CN110499151A - 一种树枝状放大的荧光信号探针及其制法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种树枝状放大的荧光信号探针；以及所述荧光信号探针的制备方法及检测Hg2+的分析应用。本发明的技术方案是通过末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)催化的DNA聚合延伸结合生物条形码扩增策略，构建了一种树枝状放大的荧光信号探针，实现了对Hg2+的灵敏分析。目标Hg2+首先引发链置换扩增(SDA)反应，产生大量模拟目标(MT)。MT与SiO2微球上捕获探针1杂交，利用TdT催化作用结合AuNPs表面的条形码技术，构建了放大的树枝状结构，可组装大量的Cy5荧光信号探针，实现了Hg2+的超灵敏检测。该研究在环境和生物领域分析中具有很好的应用潜力。
Description
技术领域：
本发明涉及一种树枝状放大的荧光信号探针；以及所述荧光信号探针的制备方法及其检测Hg2+的分析应用。
背景技术：
汞离子是毒性最大的重金属之一，即使在极低浓度下也会对环境和人体器官产生严重的不利影响[Tchounwou,P.B.；Ayensu,W.K.et.al.Environ.Toxicol.2010,18,149-175.]。脱氧核糖核酸(DNAs)由于其序列可编程性和特殊的识别特性，已被用于制造各种纳米结构和器件[Li,J.；Green,A,A.；Yan,H.Nat.Chem.2017,9,1056-1067.]。组装好的DNA纳米结构作为信号放大器，有效地提高了生物传感平台的性能[Li,C.；Li,H.；Ge,J.Chem.Commun.2019,55,3919-3922.]。树枝状DNA纳米结构具有高稳定性、良好的生物相容性、高度支化的纳米结构和单分散性等特点，在生物传感器、生物成像探针、药物载体等生物应用领域得到了广泛的研究[Li,J.；Mo,L.；Lu,C.H.Chem.Soc.Rev.2016,45,1410-1431.]。
本工作采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)催化无模板聚合延伸技术，结合生物条形码(BBC)扩增策略，于SiO2微球表面可控地制备了一种新型树枝状放大的荧光信号探针，用于Hg2+的灵敏检测。
发明内容：
本发明的目的之一提供一种新型树枝状放大的荧光信号探针；以及所述荧光信号探针的制备方法及其检测Hg2+的分析应用。
具体包括以下步骤：
步骤1.靶向Hg2+诱导扩增过程：首先，不同浓度的Hg2+样品溶液和30μM机器DNA在40μL 1×NEB缓冲溶液中37℃下反应1小时。然后，加入包含phi29DNA聚合酶(5U)、Nt.BbvCI(5U)和500μM dNTPs的混合物，在37℃下温育2h，获得大量的MT序列。最后，80℃热处理10min，停止上述反应，冷却至室温。
步骤2.制备SiO2-C1和C2/报告探针-AuNPs：取0.5μL羧基二氧化硅微球，加入15μL0.1M EDC和15μL 0.025M NHS在室温下活化2h，再加30μL捕获探针1(C1,10μM)37℃下反应6h。离心去除多余的DNA序列，沉淀分散在10μL去离子水中，在4℃储存。1μL AuNPs,0.9μL捕获探针2(C2,2μM)和8.1μL报告探针(2μM)混合，在37℃反应16h，形成C2/报告探针-AuNPs复合物。
步骤3.二氧化硅微球表面树枝状荧光信号探针的制备及检测：上述MT溶液与含有10μL SiO2-C1溶液、750mM NaCl和75mM柠檬酸钠的溶液混合，在37℃下反应1h。离心后，取5U(TdT)加到20μL含有该沉淀产物、2μLdGTPs(100mM)、2μL 10×末端转移酶反应液、2μLCoCl2(2.5mM)的混合溶液，在37℃下进行聚合反应2h。随后，50μLC2/报告探针-AuNPs加到上面聚合产物溶液中，室温反应1h。多余的TdT、dTTPs等通过离心除去。
TdT-催化的第二次聚合扩展反应：5U(TdT)加到20μL聚合反应体系，含有上述沉淀产物、2μL dTTPs(100mM)、2μL 10×末端转移酶反应缓冲液、2μL CoCl2(2.5mM)，37℃下反应2h。离心后，加入信号探针37℃下反应1h。离心除去上清液，沉淀分散在50μL水，测量荧光信号。
附图说明：
图1二氧化硅微球表面树枝状放大的荧光信号探针制备及检测Hg2+的原理图。
图2电泳表征：(A)SDA过程，(B)TdT催化的聚合延伸过程。
图3荧光信号探针的(A)AFM图，(B)AFM高度图，(C)TEM图。(D)二氧化硅微球表面聚合产物探针的TEM图。
图4(A)不同浓度目标Hg2+对应的荧光信号。(B)荧光信号变化和Hg2+浓度的关系，插图：测定Hg2+的矫正曲线。
具体实施方式：
实施例1.荧光信号探针的制备及对目标Hg2+的检测
Hg2+诱导扩增过程：不同浓度的Hg2+溶液和30μM机器DNA 37℃下反应1小时。再加入phi29DNA(5U),Nt.BbvCI(5U)和500μM dNTPs在37℃温育2h，获得大量MT序列的溶液。
荧光信号探针的制备及对目标Hg2+的检测：
取0.5μL SiO2溶液，加入15μL 0.1M EDC和15μL 0.025M NHS在室温下活化2h，再加30μL捕获探针1(10μM)37℃下反应6h。离心去除多余的DNA序列，沉淀分散在10μL去离子水中，得到SiO2-C1。
1μL AuNPs,0.9μL捕获探针2(2μM)和8.1μL报告探针(2μM)在37℃反应16h，形成C2/报告探针-AuNPs。
