CN111218443A - 合成核酸药物偶联物的方法 - Google Patents

合成核酸药物偶联物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111218443A
CN111218443A CN201811410067.7A CN201811410067A CN111218443A CN 111218443 A CN111218443 A CN 111218443A CN 201811410067 A CN201811410067 A CN 201811410067A CN 111218443 A CN111218443 A CN 111218443A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
drug
primer
aptamer
drug conjugate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811410067.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111218443B (zh
Inventor
谭蔚泓
王若文
孙洋
高飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Original Assignee
Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine filed Critical Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority to CN201811410067.7A priority Critical patent/CN111218443B/zh
Publication of CN111218443A publication Critical patent/CN111218443A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111218443B publication Critical patent/CN111218443B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及合成核酸适体药物复合物的方法。具体地，本发明通过固相合成，在引物的5’末端定点、定量的引入药物分子，可以实现一种到多种药物分子的连接。通过对模板(如核酸适体)和带有药物分子的引物进行扩增反应(如PCR)，可以大批量合成核酸适体药物复合物。由于引物较短，易于合成和分离，因此产率高、成本低，批次间差异小，可控性高。

Description

合成核酸药物偶联物的方法
技术领域
本发明属于生物药物技术领域，具体涉及合成核酸药物偶联物的方法。
背景技术
核酸适体与药物复合物的连接当前已报道的有多种方法。其中应用较多的是共价连接。
2009年Tan课题组实现了药物Dox与核酸适体sgc8的共价连接，并对其活性进行了考查，发现其能很好的靶向并特异性杀死核酸适体sgc8的靶细胞CEM，而对NB4细胞的活性没有影响。
2016年Rossi课题组用靶向胰腺癌的核酸适体P19分别与gemcitabine、5FdCMP、MMAE、DM1通过共价连接方式构建为核酸适体药物复合物，实现了靶向药物运输及胰腺癌的靶向治疗。
核酸适体与药物也可以通过非共价组装的方式进行连接，2006年John课题组通过将药物Dox嵌入核酸适体A10，实现了药物的靶向运输。
2015年Tan课题组通过构建Nano-train的方式在核酸适体sgc8中装载多个Dox，实现了靶向药物运输。
此外，通过纳米材料载体，结合aptamer的靶向性也可以实现药物的靶向运送。
2015年Li课题组通过纳米颗粒修饰核酸适体，装载光动力学治疗的药物，用于肿瘤的光动力学治疗。
2018年song课题组通过脂质体与核酸适体构建纳米载体装在药物Dox，用于乳腺癌的靶向治疗。
上述连接方式反应复杂，产率较低且可控性差。通过共价连接的方法，通常只能在核酸适体的一端引入一个药物分子，且反应相对复杂，产率不高。而非共价嵌入的方式，药物分子容易脱落，药物分子的个数不能控制。通过纳米载体的方式，需要制备纳米载体，修饰核酸适体，反应复杂，包裹药物分子的比例和效率也不可控。
2014年Tan课题组通过固相合成反应将药物5FdU连接至核酸适体sgc8上，实现了在核酸适体上定点引入特定数目的药物分子的方法，实现了药物的靶向可控运输。但固相合成本身受限于DNA长度，随着DNA长度的增加，合成效率降低，合成成本增加。通过固相合成法不利于合成长链的或双特异的Aptamer，因为合成产率低、成本相对高。
