CN106754894A - 一种多功能磁性dna纳米球及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多功能磁性DNA纳米球，所述多功能磁性DNA纳米球包括：结合有磁珠的DNA纳米球和/或含双硫键的结合磁珠的DNA纳米球。本发明通过一条磷酸化的线性DNA模板单链和一条DNA引物单链即可完成纳米球的组装；在组装纳米球的过程中，通过对另一条DNA引物单链进行不同的修饰以及对磷酸化的线性DNA模板单链进行结构设计，可以在纳米球结构中组装多种功能基团。本发明的多功能磁性DNA纳米球可以作为靶向运输的药物载体，而且易于实现生物分离；将制备多功能磁性DNA纳米球的DNA引物单链用双硫键进行修饰，还可实现对细胞内巯基化合物的检测。

Description

一种多功能磁性DNA纳米球及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及细胞内巯基化合物的检测及靶向给药技术领域，特别是涉及一种多功能磁性DNA纳米球及其制备方法与应用。
背景技术
脱氧核糖核苷酸(DNA)的互补性表现在胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)这四种核苷酸的互补性上。就本质上而言，DNA的互补性是DNA复制和转录的基础，造就了DNA双链的双螺旋结构。与传统观念认为DNA具有遗传性相比较，已经发展了越来越多的利用其生物相容性与纳米技术相结合的成功案例，比如DNA纳米笼，是一种可有效封装酶的结构，六分之五的被检测的代谢酶表现出比一般代谢酶高4到10倍的转换率。DNA纳米花也是一种该方面的发现，被用于选择性识别癌细胞并进行相应药物的输送等。这些都表现出了DNA极大的可塑性。然而，这些方法也存在一些固有的缺点，尤其在生物分离上。因此，易于生物分离与纯化的纳米技术或新型材料的创新是非常重要的。而磁性纳米材料作为候选材料在磁性领域引起了极大反响。
作为最具有代表性的磁珠被广泛应用到生物学和诊断学当中，磁珠拥有磁性纳米颗粒和进口材料所有的特性，在磁性材料领域内被广泛拓展使用。它具有易操作的特点，被研究者们用在搭载，吸附和富集等各个步骤上，比如最简单有效地磁性分离和回收利用等操作。此外，医学上的核磁共振成像则是利用了其高空间分辨率和组织穿透力。与传统方法相比，所有此方面的研究都提高了实验的灵敏度和选择性。
在医疗诊断领域，仅靠单一目标来判断结果容易导致“假阳性”，因为疾病大都跟多种生物分子有关，传统的单一方式的检测方法不能满足疾病诊断的需要，疾病早期诊断的精确度可以通过对多个目标的检测来提高，目前生物医疗领域已经设计出多种目标检测的方案，多目标材料和技术与生物成像及传感等方面的结合仍具有巨大的应用潜能。与传统的单一功能纳米粒子相比较，多功能的磁珠可以优化在生物传感、目标靶向、药物输送和治疗等方面的个性化诊疗。
DNA滚环复制扩增技术可实现对靶向核酸和蛋白质的灵敏检测，而且滚环复制产物可定量目标物，滚环复制产物不光靠自组装形成纳米结构，还可形成可溶性的线状长链。通过设计合理的DNA合成方案，可以形成纳米结构，DNA纳米球就是这样一种纳米结构。但目前对于DNA纳米球的研究较少，特别是能够特异性识别靶细胞，作为靶向药物输送的载体，同时还能检测细胞内的谷胱甘肽的多功能DNA纳米球目前尚未见报道。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多功能磁性DNA纳米球及其制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述多功能磁性DNA纳米球在制备检测细胞内巯基化合物的试剂中的应用和/或制备靶向给药系统中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种多功能磁性DNA纳米球，所述多功能磁性DNA纳米球包括：结合有磁珠的DNA纳米球(MNP/DNA-SP)和/或含双硫键的结合磁珠的DNA纳米球(MNP/DS-SP)；
所述结合有磁珠的DNA纳米球由如下方法制备而成：
(1)构建反应体系，进行DNA链的环化和连接，得到结合了磁珠的环状DNA；所述反应体系包括：磷酸化的线性DNA模板单链、DNA引物单链I、T4DNA连接酶、D-PBS溶液和磁珠(MNPs)溶液；
(2)将结合了磁珠的环状DNA与phi29DNA聚合酶和dNTP溶液混合，进行滚环扩增反应，即得结合有磁珠的DNA纳米球。
