CN109055498A - 基于超树枝状滚环转录反应的miRNA和/或生物小分子检测探针、检测方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及核酸分子检测领域，具体涉及一种超树枝状滚环转录反应的miRNA和/或生物小分子检测探针、检测方法和试剂盒。所述探针包括环形探针、荧光探针和发卡探针；所述环形探针包括识别序列、配对序列和分子信标结合序列；所述荧光探针，5’端修饰荧光基团Cy5，3’端修饰淬灭基团Dabcyl，荧光探针环区核苷酸序列与环形探针分子信标结合序列相同；所述发卡探针依次包括5’端侧链(1)、环区(2)以及3’端侧链(3)。本发明检测成本低、操作简单、检测迅速、灵敏度高、特异性好，可以定量检测miRN‑21低至1×10^‑18M。

Description

基于超树枝状滚环转录反应的miRNA和/或生物小分子检测探 针、检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及核酸分子检测领域，具体涉及一种超树枝状滚环转录反应的miRNA和/或生物小分子检测探针、检测方法和试剂盒。

背景技术

作为体外转录过程的补充，滚环转录(RCT)，使用小环状单链DNA(ssDNA)作为RNA聚合酶的模板，产生大量的作为循环序列的放大拷贝的长重复产物链是简单的、快速的和低成本的。RCT是一种高效、通用的等温酶促扩增技术，在生物医学研究中得到了广泛应用，尤其是在基因组学和诊断学领域的超灵敏DNA和RNA检测中得到广泛应用。在经典的RCT中，启动子序列通过RNA聚合酶启动转录，并在环状模板DNA周围重新合成RNA。当遇到连接子序列的5’端(模板DNA的5’端和3’端)时，通过RNA聚合酶和链转移释放连接体序列。然后，释放的接头序列可退火至新模板并重复工作，而启动子序列将不可逆转地成为产品的一部分，因此在经典的的RCT过程中只使用一次。

RCT已广泛应用于microRNA的合成和RNA纳米技术领域。所获得的RCT产物能够构建自组装的核酸纳米材料，并且可以用作纳米簇周期性组装的模板，命名为RNA微球，RNA膜,RNA纳米载体RNA纳米粒子这些复合材料在生物医学领域有着巨大的应用前景。例如，RNA纳米花已经被报道用于药物的共给药和靶向治疗。气泡RNA为基础的药物可用于靶标特异性RNA治疗，在靶细胞中产生功能性siRNAs中具有很高的效率。作为一种平台技术，它提供了一种将siRNA系统地传送到肿瘤部位的新方法，可以很容易地扩展治疗性siRNA在癌症治疗中广泛的的应用。然而，RCT很少用于定量检测。在Li的研究中，检测到microRNA靶点作为连接子序列，并通过链位移释放。释放的靶标可以对新模板进行退火，重复工作，并能定量检测到微RNA。一旦环状DNA处于转录环境中，ssDNA模板就可以通过带有启动子的RCT有效地转录。因此，对RCT的改进将对扩增技术产生显著的改善。

发明内容

本发明的主要目的是，提供一种超树枝状滚环转录反应的miRNA和/或生物小分子检测探针、检测方法和试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明第一个方面，提供一种基于超树枝状滚环转录反应的miRNA和/或生物小分子检测探针，包括环形探针、荧光探针和发卡探针；所述环形探针包括识别序列、配对序列和分子信标结合序列；所述荧光探针，5’端修饰荧光基团Cy5，3’端修饰淬灭基团Dabcyl，荧光探针环区核苷酸序列与环形探针分子信标结合序列相同；所述发卡探针依次包括5’端侧链(1)、环区(2)以及3’端侧链(3)；发卡探针环区(2)核苷酸序列与环形探针配对序列相同；发卡探针5’端侧链(1)与3’端侧链(3)部分序列互补；

所述环形探针识别序列可特异性识别待分析物碱基序列；配对序列的互补序列可与发卡探针的环区结合，使发卡探针的茎区核苷酸双链打开。

优选的，miRNA检测探针核苷酸序列具体如下：

荧光探针核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；发卡探针核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

生物小分子检测探针核苷酸序列具体如下：

荧光探针核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；发卡探针核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述环形探针的制备方法，包括以下步骤：

