das auf der Modifizierung des Signals eines markierten einzelsträngigen Oligonucleotids durch ein an DNA bindendes Mittel beruht. Die Änderung des Signals, die das Ergebnis einer verringerten Kettenlänge der Sonde infolge der Spaltung der Sonde (Hydrolyse) während der Polymerasekettenreaktion ist, wird als Möglichkeit zum Nachweis des Vorhandenseins einer Zielnucleinsäure vorgeschlagen.
Hybridisierungssonden sind in einer Anzahl verschiedener Formen verfügbar. Molecular Beacons ("molekulare Leuchtfeuer") sind Oligonucleotide, die komplementäre 5'- und 3'-Sequenzen haben, so dass sie Schleifen mit Haarnadel-Struktur bilden. Endständige fluoreszierende Markermoleküle befinden sich in unmittelbarer Nähe, damit es zum FRET kommt, wenn die Haarnadel-Struktur gebildet wird. Nach der Hybridisierung der "Molecular Beacons" auf eine komplementäre Sequenz werden die fluoreszierenden Markermoleküle voneinander entfernt, so dass kein FRET stattfindet, und dies bildet die Basis des Nachweises.
Paare markierter Oligonucleotide können ebenfalls verwendet werden. Diese hybridisieren in unmittelbarer Nähe zueinander auf einem PCR-Produktstrang und bringen das Donormolekül und das Akzeptormolekül zusammen, so dass es zum FRET kommen kann. Verstärkter FRET stellt die Grundlage des Nachweises dar. Zu den Varianten dieses Typs gehört die Verwendung eines markierten Amplifikationsprimers mit einer einzigen benachbarten Sonde.
Die Verwendung von zwei Sonden oder einer Sande vom "Molecular-Beacon"-Typ, die zwei markierende Moleküle umfaßt, erhöht die mit dem Verfahren verbundenen Kosten. Außerdem erfordert dieses Verfahren das Vorhandensein einer einigermaßen langen bekannten Sequenz, damit zwei Sanden, die lang genug sind, um in nächster Nähe zueinander spezifisch zu binden, bekannt sind. Dies kann bei einigen diagnostischen Anwendungen ein Problem sein, bei denen die Länge konservierter Sequenzen in einem Organismus, die verwendet werden können, um eine wirksame Sonde zu gestalten, wie beim HI-Virus, relativ kurz sein kann.
Außerdem bringt die Verwendung von Sondenpaaren einen komplizierteren experimentellen Aufbau mit sich. Beispielsweise hängt ein Signal, das beim Schmelzen einer Sande geliefert wird, vom Abschmelzen beider Sonden ab. Die Untersuchung kleiner Unterschiede ("mismatches"), oder wo eine der Sonden über eine Spleiß-Region binden muss (z.B. um RNA im Vergleich zu DNA in einer Probe nachzuweisen, in der die Sequenz auf jeder Seite eines Introns als Sondenstelle verwendet werden kann), kann unkorrekte Ergebnisse liefern, wenn die andere Sonde zuerst schmilzt.
In dem US-Patent Nr. 4,868,103 wird in allgemeiner Form ein FRET-System für den Nachweis des Vorhandenseins eines Analyts beschrieben, in dem ein interkalierender Farbstoff als Donormolekül verwendet wird. Das Verfahren umfasst keine Amplifikationsschritte ein.
Die Anmelder haben ein strangspezifisches System für den Nachweis des Vorhandenseins spezieller Nucleinsäuresequenzen entwickelt.
Die Erfindung gibt ein Verfahren für den Nachweis des Vorhandenseins einer Zielnucleinsäuresequenz in einer Probe an, wobei bei diesem Verfahren

(a) zu einer Probe, von der vermutet wird, dass sie die Zielnucleinsäuresequenz enthält, ein DNA-Duplex-Bindemittel und eine für diese Zielsequenz spezifische Sonde gegeben werden, wobei die Sande ein reaktives Molekül enthält, das imstande ist, Fluoreszenzenergie von dem DNA-Duplex-Bindemittel zu absorbieren oder an das DNA-Duplex-Bindemittel abzugeben,
(b) das so gebildete Gemisch einer Amplifikationsreaktion unterzogen wird, in der Zielnucleinsäure vervielfältigt wird,
(c) die Probe Bedingungen ausgesetzt wird, unter denen die Sonde an die Zielsequenz hybridisiert, und
(d) die Fluoreszenz dieser Probe verfolgt wird und die Sonde in intakter Form von der Zielsequenz freigesetzt wird.

So wie er hier verwendet wird bezieht sich der Ausdruck "DNA-Duplex-Bindemittel" auf eine beliebige Einheit, die an DNA in Duplex-Form haftet oder damit kombiniert. Dies schließt interkalierende Farbstoffe ein, die im Stand der Technik wohlbekannt sind.