优选的，步骤(1)中，所述磷酸化的线性DNA模板单链的序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
Phosphate-TTC CCG GCG GCG CAG CAG TTA GAT GCT GCT GCA GCG ATA CGC GTATCG CTA TGG CAT ATC GTA CGA TAT GCC GCAGCAGCA TCT AAC CGT ACA GTA TT；(SEQ IDNO.1)其中，斜体标注的区域为sgc8序列，即CEM细胞的核酸适配体序列。
优选的，步骤(1)中，所述DNA引物单链I与磷酸化的线性DNA模板单链部分互补。作为优选的方案，所述DNA引物单链I为多聚(T)DNA引物单链或修饰生物素分子的DNA引物单链。其中：
多聚(T)DNA引物单链的序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：
AAA AAA AAA AAA AAA TCT AAC TGC TGC GCC GCC GGG AAA ATA CTG TAC GGTTAG ATG CTG CTG C；(SEQ ID NO.2)。
修饰生物素分子的DNA引物单链的序列如SEQ ID NO.3所示，具体如下：
Bio-TCT AAC TGC TGC GCC GCC GGG AAA ATA CTG TAC GGT TAG ATG CTG CTGC；(SEQ ID NO.3)
优选的，步骤(1)中，所述反应体系中，磷酸化的线性DNA模板单链和DNA引物单链的浓度为80-120μM，优选为100μM；T4DNA连接酶的浓度为1800-2200U/μL，优选为2000U/μL；所述D-PBS溶液的pH值为7.4。
所述磷酸化的线性DNA模板单链、DNA引物单链、T4DNA连接酶、D-PBS溶液和磁珠溶液加入的体积比为0.6：1.2：0.5：(97-98)：10。
优选的，步骤(1)中，DNA链的环化和连接的操作为：将磷酸化的线性DNA模板单链与D-PBS溶液混合均匀后，在PCR仪中，于95℃反应2min，之后以0.4℃/min降温至55℃；再加入DNA引物单链，混合均匀后，在PCR仪中以0.4℃/min降温至25℃；再加入T4DNA连接酶和磁珠溶液，混合后，于25℃反应4h。
优选的，步骤(1)中，所述磁珠溶液为链霉亲和素磁珠溶液。
优选的，步骤(2)中，所述phi29DNA聚合酶的浓度为10U/μL，dNTPs溶液的浓度为10mM。
优选的，步骤(2)中，滚环扩增反应的温度为25-35℃，反应时间为8-12h；反应的终止温度为60-70℃，终止反应的时间为8-12min。进一步优选的，滚环扩增反应的温度为30℃，反应时间为10h；反应的终止温度为65℃，终止反应的时间为8-10min。
所述含双硫键的结合磁珠的DNA纳米球由如下方法制备而成：
(1)构建反应体系，进行DNA链的环化和滚环扩增反应，得到滚环扩增产物；所述反应体系包括：磷酸化的线性DNA模板单链、DNA引物单链I、T4DNA连接酶、D-PBS溶液、phi29DNA聚合酶和dNTPs；
(2)将链霉亲和素磁珠与DNA引物单链II混合反应，然后与滚环扩增产物反应形成含双硫键的结合磁珠的DNA纳米球。
步骤(1)中，所述磷酸化的线性DNA模板单链的序列如SEQ ID NO.1所示。
步骤(1)中，所述DNA引物单链I与磷酸化的线性DNA模板单链部分互补。作为优选的方案，所述DNA引物单链I为多聚(T)DNA引物单链或修饰生物素分子的DNA引物单链。其中：
多聚(T)DNA引物单链的序列如SEQ ID NO.2所示；修饰生物素分子的DNA引物单链的序列如SEQ ID NO.3所示。
步骤(2)中，所述DNA引物单链II为修饰双硫键及生物素分子的DNA引物单链，其序列如SEQ ID NO.4所示，具体如下：
TTT TTT TTT TTT TTT-/HS-SH/-TTT-Bio；(SEQ ID NO.4)
步骤(2)中，链霉亲和素磁珠与DNA引物单链II混合反应的温度为25℃，反应时间为1h。
本发明的第二方面，提供上述多功能磁性DNA纳米球在制备检测细胞内巯基化合物的试剂中的应用和/或制备靶向给药系统中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过一条磷酸化的线性DNA模板单链和一条DNA引物单链(SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示)即可完成纳米球的组装；在组装纳米球的过程中，通过对另一条DNA引物单链(SEQ ID NO.4所示)进行不同的修饰以及对磷酸化的线性DNA模板单链进行结构设计，可以在纳米球结构中组装多种功能基团，如：在DNA引物单链上修饰生物素，使其可以与修饰有亲和素的磁珠相结合，赋予DNA纳米球以磁性，方便进行分离；通过在DNA引物单链上修饰双硫键，可以对细胞内的巯基化合物进行检测；通过在磷酸化的线性DNA模板单链中设计sgc8序列，可以实现对CEM细胞的靶向识别并给药。
