CN107469088B

CN107469088B - 一种基于dna折纸术的精确识别靶向纳米载体的构建方法及其应用

Info

Publication number: CN107469088B
Application number: CN201710615442.0A
Authority: CN
Inventors: 赵永星; 张楠; 华海婴; 唐亚芳
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2017-06-27
Filing date: 2017-07-26
Publication date: 2020-04-03
Anticipated expiration: 2037-07-26
Also published as: CN107469088A

Abstract

本发明涉及一种基于DNA折纸术的精确识别靶向纳米载体的构建方法及其应用，属于医药技术领域。该载体由脚手架DNA、订书钉单链DNA、特殊订书钉单链DNA和核酸适配体组成，其中脚手架DNA与订书钉单链DNA的物质的量的比范围为1:（5‑10）:（5‑10）；核酸适配体与折纸的物质的量的比范围为1:（1‑32）；在进行载药时载体与抗肿瘤药物阿霉素的物质的量的比范围为1:（12500‑50000）；合适的载药时间范围为2h‑6h。本发明可实现靶头精确修饰DNA载体，提高载体靶向作用和靶头诱发的生物作用，载药后可延缓药物的释放，降低蒽环类抗肿瘤药物的毒副作用，增强对肿瘤细胞的抗肿瘤作用，使载药系统能够同时发挥化学治疗作用和生物治疗作用。

Description

一种基于DNA折纸术的精确识别靶向纳米载体的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于医药科技领域，涉及采用DNA折纸术构建蒽环类抗肿瘤药物纳米载体，具体涉及基于DNA折纸术的精确识别靶向纳米载体的构建方法及其应用。

背景技术

DNA折纸术最早由Nadrian Seeman在上世纪八十年代提出，该领域的一个里程碑式的研究成果是2006年Paul W.K.Rothemund发表在Nature上的研究成果。研究中将DNA折纸的合成步骤大大简化，使DNA折纸用到的订书钉单链DNA之间及与脚手架DNA之间不再需要有严格的比例关系，过量即可，自组装的过程也由之前的几十小时缩短为数小时甚至几十分钟。

核酸适配体是一种通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)从随机单链核酸序列库中筛选出的与细胞膜上的靶物质具有高度亲和性的寡聚核苷酸片段，其特异性可以媲美抗体，能够精准识别相应的蛋白质或小分子物质。核酸适配体(aptamer,Apt)是通过SELEX筛选得到能够与特异性靶标物质具有高亲和力结合的寡核苷酸，其通过折叠形成特定空间结构而与靶标结合，其亲和力和特异性与抗体相当。核酸适配体还具有分子量较小、可化学合成、生物相容性好、无(或更低的)抗原性/免疫原性、生物膜穿透性等优点，特别是DNA适配体的稳定性高于RNA适配体，可对抗核酸酶的降解。因此，核酸适配体受到科学家的广泛关注，现在已筛选出多个可与肿瘤细胞表面特异性蛋白(受体)结合的核酸适配体，如靶向结合核仁素的AS1411、靶向结合CD30的适配体C2NP、靶向结合VEGF165受体的DNA适配体SL2B和靶向结合HER2受体的DNA适配体等。为了提高抗肿瘤药物的作用降低其对正常组织的毒副作用，研究者将能特异性结合靶标的核酸适配体与药物(如阿霉素)或载体(如脂质体、碳纳米管、胶束、金纳米粒等)结合，构建核酸适配体介导的主动靶向药物复合体或给药系统用于肿瘤靶向治疗研究。

靶向治疗恶性肿瘤是现代医药学研究的热点，其中主动靶向治疗是理想的治疗方式之一。主动靶向治疗的方式主要有两种：一是用靶分子修饰药物(或药物载体)，使之与肿瘤细胞表达的靶标特异性结合后将药物递送到靶细胞，进而产生治疗作用；另一种是用靶分子直接与靶标作用，诱导细胞信号，发挥生物治疗作用。前者由于靶分子修饰药物或载体的位置和数量不可控，导致靶分子识别结合靶标的效率低或结合力弱，易产生“脱靶”现象，因而治疗效果较差。后者由于靶分子的空间存在形式(空间位置和数量)不同，其识别能力及结合靶标后所激发的细胞信号也各有差异，导致其生物治疗作用受到极大影响。因此，无论何种靶向治疗，其有效治疗的关键是靶分子必须能够精准识别靶标。再者，若要使靶向分子既能靶向递送化疗药物又能产生生物活性发挥生物治疗与化疗协同作用，则更需要靶分子精准有效的识别靶标。然而，现有的传统技术无法精确控制靶分子的空间位置和数量，实现精准识别靶标，达到高效递药和有效诱导生物效应一体化，发挥协同抗肿瘤作用。本课题组前期研究表明，利用DNA纳米技术在纳米尺度范围内精确控制核酸适配体的空间位置和数量有望解决这一难题。