因此，本领域亟需开发合成产率高、成本低、可控性好地制备核酸适体药物复合物的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种合成产率高、成本低、可控性好地制备核酸适体药物复合物的方法。
本发明的第一方面，提供了一种制备核酸药物偶联物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供第一引物，所述第一引物的结构如式I所示，
(X1)n-X2 (I)，
式中，“-”为化学键或连接元件，
X1为药物分子，
X2为匹配区，所述匹配区与待扩增的核酸完全互补，
n为≥1的正整数；
(b)在一扩增体系中，以所述待扩增的核酸为模板，用所述的第一引物进行核酸扩增，从而获得核酸扩增产物；以及任选地
(c)对步骤(b)中所述的核酸扩增产物，除去反义链，得到所述的核酸药物偶联物。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(d)将步骤(c)中所述的核酸药物偶联物与药学上可接受的载体混合，制备得到药物组合物。
在另一优选例中，所述待扩增的核酸选自下组：核酸适体或其互补链(或其反义链)、siRNA、miRNA、mRNA、DNA、或其组合。
在另一优选例中，扩增得到的核酸扩增产物为双链核酸。
在另一优选例中，所述的反义链指不含(未偶联有)药物分子的那条链，正义链为含有(偶联有)药物分子的那条链。
在另一优选例中，所述正义链为核酸药物偶联物。
在另一优选例中，所述待扩增的核酸为核酸适体反义链，所述核酸药物偶联物为核酸适体药物偶联物。
在另一优选例中，所述n为1-10，较佳地n为1-8，更佳地n为1-4。
在另一优选例中，(X1)n位于(或连接于)X2的5’端。
在另一优选例中，所述(X1)n为n个相同(包括完全相同和部分相同)或不同的药物分子。
在另一优选例中，所述X1的分子量为100-4000，较佳地200-3000，更佳地300-2500，更佳地1000-2000。
在另一优选例中，所述连接元件为双肽，如Val-Cit。
在另一优选例中，所述药物分子与所述匹配区通过巯基与氨基的反应连接。
在另一优选例中，所述匹配区的长度为10-50bp，较佳地为15-30bp。
在另一优选例中，各X1独立地为选自下组的药物分子：核酸类似物、碱基类似物、生物碱、中药提取物、小分子抑制剂、或其它药物分子。
在另一优选例中，n个药物分子X1以串联的形式共价连接在引物上；或n个药物分子X1各自独立地共价修饰连接在所述引物上。
在另一优选例中，n个药物分子X1以碱基类似物的形式串联在引物上。
在另一优选例中，各X1独立地为选自下组的药物分子：5FdUTP、5F-dCTP、MMAE、喜树碱、或酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。
在另一优选例中，各X1独立地所述药物分子为MMAE、喜树碱、或酪氨酸激酶抑制剂。
在另一优选例中，所述核酸药物偶联物为核酸适体药物偶联物，较佳地为单特异核酸适体药物偶联物、双特异核酸适体药物偶联物、或多特异核酸适体药物偶联物。
在另一优选例中，所述核酸适体药物偶联物指偶联有药物的核酸适体。
在另一优选例中，所述待扩增的核酸为核酸适体的互补链或反义链。
在另一优选例中，所述核酸适体为单特异核酸适体、双特异核酸适体、或多特异核酸适体。
在另一优选例中，所述双特异核酸适体或多特异核酸适体是指，可以靶向两种或多种靶标的核酸适体。
在另一优选例中，所述核酸适体为单个核酸适体、或串联的多个(如2、3、4个)相同或不同的核酸适体。
在另一优选例中，在串联的多个(如2、3、4个)相同或不同的核酸适体中，设有位于两个相邻的核酸适体之间的核酸连接序列，较佳地，所述核酸连接序列的长度为4-8。
在另一优选例中，所述核酸适体靶向(或特异性结合于)选自下组的靶标：蛋白、糖链、或其组合。例如，肿瘤表面异常表达的蛋白，PTK7、EGFR、HER2等。
在另一优选例中，步骤(a)中包括将(X1)n修饰或合成于所述匹配区的5’端，较佳地通过固相合成或PCR合成。
在另一优选例中，步骤(b)的扩增体系中还包括第二引物，所述第二引物为正常引物或带有标记物的引物。
在另一优选例中，所述标记物包括：生物素、巯基、his标签、或其它用于分离的标记物。
在另一优选例中，步骤(b)中的核酸扩增为PCR扩增(如温控PCR、恒温PCR)。
在另一优选例中，所述第一引物和第二引物的摩尔比C1/C2≥10，较佳地C1/C2≥20，更佳地C1/C2≥100。
在另一优选例中，所述第二引物中的标记物为生物素。
在另一优选例中，步骤(c)中还包括：解开双链，与标记有亲和素的琼脂糖球珠或磁珠通过“亲和素-生物素”进行结合，分离反义链，从而获得核酸药物偶联物。
在另一优选例中，所述第二引物中的标记物为巯基，步骤(c)中包括通过金颗粒进行分离反义链。
在另一优选例中，所述第二引物中的标记物为His标签，步骤(c)中包括通过Ni修饰的beads进行分离反义链。