(2)本发明的磁性DNA纳米球具有多种功能，既能作为靶向给药的运输载体，还可以对胞内的巯基化合物进行检测，检测特异性强，选择性高，而且分离操作简单，靶向输送药物的毒性小。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1：DNA纳米球电泳图；图中，泳道1为DNA引物单链与线性DNA模板单链杂交；泳道2为线性DNA模板单链；泳道3为DNA纳米球。
图2：DNA纳米球(DNA-SP)的透射电镜图。
图3：紫外吸收图；图中，a为DNA，b为磁珠，c为MNP/DNA-SP。
图4：A为磁珠透射电镜图及能量色散X射线光谱图；B为磁性DNA纳米球(MNP/DNA-SP)的透射电镜图及能量色散X射线光谱图。
图5：磁珠与磁性DNA纳米球(MNP/DNA-SP)的zeta电位图。
图6：磁珠与磁性DNA纳米球(MNP/DNA-SP)的磁滞曲线，图中，a为磁珠，b为磁性DNA纳米球(MNP/DNA-SP)。
图7：激光共聚焦图；图中，(A)红色为与磁珠结合的纳米球搭载了DOX后所发荧光，绿色为不含磁珠的纳米球与syber green染料结合后所发荧光；(B)在磁性分离之后，只剩下绿色的未含磁珠的纳米球，由此说明磁性分离可很好的实现对所需样品的分离；由于将激光共聚焦图调整成黑白图后，红色和绿色荧光无法再通过颜色进行区分，本发明将其中几个与磁珠结合的纳米球搭载DOX后所发的红色荧光点用白色圆圈做了示意性的标注，用于区分。
图8：MNP/DS-SP与DOX进行结合，并进行磁性分离的示意图。
图9：NEM实验结果。
图10：荧光强度图及标准曲线。
图11：细胞毒性实验图。
图12：靶向药物输送流式细胞图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
术语说明：
DNA-SP：DNA纳米球。
MNP/DNA-SP：指结合了磁珠的DNA纳米球。
MNP/DS-SP：指含双硫键的结合磁珠的DNA纳米球。
MNP/sgc8-SP：指含适配体的结合磁珠的DNA纳米球。
DOX：指抗癌药物阿霉素。
MNPs：指链霉亲和素磁珠。
GSH：指谷胱甘肽。
正如背景技术中所介绍的，目前对于DNA纳米球的研究较少，特别是能够特异性识别靶细胞，作为靶向药物输送的载体，同时还能检测细胞内的谷胱甘肽的多功能DNA纳米球目前尚未见报道。基于此，本申请提出了一种多功能磁性DNA纳米球及其制备方法。
在本申请的一种实施方案中，提供了一种结合有磁珠的DNA纳米球(MNP/DNA-SP)，该结合有磁珠的DNA纳米球由如下方法制备而成：
(1)构建反应体系，进行DNA链的环化和连接，得到结合了磁珠的环状DNA；所述反应体系包括：磷酸化的线性DNA模板单链、DNA引物单链I、T4DNA连接酶、D-PBS溶液和磁珠(MNPs)溶液；
(2)将结合了磁珠的环状DNA与phi29DNA聚合酶和dNTP溶液混合，进行滚环复制反应，即得结合有磁珠的DNA纳米球(MNP/DNA-SP)。
所述磷酸化的线性DNA模板单链的序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
Phosphate-TTC CCG GCG GCG CAG CAG TTA GAT GCT GCT GCA GCG ATA CGC GTATCG CTA TGG CAT ATC GTA CGA TAT GCC GCAGCAGCA TCT AAC CGT ACA GTA TT；(SEQ IDNO.1)其中，斜体标注的区域为sgc8序列，即CEM细胞的核酸适配体序列。本申请的磷酸化的线性DNA模板单链具有sgc8核酸适配体互补序列，能够靶向识别CEM细胞，因而多功能磁性DNA纳米球作为药物运输系统还具有靶向识别作用；
所述DNA引物单链I与磷酸化的线性DNA模板单链部分互补。作为优选的方案，所述DNA引物单链I为多聚(T)DNA引物单链或修饰生物素分子的DNA引物单链。其中：
多聚(T)DNA引物单链的序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：