尽管上述研究都通过一些技术方法(如与亲和素或高分子聚合物通过化学键连接等)提高了适配体与其靶标的定向识别，增加了适配体稳定性和抗肿瘤活性，但都未能将核酸适配体精确定量、定位的组合，因而无法做到精准识别和高效激活可引起肿瘤细胞凋亡(抑制增殖或迁移等)的受体，导致其抗肿瘤作用较弱。

恶性肿瘤的发生是多种因素共同作用的结果，现有的治疗药物大都只针对一个靶点或单因素作用。因此，单一方法治疗肿瘤并非最佳的治疗方式，应用两种或者多种不同作用机理的联合治疗方法可发挥协同增效作用，能更好地抑制肿瘤生长。近年来，将生物治疗剂(如基因、siRNA、细胞因子等)和化疗药物共包载于同一载体用于联合治疗肿瘤的研究日渐增多。研究结果提示：生物治疗和化疗联合治疗可以发挥协同作用，提高抗肿瘤作用并降低药物的毒副作用。然而，如何使生物治疗剂与化学药物的作用达到治疗同步，发挥最佳的治疗效果是联合治疗中亟需解决的一个重要问题。

发明内容

本发明为解决传统药物递送系统的不足的技术问题，公开了一种基于DNA折纸术的精确识别靶向纳米载体的构建方法及其应用，靶向纳米载体具有生物相容度高、无毒、载药量大的优点，可精准靶向肿瘤细胞，显著提高蒽环类抗肿瘤药物的抗肿瘤效果。

为解决上述技术问题，采用以下技术方案：

一种基于DNA折纸术的精确识别靶向纳米载体的构建方法，步骤如下：

(1)制备脚手架DNA(M13mp18单链DNA(N4040S)、订书钉单链DNA和特殊订书钉单链DNA作为构建载体的材料；设计合成特异性核酸适配体DNA(C2NP)，并使特殊订书钉单链DNA与核酸适配体DNA之间有一连接体，连接体为订书钉单链DNA上特异性的寡核苷酸序列与核酸适配体DNA通过碱基互补配对原则形成的结构；

(2)将步骤(1)得到的订书钉单链DNA、特殊订书钉单链DNA和脚手架DNA溶于 1×TAE/Mg²⁺溶液中得反应溶液，进行自组装，得到DNA折纸(RE)溶液；

(3)将步骤(1)得到的DNA折纸溶液中加入核酸适配体DNA，得到核酸适配体精确定位定量修饰的DNA折纸靶向载体(RE-Apt)溶液；

(4)根据设计，向步骤(3)得到核酸适配体精确定位定量修饰的DNA折纸靶向载体溶液中加入蒽环类抗肿瘤药物溶液，避光孵育2-6h后离心去上清，沉淀即为精确识别的靶向纳米载药分子。

所述步骤(1)中的订书钉单链DNA、特殊订书钉单链DNA、脚手架DNA序列，在设计时参考《Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns》,PaulW.K.Rothemund1；Vol 440|16March 2006|doi:10.1038/nature04586中的第1-第226条序列，其中订书钉单链DNA和特殊订书钉单链DNA在设计时，为避免碱基的Ω-Ω堆积效应造成折纸结构相互偶联和堆积，去掉其中第100-第111条、第205-216条及特殊订书钉单链DNA选取的订书钉单链DNA的序列，特殊订书钉单链DNA选自第1-99条、第112-204条、第217-226条订书钉单链中的若干条、并在原有订书钉单链DNA上增加与核酸适配体DNA互补的寡聚脱氧核苷酸序列。

核酸适配体DNA的序列如SEQ ID NO：1所示，所述核酸适配体为特异性靶向结合肿瘤细胞，并能够发挥生物作用的碱基序列。

DNA折纸与核酸适配体靶头的结合位置和数目，通过改变DNA折纸上特殊订书钉单链 DNA的位置和数目来控制，即通过将与核酸适配体DNA互补的寡聚脱氧核苷酸片段延长至订书钉单链DNA的末端形成特殊订书钉单链DNA。

所述步骤(2)中，脚手架DNA：订书钉单链DNA：特殊订书钉单链DNA的物质的量比为1：(5-10)：(5-10)；自组装的操作为：将反应溶液置于PCR仪中，以0.01-0.17℃/s，从 95℃退火至20℃。