Wenn in Schritt (c) die Sonde an die Zielsequenz hybridisiert, wird das DNA-Duplex-Bindemittel, wie z.B. ein interkalierender Farbstoff, zwischen den Strängen eingefangen. Im Allgemeinen sollte hierdurch die Fluoreszenz bei der Wellenlänge, die für den Farbstoff typisch ist, erhöht werden. Wenn jedoch das reaktive Molekül imstande ist, Fluoreszenz vom Farbstoff zu absorbieren (d.h. es ist ein Akzeptormolekül), nimmt es vom Farbstoff emittierte Energie über FET, insbesondere FRET, auf, und sendet dann selbst Fluoreszenz bei seiner charakteristischen Wellenlänge aus. Die Zunahme der Fluoreszenz des Akzeptormoleküls, die eine andere Wellenlänge als die Fluoreszenz des Farbstoffs hat, zeigt die Bindung der Sonde in Duplex-Form. Demnach werden in Schritt (d) bevorzugt Änderungen der Fluoreszenz verfolgt, die auf die Bildung oder Destabilisierung von Duplexen hinweisen, an denen die Sonde beteiligt ist.
Ähnlich nimmt, wenn das reaktive Molekül imstande ist, Fluoreszenz an den Farbstoff abzugeben (d.h. es ist ein Donormolekül), die Emission des Donormoleküls als Folge des FRET ab, und diese Abnahme kann nachgewiesen werden. Die Fluoreszenz des Farbstoffs nimmt stärker zu als unter diesen Umständen erwartet würde.
Das reaktive Molekül ist vorzugsweise ein Akzeptormolekül, da die Signale leichter meßbar sind.
Die Verwendung eines DNA-Duplex-Bindemittels, wie eines interkalierenden Farbstoffs, und einer Sonde, die einfach markiert ist, ist vorteilhaft, weil diese Bestandteile wesentlich ökonomischer sind als andere Analysenmethoden, in denen doppelt markierte Sonden benötigt werden. Durch die Verwendung von nur einer Sonde kann die Länge an bekannter Sequenz, die erforderlich ist, um die Basis der Sonde zu bilden, relativ kurz sein, und daher kann das Verfahren selbst in schwierigen diagnostischen Situationen verwendet werden.
Weiterhin ist das erfindungsgemäße Verfahren äußert vielseitig in seinen Arzwendungen. Das Verfahren kann verwendet werden, um sowohl quantitative als auch qualitative Daten hinsichtlich der Zielnucleinsäuresequenz in der Probe zu erzeugen, was weiter unten ausführlicher diskutiert wird. Insbesondere ermöglicht die Erfindung nicht nur die quantitative Amplifikation, sondern sie kann auch zusätzlich oder alternativ verwendet werden, um charakteristische Daten, wie die Duplex-Destabilisierungstemperaturen oder Schmelzpunkte, zu erhalten.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Probe Bedingungen ausgesetzt werden, unter denen die Sonde während der Amplifikationsreaktion oder nach Beendigung der Amplifikationsreaktion an die Proben hybridisiert. Das Verfahren erlaubt daher die Durchführung des Nachweises insoweit in einer homogenen Weise, als die Amplifikation und die Messung in einem einzigen Behälter durchgeführt werden können, wobei alle Reagenzien zu Beginn zugegeben werden. Es sind keine späteren Verfahrensschritte erforderlich, in denen Reagenzien zugegeben werden. Es gibt keinerlei Notwendigkeit, das Verfahren in Gegenwart fester Träger durchzuführen (obwohl dies eine alternative Möglichkeit darstellt).
Die Sonde kann ein Nucleinsäure-Molekül enthalten, wie DNA oder RNA, das an die Zielnucleinsäuresequenz hybridisiert, wenn diese in Einzelstrangform vorliegt. In diesem Fall schließt Schritt (c) die Einhaltung von Bedingungen ein, unter denen die Zielnucleinsäure in die Einzelstrangform übergeht.
Die Sonde kann entweder frei in der Lösung enthalten sein oder auf einem festen Träger, wie z.B. der Oberfläche von Perlen, wie magnetischen Microbeads, wodurch das Abtrennen der Produkte erleichtert wird, oder der Oberfläche einer Nachweisvorrichtung, wie dem Wel lenleiter eines Oberflächenplasmonresonanzdetektors, immobilisiert sein. Die Wahl hängt von der Art der speziellen Analysenmethode, die in Betracht gezogen wird, und den speziellen Nachweismitteln, die eingesetzt werden, ab.
Insbesondere die verwendete Amplifikationsreaktion ist mit einem Schritt verbunden, in dem die Probe Bedingungen ausgesetzt wird, unter denen eine beliebige Zielnucleinsäuresequenz, die in der Probe vorhanden ist, einzelsträngig wird, Zu diesen Amplifikationsreaktionen gehört die Polymerasekettenreaktion (PCR) oder die Ligasekettenreaktion (LCR), vorzugsweise handelt es sich aber um eine PCR-Reaktion.