AAA AAA AAA AAA AAA TCT AAC TGC TGC GCC GCC GGG AAA ATA CTG TAC GGTTAG ATG CTG CTG C；(SEQ ID NO.2)。为避免在形成纳米球的过程中出现空间位阻，本申请在设计DNA引物单链时进行了特殊的考虑，在末端修饰有多个A碱基。
修饰生物素分子的DNA引物单链的序列如SEQ ID NO.3所示，具体如下：
Bio-TCT AAC TGC TGC GCC GCC GGG AAA ATA CTG TAC GGT TAG ATG CTG CTGC；(SEQ ID NO.3)。修饰有生物素分子的DNA引物单链能够修饰有链霉亲和素的磁珠相结合，通过使用磁力架进行磁性分离即可实现生物分离。
在本申请的另一种实施方案中，提供了一种含双硫键的结合磁珠的DNA纳米球(MNP/DS-SP)，该MNP/DS-SP由如下方法制备而成：
(1)构建反应体系，进行DNA链的环化和滚环扩增反应，得到滚环扩增产物；所述反应体系包括：磷酸化的线性DNA模板单链、DNA引物单链I、T4DNA连接酶、D-PBS溶液、phi29DNA聚合酶和dNTPs；
(2)将链霉亲和素磁珠与DNA引物单链II混合反应，然后与滚环扩增产物反应形成含双硫键的结合磁珠的DNA纳米球。
步骤(1)中，所述磷酸化的线性DNA模板单链的序列如SEQ ID NO.1所示。
步骤(1)中，所述DNA引物单链I与磷酸化的线性DNA模板单链部分互补。作为优选的方案，所述DNA引物单链I为多聚(T)DNA引物单链或修饰生物素分子的DNA引物单链。其中：
多聚(T)DNA引物单链的序列如SEQ ID NO.2所示；修饰生物素分子的DNA引物单链的序列如SEQ ID NO.3所示。
步骤(2)中，所述DNA引物单链II为修饰双硫键及生物素分子的DNA引物单链，其序列如SEQ ID NO.4所示，具体如下：
TTT TTT TTT TTT TTT-/HS-SH/-TTT-Bio；(SEQ ID NO.4)。
本申请上述方案构建的MNP/DNA-SP，包含了预设定的一条DNA线性长链，阿霉素(DOX)作为一种抗癌常用药，可嵌入该DNA线性长链的GC互补的碱基对之间，从而DNA纳米球可作为生物相容性的运输系统，通过细胞的胞吞作用，携带DOX进入癌细胞中，并在癌细胞中缓慢释放出DOX；另外，磷酸化的线性DNA模板单链具有sgc8核酸适配体互补序列，能够靶向识别CEM细胞，因而多功能磁性DNA纳米球作为药物运输系统还具有靶向识别作用；此外，该多功能磁性DNA纳米球作为药物运输系统，通过DNA引物单链上修饰的生物素和修饰有链霉亲和素的磁珠相结合，通过使用磁力架进行磁性分离即可实现生物分离。
进一步的，为同时实现作为药物靶向运输的载体和检测细胞内巯基化合物检测的功能，本申请的另一实施方案中构建的MNP/DS-SP，将DNA引物单链优化为修饰双硫键及生物素分子的DNA引物单链，进而制备得到多功能磁性DNA纳米球。
当环境中存在巯基化合物时，多功能磁性DNA纳米球中的双硫键即被打断，经磁性分离后，DOX将被释放出，从而进行荧光检测，根据测定的荧光强度，可以对环境中的巯基化合物进行定性和定量。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：DNA-SP的合成
将0.6μL磷酸化的线性模板链(浓度为100μM)溶于97.7μL D-PBS溶液(pH为7.4)，混合液置于PCR仪中，95摄氏度下反应2min，之后以每分钟降温0.4摄氏度的速度缓慢降温至55摄氏度，然后加入1.2μL多聚(T)DNA引物单链(浓度为100μM；序列如SEQ ID NO.2所示)，继续以每分钟降温0.4摄氏度的速度缓慢降温至25摄氏度，完成退火过程，之后加入0.5μL T4DNA连接酶，混合均匀后于25摄氏度下反应4h。
接下来进行滚环扩增过程，向上述反应溶液中加入40μL phi29DNA聚合酶(浓度为10U/μL)，40μL dNTPs(浓度为10mM)，及10μL D-PBS溶液(pH为7.4)，混合均匀后置于30摄氏度下反应10h，最后反应体系置于65摄氏度下加热10min停止反应，即得到DNA-SP。
将本实施例制备的DNA-SP分别进行电泳和透射电镜扫描，电泳结果如图1所示，图中，泳道1为DNA引物单链与线性DNA模板单链杂交；泳道2为线性DNA模板单链；泳道3为DNA纳米球。分子量越大，亮带越滞后，由此可见我们成功合成了DNA纳米球。
