CN110057797B - 一种基于量子点构建的网状结构检测microRNA-155的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种基于量子点构建的网状结构检测microRNA‑155的方法，在microRNA‑155存在下，固定在金纳米粒子@SiO2核壳纳米复合物(AuNPs@SiO2)表面的发夹探针可以部分与之杂交。然后，利用外切酶ExoIII可以产生大量的H1‑AuNPs@SiO2。将辅助链A2、H1‑AuNPs@SiO2与A1‑QDs结合，然后用AuNPs@SiO2通过FRET作用猝灭量子点的荧光信号。溶液中含有越多的microRNA‑155，相应的FL信号就越弱。该方法线性响应范围为0.01fM‑1nM，最低检出限为3aM。此外，该方法在实际人血清样品中的特异性较高，回收率在93‑107％之间，具有很大的实际应用前景。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物传感器以及荧光检测分析技术领域，具体涉及一种基于核壳CdSeTe/ZnS量子点构建的网状结构检测microRNA-155的方法。
背景技术
到目前为止，许多癌症和肿瘤还不能完全治愈，例如肺癌，其发病率和死亡率几乎最高，对我们的健康构成了严重的威胁。因此，早期及时治疗对于挽救患者生命是非常必要的。目前迫切需要开发更有效的肺癌早期诊断方法。miRNA是一类内源性非编码短单链调控RNA，调节靶蛋白和信号通路，参与细胞发育、分裂增殖甚至细胞分化等生物学过程。microRNA-155显示了在患者血浆中的特异性表达水平，因此被选为肿瘤标记物并进行了研究。然而，由于microRNA-155的含量极低，给科学家对它的定性定量检测带来了巨大的挑战。荧光分析具有操作简单，不需要任何复杂仪器，灵敏度高和成本低等优点，常被应用于构建荧光生物传感器检测miRNA。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测miRNA的方法，该方法可以对microRNA-155进行定性、定量检测，具有操作简单、准确性高、检测范围广、灵敏度高、特异性强等优点。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种基于量子点构建的网状结构检测microRNA-155的方法，包括如下步骤：
(1)制备核酸序列修饰的量子点：
将核壳结构的CdSeTe/ZnS量子点表面的羧基活化后置于核酸序列A1的溶液中，孵育15～20h，得到核酸序列A1修饰的量子点，标记为A1-QDs；
所述核酸序列A1为：5’-GTTGCCATTGAC-NH2-3’；
(2)制备核酸序列修饰的AuNPs@SiO2复合材料：
将断裂二硫键后的核酸序列HP的溶液加入AuNPs@SiO2的分散液中，于35～38℃的黑暗中孵育15～24h，之后采用巯基己醇阻断AuNPs@SiO2上剩余的活性结合位点，得到核酸序列HP修饰的AuNPs@SiO2复合材料，标记为HP-AuNPs@SiO2；
所述核酸序列HP为：
5’-SH-ACCTCACACTGTTAATGACCCCTATCACGATTAGCATTAA-3’；
(3)对microRNA-155进行荧光检测：
将步骤(2)制备得到的HP-AuNPs@SiO2、外切酶ExoⅢ和microRNA-155于30～40℃中孵育1～2h之后离心、净化得到的沉淀标记为H1-AuNPs@SiO2；
向H1-AuNPs@SiO2中加入步骤(1)制备得到的A1-QDs和核酸序列A2，于37℃中孵育1～2h，然后记录溶液的荧光强度；
所述核酸序列A2为：5’-CAATGGCAACCATTAACAGT-3’。
该方法中的步骤(3)，采用外标法即可得到microRNA-155的量，比较等量的A1-QDs的荧光强度和步骤(3)得到的溶液的荧光强度可定性检测microRNA-155。
该检测方法的原理如图1所示。
优选的，步骤(1)中活化核壳结构的CdSeTe/ZnS量子点表面的羧基的方法为：向所述CdSeTe/ZnS量子点的分散液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合液，于30～40℃中，孵育1～2h。
优选的，所述EDC和NHS的混合液中EDC和NHS的用量比为1:1(v/v)。
优选的，所述EDC和NHS的混合液的浓度为1nM。
步骤(1)所述的核壳结构的CdSeTe/ZnS量子点是以CdSeTe为核，ZnS为壳。
步骤(1)所述的核壳结构的CdSeTe/ZnS量子点可采用现有技术制备，也可采用如下方法制备：
调节CdCl2和半胱氨酸的水溶液的pH值为11～12，后脱氧，于95℃加入KHTe溶液，回流20～30min，之后加入KHSe溶液，继续回流20～30min得到CdSeTe，然后于惰性气氛下，将CdSeTe加入到ZnCl2溶液中，于pH11～12，的条件下，于60～70℃加入Na2S溶液，回流30～50min，即得所述CdSeTe/ZnS量子点。