Die Sonde kann dann während der Amplifikatiansreaktion hybridisieren, sofern geeignete Hybridisierungsbedingungen angetroffen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Sande so gestaltet sein, dass diese Bedingungen während jedes Zyklus der Amplifikatiansreaktion angetroffen werden. Zu irgendeinem Zeitpunkt während jedes Zyklus der Amplifikationsreaktion hybridisiert die Sonde an die Zielsequenz und erzeugt ein Signal als Ergebnis des FET oder FRET zwischen der Sonde und dem DNA-Duplex-Bindemittel, wie dem interkalierenden Farbstoff, der zwischen der Sonde und der Zielsequenz eingefangen ist. Mit fortschreitender Amplifikation wird die Sande von der Zielsequenz getrennt oder abgeschmolzen, und so nimmt das durch sie erzeugte Signal ab. Folglich wird in jedem Zyklus der Amplifikation ein Fluoreszenzpeak von dem reaktiven Molekül erzeugt. Die Intensität des Peaks nimmt mit fortschreitender Amplifikation zu, weil mehr Zielsequenz für das Anbinden an die Sonde verfügbar wird.
Durch das Verfolgen bzw. Aufzeichnen der Fluoreszenz des reaktiven Moleküls der Probe während jedes Zyklus kann der Fortschritt der Amplifikationsreaktion auf verschiedene Weisen verfolgt werden. Beispielsweise können die Daten, die durch Schmelzpeaks geliefert werden, analysiert werden, z.B. durch Berechnen der Fläche unter den Schmelzpeaks, und diese Daten werden gegen die Zahl der Zyklen aufgetragen.
Die Fluoreszenz wird beispielsweise in geeigneter Weise durch die Verwendung eines bekannten Fluorimeters verfolgt. Die Signale des Fluorimeters, beispielsweise in Form von Photomultiplier-Spannungen, werden an eine Datenverarbeitungseinheit weitergeleitet und in Spektren umgewandelt, die dem jeweiligen Probenröhrchen zugeordnet werden. Mehrere Röhrchen, beispielsweise 96 Röhrchen, können gleichzeitig untersucht werden. Daten können auf diese Weise in kurzen Zeitabständen, beispielsweise einmal alle 10 ms, während der gesamten Umsetzung gesammtelt werden.
Die auf diese Weise erzeugten Spektren können aufgelöst werden, beispielsweise unter Verwendung von "fits" von vorausgewählten Farbstoffen, um Peaks zu erzeugen, die repräsentativ für jede signalliefernde Einheit (d.h. Farbstoff und/oder reaktives Molekül) sind. Die Flächen unter den Peaks können bestimmt werden, sie entsprechen dem Intensitätswert jedes Signals, und falls erforderlich, können sie als untereinander gebildete Quotienten ausgedrückt werden. Die Ableitung von Signalintensitäten und/oder Verhältniswerten ermöglicht es, Änderungen im FRET während der Umsetzung oder unter verschiedenen Reaktionsbedingungen, wie Temperaturen, aufzuzeichnen. Die Änderungen hängen, wie oben skizziert, mit den Bindungsverhältnissen zwischen der Sonde und der Zielsequenz zusammen. Das Integral der Fläche unter den Ableitungspeaks ermöglicht es, Intensitätswerte für die FRET-Effekte zu berechnen.
Dieser Wert macht es möglich, die Menge an Zielnucleinsäure, die in der Probe enthalten ist, zu quantifizieren.
Zusätzlich ermöglicht die Kinetik der Sondenhybridisierung die Ermittlung der Konzentration der Zielsequenz in absoluten Zahlen. Änderungen der Fluoreszenz der Probe ermöglichen es, die Geschwindigkeit der Hybridisierung der Sonde mit der Probe zu berechnen. Eine Zunahme der Geschwindigkeit der Hybridisierung hängt mit der Menge an. Zielsequenz zusammen, die in der Probe enthalten ist. In dem Maße, wie die Konzentration an Zielsequenz mit fortschreitender Amplifikationsreaktion zunimmt, findet auch die Hybridisierung der Sonde schneller statt. Demzufolge kann auch dieser Parameter als eine Grundlage für die Quantifizierung verwendet werden. Diese Art der Datenverarbeitung ist nützlich, weil sie nicht von einer Signalintensität abhängt, um die Information zu erhalten.
Vorzugsweise wird die Fluoreszenz sowohl des Farbstoffs als auch des reaktiven Moleküls verfolgt und die Beziehung zwischen den Emissionen berechnet. Dies liefert eine strangspezifische Messung, durch die die generische DNA-Information, die durch die Messung der Fluoreszenz des Farbstoffs erhalten wird, ergänzt wird. Auf diese Weise kann der Beitrag der nicht-spezifischen Amplifikation zum Signal unterschieden werden, und auf diese Weise liefert das Verfahren eine interne Überprüfung.
Geeignete reaktive Moleküle sind Rhodaminfarbstoffe oder andere Farbstoffe, wie Cy5 oder Fluoreszein. Diese können in herkömmlicher Weise an die Sonde angebunden sein. Die Position des reaktiven Moleküls auf der Sonde ist unkritisch, obwohl es im allgemeinen an einem Endbereich der Sande angeordnet wird.
Interkalierende Farbstoffe sind im Stand der Technik bekannt. Hierzu gehören beispielsweise SYBRGreen, wie SYBRGreen I, SYBRGold, Ethidiumbromid und YOPRO-1.
Damit es zwischen dem reaktiven Molekül und dem Farbstoff zum FET, wie FRET, kommt, muß die Fluoreszenzemission des Donors (bei dem es sich entweder um den interkalierenden Farbstoff oder das reaktive Molekül auf der Sonde handeln kann) bei einer kürzeren Wellenlänge liegen als die des Akzeptors (d.h. je nachdem des Farbstoffs oder des reaktiven Moleküls).