在另一优选例中，所述解开双链包括用碱性溶液进行处理、或调节温度控制双链的解聚和聚合(如微流控或水浴等其他温控装置)。
在另一优选例中，步骤(c)中还包括脱盐处理。
在另一优选例中，所述方法还包括对得到的核酸适体药物复合物进行功能和有效性检测的步骤。
本发明的第二方面，提供了一种用于制备核酸药物偶联物的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：
(a)第一引物，所述第一引物的结构如式I所示，
(X1)n-X2 (I)，
式中，“-”为化学键或连接元件，
X1为药物分子，
X2为匹配区，所述匹配区与待扩增的核酸完全互补，
n为≥1的正整数；
(b)待扩增的核酸；以及任选的
(c)用于核酸扩增的其它试剂。
在另一优选例中，所述待扩增的核酸选自下组：核酸适体或其互补链(或其反义链)、siRNA、miRNA、mRNA、DNA、或其组合。
在另一优选例中，所述(c)用于核酸扩增的其他试剂中包括第二引物，所述第二引物为正常引物或带有标记物的引物。
在另一优选例中，所述标记物包括：生物素、巯基、his标签、或其它用于分离的标记物。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括用于分离反义链的试剂。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了PCR法构建核酸适体药物复合物流程图。
图2显示了琼脂糖凝胶鉴定核酸适体药物复合物ApDC1的结果。
图3显示了质谱鉴定核酸适体药物复合物ApDC1的结果。
图4显示了流式考查实施例1中制备的ApDC1对正常细胞NCM460(A)和肿瘤细胞HCT116(B)的结合能力的结果，其中“NCM460-对照”组、“HCT116-对照”组为核酸适体的阴性对照。
图5显示了Confocal验证ApDC1对靶标的识别能力的结果。
图6显示了细胞活性实验验证ApDC1对正常细胞NCM460(A)和肿瘤细胞HCT116(B)的药效的结果。
图7显示了琼脂糖凝胶检测实施例2中制备的ApDC2的正确性的结果。
图8显示了流式细胞术检测双特异核酸适体对结肠癌细胞HCT116(A)和肺癌细胞H460(B)的靶向性的结果，其中“HCT116-对照”组、“H460-对照”组为核酸适体的阴性对照。
图9显示了流式验证ApDC2的靶向性的结果。其中，A为对结肠癌细胞HCT116的结合，B为对肺癌细胞H460的结合。
图10显示了细胞活性实验验证ApDC2对结肠癌细胞HCT116(A)和肺癌细胞H460(B)的药效的结果。
图11显示了琼脂糖凝胶验证实施例4中ApDC3的正确性。
图12显示了质谱考查ApDC3的分子量。
图13显示了ApDC3对细胞的结合能力和靶向性。其中，A为肿瘤细胞HCT116，B为正常细胞NCM460，其中“NCM460-对照”组、“HCT116-对照”组为核酸适体的阴性对照。
图14显示了ApDC3对细胞的毒性和选择性。其中，A为正常细胞NCM460，B为肿瘤细胞HCT116。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种制备核酸适体药物复合物的方法。本发明通过固相合成，能够在引物的5’末端定点、定量的引入药物分子，可以实现一种到多种药物分子的连接。通过对模板(核酸适体)和带有药物分子的引物进行扩增反应(如PCR)，可以大批量合成核酸适体药物复合物。由于引物较短，易于合成和分离，因此产率高、成本低，批次间差异小，可控性高。在此基础上完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。
核酸适体
如本文所用，“核酸适体”、“适体”、“适配体”、“适配子”和“aptamer”可以互换使用，指能够与特定的靶分子结合的核酸序列，包括DNA适体、RNA适体、杂合类型的适体、或其他类型的适体。此外，在本发明中，适体还包括单链和双链形式，尤其是单链形式的适体。较佳地，核酸适体如本发明第一方面所述。
第一引物
如本文所用，“第一引物”指5’端连接有药物分子的引物，所述第一引物的结构如式I所示，
(X1)n-X2 (I)，
式中，“-”为化学键或连接元件，
X1为药物分子，
X2为匹配区，所述匹配区与待扩增的核酸完全互补，
n为≥1的正整数。
在另一优选例中，各X1独立地为选自下组的药物分子：核酸类似物、碱基类似物、生物碱、中药提取物、小分子抑制剂、或其它药物分子。
在另一优选例中，各X1独立地为选自下组的药物分子：5FdUTP、5F-dCTP、MMAE、喜树碱、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)、或其组合。
在另一优选例中，各X1独立地所述药物分子为MMAE、喜树碱、或酪氨酸激酶抑制剂。
核酸适体药物复合物(Aptamer-Drug-conjugates，ApDC)