步骤(1)中核酸序列A1由现有技术合成得到。
步骤(2)中断裂二硫键后的核酸序列HP由如下方法制备：
将核酸序列HP加入到二硫键还原剂与NaCl的混合溶液中，于3～5℃中孵育1～1.5h即得。
步骤(2)中核酸序列HP由现有技术合成得到。
优选的，所述二硫键还原剂为三(2-羧乙基)膦(TCEP)。
步骤(2)所述的AuNPs@SiO2可采用现有技术制备。
步骤(3)所述的核酸序列A2由现有技术合成得到。
优选的，步骤(3)中所述外切酶ExoIII的用量为6UμL-1。在此优化条件下，量子点的猝灭效果达到最佳，FL最低。
microRNA-155的序列为：5’-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3’。采用本发明的方法进行检测，如图1所示，microRNA-155首先打开了发夹修饰的AuNPs@SiO2(HP-AuNPs@SiO2)生物复合材料，并与部分HP杂交，在此基础上，核酸外切酶(ExoⅢ)触发催化了核酸序列HP的3’端的酶解，产生靶循环和大量H1-AuNPs@SiO2，其中H1的序列为：5’-3’：ACCTCACACTGTTAATG，H1是HP的剩余部分。利用核酸序列A2，H1-AuNPs@SiO2与A1-QDs结合，形成网络结构。从而发生荧光共振能量转移(FRET)现象，量子点的荧光可以被相邻的AuNPs猝灭。荧光强度下降值与microRNA-155浓度成正比，可作为miRNA-155检测的定量证据。
本发明的方法具有如下有益效果：
(1)高灵敏度。基于FRET效应的网状结构提高了量子点的猝灭效率。
(2)高特异性。HP结构探针的应用，由于其固有的结构约束，提高了选择性，只有microRNA-155的完全匹配目标才能识别HP的3’端，有效打开发夹结构；同时在与HP探针相互作用的基础上，利用切割位点触发外切酶ExoⅢ特异性识别，也能保证特异性；此外借助于辅助的核酸序列A2，可以形成FRET网状结构，从而提高特异性。
(3)结果准确。microRNA-155的回收率在93-107％。
本发明提出了一种将FRET技术与目标循环放大技术相结合检测microRNA-155的新方法。该方法具有良好的稳定性和选择性，并在实际血清样品中得到了验证。该方法具有成本效益高、通用性强、灵敏度高等优点。并且该工作为基于量子点(QDs)的FRET技术为miRNA检测提供了一种有前景的方法，并提出了一种FL传感器的模型。可以构建任何miRNA传感器，只需要改变DNA探针的序列。
该方法线性响应范围为0.01fM-1nM，最低检出限为3aM，具有很大的实际应用前景。
附图说明
图1是本发明所述方法的流程图。
图2是实施例1中的定性检测结果。
图3是实施例1中的定量检测结果。
图4是实施例1中的特异性检测结果。
图5是实施例2的检测结果。
图6是实施例3的检测结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和特点更加清楚，下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
(1)制备CdSeTe/ZnS量子点：
将57.1mgCdCl2和72.7mgL半胱氨酸溶于200mL的水中，用1M NaOH调节pH值至11.5。所制得的透明溶液经氮气脱氧20min，加热至95℃。在强力搅拌下，将33.7mg KBH4和79.8mg Te粉配制的新鲜KHTe溶液注入反应体系，95℃下回流0.5h。然后，加入33.7mg KBH4和19.7mg Se粉制备的新鲜KHSe溶液2.0mL，继续回流0.5h，使CdTe量子点进一步成核生长。最后，在N2气氛下，将所制备的50mLCdSeTe量子点加入到45mL的0.06mM ZnCl2中，再用1MNaOH调节pH值至11.5。当溶液加热到65℃时，加入31.3mM的Na2S溶液，在65℃中回流40min，使ZnS壳层生长，即得所述CdSeTe/ZnS量子点。
(2)制备核酸序列A1修饰的量子点：
将100μL 1nM EDC/NHS(1:1，v/v)的混合物加入到200μL的CdSeTe/ZnS量子点分散液中，在37℃中孵育2h，活化量子点表面的羧基。然后，加入100μL 1μM A1，孵育16h获得A1-QDs。
(3)制备核酸序列修饰的AuNPs@SiO2复合材料：
SiO2在水和乙醇(10/90v/v)的混合物中超声分散30min。然后，在10mL SiO2分散液中加入5mL 3％PDDA(w/w)，搅拌1h。收集带正电荷的SiO2纳米球，清洗三次。在此基础上，加入60mL新制备的AuNPs溶液，隔夜搅拌。由带负电荷的AuNPs和带正电荷的SiO2之间的静电吸收得到AuNPs@SiO2。离心分离后，再分散在10mL水中，4℃贮存。