所述步骤(3)中，核酸适配体DNA：DNA折纸的物质的量比为1：(1-32)。

所述步骤(4)中，DNA折纸靶向载体：蒽环类抗肿瘤药物的物质的量比为1：(12500-50000)，蒽环类抗肿瘤药物为柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、伊达比星、戊柔比星或米托葱酮中的一种或多种。

一种基于DNA折纸术的精确识别靶向纳米载体作为肿瘤精准生物治疗和化学治疗的应用。

本发明的有益效果在于：

1.本发明所构建精确识别靶向纳米载体结构的不同位置，设计有不同数量或密度的特异性寡核苷酸序列，核酸适配体DNA与特异性寡核苷酸序列通过连接体特异性相连，从而实现靶头精确修饰DNA载体，提高载体靶向作用和靶头诱发的生物作用，载药后可延缓药物的释放，降低蒽环类抗肿瘤药物的毒副作用，增强对肿瘤细胞的抗肿瘤作用，使载药系统能够同时发挥化学治疗作用和生物治疗作用。

2.本发明的精确识别靶向纳米载体系统主要有两种靶向治疗方式：一方面靶分子与肿瘤细胞膜特异性结合后将药物递送到靶细胞，产生化学治疗作用；另一方面靶分子可直接与靶标作用，诱导细胞信号，发挥生物治疗作用，同步协同增强肿瘤的作用。

3.本发明的靶向折纸载体及可控制适配体距离和数目的折纸载体，且核酸适配体可精准识别靶标，提高其结合力，降低“脱靶率”，有效诱导细胞信号，增强生物治疗作用，实现核酸适配体的靶向递药和生物效应双重功能一体化，达到生物治疗与化疗协同抗肿瘤作用。

4.本发明制备的精确识别靶向纳米载体系统连有若干个靶头，显著提高了细胞对药物的摄取量，DNA折纸载体则主要增加了细胞的早期凋亡率，本发明所构建的载药体系能够提高目的药物的抗肿瘤作用，且同时显示出生物活性和化疗作用；由于目的药物从载体中游离出来需要一定时间，因此在时效上，载药系统发挥作用没有游离目的药物快，主要增加的是细胞的早期凋亡率。

附图说明

图1为折纸载体的原子力显微镜图；其中a为DNA折纸载体、b为DNA靶向折纸载体。

图2为载药折纸与不同浓度血清孵育4h后的电泳结果，其中1：1Kb plus marker；2： RE+0％FBS；3：RE+2％FBS；4：RE+5％FBS；5：RE+10％FBS；6：DNA折纸对照。

图3为DOX@RE、DOX@RE-Apt和游离DOX体外释放曲线。

图4为基于DNA折纸术的精确识别靶向纳米载体对肿瘤细胞的增殖抑制作用。

图5为基于DNA折纸术的精确识别靶向纳米载体对肿瘤细胞的生物作用联合化学作用。

图6为Karpass299细胞对不同载体载药后的定量摄取情况。

图7为不同浓度的折纸缓冲液对K299细胞的影响。

图8为K299细胞对阿霉素的摄取情况。

图9为载体进入细胞位置的考察。

图10为不同载体载药后对Karpass299细胞凋亡周期的影响。

具体实施方式

(1)制备脚手架DNA(M13mp18单链DNA(N4040S)、订书钉单链DNA和特殊订书钉单链DNA作为构建载体的材料(订书钉单链购于生工生物工程(上海)股份有限公司、脚手架DNA购于美国NEB公司)；设计合成特异性核酸适配体DNA(C2NP)，并使特殊订书钉单链DNA与核酸适配体DNA之间有一连接体，连接体为订书钉单链DNA上特异性的寡核苷酸序列与核酸适配体DNA通过碱基互补配对原则形成的结构；

(3)将步骤(1)得到的DNA折纸溶液中加入核酸适配体DNA，得到DNA折纸靶向载体(RE-Apt)溶液；

(4)向步骤(3)得到DNA折纸靶向载体溶液中加入蒽环类药物溶液，避光孵育2-6h后离心去上清，沉淀即为靶向纳米载药分子。

一种基于DNA折纸术的精确识别靶向纳米载体作为肿瘤精准治疗的应用。

以临床上常用的蒽环类抗肿瘤药物——阿霉素(DOX)为例，核酸适配体选择能够靶向淋巴瘤细胞的C2NP适配体如SEQ ID NO：1所示，阐述具体实施方式。

试验试剂

a.1×TAE/Mg²⁺溶液的配制

用天平称取四水合乙酸镁1.34g、EDTA-2Na 9.30g、Tris base 6.02g置于100mL烧杯中，加入适量去离子水并搅拌至全部溶解后转移到100mL容量瓶，定容至刻度。摇匀后分装在 50mL离心管中，于4℃冰箱存放备用。

b.各小链DNA的溶解

将购买的分装于96孔板的订书钉单链DNA和特殊订书钉单链DNA用板式离心机以3000rpm的转速离心10min，使DNA冻干粉聚集于底部。按照合成公司提供的物质的量，加入适量无菌纯化水，使DNA的终浓度为100μM。用移液枪吹打数次使DNA充分溶解，储存于-20℃冰箱。