核酸适体药物复合物，是指核酸适体与药物的连接物，旨在提高靶向性，降低药物的毒副作用。
近年来靶向药物运输得到大量的研究，目前研究者们提出多种靶向策略来提高药物的靶向性，降低药物的毒性。而药物的靶向运送取决于靶向元件。核酸适体是一段具有高亲和力、特异性、选择性的单链的DNA或RNA，其具有易于合成、易于修饰、批次间差异小、易于储存和运输、成本低廉、免疫原性低、组织穿透能力强、热变性化学变性后容易恢复活性等特点。核酸适体可以靶向细胞甚至组织。研究表明核酸适体与药物连接能有效的改善药物的水溶性，提高药物的靶向性，降低药物对正常组织的毒副作用。
核酸适体与药物复合物的连接当前已报道的有多种方法。其中应用较多的是共价连接。核酸适体与药物也可以通过非共价组装的方式进行连接。此外，通过纳米材料载体，结合aptamer的靶向性也可以实现药物的靶向运送。但上述连接方式反应复杂，产率较低且可控性差。通过共价连接的方法，通常只能在核酸适体的一端引入一个药物分子，且反应相对复杂，产率不高。而非共价嵌入的方式，药物分子容易脱落，药物分子的个数不能控制。通过纳米载体的方式，需要制备纳米载体，修饰核酸适体，反应复杂，包裹药物分子的比例和效率也不可控。
2014年Tan课题组通过固相合成反应将药物5FdU连接至核酸适体sgc8上，实现了在核酸适体上定点引入特定数目的药物分子的方法，实现了药物的靶向可控运输。但固相合成本身受限于DNA长度，随着DNA长度的增加，合成效率降低，合成成本增加。
本发明制备核酸药物偶联物的方法
本发明提供了一种合成产率高、成本低、可控性好的核酸药物偶联物制备方法。具体地，所述制备核酸药物偶联物的方法如本发明第一方面所述。
在本发明中，一种典型的核酸药物偶联物制备方法如下：
如图1所示，通过将药物修饰/合成于引物上，之后通过PCR扩增反应得到大量的核酸药物偶联物，通过NaOH解开双链，借助链霉亲和素和biotin的亲和力，用链霉亲和素标记的琼脂糖球珠分离反义链，即得到溶于NaOH的核酸药物偶联物，进一步通过脱盐，即可得到纯的核酸药物偶联物。
除本发明涉及的温控PCR扩增方法之外，也可采用恒温PCR法，即不需要通过升温降温，在单独某一温度条件下可实现PCR的反应过程。PCR反应本身是依赖于聚合酶的温控反应，因此恒温PCR法也属于该范畴。通过其他装置实现类似的温控反应，通过酶实现DNA的大量扩增也属于该范畴。
本发明主要利用聚合酶的作用，通过温度的调节实现双链的解聚与聚合，实现核酸药物偶联物的合成与大量扩增。微流控或水浴等其他温控装置也可实现上述反应。
传统合成DNA的方法为固相合成，但合成长链的DNA效率较低，特别是合成药物或特殊修饰的DNA，成本高昂。与固相合成相比，本发明核酸扩增法能够快速高效的合成任意长度的DNA。
PCR技术，即聚合酶链式反应，可以通过少量的模板反应得到大量的产物，是一种高效的实现大量合成DNA的一种方法。本发明结合固相合成的优势，通过固相合成能够在引物的5’末端定点、定量的引入药物分子。由于引物分子较短，易于合成和分离，因此产率高、成本低。通过核酸扩增反应可以实现大批量的核酸适体药物复合物的合成。因此本发明制备方法反应效率高、产率高、成本低，批次间差异小，可控性高。
本发明的主要优点包括：
1.可实现多种药物的简单可控连接
本发明通过固相合成引物，能够在核酸(如核酸适体)的末端定点、定量的引入药物分子。可以实现一种到多种药物分子的连接，且连接比例可控。由于引物分子较短，易于合成和分离，因此合成效率高、产率高、成本低、可控性强。
2.可实现核酸药物偶联物的批量制备
本发明通过对模板(如核酸适体)和带有药物分子的引物进行扩增反应(如PCR)，可以实现指数倍数的扩增，从而可以批量的制备核酸适体药物复合物，且可以扩增任意长度的DNA，产率高、成本低、批次间差异小。
3.通过序列组合可以构建单个核酸适体的多个重复或者不同核酸适体的组合，实现增强靶向或协同靶向运输药物，且构建方法简单高效、成本低、可控性强。
4.本发明方法制备的核酸适体药物复合物的靶向特异性强、与靶标结合能力与核酸适体相当，毒副做用小，能有效杀伤肿瘤细胞。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1PCR法构建的核酸适体药物复合物
1.PCR法构建的核酸适体药物复合物
本实施例使用的药物为5F尿嘧啶(药物1)，又称5FU(是5FdU还是5FU)。5FdU是一种碱基类似物，通过PCR合成的方法将5FdU连接到上游引物上，得到5’端连接有5FdU的上游引物。
通过PCR法构建核酸适体药物复合物(Aptamer-Drug-conjugates，ApDC)，流程如图1所示。其中，模板为核酸适体sgc8(核酸适体1)，靶向PTK7蛋白，其序列为TTTTTTATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA(SEQ ID NO.:3)。