上述MT溶液与含有10μL SiO2-C1溶液、750mM NaCl和75mM柠檬酸钠的溶液混合，在37℃下反应1h。离心后，取5U(TdT)加到20μL含有该沉淀产物、2μL dGTPs(100mM)、2μL 10×末端转移酶反应液、2μL CoCl2(2.5mM)的反应体系，在37℃下进行聚合反应2h。随后，50μLC2/报告探针-AuNPs加到上面聚合产物溶液中，室温反应1h。多余的TdT、dTTPs等通过离心除去。
荧光信号探针的制备及检测：5U(TdT)加到20μL含有上述沉淀产物、2μL dTTPs(100mM)、2μL 10×末端转移酶反应缓冲液、2μL CoCl2(2.5mM)的反应体系，37℃下反应2h。离心后，加入信号探针37℃下反应1h。离心除去上清液，沉淀分散在50μL水，测量荧光信号。
实施例2.荧光信号探针的制备及对目标Hg2+的检测
将“不同浓度的Hg2+溶液和30μM机器DNA 37℃下反应1小时。”改为“不同浓度的Hg2 +溶液和30μM机器DNA 37℃下反应1.5小时。”制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的荧光信号探针。对Hg2+检测的结果同实施例1。
实施例3.荧光信号探针的制备及对目标Hg2+的检测
将“1μL AuNPs,0.9μL捕获探针2(2μM)和8.1μL报告探针(2μM)在37℃反应16h，形成C2/报告探针-AuNPs。”改为“1μL AuNPs,0.9μL捕获探针2(2μM)和8.1μL报告探针(2μM)在37℃反应12h，形成C2/报告探针-AuNPs。”制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的荧光信号探针。对Hg2+检测的结果同实施例1。
实施例4.荧光信号探针的制备及对目标Hg2+的检测
将“再与phi29DNA(10U/μL)、Nt.BbvCI(10U/μL)和500μM dNTPs在37℃温育2h，获得大量MT序列的溶液。”改为“再与phi29DNA(10U/μL)、Nt.BbvCI(10U/μL)和600μM dNTPs在37℃温育2h，获得大量MT序列的溶液。”制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的荧光信号探针。对Hg2+检测的结果同实施例1。
实施例5.荧光信号探针的制备及对目标Hg2+的检测
将“5U(TdT)加到20μL含有上述沉淀产物、2μL dTTPs(100mM)、2μL 10×末端转移酶反应缓冲液、2μL CoCl2(2.5mM)的反应体系，37℃下反应2h。离心后，加入信号探针37℃下反应1h。”改为“6U(TdT)加到20μL含有上述沉淀产物、2μL dTTPs(100mM)、2μL 10×末端转移酶反应缓冲液、2μL CoCl2(2.5mM)的反应体系，37℃下反应2h。离心后，加入信号探针37℃下反应1h。”制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的荧光信号探针。对Hg2+检测的结果同实施例1。
Claims (2)
1.一种树枝状放大的荧光信号探针，其特征是：利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)催化的聚合延伸技术结合生物条形码扩增策略，构建了一种树枝状放大的荧光信号探针，实现了对Hg2+的灵敏分析。目标Hg2+首先引发链置换扩增(SDA)反应，产生大量模拟目标(MT)。MT与SiO2微球上捕获探针1杂交，利用TdT催化作用结合AuNPs表面的条形码技术，构建了一种放大的树枝状DNA结构，可组装大量的荧光信号探针，实现了Hg2+的超灵敏检测。
2.一种制备权利要求1所述的树枝状放大的荧光信号探针的方法和应用，其特征方法由下列步骤组成：
步骤1.靶向Hg2+诱导扩增过程：首先，不同浓度的Hg2+样品溶液和30μM机器DNA在40μL 1×NEB缓冲溶液中37℃下反应1小时。然后，加入包含phi29 DNA聚合酶(5U)、Nt.BbvCI(5U)和500μM dNTPs的混合物，在37℃温育2h，获得大量的MT序列。最后，80℃热处理10min，停止上述反应，冷却至室温。
步骤2.制备SiO2-C1和C2/报告探针-AuNPs：取0.5μL羧基二氧化硅微球，加入15μL 0.1MEDC和15μL 0.025M NHS在室温下活化2h，再加30μL捕获探针1(C1,10μM)37℃下反应6h。离心去除多余的DNA序列，沉淀分散在10μL去离子水中，在4℃储存。1μLAuNPs,0.9μL捕获探针2(C2,2μM)和8.1μL报告探针(2μM)混合，在37℃反应16h，形成C2/报告探针-AuNPs复合物。
步骤3.二氧化硅微球表面树枝状荧光信号探针的制备及检测：上述MT溶液与含有10μLSiO2-C1溶液、750mM NaCl和75mM柠檬酸钠的溶液混合，在37℃下反应1h。离心后，取5U(TdT)加到20μL含有该沉淀产物、2μLdGTPs(100mM)、2μL 10×末端转移酶反应液、2μLCoCl2(2.5mM)的反应体系，在37℃下进行聚合反应2h。随后，50μLC2/报告探针-AuNPs复合物加到上面聚合产物溶液中，室温反应1h。多余的TdT、dTTPs等通过离心除去。
TdT-催化的第二次聚合扩展反应：取5U(TdT)加到20μL含有上述沉淀产物、2μL dTTPs(100mM)、2μL 10×末端转移酶反应缓冲液、2μL CoCl2(2.5mM)的反应体系，37℃下反应2h。离心后，加入信号探针37℃下反应1h。离心除去上清液，沉淀分散在50μL水，测量荧光信号。
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