将购买的脚手架DNA分装于1.5mL离心管中的DNA以10000rpm的转速离心3min，使DNA冻干粉聚集在离心管底部，按照合成公司提供的物质的量，加入相应的无菌纯化水，使DNA的终浓度为100μM，使用旋涡混合器混匀后存放于-20℃冰箱备用。

1、基于DNA折纸术的精确识别靶向纳米载体的构建

(1)将脚手架DNA、订书钉链DNA溶液和特殊订书钉单链DNA溶液按1:5:5的比例混合均匀，在PCR仪中进行退火(从95℃降至20℃，0.017℃/S)，得DNA折纸(RE)溶液。

(2)向步骤(1)中得到的DNA折纸溶液中，加入核酸适配体进行退火(从40℃降至20℃，0.003℃/S)即得靶向DNA载体(RE-Apt)溶液。

2、载体结构的考察

将所得的DNA折纸溶液用超滤管过滤后稀释到合适的浓度，使用原子力显微镜在液相模式进行扫描。结果显示载体的大小与理论值(90nm×60nm)相符(图1a)。在扫描精确识别靶向纳米载体时，由于连接上的核酸适配体体积太小而不能观察到，因此将特殊订书钉单链 DNA与核酸适配体之间的连接体用生物素修饰，在扫描之前加入链霉亲和素，利用生物素与链霉亲和素之间的特异性结合来表征核酸适配体的连接。结果表明，修饰后的精确识别靶向纳米载体能够明显观察到折纸载体上的生物素-亲和素，间接证明了核酸适配体的连接(图1b)。

3、DOX@RE、DOX@RE-Apt和游离DOX体外释放的考察

为考察DNA折纸在含血清培养基中的稳定性，将载药后的折纸载体与含不同浓度血清的培养基共同孵育后进行电泳，根据电泳条带的位置以及亮度，筛选出合适的血清浓度，结果如图2所示。

由图可知，载体在血清含量不超过5％时，电泳条带清晰可见，位置也与对照样品的位置相同。而在10％含量的培养基中并没有产生载体的条带，猜测折纸载体在高浓度的含血清培养基中并不稳定，结构被破坏，因此后续的实验中采用含5％胎牛血清的培养基进行细胞实验。

依据筛选出的最佳孵育条件将阿霉素载入到DNA折纸(RE)及靶向折纸(RE-Apt)中，通过离心去除游离的阿霉素，得到载药的DNA折纸。用折纸缓冲盐溶液将沉淀重悬，取出5μL 于荧光酶标板，加入2μL无水二甲基亚砜、43μL的折纸缓冲液溶液，放入摇床振摇100r/min×5min后测定其荧光值，由标准曲线计算出总浓度。将重悬后的载药折纸放入微量透析管，每管20μL，平行设置三组，在1000mL、pH分别为5.0、7.4的缓冲液、200r/min、37℃ 条件下检测其释放情况。分别于0.5、1、2、4、8、12、24、48h时刻取出3个微量透析管，从管中取出5μL样品置于荧光酶标板中，按前述测总浓度的方法测其浓度并计算各个取样点的累计释放量，绘制释放曲线。同法测定游离阿霉素的释放情况。

在pH7.4的释放介质中，游离阿霉素在0.5h内释放了65.36％，4h时释放了96.63％。而载入DNA折纸载体的阿霉素，无论是在靶向载体(DOX@RE-Apt)还是非靶向载体(DOX@RE)中，释放速度均比游离阿霉素的速度小，0.5h时刻分别释放了10.13％、9.92％；24h时释放量为90％左右，至48h时基本释放完全。由此说明，DNA折纸载体延缓了阿霉素的释放。在pH5.0的释放介质中载体释药的速度稍快，推测酸性环境不利于折纸载体保持完整结构导致阿霉素较快地从载体中游离出来(图3)。

4、基于DNA折纸术的精确识别靶向纳米载体的体外抗肿瘤作用考察

采用CCK-8法考察纳米载体(DOX@RE)、连接不同数目核酸适配体的靶向载体(DOX@RE-4Apt、DOX@RE-16Apt)和游离DOX在不同浓度和不同作用时间下对Karpas299 细胞(间变性大细胞淋巴瘤)的增殖抑制作用。实验数据显示，与原料药相比，载入DNA 折纸载体的阿霉素对淋巴瘤细胞的抑制作用更强；与非靶向折纸载药系统相比，靶向折纸载药系统提高了阿霉素对细胞的抑制作用。在阿霉素浓度为0.1μM、0.5μM和1μM时，载体载药系统与原料药的差别较大，当阿霉素浓度升高到5μM和10μM时均表现出对细胞较强的抑制作用且差别并不明显(图5)。

同时采用CCK-8法考察了DOX@RE、DOX@RE-4Apt、DOX@RE-16Apt和游离DOX对Karpas299细胞的生物作用联合化学作用。实验结果显示，靶向适配体载入药物后增加了对K299细胞的增殖抑制作用。当阿霉素浓度为0.1μM、0.5μM和1μM时，各载药的靶向载体对细胞的抑制作用均显著大于同浓度的游离阿霉素，当阿霉素浓度为5μM时各载药体系组的抑制率均稍大于游离阿霉素组，只有在适配体浓度为64nM时靶向载药体系与游离阿霉素的差别才明显，说明在阿霉素为高浓度时，载药系统的化学治疗作用占主导地位(图5)。

5、体外肿瘤细胞抑制率考察

(1)实验所用缓冲液对淋巴瘤细胞的毒性考察

在细胞生长状态良好时收集细胞，离心去掉旧培养基后用新鲜培养基重悬。使用细胞计数板进行计数并将其稀释成浓度为1×10⁵个/mL的细胞悬液，接种于96孔板并使每孔含有 100μL细胞悬液。然后将细胞悬液接种于96孔板中，每孔200μL，在低氧条件下继续培养12h。向每孔细胞加入浓缩的折纸缓冲液，使体系中镁离子浓度分别为12.5mM、6.25mM、3.125 mM、1.25mM、0.625mM。放于培养箱中继续培养，分别于24h、48h、72h取出细胞板向培养孔中加入20μL的CCK8，并用移液枪吹打数次使CCK8与培养基混合均匀。放于培养箱中继续培养4h后取出，在摇床中100rpm震荡3min。使用酶标仪检测各孔在450nm处的光密度值(OD值)，根据OD值计算不同浓度的折纸缓冲液对细胞的抑制率。

(2)DNA材料对淋巴瘤细胞的毒性考察

粗略估计细胞生长状况良好且处于对数生长期时收集细胞并进行计数。用新鲜培养基稀释成每毫升含10万个细胞后接种于96孔板，每孔接种100μL，并放置细胞培养箱中培养12h。用培养基将非靶向DNA折纸载稀释，使100μL培养基中折纸的浓度分别为8nM、4nM、2nM、 1nM、0.2nM，每个浓度设置5个复孔，将稀释好的折纸加入到相应的孔中。在细胞培养箱中继续培养，分别于24h、48h、72h取出细胞板向培养孔中加入10μL的CCK8，并用移液枪吹打数次使CCK8与培养基混合均匀。放于培养箱中继续培养4h后取出，在摇床中100rpm震荡3min。使用酶标仪检测各孔在450nm处的OD值，根据(1)所述公式计算不同浓度的非靶向载体对细胞的抑制率。

(3)DNA折纸载药后对淋巴瘤细胞的增殖抑制作用

取处于对数生长期的淋巴瘤细胞，离心后用新鲜培养基重悬并进行细胞计数，将细胞悬液稀释成浓度为1×10⁵个/mL。将细胞接种于96孔板中，每孔100μL，在低氧条件下继续培养12h。实验分为6组，分别为调零组(不含细胞的培养基)、对照组、DOX组、DOX@RE组、DOX@RE-4Apt组、DOX@RE-16Apt组。依次向各孔中加入不同浓度的载药体系，使每组C2NP的浓度为64nM、阿霉素的终浓度分别为10μM、5μM、1μM、0.5μM、0.1μM，每个浓度设置5个复孔。在细胞培养箱中继续培养，分别于24h、48h、72h取出细胞板向培养孔中加入10μL的CCK8溶液，并用移液枪吹打数次使CCK8与培养基混合均匀。放于培养箱中继续培养4h后取出，在摇床中100rpm震荡3min。使用酶标仪检测各孔在450nm处的光密度值，根据(1)所述公式计算载药系统的细胞抑制率。