将DNA链1，DNA链2按摩尔比1:1-1:5混合，在缓冲溶液中80-95℃加热1-2min，然后缓慢冷却至室温；加入T4 DNA连接酶，20-25℃下孵育12-15h；60-65℃加热10-15min使酶变性；加入Exo I、Exo III消化3-5小时，并且通过在80-90℃加热20-25min使酶变性；离心、过滤、纯化即得。

本发明第二个方面，提供一种基于超树枝状滚环转录反应的miRNA和/或生物小分子检测方法，包括以下步骤：

配置超树枝状滚环转录体系，及

在25-40℃下恒温反应3-10h，及

进行荧光检测；

其中，所述超树枝状滚环转录体系包含RNA聚合酶、待测miRNA和/或生物小分子样品，环形探针、荧光探针和发卡探针；所述环形探针包括识别序列、配对序列和分子信标结合序列；所述荧光探针，5’端修饰荧光基团Cy5，3’端修饰淬灭基团Dabcyl，荧光探针环区核苷酸序列与环形探针分子信标结合序列相同；所述发卡探针依次包括5’端侧链(1)、环区(2)以及3’端侧链(3)；发卡探针环区(2)核苷酸序列与环形探针配对序列相同；发卡探针5’端侧链(1)与3’端侧链(3)部分序列互补。

优选的，所述RNA聚合酶为T7RNA聚合酶。

优选的，待测miRNA样品为合成的miRNA样品或含有miRNA的细胞样品；待测生物小分子样品为合成的生物小分子样品或含有生物小分子的待测细胞裂解液。

优选的，所述超树枝状滚环转录体系中，所述环形探针、荧光探针和发卡探针的摩尔比为：1-5:1-10:1-10。

优选的，所述生物小分子为还原型巯基化合物，进一步优选的为谷胱甘肽；所述生物小分子超树枝状滚环转录体系还包括含有二硫键的生物素化DNA与链霉亲和素修饰的磁珠结合。

本发明第三个方面，提供所述的基于超树枝状滚环转录反应的miRNA和/或生物小分子检测探针在制备检测miRNA和/或生物小分子基因芯片或试剂盒中的应用。

本发明第四个方面，提供一种用于miRNA和/或生物小分子检测的试剂盒，包括环形探针、荧光探针，发卡探针和RNA聚合酶；

所述环形探针包括识别序列、配对序列和分子信标结合序列；所述荧光探针，5’端修饰荧光基团Cy5，3’端修饰淬灭基团Dabcyl，荧光探针环区核苷酸序列与环形探针分子信标结合序列相同；所述发卡探针依次包括5’端侧链(1)、环区(2)以及3’端侧链(3)；发卡探针环区(2)核苷酸序列与环形探针配对序列相同；发卡探针5’端侧链(1)与3’端侧链(3)部分序列互补。

优选的，miRNA检测探针核苷酸序列具体如下：

荧光探针核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；发卡探针核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

优选的，生物小分子检测探针核苷酸序列具体如下：

荧光探针核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；发卡探针核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明取得的显著效果：

(1)本发明可以定量检测miRN-21低至1×10^-18M；更重要的是，它可以很容易地扩展到其他核酸靶标(包括DNA、microRNA和mRNA)和适体相关的小分子、蛋白质和细胞。对于没有适体的还原型巯基化合物，巯基交换反应也具有很好的性能。

(2)本发明基于超树枝状滚环转录反应设计的环形探针、荧光探针和发卡探针用于miRNA和/或生物小分子检测，检测成本低、操作简单、检测迅速、灵敏度高、特异性好。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1发卡探针示意图：1为5’端侧链，2为环区；3为3’端侧链。

图2HRCT扩增检测miRNA-21的原理图。

图3表征cDNA和HRCT产物合成的凝胶电泳实验。泳道1，DNA1；泳道2，DNA2；泳道3，DNA1/DNA2杂合体；泳道4，cDNA；泳道5，HRCT产物。

图4miRNA-21触发的HCRT实时荧光曲线。(a-g)分别为0，1.0×10^-18M，1.0×10^-17M，1.0×10^-16M，1.0×10^-15M，1.0×10^-14M和1.0×10^-13M。插图：POI值与miRNA-21量的对数之间的关系。