上游引物：5’-FAM-5FdU5FdU5FdU-TTTTTTATCTAACTGCTG-3’(SEQ ID NO.:1)
下游引物：5’-Biotin-TCTAACCGTACAGTATTT-3’(SEQ ID NO.:2)
PCR体系为：10X buffer 100μL，dNTP 80μL，上下游引物各300μL，模板5μL，Taq酶5μL，用水补至1000μL。
反应条件为：
95℃3min，95℃30s，44℃30s，72℃30s，72℃3min，4℃∞
50个循环。
之后每1ml PCR产物中加入300μL链霉亲和素修饰的琼脂糖球珠，4℃孵育过夜，次日用10ml DPBS清洗球珠，去掉未结合的核酸，并加入500μL 0.2M的NaOH变性3min，离心，上清即为产物。将产物加入脱盐柱中，脱去盐离子，并用1ml超纯水洗脱，即得溶于水中的核酸适体药物复合物ApDC1,可以冻干备用。所述ApDC1为5’端偶联有5FdU的核酸适体sgc8。
2.核酸适体药物复合物鉴定
首先通过琼脂糖凝胶电泳对上述方法制备的ApDC1的分子量进行鉴定，发现其大小正确(图2)。之后通过质谱法鉴定该ApDC1的分子量，与理论值15920一致(图3)，因此认为核酸适体药物复合物构建正确。
3.核酸适体药物复合物的功能活性考查
首先，通过流式细胞术，以单独的药物5FdU及单独的核酸适体sgc8为对照。考查上述方法制备的ApDC1对结肠癌细胞HCT116和结肠上皮细胞NCM460的结合能力，从而判断ApDC1的选择性。
结果如图4所示，对于肿瘤细胞HCT116，所述ApDC1具有和单独的核酸适体sgc8相当的结合能力，且对正常细胞NCM460没有明显结合。结果表明，通过本发明方法制备的ApDC1仍然保留结合靶标的能力，并且其结合能力与单独核酸适体相当、靶向特异性好，毒副作用小。
进一步地，通过共聚焦显微镜观察上述方法制备的ApDC1区分正常细胞与肿瘤细胞的能力。接种10万个细胞至共聚焦小皿，次日弃培养基，并用DPBS清洗，将250nM，500ulApDC1与细胞在4℃孵育30分钟，DPBS清洗未结合的核酸适体。
结果如图5所示，所述ApDC1能很好的结合肿瘤细胞HCT116，而对正常细胞NCM460没有结合。
接着，通过细胞毒性实验，以单独的药物5FdU及单独的核酸适体sgc8为对照，接种10000个细胞至96孔板，次日加入不同浓度的ApDC1、5F、sgc8，48小时后弃培养基，加入培养基稀释的CCK-8中，37℃孵育0.5-1小时，通过酶标仪测定450nm处的吸光度值，计算细胞存活率。考查上述方法制备的ApDC1对肿瘤细胞HCT116和正常细胞NCM460的毒性，从而判断ApDC的选择性和毒性。
如图6所示，结果显示该ApDC1能明显的抑制肿瘤细胞HCT116的生长，在2μM可导致细胞死亡，而对正常细胞没毒性。结果表明，本发明方法制备的核酸适体药物复合物的毒性与单独的药物及核酸适体相比明显增强，且对肿瘤细胞具有选择性、靶向特异性好，毒副作用小(图6)。
实施例2构建的双特异核酸适体药物复合物
通过上述类似的方式，合成两个甚至多个核酸适体片段，核酸适体之间间隔几个A或T碱基，实现双特异甚至多靶向。本实施例使用的药物为5F尿嘧啶，同实施例1。通过PCR法构建核酸适体药物复合物，流程如图1所示。其中，模板为核酸适体sgc8-R50，其中sgc8靶向PTK7蛋白，在白血病、结肠癌细胞表面高表达，而R50(核酸适体2)靶向肺癌细胞，其序列为TTTTTTATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGATTTTTTAAAGGGCGGGGGGTGGGGTGGTTGGTAGTTGTTTTTTCTGTTTC(SEQ ID NO.:5)。
上游引物：5’-FAM-5FdU5FdU5FdU-TTTTTTATCTAACTGCTG-3’(SEQ ID NO.:1)
下游引物：5’-Biotin-GAAACAGAAAAAACAAC-3’(SEQ ID NO.:4)
PCR方法及核酸适体药物复合物的纯化方法同实施例1，最终制备得到ApDC2。
对制备得到的双特异ApDC2鉴定和功能活性考查，实验方法同实施例1，将其中实施例1中的ApDC1替换为本实施例中的双特异ApDC2。
通过琼脂糖凝胶电泳对制备得到的ApDC2的分子量进行鉴定，对照为双特异核酸适体sgc8-R50，发现其大小正确(图7)。如图8所示，双特异核酸适体保持了核酸适体1对结肠癌细胞HCT116的靶向性，并比核酸适体2对肺癌细胞H460的靶向性更强。如图9所示，ApDC2对结肠癌细胞HCT116及肺癌细胞H460具有和核酸适体1、核酸适体2相似的靶向效果。
通过细胞毒性实验验证ApDC2的药效，结果如图10所示，ApDC2能很好的抑制结肠癌细胞HCT116及肺癌细胞H460的生长。
实施例3PCR法构建的含药物的核酸适体药物复合物