Geeignete Kombinationen werden in der folgenden Tabelle angegeben:
Die Moleküle, die als Donor und/oder als Akzeptor verwendet werden, führen vorzugsweise zu scharfen Peaks, und es gibt wenig oder keine Überlappung bei den Emissionswellenlängen. Unter diesen Umständen ist es gegebenenfalls nicht erforderlich, den strangspezifischen Peak vom Signal des DNA-Duplex-Bindemittels aufzulösen. Eine einfache Messung nur des strangspezifischen Signals (d.h. des Signals, das vom reaktiven Molekül geliefert wird) liefert Informationen hinsichtlich des Ausmaßes des FRET, der durch die Zielreaktion verursacht wird. Die Ethidiumbromid/Fluorescein-Kombination kann dieses Erfordernis erfüllen. In diesem Fall ist die strangspezifische Reaktion durch die Abnahme der Fluoreszenz bei 520 nm, die geeigneterweise als 1/Fluoreszenz ausgedrückt wird, quantifizierbar.
Wenn es jedoch eine spektrale Überlappung der Fluoreszenzsignale des Donormoleküls und des Akzeptormoleküls gibt, kann dies in den Ergebnissen berücksichtigt werden, beispielsweise indem die Beziehung zwischen den Spektren empirisch ermittelt wird und diese Beziehung verwendet wird, um die Einzelsignale aus den beiden Signalen zu berechnen.
Um ein vollkommen reversibles Signal zu erhalten, das unmittelbar mit der Menge des Amplifikationsprodukts zusammenhängt, die zu jedem Zeitpunkt der Reaktion vorhanden ist, und/oder wenn die Reaktionsgeschwindigkeit von größter Wichtigkeit ist, z.B. in schneller PCR, wird die Sonde intakt von der Zielsequenz freigesetzt. Dies kann beispielsweise während der Extensionsphase (= Verlängerungsphase) der Amplifikationsreaktion sein. Da jedoch das Signal nicht von der Sondenhydrolyse abhängt, kann die Sonde so gestaltet sein, dass sie hybridisiert und von der Zielsequenz während eines beliebigen Schrittes während des Amplifikationszyklus schmilzt, einschließlich der Anlagerungsphase (Annealing) oder der Schmelzphase der Reaktion. Derartige Sonden gewährleisten, dass störende Wechselwirkungen mit der Amplifikationsreaktion so gering wie möglich ausfallen.
Wenn Sonden verwendet werden, die während der Extensionsphase anbinden, kann ihre intakte Ablösung von der Zielsequenz erreicht werden, indem ein Enzym verwendet wird, dem die 5'-3'-Exonuclease-Aktivität fehlt, wie das Stoffle-Fragment von Taq oder Pwo.
Um zu gewährleisten, dass die Sonde während der Extensionsphase dieser oder einer beliebigen Amplifikationsreaktion nicht verlängert wird, kann das 3'-Ende der Sonde blockiert werden, was passend durch Phosphorylierung geschieht.
Die Sonde kann dann wieder an der Reaktion teilnehmen, was eine ökonomische Verwendung der Sonde darstellt.
Die auf diese Weise erzeugten Daten können auf verschiedene Weisen interpretiert werden. In ihrer einfachsten Form weist eine Zunahme der Fluoreszenz des Akzeptormoleküls im Laufe der Amplifikationsreaktion oder an deren Ende auf eine Zunahme der vorhandenen Menge an Zielsequenz hin, was darauf hindeutet, dass die Amplifikationsreaktion stattgefunden hat und daher die Zielsequenz tatsächlich in der Probe enthalten ist. Wie weiter oben angegeben wurde, ist jedoch auch eine Quantifizierung möglich, indem die Amplifikationsreaktion fortlaufend verfolgt wird. Zusätzlich können die Emissionen des DNA-Duplex-Bindemittels, insbesondere des interkalierenden Farbstoffs, verwendet werden, um die Volumenzunahme an Nucleinsäure in der Probe zu verfolgen, und dies kann mit der strangspezifischen Amplifikation verglichen werden, wie gemessen durch die Beziehung zwischen dem Signal des reaktiven Moleküls und dem Signal des Farbstoffs. Schließlich ist es möglich, charakterisierende Daten zu erhalten, und insbesondere eine Schmelzpunktanalyse, entweder als Endpunktmessung oder während der Umsetzung, um Informationen über die Sequenz zu erhalten, was weiter unten diskutiert wird.
Eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft demnach ein wie weiter oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis der Nucleinsäureamplifikation, das folgende Schritte umfaßt:
Durchführen einer Nucleinsäureamplifikation eines Zielpolynucleotids in Gegenwart (a) einer Nucleinsäurepolymerase, (b) mindestens eines Primers, der imstande ist, an das Zielpolynucleotid zu hybridisieren, (c) eines fluoreszierenden DNA-Duplex-Bindemittels und (d) einer Oligonucleotid-Sonde, die imstande ist, an die Zielpolynucleotidsequenz zu binden und die ein Akzeptormolekül enthält, das imstande ist, Fluoreszenz von diesem Farbstoff zu absorbieren; und Verfolgen der Änderungen der Fluoreszenz während der Amplifikationsreaktion.