图5由miRNA-203、miRNA-16、miRNA-155和miRNA-21触发的HRCT实时荧光曲线。

图6不同细胞株miRNA-21的特异性检测。具有代表性的MCF-7细胞、Hela细胞和PC-3细胞的荧光成像。

图7流式细胞仪检测图。

图8HRCT扩增检测还原型巯基化合物原理图。

图9 GSH触发的HRCT实时荧光曲线(a-f：0，1×10^-10，1×10^-9，1×10^-8，1×10^-7，1×10^-6M)。插入图：POI值与GSH浓度的对数之间的关系。

图10GSH、葡萄糖、His、Cys触发的HRCT实时荧光曲线。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

核酸外切酶I是从Thermo购买的。核酸外切酶Ⅲ、T4 DNA连接酶、T7 RNA聚合酶、rNTPs和RNase酶抑制剂均购自新英格兰生物。实验用水取自超纯水(18.25MΩ)。SYBR绿色II染料是从Invitrogen购买的。所有的寡核苷酸都是由生工生物工程股份有限公司(中国上海)合成。链霉亲和素功能化磁性纳米粒子(MNP，100nm直径)购自天恩泽(中国北京)。对于细胞实验，所有的试剂，缓冲液和培养基维持在无菌条件下。

本发明所用引物序列，具体如下表所示。

表1各引物序列

实施例1环形探针的制备

将1μLDNA链1(miRNA-21 DNA链1为DNA1，核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示，谷胱甘肽DNA链1为DNA6，核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示。)(10^-4M)，1μLDNA链2(miRNA-21DNA链2为DNA2，核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，谷胱甘肽DNA链2为DNA8，核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示。)(10^-4M)和89μL缓冲溶液在95℃加热2min，然后缓慢冷却至室温。加入2μLT4 DNA连接酶(10U/L)后，反应混合物在25℃下孵育12h。连接反应过程在由50mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mM MgCl₂，1mM ATP，10mM DTT组成的缓冲溶液中进行。通过在65℃加热15min使酶变性。随后，加入2μLExo I(20U/μL)和2μLExo III(100U/μL)，将残余的DNA链1和DNA链2消化3小时，并且通过在80℃加热20min使酶变性。然后使用离心过滤装置将连接的环状DNA产物纯化并从连接反应溶液中分离。将合成的环状DNA1(cDNA1)保存在4℃直至使用。

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析DNA链1，DNA链2，DNA1/DNA2杂交体，cDNA和HRCT产物。聚丙烯酰胺凝胶的浓度为10％，缓冲液为1×TAE溶液(40mM Tris-乙酸盐，1mM EDTA，pH8.0)。凝胶电泳仪的电压设定为100V。电泳完成后，用溴化乙锭浸泡20min，在紫外成像仪上观察到明亮的条带。

实验结果如图3所示：泳道1是DNA1，泳道2是DNA2，泳道3是DNA1/DNA2杂合体，泳道4是cDNA，泳道5是通过使用合成方法在此获得的HRCT产物。注意，本发明使用环状连接酶连接线性DNA 1的3'和5'端(线1)作为用于跟随合成cDNA(线4)的对照系统，即通过将线性DNA1封端然后连接。从图中可以看出，泳道5由于产品的高分子量而表现出明显的低游泳度，这进一步说明了该系统合成方法的正确性。

实施例2 miRNA-21的HRCT检测

将90μL miRNA-21(不同浓度)和环形探针在95℃加热2min，然后缓慢冷却至室温。此后，加入6μL rNTP混合物(2.5mM每种rNTP)，4μLT7RNA聚合酶(5U/μL)，4μL荧光探针(10^{- 4}M)和4μL发卡探针(10^-4M)用于HRCT过程；HRCT反应温度为25℃，反应90min。HRCT过程在由40mM Tris-HCl(pH7.9)，6mM MgCl₂，2mM亚精胺，1mM DTT组成的缓冲溶液中进行。

miRNA-21的HRCT检测原理如图2所示。

(1)HRCT检测miRNA-21的灵敏度实验

拐点(POI)，它被定义为对应于最大值的时间荧光曲线中的斜率用于定量检测miRNA靶标。使用不同浓度的miRNA-21标准溶液体外检测miRNA-21浓度。如实验的荧光强度所示，从图4可以看出，POI值在1×10^-18M至1×10^-13M范围内线性依赖于靶标miRNA量的对数(lg)线性方程为POI＝2.68lgC+49.67(R＝0.998，N＝6)，其中Y代表POI，X代表miRNA-21(M)浓度的对数。因此，本方法具有5个数量级的动态范围。