透射电镜扫描结果如图2所示，由图可以看出，DNA-SP的粒径大约为40nm。
实施例2：MNP/DNA-SP的合成
将0.6μL磷酸化的线性模板链(浓度为100μM，序列如SEQ ID NO.1所示)溶于97.7μL D-PBS溶液(pH为7.4)，混合液置于PCR仪中，95摄氏度下反应2min，之后以每分钟降温0.4摄氏度的速度缓慢降温至55摄氏度；然后加入1.2μL DNA引物单链(浓度为100μM；该引物单链是指修饰生物素分子的DNA引物单链，序列如SEQ ID NO.3所示)，继续以每分钟降温0.4摄氏度的速度缓慢降温至25摄氏度，完成退火过程；之后加入0.5μL T4DNA连接酶(2000U/μL)和10μL链霉亲和素磁珠(10mg/ml)，混合均匀后于25摄氏度下反应4h。
接下来进行滚环扩增过程，向上述反应溶液中加入40μL phi29DNA聚合酶(浓度为10U/μL)，40μL dNTPs(浓度为10mM)，及10μL D-PBS溶液，混合均匀后置于30摄氏度下反应10h，最后反应体系置于65摄氏度下加热10min停止反应。最终所得产物用去离子水洗涤置于4摄氏度下储存备用，即得到MNP/DNA-SP。
本实施例制备的MNP/DNA-SP的紫外吸收图如图3所示，由图可以看出，与磁珠(b)相比较，DNA(a)在260nm处表现出明显的吸收峰，而MNP/S-SP(c)在260nm处也有明显的吸收峰，说明了磁珠与纳米球的良好结合力。
本实施例制备的MNP/DNA-SP的透射电镜图及能量色散X射线光谱图如图4所示，图中(B)显示磁珠与纳米球结合之后的粒径大约为150nm，能量色散X射线光谱图可对所含元素进行分析，如图显示，磁珠与DNA纳米球结合之后，分析元素中明显多了P元素，由此进一步说明了DNA纳米球成功结合到了磁珠表面。
本实施例制备的MNP/DNA-SP的zeta电位图如图5所示，显示与DNA纳米球结合之后，磁珠表面的电位由-13mV降到-24mV，表明了两者良好的结合性。
本实施例制备的MNP/DNA-SP的磁滞曲线如图6所示，由图可以看出，磁珠(a)的磁化强度大约为11.2emu/g，MNP/S-SP(b)的磁化强度约为9.3emu/g，数值降低的原因可能为磁珠表面包裹了一层DNA纳米球。
实施例3：MNP/DS-SP的制备
将0.6μL磷酸化的线性模板链(浓度为100μM)溶于97.7μL D-PBS溶液(pH为7.4)，混合液置于PCR仪中，95摄氏度下反应2min，之后以每分钟降温0.4摄氏度的速度缓慢降温至55摄氏度，然后加入1.2μL多聚(T)DNA引物单链(浓度为100μM；序列如SEQ ID NO.2所示)，继续以每分钟降温0.4摄氏度的速度缓慢降温至25摄氏度，完成退火过程，之后加入0.5μL T4DNA连接酶，混合均匀后于25摄氏度下反应4h。
接下来进行滚环扩增过程，向上述反应溶液中加入40μL phi29DNA聚合酶(浓度为10U/μL)，40μL dNTPs(浓度为10mM)，及10μL D-PBS溶液(pH为7.4)，混合均匀后置于30摄氏度下反应10h，最后反应体系置于65摄氏度下加热10min停止反应。
10μL的链霉亲和素磁珠与修饰双硫键及生物素分子的DNA引物单链(浓度为100μM；该引物单链是指修饰双硫键及生物素分子的DNA引物单链，序列如SEQ ID NO.4所示)混合后在25摄氏度下反应1h，然后磁性分离下进行洗涤，滚环扩增产物用PBS溶液洗涤三次，然后与MNP/S-SD反应形成MNP/DS-SP。洗涤后置于4摄氏度下备用。
应用例1：抗癌药物DOX的搭载
将1mM的DOX溶液分别与实施例2和实施例3制备的不同功能的DNA纳米球混合，于25摄氏度下反应24h，磁性分离去掉未结合的DOX。
实施例2磁珠结合的纳米球与抗癌药物DOX搭载后的激光共聚焦图如图7所示；图中，(A)红色为与磁珠结合的纳米球搭载了DOX后所发荧光，绿色为不含磁珠的纳米球与syber green染料结合后所发荧光；(B)在磁性分离之后，只剩下绿色的未含磁珠的纳米球，由此说明磁性分离可很好的实现对所需样品的分离。
实施例3所制备的MNP/DS-SP与DOX进行结合，并进行磁性分离的示意图如图8所示。
应用例2：NEM实验
为了验证还原性硫醇与MNP/DS-SP之间的反应，浓度为1.0mM的NEM(N-ethylmaleimide)与其反应60min，然后加入MNP/DS-SP，检测最终荧光强度。结果如图9所示。
由图9可以看出，NEM的加入，打断了双硫键，样本中双硫键的失去致使本方法信号较低，未加入NEM的样本，信号依旧很强，说明本发法确实打断了双硫键，从而产生了荧光信号。