(4)C2NP(Apt)修饰的DNA折纸载体对淋巴瘤细胞的生物活性研究

在细胞生长状态良好时收集细胞，离心去掉旧培养基后用新鲜培养基重悬。使用细胞计数板进行计数并将其稀释成浓度为1×10⁵个/mL的细胞悬液，接种于96孔板并使每孔含有 100μL细胞悬液。实验分为5组，分别为调零组、对照组、Apt组、RE-4Apt组和RE-16Apt 组。放入培养箱中培养待细胞恢复状态后加入100μL上述各组含不同成分的培养基，使得实验组的各组中C2NP靶头的浓度为64nM。继续培养72h后取出细胞板向培养孔中加入10μL 的CCK8溶液，并用移液枪吹打数次使CCK8与培养基混合均匀。放于培养箱中继续培养4h 后取出，在摇床中100rpm震荡3min。使用酶标仪检测各孔在450nm处的光密度值，根据(1) 所述公式计算C2NP修饰的DNA折纸载体对淋巴瘤细胞的抑制率。同法处理细胞膜表面没有超表达CD30的乳腺癌细胞(MCF-7)作对照如图4所示。

(5)C2NP修饰的靶向DNA折纸载体载药后对淋巴瘤细胞的生物作用联合化学作用的研究

收集细胞后用新鲜培养基重悬，接种于96孔板中并使每孔含有100μL培养基和一万个细胞。放于细胞培养箱中培养过夜，向各孔中分别加入DOX、DOX@RE、DOX@RE-4Apt、DOX@RE-16Apt，使各组RE和DOX的浓度分别为4nM和2μM、4nM和1μM、4nM和0.5μM、 4nM和0.1μM、2nM和2μM、2nM和1μM、2nM和0.5μM、2nM和0.1μM、1nM和2μM、 1nM和1μM、1nM和0.5μM、1nM和0.1μM。在5％的CO₂条件下继续培养48h，然后取出培养板向每孔加入10μL的CCK8溶液，并用移液枪吹打使CCK8溶液与培养基混合均匀。于培养箱中继续避光培养4h，取出后在摇床中100rpm震荡3min。使用酶标仪检测各孔在 450nm处的光密度值，根据(1)所述公式计算细胞的抑制率。

使用CCK-8(Cell Counting Kit-8)试剂可以快捷而准确地测定样品对细胞的增殖抑制作用。该试剂中含有WST-8的物质，它能够和细胞中的脱氢酶反应生成易溶于水的橙黄色产物甲臜且生成量与活细胞的数量成正比。因此本申请采用CCK8法考察载药系统对细胞的增殖抑制情况。

6、K299细胞对DNA折纸载药系统的摄取情况考察

(1)体外肿瘤细胞定性摄取考察

收集生长状态良好的处于对数生长期的细胞并用新鲜培养基重悬，调整细胞浓度到5×10⁵个/mL后接种于24孔板，每孔1mL。低氧条件下培养过夜，待细胞恢复状态后向各孔中分别加入DOX、DOX@RE、DOX@RE-4Apt、DOX@RE-16Apt，使各组RE和DOX的浓度分别为4nM和2μM，在细胞培养箱中继续培养。分别于0.5h、1h、2h、4h时加入预冷的PBS终止细胞对阿霉素的摄取。用标记的4mL离心管分别收集培养板里的细胞并用PBS洗三遍以除去游离的药物。加入细胞固定液1mL并混合均匀，静置10min后用PBS洗掉固定液，向各组加入500μL的DAPI染色液并在室温下避光染色15min。然后将染色液用PBS洗净，快速倒掉PBS并用100μL左右的PBS溶液重悬细胞，用移液枪吸取细胞悬液滴在载玻片上，盖上盖玻片后立即用激光共聚焦显微镜观察K299细胞内的荧光强度。

(2)体外肿瘤细胞定量摄取考察

收集细胞后调整细胞浓度为5×10⁵个/mL，接种于24孔板，每孔接种1mL。低氧条件下培养过夜，向各孔中分别加入DOX、DOX@RE-16Apt、DOX@RE-4Apt、DOX@RE，使各组DOX和RE的浓度分别为2μM和4nM，并设置好阴性对照组，在培养箱中继续培养。2h 后在培养板中加入1mL预冷的PBS终止细胞对药物的摄取。用标记好的离心管分别收集细胞并用PBS溶液洗三遍以除去游离的药物。最后用100μL的PBS溶液重悬细胞并使用流式细胞仪进行检测。

在制备DNA折纸的过程中会加入适量的缓冲盐溶液，在考察载药系统的生物活性与化学作用时需要排除缓冲液溶液的影响。因此考察了不同浓度缓冲液(以镁离子浓度代表)对K299 细胞的影响，结果见表1和图7。

表1不同浓度的折纸缓冲液对K299细胞的影响

由结果可知，折纸缓冲液对K299细胞的抑制作用随着浓度的增大而增加，但实验中用到的各浓度折纸缓冲液对细胞的抑制率均小于10％。因此在实验中基本可忽略折纸缓冲液对 K299细胞的影响。

(3)折纸载药后进入细胞位置的考察

将处于对数生长期的细胞离心并用新鲜培养基重悬，接种于24孔板并使每孔含有1mL 培养基和50万细胞。低氧条件下培养至细胞恢复状态后向孔中加入FITC标记的靶向载体，使折纸的终浓度为4nM并在细胞培养箱中继续培养，操作过程注意全程避光。4h后加入预冷的PBS终止细胞的摄取。用4mL离心管分别收集培养板里的细胞并用PBS洗三遍以除去未被细胞摄取的载体。加入4％多聚甲醛固定液1mL静置10min后用PBS洗掉固定液，加入500μL的DAPI染色液在室温下避光染色15min后用PBS洗掉染色液，加入100μL左右的PBS 溶液重悬细胞，用移液枪吸取细胞悬液滴在载玻片上，盖上盖玻片立即用激光共聚焦显微镜观察。

本申请所构建的载体，材料均为DNA，而载体中使用的靶头亦有生物活性，因此对载体材料的毒性研究仅考察非靶向DNA折纸在不同浓度时对K299细胞的抑制作用。结果如表2 所示，当载体浓度在0.1nM至4nM之间时，对K299细胞的抑制率均小于5％，由此可说明本申请所构建的折纸载体对淋巴瘤细胞无明显毒性，具有进一步研究的价值。

表2DNA载体对K299细胞的影响

(4)DNA折纸载药后对淋巴瘤细胞的抑制率考察

本申请分别考察了载药系统在不同浓度和不同作用时间时对淋巴瘤细胞的增殖抑制作用，结果如图5所示。随着阿霉素浓度的增大，DOX组、DOX@RE组、DOX@RE-4Apt组、DOX@RE-16Apt组对K299细胞的抑制作用均增大，各实验组的抑制作用与载药系统的作用时间亦成正比。

由图5可知，与原料药相比，载入DNA折纸载体的阿霉素对淋巴瘤细胞的抑制作用更强；与非靶向折纸载药系统相比，靶向折纸载药系统提高了阿霉素对细胞的抑制作用。在阿霉素浓度为0.1μM、0.5μM和1μM时，载体载药系统与原料药的差别较大，当阿霉素浓度升高到 5μM和10μM时均表现出对细胞较强的抑制作用且差别并不明显。

7、不同载体载药后对Karpass299细胞凋亡周期的影响

利用阿霉素本身在激发波长485nm下的红色荧光，定性地考察K299细胞对游离阿霉素及DNA折纸载药系统的摄取情况。同等实验条件下，固定荧光显微镜的曝光时间，通过对比各实验组的荧光强度可以粗略地估计淋巴瘤细胞对阿霉素的摄取情况。K299细胞对各实验组中的DOX的摄取情况如图8。

由图8可知，随着摄取时间的延长，游离阿霉素和载药系统负载的阿霉素都能够进入到细胞核内且被摄取的量逐渐增大。0.5h时各实验组细胞内摄取的阿霉素的量均较少，导致荧光强度微弱；1h时刻荧光强度均有所增强且游离阿霉素组强于其他实验组；2h后细胞摄取的阿霉素的量继续增多，且载药系统组荧光强度高于游离阿霉素组；4h时刻DNA折纸载体组荧光强度继续增强，但游离阿霉素组增强不明显。在与细胞作用一小时以内时，嵌入到DNA 折纸中的阿霉素没有完全释放出来，导致其在荧光显微镜下荧光强度低于游离阿霉素组，但 2h以后阿霉素逐渐被释放出来被细胞更多的摄取，因此2h后的荧光强度较游离阿霉素组高。

用流式细胞仪检测药物作用后细胞内的荧光强度并与对照组比较，可以实现对细胞摄取药物的定量研究。使用FlowJo软件分析样品，结果如图6所示。

由图6可知，当药物浓度和作用时间一定时，各实验组细胞摄取的阿霉素的量有所不同。与原料药相比，阿霉素载入到折纸载体上后提高了药物被细胞摄取的量，由4.43％提高到 26.84％。与非靶向的DNA折纸载药系统相比，连有16个靶头的载药系统显著提高了细胞对药物的摄取量(56.84％)，连接4个靶头的载药系统对摄取量的提高不甚明显(30.23％)。由此可知，由16个适配体C2NP修饰的DNA折纸载体能够显著提高K299细胞对阿霉素的摄取能力。