(2)HRCT检测miRNA-21的特异性实验

为了评估性能，研究对miRNA-21检测选择性。本部分分别选miRNA-203，miRNA-16，miRNA-155和miRNA-21(各1.0×10^-14M)作为模型系统。结果如图5所示，在时间轴上的miRNA-21信号的POI处，未观察到miRNA-203，miRNA-16,miRNA-155的荧光信号。这一结果表明本发明方法对于miRNA-21的测定显示出良好的选择性和特异性。

(3)HRCT在细胞荧光成像中检测miRNA-21的应用

HRCT方法用于定量三种不同细胞系(MCF-7，PC-3和Hela)中miRNA-21的表达水平按照制造商的方案使用miRVanamiRNA Isolation kit(Thermo Scientific)从细胞中提取总RNA。用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific，Wilmington，Delaware，USA)在260nm测定RNA浓度，并在-80℃储存前用RNase-free水稀释所有储液至0.5μg/μL。在HRCT实验之前，我们将指定的RNA样品稀释至1.0ng/μL。然后将该样品混合物在70℃水浴中变性5min以确保完全破坏RNA二级结构并置于冰上。在miRNA检测中观察到MCF-7和PC-3细胞中miRNA-21表达的差异。根据图4中的公式，miRNA-21在MCF-7，Hela，PC-3中的浓度为3.02×10^-18M，5.38×10^-19M和5.14×10^-21M。如图6所示，在共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)中分别观察到分布于细胞质中的细胞质荧光信号，表明在细胞中检测到miRNA-21。这些癌细胞系的不同强度反映了miRNA-21表达水平的不同程度。MCF-7细胞内的荧光强度高于Hela细胞内的荧光强度，PC-3细胞的荧光强度最低。因此，miRNA-21在MCF-7细胞中的含量高于Hela细胞。最低的是PC-3细胞。

如图7所示，峰值位置值越大，荧光强度越强。在MCF-7细胞的检测中，峰位移动最明显，荧光强度显着增加；在Hela细胞的检测中，峰位的移动明显，荧光强度增加。但在PC-3细胞检测实验中，峰位移动不明显，表明MCF-7中miRNA21含量最高，Hela次之，PC-3最少。

为进一步验证该方法在实际样品分析中的准确性，在指定的RNA样品中加入10fm合成的miRNA-21，制备了一个加药样品。回收率从91％上升到107％。结果表明，该方法对实际样品分析具有较高的准确性和可靠性。

实施例3 GSH的HRCT检测

GSH检测的原理，如图8所示：含有二硫键的生物素化DNA与链霉亲和素修饰的磁珠结合.二硫键可以被还原型巯基化合物(如GSH)断键。巯基交换反应与磁性分离，连接DNA与模板DNA杂交，然后进行连锁反应和HRCT。

具体步骤如下：

将100μL链霉亲和素功能化磁性纳米颗粒用PBS冲洗两次，37℃下用50μL生物素化DNA5(10^-4M)孵育12h。然后，用磁选法去除上清液中游离DNA，形成MNP/DNA5。加入100μL谷胱甘肽溶液(不同浓度)，37℃与MNP/DNA5孵育2h。磁性分离后，加入形成良好的cDNA6，6μLrNTP混合物(2.5mM每种rNTP)，4μLT7 RNA聚合酶(5U/μL)，4μLDNA3(10^-4M)和4μLDNA3加入4μL DNA7(10^-4M)进行HRCT反应：HRCT反应温度为25℃，反应90min。整个HRCT过程在由40mMTris-HCl(pH7.9)，6mM MgCl₂，2mM亚精胺，1mM DTT组成的缓冲溶液中进行。