应用例3：体外谷胱甘肽含量的测定
使用荧光仪测定荧光强度，图10显示了检测不同浓度GSH标准样品的荧光强度叠加图，取595nm出荧光数值制成标准曲线，线性回归方程为Y＝49.1X+77.3，Y表示相对荧光强度，X表示GSH浓度。对浓度为5.0×10-9M的GSH进行11次平行试验，测得相对标准偏差为3.5％。表现出较好的重复率。
应用例4：Ramos细胞中谷胱甘肽含量的测定
1.0ml的数量为2.1×105的细胞悬浮液于3500转下离心5min，用冰PBS溶液洗涤两次，然后重新悬于100μL PBS溶液中，用超声波细胞粉碎机粉粹细胞30min得到细胞溶解产物，100μL GSH实际样品及细胞溶解物与MNP/DS-SP(实施例3制备)溶液混合，然后在37摄氏度下孵育，磁力架磁性分离之后，上清液在25摄氏度下避光放置24h。
最终计算Ramos细胞中谷胱甘肽类物质含量为～3.705fmol/cell，与报道相符合。为检验该方法的可行性，向细胞溶解物中加入不同浓度的谷胱甘肽标准溶液，进行重复率实验。结果如表1所示。
表1：重复率试验结果：
此结果表现出良好的可靠性。
应用例5：细胞毒性实验
如图11A所示，不同体积倍数的不含DOX的DNA纳米球与CEM细胞混合培养4h后，使用台盼蓝溶液对细胞进行染色3min，使用细胞计数板进行计数，估算细胞存活率。倍数增加磁性DNA纳米球的量，细胞存活率均在90％左右，并未出现较大波动。说明在不含DOX的情况下，磁性DNA纳米球对细胞的毒性非常小。
如图11B所示，MNP/sgc8-SP与DOX结合之后，分别使用不同体积的样品与CEM及Ramos混合孵育，使用台盼蓝进行染色，用细胞计数板进行计数并计算存活率。其中，CEM细胞表现出明显的存活率降低，而Ramos细胞存活率虽然也呈现出下降趋势，但明显没有CEM下降速度大，由此反应出sgc8适配体对CEM的识别和靶向给药作用。
如图11C所示，游离态DOX对两种细胞的损伤率呈现一致的水平，即纯DOX药物并不能靶向给药，没有选择性。
综上图可知，本发明的磁性DNA纳米球具有良好的生物相容性及选择性。
应用例6：靶向选择性实验
靶向药物输送流式细胞图如图12所示。图中A表示搭载了药物DOX的MNP/sgc8-SP可对CEM细胞进行特异性识别和药物的靶向运输，从而使得细胞显示荧光，与纯细胞(红色)的峰相比，明显向荧光强度变大的方向移动；图中B为对比试验，与(A)图同样操作的情况下，样品与Ramos细胞进行孵育反应，检测峰并没有出现如(A)图所示较大的移动，微小的偏移可能是因为DOX微量释放的误差所致。由峰的位移对比可以看出其靶向选择性。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 临沂大学
<120> 一种多功能磁性DNA纳米球及其制备方法与应用
<130> 2017
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttcccggcgg cgcagcagtt agatgctgct gcagcgatac gcgtatcgct atggcatatc 60
gtacgatatg ccgcagcagc atctaaccgt acagtatt 98
<210> 2
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaaaaaaaaa aaaaatctaa ctgctgcgcc gccgggaaaa tactgtacgg ttagatgctg 60
ctgc 64
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tctaactgct gcgccgccgg gaaaatactg tacggttaga tgctgctgc 49
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tttttttttt ttttthssht tt 22

Claims (10)

1.一种多功能磁性DNA纳米球，其特征在于，所述多功能磁性DNA纳米球包括：结合有磁珠的DNA纳米球和/或含双硫键的结合磁珠的DNA纳米球。
2.根据权利要求1所述的多功能磁性DNA纳米球，其特征在于，所述结合有磁珠的DNA纳米球由如下方法制备而成：
(1)构建反应体系，进行DNA链的环化和连接，得到结合了磁珠的环状DNA；所述反应体系包括：磷酸化的线性DNA模板单链、DNA引物单链I、T4DNA连接酶、D-PBS溶液和磁珠溶液；
(2)将结合了磁珠的环状DNA与phi29DNA聚合酶和dNTP溶液混合，进行滚环扩增反应，即得结合有磁珠的DNA纳米球。
3.根据权利要求2所述的多功能磁性DNA纳米球，其特征在于，步骤(1)中，所述磷酸化的线性DNA模板单链的序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求2所述的多功能磁性DNA纳米球，其特征在于，步骤(1)中，所述DNA引物单链I为多聚(T)DNA引物单链或修饰生物素分子的DNA引物单链。
5.根据权利要求4所述的多功能磁性DNA纳米球，其特征在于，所述多聚(T)DNA引物单链的序列如SEQ ID NO.2所示；所述修饰生物素分子的DNA引物单链的序列如SEQ ID NO.3所示。
6.根据权利要求2所述的多功能磁性DNA纳米球，其特征在于，步骤(1)中，所述反应体系中，磷酸化的线性DNA模板单链和DNA引物单链的浓度为80-120μM，优选为100μM；T4DNA连接酶的浓度为1800-2200U/μL，优选为2000U/μL。
7.根据权利要求1所述的多功能磁性DNA纳米球，其特征在于，所述含双硫键的结合磁珠的DNA纳米球由如下方法制备而成：
(1)构建反应体系，进行DNA链的环化和滚环扩增反应，得到滚环扩增产物；所述反应体系包括：磷酸化的线性DNA模板单链、DNA引物单链I、T4DNA连接酶、D-PBS溶液、phi29DNA聚合酶和dNTPs；
(2)将链霉亲和素磁珠与DNA引物单链II混合反应，然后与滚环扩增产物反应形成含双硫键的结合磁珠的DNA纳米球。
8.根据权利要求7所述的多功能磁性DNA纳米球，其特征在于，步骤(1)中，所述磷酸化的线性DNA模板单链的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述DNA引物单链I为多聚(T)DNA引物单链或修饰生物素分子的DNA引物单链；优选的，所述多聚(T)DNA引物单链的序列如SEQ ID NO.2所示；修饰生物素分子的DNA引物单链的序列如SEQ ID NO.3所示。
9.根据权利要求7所述的多功能磁性DNA纳米球，其特征在于，步骤(2)中，所述DNA引物单链II为修饰双硫键及生物素分子的DNA引物单链，其序列如SEQ ID NO.4所示。
10.权利要求1-9任一项所述的多功能磁性DNA纳米球在制备检测细胞内巯基化合物的试剂中的应用和/或制备靶向给药系统中的应用。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108148810A (zh) * 2017-12-14 2018-06-12 临沂大学 一种适体和鲁米诺-金纳米粒子功能化的rna膜及其制备方法和应用
CN109055498A (zh) * 2018-07-26 2018-12-21 临沂大学 基于超树枝状滚环转录反应的miRNA和/或生物小分子检测探针、检测方法和试剂盒
CN109925517A (zh) * 2017-12-19 2019-06-25 浙江大学 pH响应型磁性纳米粒子组装体及其制备方法和应用
CN110470712A (zh) * 2018-05-09 2019-11-19 南京大学 一种基于通道内生成DNA纳米花的miRNA检测装置
CN113292050A (zh) * 2021-07-02 2021-08-24 安徽农业大学 新型纳米硒双球及其制备方法
CN113975397A (zh) * 2021-10-26 2022-01-28 中南大学湘雅三医院 一种基因/小分子化合物纳米递药系统及其制备方法与应用
CN117431058A (zh) * 2023-12-18 2024-01-23 天津大学 单分散及表面单功能化超小金团簇的方法及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104388563A (zh) * 2014-11-19 2015-03-04 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 纳米粒子表面用dna四面体为支架并引滚环扩增反应的方法
CN105883714A (zh) * 2016-04-19 2016-08-24 南开大学 一种新型基于拓扑异构酶的核酸纳米网状结构及制备方法
US20160320377A1 (en) * 2014-02-13 2016-11-03 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for protein analysis