将25μL的1μM HP加入2.5μL的10mM TCEP和25μL的0.5M NaCl的混合物中，在4℃中孵育1h，断裂二硫键。然后将该溶液加入125μL AuNPs@SiO2的分散液中，在37℃黑暗中孵育15h。AuNPs@SiO2上剩余的活性结合位点在37℃下用25μL的1mM巯基己醇阻断2h，用水仔细清洗后，得到HP-AuNPs@SiO2，将HP-AuNPs@SiO2分散在10mL的水中。
(4)对microRNA-155进行荧光检测：
将包含75μL HP-AuNPs@SiO2、1μL 6UμL-1 ExoⅢ和不同浓度的15μL microRNA-155分别在37℃中孵育1h，然后冷却至室温。离心分离后，收集并净化得到的H1-AuNPs@SiO2沉淀，再对各组样品分别加入10μL A1-QDs和1μL 1μM A2，在37℃下孵育2h。然后记录溶液的荧光强度。
定性检测试验：设置平行实验组(不加microRNA-155)，利用量子点进行荧光检测，比较平行实验组结果与上述步骤(4)的一组检测结果，如图2所示。可以看出，在未加入microRNA-155时，荧光信号强烈。当加入检测对象microRNA-155时，荧光信号猝灭。这说明本发明的荧光传感器能够定性检测microRNA-155。
定量检测试验：上述步骤(4)中microRNA-155的浓度分别为：0.2aM,10aM,20aM,0.1fM,0.2fM,1fM,2fM,0.01pM,0.02pM,0.1pM,0.25pM,1pM,0.01nM,0.1nM,0.2nM,1nM和5nM，检测结果如图3所示，可以看出荧光强度随microRNA-155浓度的增加而减小，microRNA-155越多，FRET网状结构越大，越多量子点被猝灭。在0.01fM-1nM浓度范围内，ΔFL与CmiR155的对数(lgCmiR155)呈线性关系，检测限为3aM。
特异性试验：设置五个实验组，分别添加不同的检测对象miR141,miR21,miR210，miR214和microRNA-155进行上述步骤(1)～(4)进行比较，结果如图4所示。可以看出microRNA-155的荧光传感强度远低于干扰的应该传感强度，具有较好的选择性。
其中miR141,miR21,miR210和miR214的序列分别为：
miR141：5’-UAACACUGUCUGGUAAAGAUGGC-3’；
miR21：5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGAC-3’；
miR210：5’-CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGAU-3’；
miR214：5’-ACAGCAGGCACAGACAGGCAGUC-3’。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的任何修改、添加或者替换，均应属于本发明保护范围。
实施例2
(1)制备核酸序列A1修饰的量子点：
将100μL 1nM EDC/NHS(1:1，v/v)的混合物加入到200μL的CdSeTe/ZnS量子点分散液中，在30℃中孵育1h，活化量子点表面的羧基。然后，加入100μL 1μM A1，孵育15h获得A1-QDs。
(2)制备核酸序列修饰的AuNPs@SiO2复合材料：
将25μL的1μM HP加入2.5μL的10mM TCEP和25μL的0.5M NaCl的混合物中，在3℃中孵育1.5h，断裂二硫键。然后将该溶液加入125μL AuNPs@SiO2的分散液中，在35℃黑暗中孵育24h。AuNPs@SiO2上剩余的活性结合位点在37℃下用25μL的1mM巯基己醇阻断2h，用水仔细清洗后，得到HP-AuNPs@SiO2，将HP-AuNPs@SiO2分散在10mL的水中。
(3)对microRNA-155进行荧光检测：
将包含75μL HP-AuNPs@SiO2、1μL 6UμL-1 ExoⅢ和不同浓度的15μL 0.02pM的microRNA-155在30℃中孵育2h，然后冷却至室温。离心分离后，收集并净化得到的H1-AuNPs@SiO2沉淀，再加入10μL A1-QDs和1μL 1μM A2，在37℃下孵育1h。然后记录溶液的荧光强度。
实施例3
(1)制备核酸序列A1修饰的量子点：
将100μL 1nM EDC/NHS(1:1，v/v)的混合物加入到200μL的CdSeTe/ZnS量子点分散液中，在40℃中孵育2h，活化量子点表面的羧基。然后，加入100μL 1μM A1，孵育20h获得A1-QDs。
(2)制备核酸序列修饰的AuNPs@SiO2复合材料：
将25μL的1μM HP加入2.5μL的10mM TCEP和25μL的0.5M NaCl的混合物中，在5℃中孵育1.5h，断裂二硫键。然后将该溶液加入125μL AuNPs@SiO2的分散液中，在38℃黑暗中孵育15h。AuNPs@SiO2上剩余的活性结合位点在37℃下用25μL的1mM巯基己醇阻断2h，用水仔细清洗后，得到HP-AuNPs@SiO2，将HP-AuNPs@SiO2分散在10mL的水中。
(3)对microRNA-155进行荧光检测：
将包含75μL HP-AuNPs@SiO2、1μL 6U μL-1 ExoⅢ和不同浓度的15μL 0.01pM的microRNA-155在40℃中孵育1h，然后冷却至室温。离心分离后，收集并净化得到的H1-AuNPs@SiO2沉淀，再加入10μL A1-QDs和1μL 1μM A2，在37℃下孵育2h。然后记录溶液的荧光强度。
Claims (10)
1.一种基于量子点构建的网状结构检测microRNA-155的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备核酸序列修饰的量子点：
将核壳结构的CdSeTe/ZnS量子点表面的羧基活化后置于核酸序列A1的溶液中，孵育15～20h，得到核酸序列A1修饰的量子点，标记为A1-QDs；
所述核酸序列A1为：5’-GTTGCCATTGAC-NH2-3’；
(2)制备核酸序列修饰的AuNPs@SiO2复合材料：
将断裂二硫键后的核酸序列HP的溶液加入AuNPs@SiO2的分散液中，于35～38℃的黑暗中孵育15～24h，之后采用巯基己醇阻断AuNPs@SiO2上剩余的活性结合位点，得到核酸序列HP修饰的AuNPs@SiO2复合材料，标记为HP-AuNPs@SiO2；
所述核酸序列HP为：
5’-SH-ACCTCACACTGTTAATGACCCCTATCACGATTAGCATTAA-3’；
(3)对microRNA-155进行荧光检测：
将步骤(2)制备得到的HP-AuNPs@SiO2、外切酶ExoⅢ和microRNA-155于30～40℃中孵育1～2h之后离心、净化得到的沉淀标记为H1-AuNPs@SiO2；
向H1-AuNPs@SiO2中加入步骤(1)制备得到的A1-QDs和核酸序列A2，于37℃中孵育1～2h，然后记录溶液的荧光强度；
所述核酸序列A2为：5’-CAATGGCAACCATTAACAGT-3’。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中活化核壳结构的CdSeTe/ZnS量子点表面的羧基的方法为：
向所述CdSeTe/ZnS量子点的分散液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合液，于30～40℃中孵育1～2h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述EDC和NHS的混合液中EDC和NHS的用量比为1:1。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述EDC和NHS的混合液的浓度为1nM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的核壳结构的CdSeTe/ZnS量子点采用如下方法制备：
调节CdCl2和半胱氨酸的水溶液的pH值为11～12，后脱氧，于95℃加入KHTe溶液，回流20～30min，之后加入KHSe溶液，继续回流20～30min得到CdSeTe，然后于惰性气氛下，将CdSeTe加入到ZnCl2溶液中，于pH11～12，的条件下，于60～70℃加入Na2S溶液，回流30～50min，即得。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中断裂二硫键后的核酸序列HP由如下方法制备：
将核酸序列HP加入到二硫键还原剂与NaCl的混合溶液中，于3～5℃中，孵育1～1.5h即得。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述二硫键还原剂为三(2-羧乙基)膦。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述外切酶ExoIII的用量为6UμL-1。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中HP-AuNPs@SiO2、外切酶ExoⅢ和microRNA-155的孵育的温度为37℃。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，CdSeTe/ZnS量子点、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的孵育温度为37℃。
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