GSH浓度对荧光与时间的影响如图9所示。POI值与GSH在10^-6到10^-10M范围内的对数(LG)呈线性关系，线性方程为POI＝4.4logC+53.4。

细胞裂解液中GSH的HRCT：

将100μLHepG2细胞(不同浓度)用冰PBS溶液(pH 7.4)洗涤2次，并在冰浴超声细胞粉碎装置中以100μL悬浮30min，然后离心。收集上清液用于检测。将细胞提取物在37℃下与MNP/DNA5温育2h。磁性分离后，将上清液与形成良好的cDNA6,6μLrNTP混合物(各含2.5mMrNTP)，4μLT7 RNA聚合酶(5U/μL)，4μLDNA3(10^-4M)和4μL DNA7(10^-4M)混合进行HRCT过程。HRCT过程在由40mM Tris-HCl(pH7.9)，6mM MgCl₂，2mM亚精胺，1mM DTT组成的缓冲溶液中进行。

(1)HRCT检测GSH的特异性

GSH检测的特异性，选择葡萄糖、His、Cys、进行检测。实验结果如图10所示，GSH或Cys产生的荧光信号可以被分离。从葡萄糖、His产生的产物中完全可以看出，还原型巯基化合物可以促进二硫键的断裂，从而触发HRCT。

(2)HRCT在生物流体中GSH检测中的应用

应用HRCT检测人尿标本和细胞提取液中GSH的含量。从三名健康志愿者中收集尿液，离心分离。采用适当稀释的尿液(66倍)进行检测。一些尿样品和细胞提取物样品与MnP/DNa5混合，其他样品用0.1mM N-乙基马来酰亚胺(NEM)作为硫代阻断化合物预处理，然后与MnP/DNA5反应。所有的生物流体样品在HRCT中明显地增加了茎环结构荧光分子信标的荧光强度。用巯基封闭试剂NEM对样品进行预处理，荧光强度明显下降，证实了荧光变化是由样品中还原型巯基化合物减少引起的。在稀释的尿液和细胞提取物样品中还原型巯基化合物的回收范围为95％至108％(表2)，表明在尿和细胞提取物的样品中没有发现与还原型巯基化合物的测定的显著干扰。以上结果表明，HCRT在生物流体中检测巯基的潜力很大。

表2.稀释尿液和细胞提取液中添加GSH(3μM)的回收率(％)(n＝3)

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 临沂大学

<120> 基于超树枝状滚环转录反应的miRNA和/或生物小分子检测探针、检测方法和

试剂盒

<130>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgctctggtg tggttgggct gagcg 25

<210> 2

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcaacatcag tctcaggaat tagtaaacaa tgaagatagc ttatcagact gatgttga 58

<210> 3

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaacccgtat atcaggaatt agtaaacaat gaagattagg atagatatac gggttc 56

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctgataagct acaggaatta gtaaacaatg aagaggtgtg gttgggctca acatcagt 58

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tagcttatca gactgatgtt ga 22

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tttttttttg aacccgtass ttaggataga tatacgggtt c 41

<210> 7

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atctatccta acaggaatta gtaaacaatg aagaggtgtg gttgggcgaa cccgtat 57

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttaggataga tatacgggtt c 21

<210> 9

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 10

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 10

gugaaauguu uaggaccacu ag 22

<210> 11

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 11

uagcagcacg uaaauauugg cg 22

<210> 12

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 12

uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23

Claims (10)

1.一种基于超树枝状滚环转录反应的miRNA和/或生物小分子检测探针，其特征在于，包括环形探针、荧光探针和发卡探针；所述环形探针包括识别序列、配对序列和分子信标结合序列；所述荧光探针，5’端修饰荧光基团Cy5，3’端修饰淬灭基团Dabcyl，荧光探针环区核苷酸序列与环形探针分子信标结合序列相同；所述发卡探针依次包括5’端侧链(1)、环区(2)以及3’端侧链(3)；发卡探针环区(2)核苷酸序列与环形探针配对序列相同；发卡探针5’端侧链(1)与3’端侧链(3)部分序列互补；

所述环形探针识别序列可特异性识别待分析物碱基序列；配对序列的互补序列可与发卡探针的环区结合，使发卡探针的茎区核苷酸双链打开。

2.根据权利要求1所述的基于超树枝状滚环转录反应的miRNA和/或生物小分子检测探针，其特征在于，miRNA检测探针核苷酸序列具体如下：

荧光探针核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；发卡探针核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