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160320377A1 (en) * 2014-02-13 2016-11-03 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for protein analysis
CN104388563A (zh) * 2014-11-19 2015-03-04 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 纳米粒子表面用dna四面体为支架并引滚环扩增反应的方法
CN105883714A (zh) * 2016-04-19 2016-08-24 南开大学 一种新型基于拓扑异构酶的核酸纳米网状结构及制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN D等: "Dual targeting luminescent gold nanoclusters for tumor imaging and deep tissue therapy", 《BIOMATERIALS》 *
GUO Y等: "DNA-spheres decorated with magnetic nanocomposites based on terminal transfer reactions for versatile target detection and cellular targeted drug delivery", 《CHEM COMMUN (CAMB)》 *
KHOSHFETRAT等: "Amplified detection of leukemia cancer cells using an aptamer-conjugated gold-coated magnetic nanoparticles on a nitrogen-doped graphene modified electrode", 《BIOELECTROCHEMISTRY》 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108148810A (zh) * 2017-12-14 2018-06-12 临沂大学 一种适体和鲁米诺-金纳米粒子功能化的rna膜及其制备方法和应用
CN108148810B (zh) * 2017-12-14 2020-06-12 临沂大学 一种适体和鲁米诺-金纳米粒子功能化的rna膜及其制备方法和应用
CN109925517A (zh) * 2017-12-19 2019-06-25 浙江大学 pH响应型磁性纳米粒子组装体及其制备方法和应用
CN109925517B (zh) * 2017-12-19 2020-10-23 浙江大学 pH响应型磁性纳米粒子组装体及其制备方法和应用
CN110470712A (zh) * 2018-05-09 2019-11-19 南京大学 一种基于通道内生成DNA纳米花的miRNA检测装置
CN110470712B (zh) * 2018-05-09 2021-10-15 南京大学 一种基于通道内生成DNA纳米花的miRNA检测装置
CN109055498A (zh) * 2018-07-26 2018-12-21 临沂大学 基于超树枝状滚环转录反应的miRNA和/或生物小分子检测探针、检测方法和试剂盒
CN113292050A (zh) * 2021-07-02 2021-08-24 安徽农业大学 新型纳米硒双球及其制备方法
CN113292050B (zh) * 2021-07-02 2023-08-29 安徽农业大学 纳米硒双球及其制备方法
CN113975397A (zh) * 2021-10-26 2022-01-28 中南大学湘雅三医院 一种基因/小分子化合物纳米递药系统及其制备方法与应用
CN113975397B (zh) * 2021-10-26 2023-08-22 中南大学湘雅三医院 一种基因/小分子化合物纳米递药系统及其制备方法与应用
CN117431058A (zh) * 2023-12-18 2024-01-23 天津大学 单分散及表面单功能化超小金团簇的方法及应用

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