本实施例的药物还包括5FdC作为碱基类似物，可与5FdU同时串联于引物上，进行后续PCR反应而合成带有两种药物ApDC。
具体地，合成引物5’-FAM-5FdU5FdU5FdC5FdC-TTTTTTATCTAACTGCTG-3’(SEQ IDNO.:1)，及另外的下游引物，可以实现将两种药物串联于同一条核酸序列上。具体实施方法同实施列1。
结果表明，偶联有5FdC和5FdU两种药物的核酸适体药物复合物ApDC能够很好地选择性地靶向靶标，并且靶向特异性好，毒副作用小，有效地发挥两种药物的药效。
实施例4构建含有大分子药物的核酸适体药物复合物
本实施例使用的药物为一甲基澳瑞他汀E(MMAE)(药物2)，一种微管蛋白抑制剂。为方便与引物反应，本药物为马来酰胺修饰的药物。
模板为核酸适体sgc8，同实施例1。
上游引物：5’SH-FAM-TTTTTTATCTAACTGCTG-3’(SEQ ID NO.:1)
下游引物：5’-Biotin-TCTAACCGTACAGTATTT-3’(SEQ ID NO.:2)
MMAE与上游引物连接通过药物上的马来酰胺与引物上的SH反应实现。反应条件为NHCl4、乙腈溶液，室温8小时。
PCR方法及核酸适体药物复合物的纯化方法同实施例1，最终制备得到ApDC3。
对制备得到的ApDC3鉴定和功能活性考查，实验方法同实施例1，将其中实施例1中的ApDC1替换为本实施例中的ApDC3。
通过琼脂糖凝胶电泳对制备得到的ApDC3的分子量进行鉴定，对照为核酸适体1，发现其大小正确(图11)。进一步通过质谱分析ApDC3的分子量，发现其与理论值(15990)一致(图12)。
如图13所示，ApDC3保持了核酸适体1对对肿瘤细胞HCT116具有很好的结合，而对正常细胞NCM460没有结合。
通过细胞毒性实验验证ApDC3的药效，结果如图14所示，ApDC3能很好的抑制肿瘤细胞HCT116的生长，而不影响正常细胞NCM460的生长。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海交通大学医学院附属仁济医院
<120> 合成核酸药物偶联物的方法
<130> P2018-0924
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
ttttttatct aactgctg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
tctaaccgta cagtattt 18
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
ttttttatct aactgctgcg ccgccgggaa aatactgtac ggttaga 47
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
gaaacagaaa aaacaac 17
<210> 5
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
cgccgggaaa atactgtacg gttagatttt ttaaagggcg gggggtgggg tggttggtag 60
ttgttttttc tgtttc 76

Claims (10)

1.一种制备核酸药物偶联物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)提供第一引物，所述第一引物的结构如式I所示，
(X1)n-X2(I)，
式中，“-”为化学键或连接元件，
X1为药物分子，
X2为匹配区，所述匹配区与待扩增的核酸完全互补，
n为≥1的正整数；
(b)在一扩增体系中，以所述待扩增的核酸为模板，用所述的第一引物进行核酸扩增，从而获得核酸扩增产物；以及任选地
(c)对步骤(b)中所述的核酸扩增产物，除去反义链，得到所述的核酸药物偶联物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述n为1-10，较佳地n为1-8，更佳地n为1-4。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，各X1独立地为选自下组的药物分子：核酸类似物、碱基类似物、生物碱、中药提取物、小分子抑制剂、或其它药物分子。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，n个药物分子X1以串联的形式共价连接在引物上；或n个药物分子X1各自独立地共价修饰连接在所述引物上。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，各X1独立地所述药物分子为MMAE、喜树碱、或酪氨酸激酶抑制剂。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸药物偶联物为核酸适体药物偶联物，较佳地为单特异核酸适体药物偶联物、双特异核酸适体药物偶联物、或多特异核酸适体药物偶联物。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中包括将(X1)n修饰或合成于所述匹配区的5’端，较佳地通过固相合成或PCR合成。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)的扩增体系中还包括第二引物，所述第二引物为正常引物或带有标记物的引物。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二引物中的标记物为生物素。