生物小分子检测探针核苷酸序列具体如下：

荧光探针核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；发卡探针核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1所述的基于超树枝状滚环转录反应的miRNA和/或生物小分子检测探针，其特征在于，所述环形探针的制备方法，包括以下步骤：

将DNA链1，DNA链2按摩尔比1:1-1:5混合，在缓冲溶液中80-95℃加热1-2min，然后缓慢冷却至室温；加入T4DNA连接酶，20-25℃下孵育12-15h；60-65℃加热10-15min使酶变性；加入Exo I、Exo III消化3-5小时，并且通过在80-90℃加热20-25min使酶变性；离心、过滤、纯化即得。

4.一种基于超树枝状滚环转录反应的miRNA和/或生物小分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

配置超树枝状滚环转录体系，及

在25-40℃下恒温反应75-90min，及

进行荧光检测；

其中，所述超树枝状滚环转录体系包含RNA聚合酶、待测miRNA和/或生物小分子样品，环形探针、荧光探针和发卡探针；所述环形探针包括识别序列、配对序列和分子信标结合序列；所述荧光探针，5’端修饰荧光基团Cy5，3’端修饰淬灭基团Dabcyl，荧光探针环区核苷酸序列与环形探针分子信标结合序列相同；所述发卡探针依次包括5’端侧链(1)、环区(2)以及3’端侧链(3)；发卡探针环区(2)核苷酸序列与环形探针配对序列相同；发卡探针5’端侧链(1)与3’端侧链(3)部分序列互补。

5.根据权利要求3所述基于超树枝状滚环转录反应的miRNA和/或生物小分子检测方法，其特征在于，所述RNA聚合酶为T7RNA聚合酶。

6.根据权利要求3所述基于超树枝状滚环转录反应的miRNA和/或生物小分子检测方法，其特征在于，待测miRNA样品为合成的miRNA样品或含有miRNA的细胞样品；待测生物小分子样品为合成的生物小分子样品或含有生物小分子的待测细胞裂解液。

7.根据权利要求3所述基于超树枝状滚环转录反应的miRNA和/或生物小分子检测方法，其特征在于，所述超树枝状滚环转录体系中，所述环形探针、荧光探针和发卡探针的摩尔比为：1-5:1-10:1-10。

8.根据权利要求3所述基于超树枝状滚环转录反应的miRNA和/或生物小分子检测方法，其特征在于，所述生物小分子为还原型巯基化合物，优选的为谷胱甘肽；所述生物小分子超树枝状滚环转录体系还包括含有二硫键的生物素化DNA与链霉亲和素修饰的磁珠结合。

9.根据权利要求1所述的基于超树枝状滚环转录反应的miRNA和/或生物小分子检测探针在制备检测miRNA和/或生物小分子基因芯片或试剂盒中的应用。

10.一种用于miRNA和/或生物小分子检测的试剂盒，其特征在于，包括环形探针、荧光探针，发卡探针和RNA聚合酶；

所述环形探针包括识别序列、配对序列和分子信标结合序列；所述荧光探针，5’端修饰荧光基团Cy5，3’端修饰淬灭基团Dabcyl，荧光探针环区核苷酸序列与环形探针分子信标结合序列相同；所述发卡探针依次包括5’端侧链(1)、环区(2)以及3’端侧链(3)；发卡探针环区(2)核苷酸序列与环形探针配对序列相同；发卡探针5’端侧链(1)与3’端侧链(3)部分序列互补。

优选的，miRNA检测探针核苷酸序列具体如下：

荧光探针核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；发卡探针核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

优选的，生物小分子检测探针核苷酸序列具体如下：

荧光探针核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；发卡探针核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述环形探针的制备方法，包括以下步骤：

将DNA链1，DNA链2按摩尔比1:1-1:5混合，在缓冲溶液中80-95℃加热1-2min，然后缓慢冷却至室温；加入T4DNA连接酶，20-25℃下孵育12-15h；60-65℃加热10-15min使酶变性；加入Exo I、Exo III消化3-5小时，并且通过在80-90℃加热20-25min使酶变性；离心、过滤、纯化即得。