Wie zuvor ist das DNA-Duplex-Bindemittel geeigneterweise ein interkalierender Farbstoff. Die Amplifikation wird geeigneterweise unter Verwendung eines Paares von Primern durchgeführt, die so gestaltet sind, dass nur die Zielnucleotidsequenz innerhalb des DNA-Stranges amplifiziert wird, wie dies auf dem Fachgebiet allgemein verstanden wird. Die Nucleinsäurepolymerase ist geeigneterweise eine hitzestabile Polymerase, wie die Taq-Polymerase.
Geeignete Bedingungen, unter denen die Amplifikationsreaktion durchgeführt werden kann, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Die optimalen Bedingungen können von Fall zu Fall in Abhängigkeit vom speziellen beteiligten Amplikon, der Art der verwendeten Primer und den eingesetzten Enzymen variieren. Die optimalen Bedingungen können vom Fachmann in jedem Fall ermittelt werden. Typische Denaturierungstemperaturen liegen in der Größenordnung von etwa 95 °C, typische Anlagerungs- oder Anhybridisierungstemperaturen liegen in der Größenordnung von etwa 55 °C, und die Extensionstemperaturen liegen in der Größenordnung von etwa 72 °C.
Das Verfahren kann in Kombination mit Hybridisierungsanalysenmethoden zur Ermittlung charakteristischer Merkmale spezieller Sequenzen verwendet werden.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Verfahren demnach einen weiteren Schritt, in dem eine Hybridisierungsbedingung, die charakteristisch für eine Sequenz ist, verfolgt wird. Dieser weitere Schritt kann beispielsweise darin bestehen, die vervielfältigte Probe Bedingungen auszusetzen, unter denen die Sonde an die Zielsequenz hybridisiert, die Fluoreszenz der Probe zu verfolgen und eine spezielle Reaktionsbedingung zu ermitteln, die für die Sequenz charakteristisch ist, unter der sich die Fluoreszenz als Ergebnis der Hybridisierung der Sonde mit der Probe oder der Destabilisierung des Duplexes, das zwischen der Sonde und der Zielnucleinsäuresequenz gebildet wurde, ändert.
Geeignete Reaktionsbedingungen schließen die Temperatur, elektrochemische Reaktionsbedingungen oder die Antwort auf das Vorhandensein bestimmter Enzyme oder Chemikalien ein. Durch das Verfolgen von Änderungen der Fluoreszenz infolge der Veränderung dieser Eigenschaften können Informationen, die für die genaue Beschaffenheit der Sequenz charakteristisch sind, erhalten werden. Beispielsweise kann im Fall der Temperatur die Temperatur bestimmt werden, bei der sich die Sonde von der Zielsequenz trennt oder davon "abschmilzt". Dies kann äußerst wertvoll sein, um Polymorphismen in Sequenzen einschließlich Allelvariationen für die genetische Diagnose nachzuweisen und gewünschtenfalls auch zu quantifizieren. Der Begriff "Polymorphismus" schließt Transitionen, Transversionen, Insertionen, Deletionen von Inversionen ein, die in Sequenzen vorkommen können, insbesondere in der Natur.
Die Hysterese des Schmelzens der Sonde ändert sich, wenn die Zielsequenz um nur ein Basenpaar verändert wird. Daher hat die Schmelztemperatur der Sonde einen speziellen Wert, wenn die Probe nur eine einzelne Allelvariante aufweist, der verschieden von dem Wert ist, der für eine Probe gefunden wird, die eine andere Allelvariante enthält. Eine Probe, die beide Allelvarianten enthält, zeigt zwei Schmelzpunkte, die den beiden Allenvarianten entsprechen.
Ähnliche Betrachtungen treffen auf elektrochemische Eigenschaften, oder auf die Gegenwart bestimmter Enzyme oder Chemikalien zu. Die Sonde kann auf einer festen Oberfläche immobilisiert sein, über die eine elektrochemische Spannung angelegt werden kann. Die Zielsequenz bindet bei bestimmten elektrochemischen Werten an die Sonde oder wird von ihr abgestoßen, was von der genauen Beschaffenheit der Sequenz abhängt.
Kits zur Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können hergestellt werden. Diese Kits enthalten eine für eine Zielnucleotidsequenz spezifische Sonde, die ein reaktives Molekül enthält. Zusätzlich können sie ein DNA-Duplex-Bindemittel, wie einen interkalierenden Farbstoff, enthalten, das/der kompatibel ist bezüglich der Fähigkeit, FET oder FRET mit dem reaktiven Molekül durchzuführen. Weitere mögliche Bestandteile des Kits sind Reagenzien, die in Amplifikationsreaktionen verwendet werden, wie DNA-Polymerase.