10.一种用于制备核酸药物偶联物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：
(a)第一引物，所述第一引物的结构如式I所示，
(X1)n-X2(I)，
式中，“-”为化学键或连接元件，
X1为药物分子，
X2为匹配区，所述匹配区与待扩增的核酸完全互补，
n为≥1的正整数；
(b)待扩增的核酸；以及任选的
(c)用于核酸扩增的其它试剂。
CN201811410067.7A 2018-11-23 2018-11-23 合成核酸药物偶联物的方法 Active CN111218443B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811410067.7A CN111218443B (zh) 2018-11-23 2018-11-23 合成核酸药物偶联物的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811410067.7A CN111218443B (zh) 2018-11-23 2018-11-23 合成核酸药物偶联物的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111218443A true CN111218443A (zh) 2020-06-02
CN111218443B CN111218443B (zh) 2024-03-08

Family

ID=70813507

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811410067.7A Active CN111218443B (zh) 2018-11-23 2018-11-23 合成核酸药物偶联物的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111218443B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114392358A (zh) * 2022-01-06 2022-04-26 上海交通大学医学院附属仁济医院 一种肿瘤靶向的核酸适体药物偶连物
CN114681619A (zh) * 2020-12-30 2022-07-01 上海交通大学医学院附属仁济医院 基于Biotin-SA的核酸适体复合物及其应用
CN115990264A (zh) * 2022-12-21 2023-04-21 中国科学院基础医学与肿瘤研究所(筹) 一种ptk7靶向核酸适体偶联药物

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101942445A (zh) * 2010-07-19 2011-01-12 谭蔚泓 核酸适体衍生物及其在制备药物载体中的应用
CN104974998A (zh) * 2014-04-11 2015-10-14 中国中医科学院中医临床基础医学研究所 用于适配子筛选的dna双链分离方法以及适配子筛选方法和新的适配子
CN105087593A (zh) * 2014-05-12 2015-11-25 中国医学科学院基础医学研究所 一种her2核酸适配体及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101942445A (zh) * 2010-07-19 2011-01-12 谭蔚泓 核酸适体衍生物及其在制备药物载体中的应用
CN104974998A (zh) * 2014-04-11 2015-10-14 中国中医科学院中医临床基础医学研究所 用于适配子筛选的dna双链分离方法以及适配子筛选方法和新的适配子