异硫氰酸荧光素(FITC)在490nm处有最大吸收并显黄绿色荧光。本申请用到的DNA折纸理论边长为60×90nm，大于细胞核孔。将DNA折纸上的两条订书钉单链用FITC标记，与能够确定细胞核位置的DAPI染液配合来确定载体进入细胞的位置。结果如图9所示。

由图可知，整个细胞内部都有绿色荧光，但在细胞核外部周围有更强的绿色荧光，且并不是连续的。这是因为FITC标记的订书钉单链相对于M13mp18单链来说是过剩的，使用超滤管纯化后被标记的小链并不能完全除去，游离的标记小链能够进入细胞核内部，导致细胞核内亦有荧光，而所有的荧光标记的DNA折纸载体都不能进入细胞核内部，因此滞留在细胞核外，导致不连续的强度更大的荧光。推测细胞核周围荧光更强的地方可能与CD30受体的分布有关。

利用细胞凋亡试剂盒考察RE、RE-4Apt、RE-16Apt载体载药后对Karpass299细胞凋亡周期的影响。结果如图9显示，与Karpass299细胞作用48h后，游离阿霉素组细胞的凋亡率为 37.5％，DOX@RE-16Apt组则为62.1％，适配体C2NP亦显示了生物活性，RE-16Apt组细胞的凋亡率为30.8％。

阿霉素载入到不同的DNA折纸后均提高了细胞的凋亡率，但具体提高的凋亡周期不同。游离阿霉素同时增加了细胞的晚期凋亡率和早期凋亡率，适配体在修饰后主要提高了细胞晚期凋亡率，而DNA折纸载体则主要增加了细胞的早期凋亡率如图10所示。由此说明，本申请所构建的载药体系能够提高阿霉素抗肿瘤作用，且同时显示出了生物活性和化疗作用；由于阿霉素从载体中游离出来需要一定时间，因此在时效上，载药系统发挥作用没有游离阿霉素快，主要增加的是细胞的早期凋亡率。

<110> 郑州大学

<120> 一种基于DNA折纸术的精确识别靶向纳米载体的构建方法及其应用

<160> 1

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（31）

<400> 1

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Claims

1.一种基于DNA折纸术的精确识别靶向纳米载体的构建方法，其特征在于，步骤如下：

（1）制备订书钉单链DNA、特殊订书钉单链DNA、核酸适配体DNA及脚手架DNA；

（2）将步骤（1）得到的订书钉单链DNA、特殊订书钉单链DNA和脚手架DNA溶于1×TAE/Mg² ⁺溶液中得反应溶液，进行自组装，得到DNA折纸溶液；

（3）向步骤（1）得到的DNA折纸溶液中加入核酸适配体DNA，得到核酸适配体精确定位定量修饰的DNA折纸靶向载体溶液；

（4）向步骤（3）得到核酸适配体精确定位定量修饰的DNA折纸靶向载体溶液中加入蒽环类抗肿瘤药物溶液，避光孵育2-6h后离心去上清，沉淀即为精确识别的靶向纳米载药分子；

所述步骤（1）中，核酸适配体DNA的序列如SEQ ID NO：1所示，核酸适配体DNA与特殊订书钉单链DNA之间设有连接体，连接体为订书钉单链DNA上特异性的寡核苷酸序列与核酸适配体DNA通过碱基互补配对原则形成的结构。

2.如权利要求1所述的基于DNA折纸术的精确识别靶向纳米载体的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中，脚手架DNA：订书钉单链DNA：特殊订书钉单链DNA的物质的量比为1：（5-10）：（5-10）；自组装的操作为：将反应溶液置于PCR仪中，以0.01-0.17℃/s，从95℃退火至20℃。

3.如权利要求1所述的基于DNA折纸术的精确识别靶向纳米载体的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中，1×TAE/Mg²⁺溶液含Tris base 40Mm、乙酸镁 12.5mM、EDTA-2Na 2mM，pH为8.0。

4.如权利要求1所述的基于DNA折纸术的精确识别靶向纳米载体的构建方法，其特征在于：所述步骤（3）中，核酸适配体DNA：DNA折纸的物质的量比为1：（1-32）。

5.如权利要求1所述的基于DNA折纸术的精确识别靶向纳米载体的构建方法，其特征在于：所述步骤（4）中，DNA折纸靶向载体：蒽环类抗肿瘤药物的物质的量比为1：（12500-50000），蒽环类抗肿瘤药物为柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、伊达比星、戊柔比星或米托葱酮中的一种或多种。

6.权利要求1-5任一项方法所构建的精确识别靶向纳米载体，其特征在于：所述靶向纳米载体在制备用于肿瘤精准生物治疗和化学治疗的药物中的应用。