Die Erfindung wird im Folgenden detailliert anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten schematischen Zeichnungen beschrieben, wobei die Figuren den folgenden Inhalt haben:
1 zeigt schematisch die Wechselwirkungen, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden;
2 veranschaulicht Schritte während der Amplifikationsreaktion gemäß der Erfindung;
3 zeigt die Ergebnisse einer Amplifikationsreaktion gemäß der Erfindung, und
4 zeigt die Ergebnisse eines Versuchs zum Nachweis von Unterschieden in den Sequenzen.
1A veranschaulicht die Funktion eines interkalierenden Farbstoffs (1), der sich in Gegenwart einer einzelsträngigen DNA (2) befindet, wie man dies während der Schmelzphase einer PCR-Reaktion finden würde. Der Farbstoff bindet an die DNA-Stränge und fluoresziert in einem gewissen Ausmaß. Wenn die DNA jedoch doppelsträngig (3) wird, wird die Farbstoffkonzentration erhöht, und die Fluoreszenz nimmt beträchtlich zu. Diese Zunahme der Fluoreszenz kann verwendet werden, um die Bildung von doppelsträngiger DNA nachzuweisen. Die Fluoreszenz des Farbstoffs liegt bei einer bestimmten Wellenlänge, z.B. im grünen Bereich des Spektrums.
Die Wirkung des interkalierenden Farbstoffs (1) auf einer Sonde (4) gemäß der Erfindung wird in 1C veranschaulicht. Etwas Farbstoff bindet an die Nucleotide der Sonde und fluoresziert mit Hintergrundintensität. Als Ergebnis des FRET geht jedoch etwas Energie auf das Akzeptormolekül (5) über, was durch den Pfeil dargestellt wird, so dass auch dieses Molekül fluoresziert, jedoch bei einer anderen Wellenlänge als der Farbstoff, beispielsweise im roten Bereich des Spektrums.
Wenn die Sonde, wie in 1D veranschaulicht, mit einer einzelsträngigen Zielsequenz hybridisiert, geht jede Zunahme der Fluoreszenzenergie vom Farbstoff auf das Akzeptormolekül (5) über, das demnach mit einer höheren Intensität fluoresziert. Die Zunahme der Fluoreszenz des Akzeptormoleküls ist demnach ein Hinweis für die Hybridisierung der Sonde an die Zielsequenz. Durch Messung der Zunahme der Fluoreszenz des Akzeptormoleküls, beispielsweise mit abnehmender Temperatur, kann der Punkt ermittelt werden, an dem die Hybridisierung stattfindet. Ähnlich findet eine Abnahme der Akzeptorfluoreszenz mit zunehmender Temperatur bei der Temperatur statt, bei der die Sonde von der Zielsequenz schmilzt. Dies variiert in Abhängigkeit von den Hybridisierungseigenschaften der Sonde und der Zielsequenz. Beispielsweise schmilzt eine Sonde, die vollständig komplementär zu einer Zielsequenz ist, bei einer anderen Temperatur als eine Sonde, die mit der Zielsequenz hybridisiert, aber eine oder mehrere fehlende Übereinstimmungen aufweist.
2 veranschaulicht, wie das erfindungsgemäße Verfahren in Amplifikationsreaktionen, wie der PCR-Reaktion, eingesetzt werden kann. Die Sonde (4) hybidisiert an einzelsträngige DNA zusammen mit dem interkalierenden Farbstoff (1), und erzeugt daher ein verstärktes Akzeptorsignal (2A). Dies geschieht während der Anlagerungsphase (= Anhybridisierungsphase) des Zyklus. So wie die Menge an Zielsequenz infolge der Amplifikation zunimmt, nimmt das während der Anlagerungsphase durch das Akzeptormolekül erzeugte Signal ebenfalls zu.
Während der Extensionsphase wird die Sonde von der Zielsequenz entfernt, entweder durch Hydrolyse oder, wie dargestellt, weil sie durch die DNA-Polymerase verdrängt wird. An diesem Punkt nimmt das Akzeptorsignal ab, obwohl das Signal des Farbstoffs (1) verstärkt wird, was wieder auf die Zunahme der Menge an Zielsequenz hinweist.
Indem auf diese Weise der Fortschritt der Amplifikationsreaktion verfolgt wird, kann die Menge an Zielsequenz, die in der ursprünglichen Probe enthalten ist, quantifiziert werden.
Beispiel 1
PCR-Amplifikationsreaktion
Die PCR-Reaktionsgemische enthielten die folgenden Reagenzien, wobei folgende Arbeitskonzentrationen hergestellt wurden:
1x "native PCR Buffer" PCR-Puffer (3 mM Mg²⁺, Bio/Gene, Bio/Gene House, 6 The Business Centre, Harvard Way, Kimbolton, Cambridge, PE18 0NJ, UK). Taq-DNA-Polymerase 0,025 Einheiten/μl, und dNTP's PCR-Nucleotide 200 μM (Boehringer Mannheim UK (Diagnostics & Biochemical) Limited, Bell Lane, Lewes, East Sussex, BN7 1LG, UK). Kundenspezifische Oligonucleotid-Primer, jeweils 1 μM (Cruachem Ltd, Todd Campus, West of Scotland Science Park, Acre Road, Glasgow G20 0UA, UK). Plasmid-DNA wurde bis zu einer Endkonzentration von 10 fg/μl (~3000 Kopien) zugegeben. In einem Negativ-Kontrollexperiment wurde eine ähnliche PCR in Abwesenheit der Plasmid-DNA durchgeführt.
Der Vorwärtsprimer YPPA155 (dATGACGCAGAAACAGGAAGAAAGATCAGCC) und der Rückwärtsprimer YPP229R (dGGTCAGAAATGAGTATGGATCCCAGGATAT) selektieren ein 104-bp-Amplikon des Anti-Coagulase-Gens von Yersinia pestis. Dieses wurde zuvor in pBluescript-SK-Vektor (Stratagene Europe, Hogehilweg 15, 1101 CB Amsterdam, Zuidoost, Niederlande) geklont, um das Phagemid-Konstrukt pYP100ML zu bilden.
Die Fluoreszenzsonde (5'(CY5)CGCTATCCTGAAAGGTGATATATCCTGG, Bio/Gene, Bio/Gene House, 6 The Business Centre, Harvard Way, Kimbolton, Cambride; PE18ONJ, UK) wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,2 μM zugegeben. SyberGold Farbstoff (Molecular Probes) wurde bis zu einer Endkonzentration von 1:400,000 der Referenzkonzentration zugegeben.
Die Umsetzung geschah durch Thermocycling in Verbundglaskapillaren in einem Idaho Technology Lightcycler (Bio/Gene, Bio Gene Hause, 6 The Business Centre, Harvard Way, Kimbolton, Cambride, PE18 0NJ, UK). Der Zyklus besteht aus 1 s bei 95 °C, 1 s bei 55 °C und 1 s bei 74 °C.
Nach dem Thermozyklus wurde ein Schmelzexperiment von 55 °C bis 95 °C mit einer Heizgeschwindigkeit von 0,1 °C/s durchgeführt. Die Umsetzung wurde optisch unter Verwendung des LightCycler^TM abgefragt, die Fluoreszenzemission bei 520 und 670 nm wurde aufgezeichnet.
Die Ergebnisse, ausgedrückt als eine Funktion der Ableitung der Fluoreszenz (F) gegen die Temperatur (T) dF/dT, aufgetragen gegen die Temperatur auf der y-Achse, ist in 3 dargestellt. Bei 520 nm wird nur die Fluoreszenz von SybrGold aufgezeichnet. Ein deutlicher Peak ist mit der Schmelztemperatur des spezifischen Produkts verbunden, das in der PCR-Reaktion vervielfältigt worden ist. Die negative Kontrolle zeigt nur Artefakte.
Bei 670 nm werden sowohl das Signal des CY5-Akzeptormoleküls als auch das Signal von SybrGold aufgezeichnet. Der Peak, der auf das spezifische Amplifikationsprodukt hinweist, wird im Positivexperiment beobachtet, fehlt aber in der negativen Kontrolle, in der wiederum nur Artefakte gezeigt werden. Zusätzlich wird in diesem Fall jedoch im Positivexperiment ein deutlicher Peak beobachtet, der vom Schmelzen der Sonde herrührt.
Beispiel 2
Die folgenden Materialien wurden verwendet.
Oligonucleotide:

Sonde: 5'(CY5)CGCTATCCTGAAAGGTGATATATCCTGGGA 3'
Homologes: 5'TCCCAGGATATATCACCTTTCAGGATAGCG 3'
Unterschied 1: 5'TCCCAGGATATATCAGCTTTCAGGATAGCG 3'
Unterschied 2: 5'TCCCAGGATATATCAGGTTTCAGGATAGCG 3'
Unterschied 3: 5'TCCCAGGATATATCTTTCAGGATAGCG 3' (Bio/Gene Limited, Bio/Gene House, 6 The Business Centre, Harvard Way, Kimbolton, Cambridgeshire, PE18 0NJ)

Interkalierender Farbstoff:

SYBR Green I (Molecular Probes)

Hybridisierungspuffer:

PCRM0012 (Bio/Gene Limited, Bio/Gene House, 6 The Business Centre, Harvard Way, Kimbolton, Cambridgeshire, PE18 0NJ)

Fluorimeter:
Idaho Technologiy LC32 (Bio/Gene Limited, Bio/Gene House, 6 The Business Centre, Harvard Way, Kimbolton, Cambridgeshire, PE18 0NJ)
Verfahren:

4μl Hybridisierungsgemische wurden zusammengestellt, die aus den folgenden Bestandteilen zusammengesetzt waren: SYBR Green I: 1/20000 Konzentration der Referenzlösung Sondenoligonucleotid: 100 μM Zieloligonucleotid: 100 μM

Die Hybridisierungsgemische wurden dem Temperaturprogramm in dem LightCycler unterzogen: Erhitzen auf 95 °C mit einer Geschwindigkeit von 20 °C/s, Abkühlen auf 50 °C mit einer Geschwindigkeit von 20 °C/s, 10 s bei 50 °C halten, Erhitzen auf 80 °C mit einer Geschwindigkeit von 0,1 °C/s. Die Fluoreszenz wurde in zwei Kanälen während des letzten Heizschritts verfolgt, F1 (520-580 nm) mit einem Verstärkungsfaktor, der auf 16 eingestellt war, und F2 (650-690 nm) mit einem Verstärkungsfaktor, der auf 128 eingestellt war.
Die spektrale Überlappung von SYBR Green I mit F2 wurde aus der F2-Fluoreszenz unter Verwendung der folgenden empirisch ermittelten Beziehung entfernt: F2 Überlappung = 0,3232 × F1 + 4,2853. Die SYBR Green I-unabhängige Komponente von F2 wurde normiert und auf die y-Achse gegen die Temperatur auf der x-Achse aufgetragen, was in 4 gezeigt wird. Die Ergebnisse zeigen die Abhängigkeit der Dissoziationstemperatur der Sonden von der Beschaffenheit der Zielsequenz. Unterschiede in einer Base in der Zielsequenz können deutlich unterschieden werden.

Claims

Verfahren für den Nachweis des Vorhandenseins einer Zielnucleinsäuresequenz in einer Probe, wobei bei diesem Verfahren (a) zu einer Probe, von der vermutet wird, dass sie die Zielnucleinsäuresequenz enthält, ein DNA-Duplex-Bindemittel und eine für diese Zielsequenz spezifische Sonde gegeben werden, wobei die Sonde ein reaktives Molekül enthält, das imstande ist, Fluoreszenzenergie von dem DNA-Duplex-Bindemittel zu absorbieren oder an das DNA-Duplex-Bindemittel abzugeben, (b) das so gebildete Gemisch einer Amplifikationsreaktion unterzogen wird, in der Zielnucleinsäure vervielfältigt wird, (c) die Probe Bedingungen ausgesetzt wird, unter denen die Sonde an die Zielsequenz hybridisiert, und (d) die Fluoreszenz dieser Probe verfolgt wird, und wobei die Sonde in intakter Form von der Zielsequenz freigesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Fluoreszenz, die mit der Bildung und Destabilisierung von Duplexen zusammenhängt, an der die Sonde beteiligt ist, gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das reaktive Molekül ein Akzeptormolekül ist, das imstande ist, Fluoreszenz von dem DNA-Duplex-Bindemittel zu absorbieren.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem DNA-Duplex-Bindemittel um einen interkalierenden Farbstoff handelt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zielnucleinsäure vor der Hybridisierung mit der Sonde in Schritt (c) in die einzelsträngige Form übergeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Amplifikationsreaktion aus einer Polymerasekettenreaktion (PCR) besteht.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Sonde während jedes Zyklus der Amplifikationsreaktion mit der Zielnucleinsäure hybridisiert.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Sonde während einer anderen Phase als der Extensionsphase des Amplifikationszyklus mit der Zielnucleinsäure hybridisiert.
Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, wobei die Fluoreszenz der Probe während der gesamten Amplifikationsreaktion verfolgt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die erzeugten Fluoreszenzdaten verwendet werden, um die relativen Mengen an Fluoreszenz vom Donormolekül und vom Akzeptormolekül während der Umsetzung oder die Geschwindigkeiten der Sondenhybridisierung zu ermitteln.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei, wobei die Fluoreszenzdaten verwendet werden, um die Menge an Zielnucleinsäure, die in der Probe enthalten ist, zu quantifizieren.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Fluoreszenz des Farbstoffs und die Fluoreszenz des reaktiven Moleküls verfolgt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem reaktiven Molekül um einen Rhodaminfarbstoff, Cy5 oder Fluorescein handelt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das reaktive Molekül an einen Endbereich der Sonde gebunden wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Amplifikationsreaktion unter Verwendung eines Enzyms ohne 5'-3'-Exonuclease-Aktivität durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das 3'-Ende der Sonde blockiert ist, um deren Extension wührend der Extensionsphase zu verhindern.
Verfahren nach Anspruch 1, das die folgenden Schritte umfasst: Durchführen einer Nucleinsäureamplifikation eines Zielpolynucleotids in Gegenwart (a) einer Nucleinsäurepolymerase, (b) mindestens eines Primers, der imstande ist, an das Zielpolynucleotid zu hybridisieren, (c) eines fluoreszierenden DNA-Duplex-Bindemittels und (d) einer Oligonucleotid-Sonde, die imstande ist, an die Zielpolynucleotidsequenz zu binden und die ein Akzeptormolekül enthält, das imstande ist, Fluoreszenz von diesem DNA-Duplex-Bindemittel zu absorbieren; und Verfolgen der Änderungen der Fluoreszenz während der Amplifikationsreaktion.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Amplifikation geeigneterweise unter Verwendung eines Paares von Amplifikationsprimern durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, wobei die Nucleinsäure-Polymerase geeigneterweise eine hitzestabile Polymerase ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in einem weiteren Schritt ein Hybridisierungsanalyseverfahren durchgeführt wird und eine Hybridisierungsbedingung, die charakteristisch für die Sequenz ist, verfolgt wird.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Bedingung aus der Temperatur, einer elektrochemischen Spannung, oder der Reaktion mit einem Enzym oder einer Chemikalie besteht.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei es sich bei der Bedingung um die Temperatur handelt.
Verfahren nach Anspruch 22, das verwendet wird, um eine Allelvariation oder einen Polymorphismus in einer Zielsequenz nachzuweisen.