CN105087593A (zh) * 2014-05-12 2015-11-25 中国医学科学院基础医学研究所 一种her2核酸适配体及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RUOWEN WANG等: "Automated Modular Synthesis of Aptamer–Drug Conjugates for Targeted Drug Delivery", 《JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114681619A (zh) * 2020-12-30 2022-07-01 上海交通大学医学院附属仁济医院 基于Biotin-SA的核酸适体复合物及其应用
CN114681619B (zh) * 2020-12-30 2023-08-29 上海交通大学医学院附属仁济医院 基于Biotin-SA的核酸适体复合物及其应用
CN114392358A (zh) * 2022-01-06 2022-04-26 上海交通大学医学院附属仁济医院 一种肿瘤靶向的核酸适体药物偶连物
CN115990264A (zh) * 2022-12-21 2023-04-21 中国科学院基础医学与肿瘤研究所(筹) 一种ptk7靶向核酸适体偶联药物

Also Published As

Publication number Publication date
CN111218443B (zh) 2024-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Limoni et al. Engineered exosomes for targeted transfer of siRNA to HER2 positive breast cancer cells
CN107469088B (zh) 一种基于dna折纸术的精确识别靶向纳米载体的构建方法及其应用
CN111218443B (zh) 合成核酸药物偶联物的方法
CN112933219B (zh) 一种dna-多肽可逆共价偶联分子的制备方法及其用途
CN110354268B (zh) 一种核酸适配体及其环形二价核酸适配体-药物的偶联系统与应用
US20220202949A1 (en) Ligand-targeted cell conjugate (ltcc)-based anti-tumor immune cell, as well as preparation method and use thereof
Taskova et al. Synthetic nucleic acid analogues in gene therapy: an update for peptide–oligonucleotide conjugates
WO2011072292A2 (en) Phase changing formulations of rna and rna derivatives
US20190209695A1 (en) Pharmaceutical Compositions for High-Capacity Targeted Delivery
JP2011511776A (ja) ＲＮＡ干渉のためのカチオン性ｓｉＲＮＡ、合成及び使用
JP2016513089A (ja) 細胞への遺伝子送達のための機能性ｄｎａデンドリマー
WO2012173994A2 (en) Phase changing formulations of nucleic acid payloads
MXPA01012802A (es) Copolimeros para el transporte de acidos nucleicos a las celulas.
CN108239646B (zh) 结合肝癌细胞的核酸适配体及其应用和应用其的检测方法
CN116376917A (zh) 核酸适体SWL-3G、SWL-3bG在制备治疗膀胱癌药物中的应用
CN112779261B (zh) 结合人b7-h4蛋白的适配体及其应用和应用其的检测方法
CN108084268A (zh) 一种肾脏靶向性小核酸递送多肽
CN116271078A (zh) 一种靶向药物nCoVshRNA·2ACE2的合成方法
CN110950931B (zh) 一种特异性靶向三阴性乳腺癌干细胞的多肽及其应用
KR101484441B1 (ko) 유전자 전달을 위한 gmp 나노입자
CN104189920B (zh) 逆转肿瘤多药耐药的基因组合物h‑R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA及其应用
KR101445438B1 (ko) 핵산 전달용 ｐａｍａｍ 유도체
JP2023501020A (ja) 治療用分子の標的化送達
WO2014030147A2 (en) Synthetic proteins based on dendrimers
CN106906219B (zh) 特异结合膜联蛋白A2的核酸适体wh6及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant