CN110376260B - 检测前列腺特异性抗原的光电化学适体传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测前列腺特异性抗原的光电化学适体传感器的制备方法。在纸基铂/氧化锌纳米片上负载大量的硫化镉量子点和一端标记有石墨烯量子点的信号转导探针，激活共敏化效应，增大光电流信号；当标记金纳米粒子的特异性识别前列腺特异性抗原的适配体与信号转导探针杂交形成三股螺旋分子开关时，抑制共敏化效应并产生金纳米粒子的信号猝灭效应，光电流信号降低；当前列腺特异性抗原识别适配体时，三股螺旋分子开关构象改变，重新活化共敏化效应和消除猝灭效应，光电流信号增强；基于转换的信号实现前列腺特异性抗原的灵敏检测。
Description
技术领域
本发明涉及纸芯片技术、肿瘤标志物检测技术、光电化学分析技术及纳米材料合成技术领域，更具体地说是一种用于高灵敏检测前列腺特异性抗原的光电化学适体传感器的制备方法。
背景技术
灵敏的检测肿瘤标志物对癌症的诊断具有重要的意义，各种各样的分析方法已经被发展。光电化学分析方法由于其检测信号和激发源是两种完全分离的形式，其可以有效地降低背景信号，增强分析灵敏度，被广泛地用于肿瘤标志物的检测。然而，光电化学分析方法通常采用单一的信号模式，在分析过程中容易产生假阳性或假阴性的错误，因此需要发展信号转换的检测模式。
传统的肿瘤标志物检测通常使用抗体作为分子识别元件，其具有一些固有的缺陷。由于抗体需要利用细胞系产生，其具有较高的成本，另外其稳定性较差不利于在恶劣的条件下储存和运输，因此，需要开发新的分子识别工具。适配体作为一种短的、化学合成的单链DNA/RNA寡核苷酸，可以识别小分子甚至蛋白质或细胞等特定的目标物。与抗体相比，适配体具有非免疫原性、易于大规模合成、易于功能化、稳定性高等优点。目标物特异性适配体序列与具有发夹结构的信号转导探针通过Hoogsteen和Watson-Crick碱基对可以杂交形成三股螺旋分子开关，其可以有效地提高适配体的结合亲和力和特异性，进而提高检测的灵敏度。更重要的是，三股螺旋分子开关具有目标物引发的构象变化机制，其可以将目标物识别转化为特定的构象变化，导致信号的变化。
发明内容
本发明的目的是通过电沉积法在包覆有铂纳米粒子的纸电极表面生长氧化锌纳米片，然后功能化硫化镉量子点和3′端标记有石墨烯量子点的信号转导探针，形成活化的共敏化效应，获得较强的光电流信号；当3′端和5′端均标记有金纳米粒子的特异性识别前列腺特异性抗原的适配体与信号转导探针杂交时，形成三股螺旋分子开关，信号转导探针的发夹结构被打开，石墨烯量子点远离电极表面，金纳米粒子靠近电极表面，导致抑制的共敏化效应和金纳米粒子对硫化镉量子点光电流信号的猝灭效应，极大地降低光电流；当前列腺特异性抗原特异性识别适配体时，导致三股螺旋分子开关解组装，同时信号转导探针恢复发夹结构，石墨烯量子点靠近电极表面，金纳米粒子远离电极表面，共敏化作用重新被激活，而金纳米粒子的猝灭效应被解除，因此，光电流信号增强；基于上述信号转换模式，实现对前列腺特异性抗原的灵敏检测。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：
（1）通过计算机软件Adobe illustrator CS6设计纸芯片的疏水蜡打印图案，然后利用蜡打印机将疏水蜡打印图案打印在色谱纸上，在烘箱中150 ℃条件下加热30 s，使蜡完全融化，形成未打印蜡的亲水功能区；
（2）通过丝网印刷技术，将利用计算机软件Adobe illustrator CS6设计好的碳工作电极、碳对电极和Ag/AgCl参比电极的印刷图案印刷在步骤（1）中获得的未打印蜡的亲水功能区；
（3）利用原位还原法在步骤（2）中获得的碳工作电极的工作区域生长铂纳米粒子层：将30 μL新制备的含有浓度为100-300 mM的氯铂酸和浓度为20-40 mM的硼氢化钠的混合液滴加到工作区域，在4 ℃条件下反应10-30 min后，用二次水洗涤，并在室温下自然干燥；
（4）利用电沉积法在步骤（3）中获得的碳工作电极的工作区域沉积氧化锌纳米片：沉积电解液由浓度为0.03-0.06 M的硝酸锌和浓度为0.1-0.3 M的氯化钾组成，沉积温度为60-80 ℃，沉积电压为-1.0 - -1.5 V，沉积时间为50-110 min，沉积完成后，用二次水洗涤工作区域表面，并在室温下自然干燥；
（5）合成硫化镉量子点，将200-300 μL巯基乙酸加入到40-60 mL浓度为0.01-0.03M的氯化镉溶液中，利用浓度为1.0 M的氢氧化钠将溶液的pH调节至9-11，在100-120 ℃条件下加热反应30-60 min，整个加热过程均在氮气氛围下进行，随后加入5-7 mL浓度为0.1-0.3 M的硫化钠溶液，继续在氮气氛围下加热回流3-5 h，获得硫化镉量子点溶液；
（6）合成石墨烯量子点：将1-3 g柠檬酸置于50 mL的烧杯中，在烘箱中，100-200℃条件下加热反应20-60 min，待自然冷却到室温后，用浓度为2 M的氢氧化钠将其溶解，并调节溶液的pH直至7.0，获得石墨烯量子点溶液；
（7）标记金纳米粒子在特异性识别前列腺特异性抗原的适配体上，具体过程分为2步：第一步是合成金纳米粒子，将0.5-0.8 mL浓度为0.1-0.3 M的硼氢化钠加入到20-40 mL浓度为200-300 μM的氯金酸溶液中，获得的混合液在冰浴条件下搅拌反应10-20 min后，在室温下静置3 h，溶液由橙红色变为酒红色；第二步是标记金纳米粒子在特异性识别前列腺特异性抗原的适配体上，所用的适配体3′端和5′端均带有巯基，将10 μL浓度为10 mM的三(2-羧乙基)-膦酸盐与200 μL浓度为5.0 μM的特异性识别前列腺特异性抗原的适配体混合并在室温下孵化1 h，然后加入800 μL金纳米粒子，震荡反应16 h后，在转速为16 000 r/min条件下，离心30 min，将获得的沉淀重新溶解在1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，其中磷酸盐缓冲溶液简写为PBS，获得标记有金纳米粒子的特异性识别前列腺特异性抗原的适配体；
（8）光电化学适体传感器的构建：在步骤（4）中获得的碳工作电极的工作区域滴加20 μL质量分数为2%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，在室温下孵化40 min后用pH 7.4的PBS洗涤，然后滴加20 μL由步骤（5）中获得的硫化镉量子点和浓度为10 mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及浓度为20 mM的N-羟基琥珀酰亚胺组成的混合液并在室温下反应50 min，用pH 7.4的PBS洗涤后，继续滴加20 μL浓度为5.0 μM的被三(2-羧乙基)-膦酸盐处理过的信号转导探针，所述的信号转导探针被三(2-羧乙基)-膦酸盐处理的过程为将10 μL浓度为10 mM的三(2-羧乙基)-膦酸盐与200 μL浓度为5.0 μM的信号转导探针混合并在室温下孵化1 h，所用的信号转导探针3′端带有氨基，5′端带有巯基，在4 ℃条件下孵化12 h后用pH 7.4的PBS洗涤除去多余的信号转导探针，随后滴加20 μL 1 mM的6-羟基-1-己硫醇并在室温下孵化1 h，用pH 7.4的PBS洗涤后，滴加20 μL含有浓度为10 mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和浓度为20 mM的N-羟基琥珀酰亚胺及步骤（6）中获得的石墨烯量子点的混合液，在室温下孵化2 h后用pH 7.4的PBS洗涤，继续滴加20 μL步骤（7）中获得的标记有金纳米粒子的特异性识别前列腺特异性抗原的适配体，反应90 min后形成三股螺旋分子开关，最后滴加10 μL不同浓度的前列腺特异性抗原，在37 ℃条件下孵化2 h后，用pH 7.4的PBS洗涤，完成光电化学适体传感器的构建；
（9）信号检测：利用电流-时间曲线法，通过由步骤（8）中获得的碳工作电极、碳对电极和Ag/AgCl参比电极组成的三电极系统进行光电流信号检测，检测电解液为含有0.01M过氧化氢的pH 7.4的PBS，检测电压为0.0 V，激发光源开关每隔10 s切换一次，激发波长范围为200-2500 nm，随着前列腺特异性抗原浓度的增加，光电流信号逐渐增强，基于光电流信号强度与前列腺特异性抗原浓度的关系实现对前列腺特异性抗原的灵敏检测。
本发明的有益效果：
（1）通过电沉积法制备的氧化锌纳米片具有大的表面积，其可以负载大量的硫化镉量子点以及石墨烯量子点，形成级联的敏化结构，基于活化的共敏化作用可以极大地增强光电流信号，实现信号放大。
（2）基于前列腺特异性抗原识别适配体诱导的三股螺旋分子开关的构象改变，获得先升高后降低再升高的信号转换模式，其可以降低背景信号的干扰，避免假阳性和假阴性错误，有效地提高分析检测的灵敏度。
（3）利用适配体作为分子识别工具，相比于传统的抗体，其不仅具有成本低、稳定性高的优点而且可以大规模的制备，更有利于实际的应用。
具体实施方式:
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1:光电化学适体传感器用于前列腺特异性抗原的检测
（1）通过计算机软件Adobe illustrator CS6设计纸芯片的疏水蜡打印图案，然后利用蜡打印机将疏水蜡打印图案打印在色谱纸上，在烘箱中150 ℃条件下加热30 s，使蜡完全融化，形成未打印蜡的亲水功能区；
（2）通过丝网印刷技术，将利用计算机软件Adobe illustrator CS6设计好的碳工作电极、碳对电极和Ag/AgCl参比电极的印刷图案印刷在步骤（1）中获得的未打印蜡的亲水功能区；
（3）利用原位还原法在步骤（2）中获得的碳工作电极的工作区域生长铂纳米粒子层：将30 μL新制备的含有浓度为300 mM的氯铂酸和浓度为30 mM的硼氢化钠的混合液滴加到工作区域，在4 ℃条件下反应20 min后，用二次水洗涤，并在室温下自然干燥；
（4）利用电沉积法在步骤（3）中获得的碳工作电极的工作区域沉积氧化锌纳米片：沉积电解液由浓度为0.05 M的硝酸锌和浓度为0.1 M的氯化钾组成，沉积温度为70 ℃，沉积电压为-1.1 V，沉积时间为60 min，沉积完成后，用二次水洗涤工作区域表面，并在室温下自然干燥；
（5）合成硫化镉量子点，将250 μL巯基乙酸加入到50 mL浓度为0.01 M的氯化镉溶液中，利用浓度为1.0 M的氢氧化钠将溶液的pH调节至11，在110 ℃条件下加热反应30min，整个加热过程均在氮气氛围下进行，随后加入5.5 mL浓度为0.1 M的硫化钠溶液，继续在氮气氛围下加热回流4 h，获得硫化镉量子点溶液；
（6）合成石墨烯量子点：将2 g柠檬酸置于50 mL的烧杯中，在烘箱中， 200 ℃条件下加热反应40 min，待自然冷却到室温后，用浓度为2 M的氢氧化钠将其溶解，并调节溶液的pH直至7.0，获得石墨烯量子点溶液；
（7）标记金纳米粒子在特异性识别前列腺特异性抗原的适配体上，具体过程分为2步：第一步是合成金纳米粒子，将0.6 mL浓度为0.1 M的硼氢化钠加入到20 mL浓度为250 μM的氯金酸溶液中，获得的混合液在冰浴条件下搅拌反应15 min后，在室温下静置3 h，溶液由橙红色变为酒红色；第二步是标记金纳米粒子在特异性识别前列腺特异性抗原的适配体上，所用的适配体3′端和5′端均带有巯基，将10 μL浓度为10 mM的三(2-羧乙基)-膦酸盐与200 μL浓度为5.0 μM的特异性识别前列腺特异性抗原的适配体混合并在室温下孵化1 h，然后加入800 μL金纳米粒子，震荡反应16 h后，在转速为16 000 r/min条件下，离心30min，将获得的沉淀重新溶解在1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，其中磷酸盐缓冲溶液简写为PBS，获得标记有金纳米粒子的特异性识别前列腺特异性抗原的适配体；
（8）光电化学适体传感器的构建：在步骤（4）中获得的碳工作电极的工作区域滴加20 μL质量分数为2%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，在室温下孵化40 min后用pH 7.4的PBS洗涤，然后滴加20 μL由步骤（5）中获得的硫化镉量子点和浓度为10 mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及浓度为20 mM的N-羟基琥珀酰亚胺组成的混合液并在室温下反应50 min，用pH 7.4的PBS洗涤后，继续滴加20 μL浓度为5.0 μM的被三(2-羧乙基)-膦酸盐处理过的信号转导探针，所述的信号转导探针被三(2-羧乙基)-膦酸盐处理的过程为将10 μL浓度为10 mM的三(2-羧乙基)-膦酸盐与200 μL浓度为5.0 μM的信号转导探针混合并在室温下孵化1 h，所用的信号转导探针3′端带有氨基，5′端带有巯基，在4 ℃条件下孵化12 h后用pH 7.4的PBS洗涤除去多余的信号转导探针，随后滴加20 μL 1 mM的6-羟基-1-己硫醇并在室温下孵化1 h，用pH 7.4的PBS洗涤后，滴加20 μL含有浓度为10 mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和浓度为20 mM的N-羟基琥珀酰亚胺及步骤（6）中获得的石墨烯量子点的混合液，在室温下孵化2 h后用pH 7.4的PBS洗涤，继续滴加20 μL步骤（7）中获得的标记有金纳米粒子的特异性识别前列腺特异性抗原的适配体，反应90 min后形成三股螺旋分子开关，最后滴加10 μL不同浓度的前列腺特异性抗原，在37 ℃条件下孵化2 h后，用pH 7.4的PBS洗涤，完成光电化学适体传感器的构建；
（9）信号检测：利用电流-时间曲线法，通过由步骤（8）中获得的碳工作电极、碳对电极和Ag/AgCl参比电极组成的三电极系统进行光电流信号检测，检测电解液为含有0.01M过氧化氢的pH 7.4的PBS，检测电压为0.0 V，激发光源开关每隔10 s切换一次，激发波长范围为200-2500 nm，随着前列腺特异性抗原浓度的增加，光电流信号逐渐增强，基于光电流信号强度与前列腺特异性抗原浓度的关系实现对前列腺特异性抗原的灵敏检测。
序列表
<110> 济南大学
<120> 检测前列腺特异性抗原的光电化学适体传感器的制备方法
<130> 2019
<141> 2019-07-18
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttttttttt ttttttttga ggagagagag agatcctc 38
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctctctcgct cgccatcaaa tagcctctct c 31
Claims (1)
1.一种检测前列腺特异性抗原的光电化学适体传感器的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）通过计算机软件Adobe illustrator CS6设计纸芯片的疏水蜡打印图案，然后利用蜡打印机将疏水蜡打印图案打印在色谱纸上，在烘箱中150 ℃条件下加热30 s，使蜡完全融化，形成未打印蜡的亲水功能区；
（2）通过丝网印刷技术，将利用计算机软件Adobe illustrator CS6设计好的碳工作电极、碳对电极和Ag/AgCl参比电极的印刷图案印刷在步骤（1）中获得的未打印蜡的亲水功能区；
（3）利用原位还原法在步骤（2）中获得的碳工作电极的工作区域生长铂纳米粒子层：将30 μL新制备的含有浓度为100-300 mM的氯铂酸和浓度为20-40 mM的硼氢化钠的混合液滴加到工作区域，在4 ℃条件下反应10-30 min后，用二次水洗涤，并在室温下自然干燥；
（4）利用电沉积法在步骤（3）中获得的碳工作电极的工作区域沉积氧化锌纳米片：沉积电解液由浓度为0.03-0.06 M的硝酸锌和浓度为0.1-0.3 M的氯化钾组成，沉积温度为60-80 ℃，沉积电压为-1.0 - -1.5 V，沉积时间为50-110 min，沉积完成后，用二次水洗涤工作区域表面，并在室温下自然干燥；
（5）合成硫化镉量子点，将200-300 μL巯基乙酸加入到40-60 mL浓度为0.01-0.03 M的氯化镉溶液中，利用浓度为1.0 M的氢氧化钠将溶液的pH调节至9-11，在100-120 ℃条件下加热反应30-60 min，整个加热过程均在氮气氛围下进行，随后加入5-7 mL浓度为0.1-0.3M的硫化钠溶液，继续在氮气氛围下加热回流3-5 h，获得硫化镉量子点溶液；
（6）合成石墨烯量子点：将1-3 g柠檬酸置于50 mL的烧杯中，在烘箱中，100-200 ℃条件下加热反应20-60 min，待自然冷却到室温后，用浓度为2 M的氢氧化钠将其溶解，并调节溶液的pH直至7.0，获得石墨烯量子点溶液；
（7）标记金纳米粒子在特异性识别前列腺特异性抗原的适配体上，具体过程分为2步：第一步是合成金纳米粒子，将0.5-0.8 mL浓度为0.1-0.3 M的硼氢化钠加入到20-40 mL浓度为200-300 μM的氯金酸溶液中，获得的混合液在冰浴条件下搅拌反应10-20 min后，在室温下静置3 h，溶液由橙红色变为酒红色；第二步是标记金纳米粒子在特异性识别前列腺特异性抗原的适配体上，所用的适配体3′端和5′端均带有巯基，将10 μL浓度为10 mM的三(2-羧乙基)-膦酸盐与200 μL浓度为5.0 μM的特异性识别前列腺特异性抗原的适配体混合并在室温下孵化1 h，然后加入800 μL金纳米粒子，震荡反应16 h后，在转速为16 000 r/min条件下，离心30 min，将获得的沉淀重新溶解在1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，其中磷酸盐缓冲溶液简写为PBS，获得3′端和5′端均标记有金纳米粒子的特异性识别前列腺特异性抗原的适配体；
（8）光电化学适体传感器的构建：在步骤（4）中获得的碳工作电极的工作区域滴加20 μL质量分数为2%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，在室温下孵化40 min后用pH 7.4的PBS洗涤，然后滴加20 μL由步骤（5）中获得的硫化镉量子点和浓度为10 mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及浓度为20 mM的N-羟基琥珀酰亚胺组成的混合液并在室温下反应50 min，用pH 7.4的PBS洗涤后，继续滴加20 μL浓度为5.0 μM的被三(2-羧乙基)-膦酸盐处理过的信号转导探针，所述的信号转导探针被三(2-羧乙基)-膦酸盐处理的过程为将10 μL浓度为10 mM的三(2-羧乙基)-膦酸盐与200 μL浓度为5.0 μM的信号转导探针混合并在室温下孵化1 h，所用的信号转导探针3′端带有氨基用于连接石墨烯量子点，5′端带有巯基用于连接硫化镉量子点，在4 ℃条件下孵化12 h后用pH 7.4的PBS洗涤除去多余的信号转导探针，随后滴加20 μL 1 mM的6-羟基-1-己硫醇并在室温下孵化1 h，用pH 7.4的PBS洗涤后，滴加20 μL含有浓度为10 mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和浓度为20 mM的N-羟基琥珀酰亚胺及步骤（6）中获得的石墨烯量子点的混合液，在室温下孵化2 h后用pH 7.4的PBS洗涤，继续滴加20 μL步骤（7）中获得的3′端和5′端均标记有金纳米粒子的特异性识别前列腺特异性抗原的适配体，反应90 min后形成三股螺旋分子开关，最后滴加10 μL不同浓度的前列腺特异性抗原，在37 ℃条件下孵化2 h后，用pH 7.4的PBS洗涤，完成光电化学适体传感器的构建；
（9）信号检测：利用电流-时间曲线法，通过由步骤（8）中获得的碳工作电极、碳对电极和Ag/AgCl参比电极组成的三电极系统进行光电流信号检测，检测电解液为含有0.01 M过氧化氢的pH 7.4的PBS，检测电压为0.0 V，激发光源开关每隔10 s切换一次，激发波长范围为200-2500 nm，随着前列腺特异性抗原浓度的增加，光电流信号逐渐增强，基于光电流信号强度与前列腺特异性抗原浓度的关系实现对前列腺特异性抗原的灵敏检测。
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